Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine skalierbare individuelle Grooming-Assay-Technik in Drosophila , die robuste, quantitative Daten liefert, um das Groomverhalten zu messen. Die Methode basiert auf dem Vergleich der Unterschied in der Farbstoff-Akkumulation auf die Körper von ungezügelten versus gepflegten Tiere über einen festgelegten Zeitraum.
Abstract
Drosophila- Grooming-Verhalten ist ein komplexes, mehrstufiges Lokomotiv-Programm, das eine koordinierte Bewegung von Vorder- und Hinterbeinen erfordert. Hier stellen wir ein Grooming-Assay-Protokoll und ein neuartiges Kammerdesign vor, das kostengünstig und skalierbar ist für kleine oder große Studien der Drosophila- Pflege. Fliegen sind ganz über ihren Körper mit Brilliant Yellow Farbstoff und gegebene Zeit, um den Farbstoff aus ihren Körpern in der Kammer zu entfernen. Fliegen werden dann in einem eingestellten Volumen an Ethanol abgelagert, um den Farbstoff zu solubilisieren. Die relative spektrale Extinktion von Farbstoff-Ethanol-Proben für gepflegte und nicht geschliffene Tiere wird gemessen und aufgezeichnet. Das Protokoll liefert quantitative Daten der Farbstoffakkumulation für einzelne Fliegen, die leicht gemittelt und über Proben verglichen werden können. Dies ermöglicht es, dass experimentelle Entwürfe die Grooming-Fähigkeit für mutierte Tierversuche oder Schaltungsmanipulationen leicht auswerten können. Dieses effiziente Verfahren ist vielseitig und skalierbar. Wir zeigen wOrk-flow des Protokolls und Vergleichsdaten zwischen WT-Tieren und mutierten Tieren für den Drosophila Typ I Dopamin Rezeptor ( DopR ).
Introduction
Grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) ist ein robustes angeborenes Verhalten, das die Koordination mehrerer unabhängiger motorischer Programme beinhaltet 1 . Fruchtfliegen reinigen ihre Körper von Staub, Mikroben und anderen Krankheitserregern, die die normale physiologische Funktion wie Seh- und Flucht behindern oder zu erheblichen Immun-Herausforderungen führen können. Beim Erfassen und Beantworten sowohl der mechanischen 2 als auch der immunen Aktivierung 3 reiben Fliegen wiederholt ihre Beine zusammen oder auf eine gezielte Körperregion, bis sie ausreichend sauber ist und das Grooming zu einem anderen Teil des Körpers fortschreitet. Fliegen führen Putzbewegungen in deutlichen Kämpfen durch, die weitgehend in stereotypen Mustern 1 , 4 auftreten . Eine Verhaltenshierarchie wird deutlich, wenn Putzsignale priorisiert werden. Schaltungen und Wirkungsmuster wurden in der Unterstützung identifiziert oFa-Modell, dass Grooming-Programme an der Spitze der Hierarchie auftreten zuerst und unterdrücken parallele Signale aus Bereichen des Körpers, die nachher gepflegt werden 5 . Höchste Priorität wird dem Kopf gegeben, dann dem Bauch, den Flügeln und schließlich dem Thorax 5 .
Das Grooming-Programm in D. melanogaster ist ein ideales System für das Studium von neuronalen Schaltungen, modulatorischen molekularen Signalen und Neurotransmittern. Zum Beispiel verursachen Kompromisse der Neurofibromin-Funktion 6 , der Verlust des Drosophila- zerbrechlichen X-mentalen Retardierungsproteins ( dfmr1 ) 7 und die Exposition gegenüber Bisphenol A (BPA) 8 alle ein übermäßiges Putzen und andere Verhaltensweisen, die analog zu diskreten menschlichen Symptomen der Neurofibromatose, zerbrechlichen X sind Syndrom und Aspekte von Autismus-Spektrum-Störungen und Attention-Deficit Hyperaktivitätsstörung (ADHS). Grooming Verhalten kann auch habitua seinTed unterschiedlich über Mutantenstämme 2 , die dieses Motorprogramm für Studien der Verhaltenskraft verleihen. Die Breite der neurologischen Phänomene, die von Drosophila modelliert werden kann, verlangt einen neuartigen Vergleichsansatz, um die Fähigkeit der Fliegen zu messen, sich selbst zu pflegen.
Die kombinierte Wirkung von vesikulären Monoamin-Transportern und die relative Häufigkeit von Dopamin und anderen biogenen Aminen im Körper wurde gezeigt, um das Fruchtfliegen-Groomverhalten 9 , 10 zu vermitteln. Octopamin und Dopamin stimulieren vergleichbare Hindleg-Grooming-Aktivität in enthaupteten Fliegen, während Tyramin, der Vorläufer des Octopamins, auch das Grooming in geringerem Maße auslöst 7 . Vier Dopaminrezeptoren wurden in D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 identifiziert DopR, dDA1, dumm ) im Hindleg- Grooming-Verhalten 15 .
Grooming kann indirekt quantifiziert werden, indem man das Ausmaß der Sauberkeit betrachtet, mit dem ein Tier nach dem Abstauben des ganzen Körpers mit einem Markerfarbstoff oder einem fluoreszierenden Staub 5 , 16 vollständig pflegen kann. Der Rest des Staubes, der auf dem Körper verbleibt, kann als relativer Marker für das Gesamtverhalten verwendet werden. Staubige Fliegen, nachdem sie genügend Zeit zum Bräutigam gegeben haben, können ein spezifisches Defizit im Putzverhalten manifestieren. Da die Grooming-Untersuchungen umfangreicher geworden sind, haben Protokolle solche Praktiken als Enthauptung integriert, um pharmakologische Behandlungen auf die Nacken-Binde-Nerven 10 hinzuzufügen, taktile Stimulation von Borsten, um die Grooming-Antwort 2 hervorzurufen,Und Videoaufzeichnung des Verhaltens 15 . Die direkte Beobachtung der Pflege kann leicht durch die visuelle Beobachtung und manuelle Aufzeichnung der Häufigkeit und Dauer der spezifischen Grooming-Ereignisse 4 untersucht werden .
Wir haben eine Fünfzehn-Brunnen-Grooming-Kammer entworfen, die mit einem 3D-Drucker oder einem Laser-Cutter konstruiert werden kann und die Blaupause-Designs zur Reproduktion zur Verfügung stehen 15 . Die Konstruktion verwendet zwei miteinander verbundene Mittelplatten mit Öffnungen, die durch Mesh und zwei zusätzliche Gleit- und Bodenplatten, von denen Fliegen und / oder Farbstoff beladen werden, abgetrennt und getrennt sind. Nachdem wir dem Staub gesträubt haben, legen wir sie in Ethanol ab, um den Farbstoff zu solubilisieren und die Absorption dieser Lösung bei der Wellenlänge des Farbstoffs zu messen. Ein Plattenleser kann für mehrere parallele Proben verwendet werden oder ein Einzellesenspektrophotometer kann für einzelne Proben verwendet werden. Diese Methode minimiert den durch Handhabung verursachten Fehler und alTiefs für Grooming-Assays, die auf einer kleineren, kostengünstigen Skala laufen. Dieses Verfahren wird abgeleitet und von den Methoden , die von Julie Simpson und Andrew Seeds Pionier modifiziert, die mit Heizelementen für temperaturempfindliche Schaltung Manipulationen 5 größere Grooming Kammern verwenden. Das folgende Protokoll zeigt die Quantifizierung des Groomens des ganzen Körpers sowie die alternativen Methoden zur Quantifizierung der Farbstoffansammlung an einzelnen Körperteilen. Wir zeigen auch Beispielvergleichsdaten zwischen WT- und DopR- Mutanten sowie Methoden zur Berechnung eines einfachen Leistungsindexes für das Groomverhalten.
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Protocol
1. Vorbereitung
- Bereiten Sie einen Aspirator für das Bewegen von lebenden Drosophila aus einer Kulturfläschchen in die Putzkammer vor. Aspiratoren erlauben den Transfer von bewussten Tieren in die Verhaltenskammern, um sicherzustellen, dass die Anästhesie die nachfolgende Verhaltensbeobachtung nicht beeinträchtigt.
- Mit Schere schneiden 1.5 Meter von Tygon-Schlauch ID ⅛ ", OD ¼" .Schneiden Sie mindestens 1 Zoll von der Spitze einer 1 mL Einweg-Mikropipettenspitze. Halten Sie ein 1 cm großes Quadratnetz (Öffnung 0,196 Zoll) über die geschnittene Spitze.
ANMERKUNG: Die meisten 1mL Spitzen haben eine Abstufungslinie, in der die Spitze in der Verpackungskasten sitzt, die normalerweise zu dieser Linie geschnitten wird. - Lege eine frische 1-ml-Mikropipettenspitze über die Mesh / Cut-Spitze legen. Beobachten Sie die Maschenform eine feste Barriere zwischen den beiden Spitzen. Das Innere der neuen Spitze schafft eine Haltekammer für Fliegen.
- Schneiden Sie die extreme Spitze der neuen Mikropipettenspitze, um die Öffnung zu erweitern, um den Durchgang einer einzelnen Fliege zu ermöglichen. Das holE entspricht etwa der Öffnung der Putzkammer (ca. 1,5-2 mm im Durchmesser).
- Legen Sie die verschachtelten Spitzen bequem auf das Ende des Tygonschlauches. Schieben Sie die Spitzen in das Rohr, um eine feste Passung zu gewährleisten, um Vakuumdruck zu ermöglichen.
- Am anderen Ende des Schlauches, schneiden Sie die Spitze einer 200 μl Mikropipettenspitze und passen Sie das schmale Schnittende in den Schlauch. Dies ist die "Mund" -Seite des Aspirators.
- Mit Schere schneiden 1.5 Meter von Tygon-Schlauch ID ⅛ ", OD ¼" .Schneiden Sie mindestens 1 Zoll von der Spitze einer 1 mL Einweg-Mikropipettenspitze. Halten Sie ein 1 cm großes Quadratnetz (Öffnung 0,196 Zoll) über die geschnittene Spitze.
- Staub-Aliquot-Rohre vorbereiten. Wiegen Sie etwa 5 mg brillanten gelben Farbstoff auf tariertem Wägepapier. Den Staub in ein 0,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben und die Kappe fest schließen.
HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung von Nitrilhandschuhen während der Aliquotvorbereitung, da einige Latexhandschuhe für den Farbstoff durchlässig sind. - Wiederholen Sie Schritt 1.2) für alle Proben im Experiment (eine für jede Fliege in jeder Kammer).
- Ethanol (EtOH) -Röhrchen vorbereiten: 1 ml 100% EtOH in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Etikettenröhrchen für Genotypen oder Bedingungen/ Li>
- Wiederholen Sie Schritt 1.4) für alle Proben im Experiment (eine für jede Fliege in jeder Kammer). Cap und rette die EtOH-Röhrchen für die Fertigstellung des Grooming-Assays. Dazu gehören auch mindestens eine "Blank" -Probe, die nur 1 mL EtOH ohne Fliege für Negativkontrollen sein wird.
- Montieren Sie jede Putzkammer, indem Sie die Schiebeplatte (mit den kleineren Löchern) verschrauben, aber die Bodenplatte (mit den größeren Löchern) entfernt werden, um Staub zu entfernen.
- Legen Sie jede notwendige Grooming-Kammer flach auf einen Tisch mit der Oberseite nach unten. Fliege Eintrittsseite ist verdeckt.
- Laden Sie 5 mg brillantes gelbes Farbstoffaliquot in jede Kammer, indem Sie das Röhrchen gegen die Oberfläche der Kammer über dem gewünschten Brunnen klopfen. Klopfen Sie die Kammer gegen den Tisch, um sicherzustellen, dass der gesamte Staub durch das Netz auf die obere Platte fällt.
- Schrauben Sie die Bodenplatte auf jede Kammer, so dass die breiteren Enden der konischen Öffnungen nach außen weisen und die Löcher nicht über den Brunnen ruhen. Sichern Sie den BotTom Platte fest, so dass es nicht gleiten und freisetzen Farbstoff.
- Klappen Sie die Kammer um und klopfen Sie es ein paar Mal gegen einen Tisch, so dass der Staub durch das Netz fällt, um auf der Bodenplatte zu ruhen.
- Schieben Sie die obere Platte der Kammer in die "offene Position", so dass die kleinen Löcher mit den fünfzehn Brunnen übereinstimmen, so dass die Einführung von Fliegen in einzelne Brunnen.
2. Fliegen-Staub und Pflege
- Laden Sie eine Fliege in den Mund Aspirator durch sanft saugen durch ein Ende des Aspirators, als ob mit einem Stroh. Setzen Sie die Fliegen durch leichtes Blasen und richten Sie die Öffnung zum Ziel.
- Aspirieren Sie eine Fliege in jeden Brunnen für das Experiment verwendet. Nach dem Laden eines Brunnens schieben Sie die obere Platte so, dass die Fliege in der Kammer eingefangen wird, und legen Sie das Band über die Öffnung dieses Brunnens während des Ladens der gesamten Kammer, um zu verhindern, dass die Flucht entweicht, während andere Brunnen geladen wird. Wenn mehrere Fliegen in ein sing. Aspiriert werdenE gut, lassen Sie diese Öffnung aufgedeckt, bis nur eine Fliege bleibt.
- Nachdem alle notwendigen Brunnen mit Fliegen gefüllt sind, klappen Sie die Kammer so, dass die Bodenplatte nach oben ist, so dass der Staub das Potenzial hat, die Fliegen zu beschichten, indem er durch das Netz fällt.
- Die obere und untere Platte fest anziehen, indem sie die Schrauben anziehen und die Kammer vorwischen, um die Fliegen für 4 s zu stauben.
- Klopfe die Kammer (obere Platte nach unten) gegen einen Tisch zweimal, so dass der Farbstoff auf die andere Seite fällt. Dann umdrehen Sie die Kammer über (obere Platte nach oben) und klopfen Sie die Kammer zweimal, um sicherzustellen, dass sich der Farbstoff auf dem Boden der unteren Kammer abseits der in der oberen Kammer gehaltenen Fliege absetzt.
- Für Kontrollfliegen, die nicht gepflegt werden sollen, fahren wir sofort mit Schritt 3 des Protokolls fort. Für Fliegen, die den Assay abschließen, fahren Sie mit Schritt 2.7 fort.
- Legen Sie die Kammer flach auf einen Tisch oder Arbeitsplatte mit der oberen Platte nach oben für dreißig Minuten, damit die Fliegen zu bräunen. Legen Sie die SohleEr in einem geräusch- und vibrationsfreien Raum, um Ihre Umgebung für alle Grooming-Experimente (Beleuchtungsstärke, Feuchtigkeit und Temperatur) konstant zu halten. Ein Tisch-Inkubator bei RT oder 25 ° C mit Feuchtigkeitskontrollen ist ideal.
3. Vorbereitung der Proben und Absorptionsanalyse
- Halten Sie das Kammerniveau mit der oberen Platte nach oben, schrauben Sie die Bodenplatte vorsichtig ab und entfernen Sie es aus der Kammer, wobei darauf zu achten ist, dass kein Farbstoff verloren geht.
- Legen Sie die Kammer auf eine Fly CO 2 -Platte mit niedrigem Luftstrom, bis die Fliegen anästhesiert sind.
- Schrauben Sie die obere Platte aus der Kammer heraus. Verwenden Sie sorgfältig eine Pinzette, um ein Bein zu packen und eine abgestaubte Fliege aus jeder Kammer zu bewegen und sie in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen zu legen, das EtOH enthält. Die Übertragungszeit für 15 Kammern, die jeweils eine Fliege enthält, beträgt ca. 3-5 min. Experimentatoren sollten in Übertragungszeiten Faktor, wenn / wenn Staffelung Experimente mit mehreren Kammern, um eine effiziente Inszenierung von Experimenten zu gewährleisten. Sobald jedes Mikrozentrifugenröhrchen 1 Fliege enthält, schließen Sie die Kappe und umdrehen die Röhre dreimal, um zu rühren und die Lösung von Farbstoff und Ethanol zu mischen.
- Inkubation von Röhrchen, die Ethanol enthalten, und fliegt 5 h bei RT, um eine vollständige Entfernung des Farbstoffs aus der Fliege in Lösung zu gewährleisten. Nach den 5 h, verwirren Sie jedes Röhrchen (2 s) kurz, um die Freisetzung des Farbstoffs von den Fliegen zu gewährleisten.
- Aliquotieren Sie 50 & mgr; l des experimentellen 1,5 ml-Röhrchens in eine Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen, falls verfügbar, wobei die Lage der einzelnen Proben auf der Platte beachtet wird. Füge 200 μl EtOH hinzu, um die Probe 5x zu verdünnen. Die Verdünnung vermeidet Deckeneffekte von stark abgestaubten Fliegen oder großen Grooming Defekten.
- Verwenden Sie einen Plattenleser, um jede Probe bei 397 nm zu analysieren. Alternativ kann die Extinktion für einzelne Proben und Zuschnitte auf einem Standard-Spektrophotometer im sichtbaren Spektrum gemessen werden, wenn ein Plattenleser nicht verfügbar ist.
- Lesen und Aufzeichnen der Probe durch den Plattenleser und speichern Sie die Kalkulationstabelle mit dem RecordeD Proben auf dem Teller.
4. Quantifizierung der Ergebnisse
- Kompilieren Sie Ergebnisse für alle Proben und messen Sie die Varianz für jeden Genotyp oder Zustand.
ANMERKUNG: Die Farbstoffansammlung zum Zeitpunkt 0 min und zum Zeitpunkt 30 min wird als separate Bedingungen unter Verwendung statistischer Analysen durch Einweg-ANOVA- und Bonferroni-Korrektur oder andere Korrekturen für mehrere parallele Vergleiche betrachtet. - Berechnen Sie die Grooming-Prozentsatzdifferenz für jeden Genotyp / Zustand unter Verwendung der folgenden Gleichung: [(Farbstoffakkumulationsmittelwert zum Zeitpunkt 0 '- Farbstoffakkumulationsmittelwert zum Zeitpunkt 30') / Farbstoffakkumulationsmittelwert zum Zeitpunkt 0] x 100.
- Express den Prozentsatz für jeden Genotyp und Bedingung in Bar-Plots und vergleichen über Genotypen und Bedingungen.
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Representative Results
Der Grooming-Assay liefert quantitative Daten, um die Verhaltensfähigkeit zu bewerten, basierend auf dem relativen Rest des angesammelten Farbstoffs, der auf den Körper der Fliegen nach einer festgelegten Zeit der Messung für das Grooming (30 min) zurückgelassen wurde. Probenbilder der Gleitpflegekammergestaltung und Hauptschritte des Assays sind in Fig. 1 hervorgehoben . Fliegen aggregieren eine signifikante Menge an Farbstoff aus der sofortigen Staubbildung durch Vortexen in Gegenwart von Farbstoff ( Abbildung 2d, 2e ). Die versunkenen Fliegen können einen Bereich der Farbstoffansammlung nach dem Assay beibehalten ( Abbildung 2f, 2g ). Die solubilisierende Farbstoffansammlung in EtOH und die Messung der Extinktion einzelner Proben liefert daher eine reproduzierbare und hochquantitative Beurteilung der Groomfähigkeit.
In dieser Studie von DopR in der Regulierung der Hindleg Grooming, verglichen wir die pflegende Leistung eines starken Hypomorph (
Um die Unterschiede zu untersuchenWährend der Grooming-Fähigkeiten von foreleg vs Hindleg Grooming-Programme, wir direkt bewertet Farbstoff Akkumulation auf trennbare Körperteile während der Grooming ( Abbildung 4 ). Durch die Sezierung der Köpfe, Flügel oder "Körper" (Bauch / Thorax / Beine) der einzelnen Fliegen nach der Assay, konnten wir zuverlässig Unterschiede und Ähnlichkeiten zwischen Genotypen quantifizieren. Die Ergebnisse stützten sich auf eine Interpretation, bei der es keine Unterschiede gab, die für die Vorderpferdeprogramme nicht vorhanden waren, da keine signifikanten Unterschiede für die Köpfe der WT Vs beobachtet wurden . DopR-Mutanten. Allerdings wurden signifikante Unterschiede für die Flügel- und Körpermessungen zwischen Genotypen beobachtet. Diese ergänzende Technik, um den primären Assay auf Körperteile anstelle von ganzen Fliegen durchzuführen, erlaubt eine einfache Methode, anfänglich zu unterscheiden, Vorder-und Hindleg-Grooming-Programme. Diese Ergebnisse wurden weiter ausgedehnt und durch sorgfältige Verhaltensbeobachtungen und Videoaufnahmen oder Verfolgen einzelner Komponenten des Vorderbeins oder h unterstütztIndleg Verhaltensweisen. Alle Ergebnisse aus den Abbildungen 2-4 werden mit Genehmigung von Genes, Brain und Behavior 15 reproduziert.
Abbildung 1: Drosophila Grooming Assay Workflow. Dieses vereinfachte Flussdiagramm skizziert die wichtigsten Schritte im Grooming-Protokoll, wobei einige der notwendigen Materialien und Ausrüstung hervorgehoben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Quantifizierung der Grooming-basierten Dye Accumulation. ( A ) pfalzkammer Einzelne Fliegen und Brilliant Yellow Dye werden in einzelne Brunnen (1 Fliege: 1 Well) platziert. MaßeUnd Blaupausen für die Produktion in ergänzenden Daten. ( B, d, f ) WT erwachsene männliche Drosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 erwachsene männliche Drosophila. ( B, c ) Fliegen vor dem Abstauben. ( D, e ) Fliegt unmittelbar nach dem Stauben durch Vortexen, vor dem Grooming (Zeit: 0 min). ( F, g ) Fliegen nach dem Grooming (Zeit: 30 min). Maßstab = 400 μm. Nachgedruckt mit Erlaubnis von Genes, Gehirn und Verhalten 15 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Dopamin-Rezeptor ( DopR / dDA1 / dumm ) ist für die Modulation des Grooming-Verhaltens erforderlich. ( A, c, e ) GroominG Wildtyp (blau) und Mutantenfliegen (rot / orange) gemessen bei 0 min oder 30 min nach dem Stauben. SEM wird für jeden Genotyp und Zustand gemessen. ( A, b ) n = 43 Fliegen pro Genotyp und Zustand. ( A ) WT und DopR f02676 Fliegen zeigen beide ein Groomverhalten (+/ + 30 'im Vergleich zu + / + 0' = p Wert <0,0001, DopR f02676 30 'im Vergleich zu DopR f02676 0' = p Wert <0,0001). DopR- Fliegen fehlt ebenso wie WT-Tiere ( DopR f02676 30 'im Vergleich zu + / + 30' = p-Wert <0,001). Die akute Abstaubung jedes Genotyps bei 0 'führt zu einer gleichwertigen Ansammlung von Staub (ns = nicht signifikant). ( B, d, f ) Für jeden Genotyp wird ein Grooming-Prozent-Unterschied berechnet (Farbstoff-Akkumulär bei 0 '- Farbstoff bei 30' / Farbstoff-Akkumulierung 0 'x 100), was einen relativen Wert für den Vergleich von Groomverhalten bietet. ( C ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
Abbildung 4: Dopamin-Rezeptor-Funktion Potentiates Hindleg Grooming. ( A ) Grooming der einzelnen Regionen von WT (blau) und DopR f02676 / DopR f02676 (rot) gemessen nach 30 min nach dem Stauben und anschließender Dissektion. P-Wert für Flügelpflegen = 0,0204. P-Wert für Körper = 0,0302. N = 33-35 fliegt für alle Bedingungen. SEM wird für jeden Genotyp und Zustand gemessen. Statistische Analyse durch Einweg-ANOVA und Bonferonni Korrektur. Nachgedruckt mit Erlaubnis von Genes, Gehirn und Verhalten 15 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzende Abbildung: Alternative Methode zur visuellen Quantifizierung des Grooming-Verhaltens mit NIH Image J Pixel Intensity Software. ( A ) Visualisierung von wilDtyp Drosophila unter Sezierbereich. Oval definiert dorsalen Abdomen als Bereich der Analyse für Pixel-Intensität. ( B ) Visualisierung des Dorsalabdoms nach dem Stauben mit Ultra Green V10 fluoreszierendem Pigment. Standardfilter für grüne Fluoreszenz fängt das blau-grüne Pigment ein. ( C ) WT-Tier nach dem Beschichten mit UGV10-Pigment (Vorgasse). ( E ) WT Tier nach dem Beschichten mit UGV10 Pigment (postgrooming). ( D ) DopRf02676 homozygote Mutante nach dem Beschichten mit UGV10-Pigment (Pregrooming). ( F ) DopRf02676 homozygote Mutante nach dem Beschichten mit UGV10-Pigment (Nach-Grooming). ( G ) Quantifizierung der Pixelintensität für alle Bedingungen. N = 15 fliegt für jeden Genotyp oder Zustand. Statistische Analysen auf einfache Weise ANOVA und Bonferonni Korrektur. Ns = nicht signifikanter Unterschied *** steht für p <0,001. PlKlicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Der Grooming-Assay ist relativ einfach, aber wir würden den Experimentatoren vorsichtig sein, den folgenden Problemen besondere Aufmerksamkeit zu widmen. Eine dichte Abdichtung durch Anziehen der Schrauben an der Ober- und Unterseite nach dem Einführen von Fliegen und Farbstoff ist für reproduzierbare Ergebnisse unerlässlich. Der brillante gelbe Farbstoff ist sehr fein und lose Gelenke werden Verluste an Farbstoff aus den Kanten der Kammer ermöglichen. Die Unregelmäßigkeit des Farbstoffgehalts für jede Vertiefung könnte leicht die Grooming-Quantifizierung als ungleichförmiges Staubwurf abwerfen, um die Varianz und die falsch-positiven Raten für die Putzereignisse zu erhöhen. Darüber hinaus ermutigen wir die Experimentatoren, sich der Umgebung bewusst zu sein, in der sie sich entscheiden, die Putzkammer während der 30-minütigen Putzzeit zu halten. Umgebungskonstanz für Temperatur, Beleuchtung, Tageszeit und Feuchtigkeit sind für eine konsistente Leistung für Drosophila- Verhaltensassays unerlässlich. Halten Sie die Grooming-Kammern in einem kleinen Inkubator, um ablenkendes o zu minimierenR variable Laborumgebungen ist ideal für maximale Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, aber auch andere räumliche Anordnungen können erfolgreich sein.
In Bezug auf Farbstoff-Akkumulationsmessungen haben wir festgestellt, dass der Farbstoff für Latex-Handschuhe durchlässig ist, so dass Nitril-Handschuhe für die Handhabung und das Wiegen von Staub vorzuziehen sind. Achten Sie darauf, den Staub nicht weit über die Laboroberflächen zu verbreiten, da er leicht Kleidung anziehen und möglicherweise Oberflächen oder Geräte verunreinigen kann. Die Isolierung eines Bereichs und eines Fliegenstation / CO 2 -Pads für Experimente ist bevorzugt, um eine Farbstoffbelichtung zu enthalten. Wir ermutigen auch Experimentatoren, sicher UV-transparente 96-Well-Platten zu verwenden. Der 397 nm-Absorptionspeak für brillanten gelben Farbstoff liegt in der Nähe des UV-Spektrums, und Standard-96-Well-Platten können schwache oder ungenaue Maßnahmen für Farbstoffverdünnungen ergeben. Der Farbstoff ist auch in Wasser als Alternative zu EtOH löslich. Allerdings saugen Drosophila nicht ohne weiteres in Wasser ohne signifikante Verwirbelung und kleine Luftblasen aloDer Körper der gefärbten Tiere zeigt eine geringere Konsistenz und Löslichkeit des Farbstoffs. Ethanol zeigt konsequent bessere Ergebnisse und geringere Varianz bei direkten Vergleichen.
Unser Assay kann für ergänzende Techniken und weiter verfeinerte Studien, wie z. B. die Sezierung des Fliegenkörpers nach der Assay, leicht modifiziert werden ( Abbildung 4 ). Solche Ergänzungen können notwendig sein, um zu verstehen, welche Grooming-Schritte betroffen sind, da die Farbstoff-Akkumulation nur weitgehend auf Verhaltensverschiebungen hinweist, ohne direkt auf die grundlegende biologische oder neuronale Ursache zu reagieren. Sobald Unterschiede beobachtet werden, sind parallele Experimente mit Videoaufzeichnung oder Direktbeobachtungsmethoden für das Verständnis der Verhaltenswurzel von jeglichen Unterschieden in der Grooming-Effizienz unerlässlich. Dies kann durch visuelle Quantifizierung der Staubpartikelansammlung auf bestimmten Körperteilen unter Verwendung von Pixelintensitätsmaßnahmen durch das NIH ImageJ-Softwareprogramm sowie die direkte Verfolgung von Vorder- und Hinterbein weiter untersucht werdenVerhaltensweisen durch das Aufnehmen von Videomaterial. In Bezug auf alternative Methoden zur visuellen Quantifizierung von fluoreszierendem Staub nutzten frühe Experimente im Labor ein fluoreszierendes Farbpigment, das aus alkalischem Seltenerdmetall-Silikat-Aluminat-Oxid Europium stammte. Nach dem Abstauben der Fliegen mit dem fluoreszierenden Farbpigment und der Betäubung oder Entkapselung der Tiere nach dem Grooming können die Körper durch digitale Mikroskopie unter Verwendung eines Standard-Fluoreszenzfilters für GFP auf einem Sektionsbereich ( Supplemental Data ) aufgezeichnet und analysiert werden. Während dieses Verfahren eine genaue Quantifizierung der Pixelintensität ermöglicht, die mit den mit dem brillanten gelben Farbstoff beobachteten Ergebnissen übereinstimmt, haben wir festgestellt, daß der Durchsatz dieses Verfahrens relativ langsam ist und die Pigmentteilchen leicht variabel sind und weniger gleichförmig sind als die für Brilliant beobachtete Beschichtung Gelber Farbstoff Allerdings ist für einige experimentelle Anwendungen diese alternative Methode angemessen, und es gibt erhebliche Vielfalt in verfügbaren FluoReszente Farben, die für Drosophila- und Nondrosophila- Anwendungen oder iterative Staubversuche nützlich sein könnten, wo die Quantifizierung von separaten Ereignissen wesentlich ist. Es ist anzumerken, dass das Farbpigment selbst wasserlöslich ist, aber schnell seine Fluoreszenz in Wasser verliert und die Nützlichkeit dieses Pigments für Standardabsorptionsmaßnahmen stark beeinträchtigt.
Diese Arten von Methoden, die auf bestimmte Vorder- oder Hinterbein-Grooming-Ereignisse abzielen, sind für das Verständnis der genauen Natur eines Phänotyps unerlässlich und können potenzielle neuronale Schaltungen oder Bewegungsapparate hervorheben, um weiter zu untersuchen. Darüber hinaus ist es für parallele Kontrollexperimente unerlässlich, potenzielle unspezifische Verhaltensgründe auszuschließen, aus denen die Pflege hervorgehen könnte. Wenn Tiere breite motorische Defizite oder Anomalien aufweisen, ist es möglich, dass Grooming-Defizite sekundär zu den breiten Bewegungs-Phänotypen sind. Einfache Video-Tracking von WT-Tieren gegen die Mutante oder CirCuit manipulierte Bedingungen können leicht unterscheiden zwischen großen Verschiebungen der Geschwindigkeit oder Gesamtstrecke zurückgelegt, unabhängig von Grooming Defizite.
Der Grooming-Assay ist ein vielseitiges Verfahren, das sowohl für kleine als auch für große Studien dieses komplexen mehrstufigen Lokomotivprogramms geeignet ist. Die Konstruktionen sind leicht modifiziert, um die Kammerdimension oder die Nummer 15 zu vergrößern. Die Methode liefert robuste quantitative Daten, die ideal für eine vergleichende Bewertung der Fütterungsfähigkeit sind. Die Herstellung der Kammern ist kostengünstig und kann in Abhängigkeit von den verfügbaren Ressourcen mit vielen verschiedenen Maschinen (3D-Drucker, Laserschneider, CNC-Mühlen) hergestellt werden. Die Technik ermöglicht einen mittleren Durchsatz von einzelnen Proben, die leicht für genetische Bildschirme und funktionelle Schaltkreis-Mapping-Studien erweitert werden können.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon und Rose Hedreen für die frühe Arbeit bei der Prüfung und Etablierung dieser Methodik und Kammermusik. Wir danken Kelly Tellez und Graham Buchan für das Lesen und Bearbeiten des Manuskripts. Wir danken Andrew Seeds und Julie Simpson für ihre Pionierarbeit und ihre Beratung und Unterstützung bei der Vorgabe der Verwendung von Brilliant Yellow Dye (Sigma). Diese Arbeit wird zum Teil von der Mary E. Groff Chirurgischen und medizinischen Forschung und Bildung Charitable Trust, dem Bronfman Science Center und dem Hellman Fellows Programm unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
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