Summary
Denne protokollen beskriver en skalerbar individuell grooming assay teknikk i Drosophila som gir robust, kvantitativ data for å måle grooming oppførsel. Metoden er basert på å sammenligne forskjellen i opphopning av fargestoffer på kroppene til ukjente dyr i forhold til preparerte dyr over en bestemt tidsperiode.
Abstract
Drosophila grooming behavior er et komplekst multi-trinns lokomotorisk program som krever koordinert bevegelse av både forben og bakben. Her presenterer vi en grooming assay protokoll og ny kammer design som er kostnadseffektiv og skalerbar for enten små eller store studier av Drosophila grooming. Fluer er støvet over hele kroppen med Brilliant Yellow farge og gitt tid til å fjerne fargestoffet fra kroppene sine i kammeret. Fluer blir deretter avsatt i et sett volum etanol for å oppløse fargestoffet. Den relative spektralabsorbansen av fargestoff-etanolprøver for preparerte versus ungromede dyr måles og registreres. Protokollen gir kvantitative data om fargestoffsakkumulering for individuelle fluer, som lett kan beregnes og sammenlignes på tvers av prøver. Dette tillater eksperimentelle design å enkelt vurdere grooming evne for mutant dyre studier eller krets manipulasjoner. Denne effektive prosedyren er både allsidig og skalerbar. Vi viser wOrk-flow av protokollen og sammenlignende data mellom WT dyr og mutant dyr for Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR ).
Introduction
Grooming i Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) er en robust medfødt atferd som involverer koordinering av flere uavhengige motorprogrammer 1 . Fruktfluer renser deres støv, mikrober og andre patogener som kan hemme normal fysiologisk funksjon som syn og fly, eller føre til betydelige immunforsvar. Ved å føle og reagere på både mekanisk 2 og immun aktivering 3 , flyr fluene gjentatt på bena sammen eller på en målrettet kroppsregion til den er tilstrekkelig ren og grooming utvikler seg til en annen del av kroppen. Fluer utfører bevegelsesbevegelser i forskjellige begivenheter som stort sett forekommer i stereotype mønstre 1 , 4 . Et oppførselshierarki blir tydelig som groomsignaler prioriteres. Kretskort og aktivitetsmønster er identifisert i støtte oFa modell som grooming programmer øverst i hierarkiet oppstår først og undertrykker parallelle signaler fra områder av kroppen som blir preparert senere 5 . Høyeste prioritet er gitt til hodet, deretter magen, vingene og til slutt thoraxen 5 .
Lekeprogrammet i D. melanogaster er et ideelt system for å studere nevrale kretser, modulerende molekylære signaler og nevrotransmittere. For eksempel, kompromittering av nevrofibrominfunksjon 6 , tap av Drosophila fragile X mentalt retardasjonsprotein ( dfmr1 ) 7 og eksponering for bisfenol A (BPA) 8 forårsaker altfor groom og annen oppførsel som er analog med diskrete menneskelige symptomer på nevrofibromatose, skjøre X Syndrom og aspekter av autismespektrumforstyrrelser og henholdsvis ADHD (Attention-Deficit Hyperactivity Disorder). Grooming atferd kan også være habituaTed differensielt over mutantstammer 2 , utlån denne motorprogrammet til studier av atferdsmessig plastisitet. Bredden av nevrologiske fenomener som kan modelleres av Drosophila krever en ny komparativ tilnærming for å måle flygens evne til å pleie seg selv.
Den kombinerte virkningen av vesikulære monoamintransportører og den relative overflaten av dopamin og andre biogene aminer i kroppen har vist seg å formidle fruktluftspleieadferd 9 , 10 . Octopamin og dopamin stimulerer sammenlignbar hindleg grooming aktivitet i decapitated fluer, mens tyramin, forløperen av oktopamin, også utløser grooming i mindre grad 7 . Fire dopaminreseptorer er identifisert i D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 DopR, dDA1, dum ) i hindleg grooming behavior 15 .
Grooming kan indirekte kvantifiseres ved å se på omfanget av renslighet som et dyr kan fullstendig grooms etter dusting hele kroppen med et markørfarger eller fluorescerende støv 5 , 16 . Resten av støv igjen på kroppen kan brukes som en relativ markør for den generelle oppførelsen. Dusty flyr etter å ha fått tilstrekkelig tid til å gifte seg, kan vise seg et bestemt underskudd i grooming behavior. Som grooming undersøkelser har blitt mer omfattende, har protokoller innarbeidet slik praksis som halshugning for å legge farmakologiske behandlinger på nakkebindende nerver 10 , taktil stimulering av børster for å fremkalle grooming respons 2 ,Og videoopptak av oppførsel 15 . Direkte observasjon av grooming kan enkelt studeres ved hjelp av visuell observasjon og manuell opptak av frekvens og varighet av bestemte grooming hendelser 4 .
Vi har designet et femten brønnkammer som kan bygges med en 3D-skriver eller laserkutter, og tegningene er tilgjengelige for reproduksjon 15 . Designet bruker to sammenføyde sentralplater med åpninger som er tilpasset og adskilt av mesh og to ytterligere glidende topp- og bunnplater, hvorfra fluer og / eller fargestoffer er lastet. Etter at støvfluene har tid til å pleie, legger vi dem i etanol for å oppløseliggjøre fargestoffet og måle absorbansen av denne løsningen ved bølgelengden av fargestoffet. En plate leser kan brukes til flere parallelle prøver eller et enkeltlest spektrofotometer kan brukes til individuelle prøver. Denne metoden minimerer feilen fremkalt ved håndtering og alLows for grooming analyser skal kjøres på en mindre, kostnadseffektiv skala. Denne metoden er avledet og modifisert fra metodene pioneret av Julie Simpson og Andrew Seeds, som bruker større pleiekamre med varmeelementer for temperaturfølsomme kretsmanipulasjoner 5 . Følgende protokoll viser kvantifiseringen av grooming av hele kroppen, samt viser alternative metoder for kvantifisering av fargestoffer på individuelle kroppsdeler. Vi presenterer også prøve-sammenligningsdata mellom WT- og DopR- mutanter, samt metoder for beregning av en enkel ytelsesindeks for pleieadferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling
- Klargjør en aspirator for å flytte levende Drosophila fra et kulturflaske til pleiekammeret. Aspiratorer tillater overføring av bevisste dyr til adferdskamrene for å sikre at anestesi ikke påvirker etterfølgende atferdsobservasjon.
- Bruk saks kutt 1,5 fot tygon tubing ID ⅛ ", OD ¼". Ta minst 1 tommers av spissen av en 1 ml engangs mikropipettespiss. Hold et 1 cm kvadratmaske (åpning 0,196 tommer) over kuttespissen.
MERK: De fleste 1mL-tipsene har en graderingslinje hvor spissen sitter i esken, vanligvis kuttet til den linjen. - Legg lett en fersk 1 ml mikropipettespiss over masken / kuttespissen. Legg merke til nettformen en tett sperre mellom de to spissene. Innsiden av det nye spissen skaper et holdekammer for fluer.
- Klipp den ekstreme spissen av den nye mikropipettespissen for å utvide åpningen nok til å tillate passasje av en enkelt fly. The holE vil grovt matche åpningen til pleiekammeret (ca. 1,5-2 mm i diameter).
- Pass godt inn i de nestede spissene på enden av tygonrøret. Skyv spissene inn i røret for å sikre en tett passform for å tillate vakuumtrykk.
- På den andre enden av slangen, kutt spissen av en 200 μl mikropipettespiss og pass den smale kutteenden inn i slangen. Dette er "munnen" siden av aspiratoren.
- Bruk saks kutt 1,5 fot tygon tubing ID ⅛ ", OD ¼". Ta minst 1 tommers av spissen av en 1 ml engangs mikropipettespiss. Hold et 1 cm kvadratmaske (åpning 0,196 tommer) over kuttespissen.
- Klargjør støv alikvot rør. Veid ca 5 mg Brilliant Yellow fargestoff på tarert veiepapir. Hell støvet i et 0,6 ml mikrocentrifugerør og lukk hetten tett.
MERK: Vi anbefaler bruk av nitrilhansker under fremstilling av alikvoter, ettersom noen latexhansker er permeable for fargestoffet. - Gjenta trinn 1.2) for alle prøver i forsøket (en for hver fly i hvert kammer).
- Klargjør etanolrør (EtOH): Pipett 1 ml 100% EtOH i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Etikettrør for genotyper eller forhold. </ Li>
- Gjenta trinn 1.4) for alle prøver i forsøket (en for hver fly i hvert kammer). Cap og lag EtOH-rørene for å fullføre grooming-analysen. Inkluder også minst en "Blank" prøve som bare vil være 1 ml EtOH uten fly for negative kontroller.
- Monter hver groomkammer ved å skru den glideplaten (med de mindre hullene), men la bunnplaten (med de større hullene) fjernes for støvtilsetning.
- Plasser hvert nødvendig pleiekammer flatt på et bord med toppsiden ned. Fly-inngangssiden er forsiden ned.
- Legg 5 mg Brilliant Yellow fargestoffdel i hvert kammer ved å tappe røret mot kammerets overflate over den ønskede brønnen. Pek kammeret mot bordet for å sikre at alt støv faller gjennom masken til topplaten.
- Skru bunnplaten på hvert kammer slik at de bredere ender av de koniske åpningene vender utover og hullene ikke hviler over brønnene. Sikre bottenTom plate tett slik at den ikke glir og slipper fargestoff.
- Vri kammeret over og slå det flatt mot et bord noen ganger, slik at støvet faller gjennom nettverket for å hvile på bunnplaten.
- Skyv toppplaten av kammeret inn i "åpen posisjon" slik at de små hullene retter seg mot de femten brønnene, slik at innføring av fluer i individuelle brønner.
2. Fly-dusting og pleie
- Legg en fly i munnsugeren ved å suge forsiktig gjennom den ene enden av aspiratoren som om du bruker et halm. Sett inn flyene ved å blåse lett og lede åpningen mot målet.
- Aspirer en fly i hver brønn som brukes til forsøket. Etter at du har lagt i en brønn, skyv toppplaten slik at flyet er fanget i kammeret og legg tape over åpningen av brønnen under lasting av hele kammeret for å hindre at flyet rømmer mens du laster andre brønner. Hvis flere fluer suges inn i en singelVel, la den åpningen være avdekket til bare én fly er igjen.
- Etter at alle nødvendige brønner er fylt med fluer, vri kammeret slik at bunnplaten er oppad, slik at støvet har potensial til å belegge fluene ved å falle gjennom masken.
- Tett godt på topp- og bunnplaten ved å stramme skruene og vortex kammeret for å støte fluene i 4 s.
- Knock kammeret (toppplate med forsiden ned) mot et bord to ganger slik at fargestoffet faller gjennom til den andre siden. Deretter vri kammeret over (toppplate med forsiden opp) og slå kammeret to ganger for å sikre at fargestoffet settes på gulvet i bunnkammeret fra flyet som holdes i toppkammeret.
- For kontrollfluer som ikke har lov til å gifte seg, fortsett umiddelbart til trinn 3 i protokollen. For fluer som vil fullføre analysen, fortsett til trinn 2.7.
- Rest kammeret flatt på et bord eller benkeplate med toppplaten oppover i tretti minutter for å tillate fluene å gifte seg. Plasser kammenEr i et støy og vibrasjonsfritt rom for å holde miljøet konstant for alle grooming eksperimenter (belysningsnivåer, fuktighet og temperatur). En bordplaterinkubator ved RT eller 25 ° C med fuktighetsregulering er ideell.
3. Fremstilling av prøver og absorpsjonsanalyse
- Hold kammernivået med topplaten oppover, skru forsiktig ned bunnplaten og fjern den fra kammeret, pass på at du ikke mister fargestoff.
- Plasser kammeret på en Fly CO 2 pute med lav luftstrøm inntil fluene er bedøvet.
- Skru av toppplaten fra kammeret. Forsiktig bruk tverr til å ta tak i et bein og flytte en støvflukt fra hvert kammer og legg det i et 1,5 ml mikrocentrifugerør som inneholder EtOH. Overføringstiden for 15 kamre som hver inneholder ett fly er omtrent 3-5 min. Eksperimenter bør faktor i overføringstider hvis / når svimlende eksperimenter med flere kamre for å sikre effektiv oppstart av eksperimenter. Når hver mikrocentrifugerør inneholder 1 flue, lukk lokket og drei røret tre ganger for å agitere og bland opp løsningen av fargestoff og etanol.
- Inkuber rør som inneholder etanol og flyr i 5 timer ved RT for å sikre fullstendig fjerning av fargestoffet fra flyet til oppløsningen. Etter 5 timer, vortex hvert rør (2 s) kort for å sikre klaring av fargene fra fluene.
- Aliquot 50 μL av den eksperimentelle 1,5 ml røret i en brønn på en 96-brønn plate hvis tilgjengelig, og ta hensyn til plasseringen av hver prøve på platen. Tilsett 200 μl EtOH for å fortynne prøven 5x. Fortynningen unngår takvirkninger av tungt støvete fluer eller store groomfeil.
- Bruk en tallerkenleser til å analysere hver prøve ved 397 nm. Alternativt måler absorbansen for individuelle prøver og emner på et standard spektrofotometer i det synlige spektret dersom en plate leser ikke er tilgjengelig.
- Les og ta opp prøven gjennom plate leseren og lagre regnearket med rekordetD prøver på platen.
4. Kvantifisering av resultater
- Samle resultater for alle prøver og måle variansen for hver genotype eller tilstand.
MERK: Dyeakkumulering ved tid 0 min og tid 30 min betraktes som separate forhold ved bruk av statistisk analyse ved enveis ANOVA- og Bonferroni-korreksjon eller andre korreksjoner for flere parallelle sammenligninger. - Beregn groomsprosentdifferanse for hver genotype / tilstand ved å bruke følgende ligning: [(sammensetning av dyeakkumuleringsmiddelverdi ved tid 0 '- verdi for opphopning av fargestoff ved tid 30') / fargestoffsammensetningsverdien ved tid 0] x 100.
- Express prosentandelen for hver genotype og tilstand i linjeposter og sammenlign på tvers av genotyper og forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Groom-analysen gir kvantitative data for å vurdere atferdsprestasjon basert på den relative resten av akkumulert fargestoff som er igjen på flygellegemene etter en bestemt måltid for grooming (30 min). Prøvebilder av glidekrympekammerdesignen og hovedtrinnene i analysen er fremhevet i figur 1 . Flyver aggregerer en betydelig mengde fargestoff fra umiddelbar støvdannelse ved vortexing i nærvær av fargestoff ( Figur 2d, 2e ). Dusted fluer kan beholde et utvalg av fargestoff akkumulering etter-analyse ( Figur 2f, 2g ). Derfor gir solubiliserende fargestoffakkumulering i EtOH og målerabsorbans av individuelle prøver en reproduserbar og høyt kvantitativ vurdering av pleiemoment.
I denne studien av DopR i regulering av hindleg grooming sammenlignet vi groomytelsen til en sterk hypomorf (
For å undersøke forskjellene væreTween grooming evner for foreleg vs hindleg grooming programmer, vi direkte vurdert fargen akkumulering på separerbare kroppsdeler under grooming ( figur 4 ). Ved å dissekere hoder, vinger eller "kropp" (abdomen / thorax / ben) av individuelle fluer etterforsøk, kunne vi pålidelig kvantifisere forskjeller og likheter mellom genotyper. Funnene støttet en tolkning at ingen forskjeller var tilstede for foreleg grooming programmer, da ingen signifikante forskjeller ble observert for lederne av WT Vs. DopR mutanter. Imidlertid ble det observert signifikante forskjeller for både vinge og kroppsmålinger mellom genotyper. Denne supplerende teknikken for å utføre den primære analysen på kroppsdeler i stedet for hele fluer, tillater en enkel metode for å skille mellom foreleg versus hindleg grooming programmer. Disse resultatene ble ytterligere utvidet og støttet av nøye atferds observasjoner og videoopptak eller sporing av individuelle komponenter i forbenet eller hIndleg atferd. Alle resultater fra figurene 2-4 gjengis med tillatelse fra gener, hjerne og adferd 15 .
Figur 1: Drosophila Grooming Assay Workflow. Dette forenklede flytskjemaet skisserer de viktigste trinnene i groomingsprotokollen, og fremhever noen av de nødvendige materialer og utstyr. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvantifisering av pleie basert på fargenakkumulering. ( A ) Pleiekammer. Individuelle fluer og Brilliant Yellow fargestoff plasseres i individuelle brønner (1 fly: 1 brønn). dimensjonerOg tegninger for produksjon i tilleggsdata. ( B, d, f ) WT voksen mannlig Drosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 voksen mannlig Drosophila. ( B, c ) Fluer før støv. ( D, e ) Flyter umiddelbart etter støving ved vortexing kammer, før grooming (tid: 0 min). ( F, g ) Fluer etter pleie (tid: 30 min). Skalbjelke = 400 μm. Gjengitt med tillatelse fra gener, hjerne og adferd 15 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dopaminreceptor ( DopR / dDA1 / dum ) er nødvendig for modulering av pleiemiddeladferd . ( A, c, e ) GroominG wildtype (blå) og mutantfluer (rød / oransje) målt til 0 min eller 30 min etter støvdannelse. SEM måles for hver genotype og tilstand. ( A, b ) n = 43 flyr per genotype og tilstand. ( A ) WT og DopR f02676 flyr begge utstillingene for grooming behavior (+ / + 30 'sammenlignet med + / + 0' = p verdi <0,0001, DopR f02676 30 'sammenlignet med DopR f02676 0' = p verdi <0,0001). DopR fluer mislykkes i brudgommen, samt WT dyr ( DopR f02676 30 'sammenlignet med + / + 30' = p verdi <0,001). Akutt avstøvning av hver genotype ved 0 'resulterer i ekvivalent opphopning av støv (ns = ikke signifikant). ( B, d, f ) Grooming prosentforskjell beregnes for hver genotype (fargestoff ved 0 '- fargestoff ved 30' / fargestoffsammensetning 0 'x 100) som gir en relativ verdi for å sammenligne groomsadferd. ( C ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
Figur 4: Dopaminreceptorfunksjonen potenserer hindleg Grooming. ( A ) Grooming av individuelle regioner av WT (blå) og DopR f02676 / DopR f02676 (rød) målt etter 30 minutter etter støv og etterfølgende disseksjon. P-verdi for vingepleie = 0,0204. P-verdi for kropp = 0,0302. N = 33-35 flyr for alle forhold. SEM måles for hver genotype og tilstand. Statistisk analyse på en måte ANOVA og Bonferonni Correction. Gjengitt med tillatelse fra gener, hjerne og adferd 15 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende Figur: Alternativ metode for visuell kvantifisering av pleieoppførsel ved hjelp av NIH Image J Pixel Intensity Software. ( A ) Visualisering av wilDtype Drosophila under dissekere omfang. Oval definerer dorsal underliv som analysegruppen for pikselintensitet. ( B ) Visualisering av dorsal abdomen etter støvdannelse med Ultra Green V10 fluorescerende maling pigment. Standardfilter for grønt fluorescens fanger det blågrønne pigmentet. ( C ) WT dyr etter belegg med UGV10 pigment (pregrooming). ( E ) WT dyr etter belegg med UGV10 pigment (etterbehandling). ( D ) DopRf02676 homozygot mutant etter belegging med UGV10 pigment (pregrooming). ( F ) DopRf02676 homozygot mutant etter belegg med UGV10 pigment (post-grooming). ( G ) Kvantifisering av pikselintensitet for alle forhold. N = 15 flyr for hver genotype eller tilstand. Statistiske analyser med One Way ANOVA og Bonferonni Correction. Ns = ubetydelig forskjell. *** representerer ap <0,001. PlEnkelt klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grooming-analysen er relativt enkel, men vi vil forsiktighetseksperimenter være spesielt oppmerksomme på følgende problemer. Opprettholde en tett forsegling ved å stramme skruene på topp- og bunnplaten etter å ha innført fluer og fargestoff er viktig for reproducerbare resultater. Brilliant Yellow-fargestoffet er veldig fint, og løse ledd vil tillate tap av fargestoffer fra kammerets kanter. Uregelmessigheten i fargestoffinnholdet for hver brønn kan lett kaste av groomkvantifisering, da ikke-jevn støving vil øke variansen og falskpositive priser for grooming-hendelser. I tillegg oppfordrer vi eksperimenter til å være oppmerksomme på miljøet der de velger å holde grooming kammeret i løpet av 30 min grooming periode. Miljøbestandighet for temperatur, belysning, tid på dagen og fuktighet er avgjørende for konsistent ytelse for Drosophila atferdsanalyser. Holder hestekamrene i en liten inkubator for å minimere distraherende oR variable laboratoriemiljøer er ideelle for maksimal reproducerbarhet av resultater, men andre romlige arrangementer kan også lykkes.
Med hensyn til fargestoffakkumuleringsmålinger har vi observert at fargestoffet er permeabelt for latexhansker, så nitrilhansker er å foretrekke for håndtering og veiing av støv. Pass på at du ikke sprer støv på tvers av laboratorieflatene, da det lett kan flekke klær og potensielt forurense overflater eller utstyr. Isolering av ett område og en flystasjon / CO 2- pute for eksperimenter er å foretrekke å inneholde farvestoffeksponering. Vi oppfordrer også eksperimenter til å være sikker på å bruke UV-transparente 96-brønnsplater. Den absorberende toppen på 397 nm for Brilliant Yellow-fargestoff er nær UV-spektret, og standard 96-brønnplater kan gi svake eller unøyaktige tiltak for fargestoffer. Fargen er også løselig i vann som et alternativ til EtOH. Imidlertid sinker Drosophila ikke lett i vann uten signifikant vortexing og små luftbobler aloNg kroppen av farvede dyr viser lavere konsistens og oppløselighet av fargestoffer. Etanol viser konsistent bedre resultater og lavere variasjon i direkte sammenligninger.
Vår analyse kan lett modifiseres for supplerende teknikker og mer raffinerte studier, som for eksempel disseksjon av flylegruppens etteranalyse ( figur 4 ). Slike kosttilskudd kan være nødvendig for å forstå hvilke groomingstrinn som er berørt, da fargestoffakkumuleringen bare brede peker på atferdsskift uten direkte å adressere den grunnleggende biologiske eller neurale årsaken. Når det er observert forskjeller, er parallelle eksperimenter som bruker videoopptak eller direkte observasjonsmetoder, avgjørende for å forstå atferdsroten av eventuelle forskjeller i grooming effektivitet. Dette kan undersøkes ytterligere ved visuell kvantifisering av støvpartikkelakkumulering på bestemte kroppsdeler ved hjelp av pikselintensitetsmålinger gjennom NIH ImageJ-programvaren, sammen med direkte sporing av forben og hindleglegAtferd ved å score videoopptak. Med hensyn til alternative metoder for visuell kvantifisering av fluorescerende støv, brukte tidligere eksperimenter i laboratoriet et fluorescerende malingspigment avledet fra Alkaline Rare Earth Metal Silicium-Aluminate Oxide Europium. Etter å ha smeltet fluene med fluorescerende malingspigmentet og bedøvet eller deapiterer dyrene etter grooming, kan legemene registreres og analyseres ved digital mikroskopi ved bruk av et standard fluorescerende filter for GFP på dissekeringsområde ( Supplemental Data ). Selv om denne metoden tillater nøyaktig kvantifisering av pikselintensitet som paralleller med resultatene observert ved hjelp av Brilliant Yellow-fargestoff, fant vi at gjennomløpet av denne metoden er relativt sakte og pigmentpartiklene varierer litt i størrelse og er mindre ensartede enn belegget observert for Brilliant Gul fargestoff. Men for noen eksperimentelle applikasjoner er denne alternative metoden hensiktsmessig, og det er betydelig variasjon i tilgjengelig fluoiserende farger som kan være nyttig for drosophila og nondrosophila programmer eller iterative forstøvningsmidler eksperimenter hvor kvantifisering av ulike arrangementer er avgjørende. Det skal bemerkes at selve malingspigmentet er vannløselig, men fortaber raskt sin fluorescens i vann, noe som vanskeliggjør bruk av dette pigmentet for standardabsorbansmålinger.
Disse typer metoder som retter seg mot spesielle forben eller hindleg grooming hendelser er avgjørende for å forstå den nøyaktige naturen av en fenotype og kan markere potensielle nevrale kretser eller lokomotoriske programmer for å undersøke videre. I tillegg til parallelle kontrolleksperimenter er det viktig å utelukke potensielle ikke-spesifikke atferdsmessige årsaker til at grooming kan bli påvirket. Hvis dyr viser store motoriske underskudd eller unormaliteter, er det mulig at grooming underskudd er sekundære til de brede lokomotoriske fenotyper. Enkel video-sporing av WT-dyr versus mutanten eller cirCuit manipulerte forhold kan enkelt diskriminere mellom store skift i fart eller total avstand som er reist, uavhengig av grooming underskudd.
Grooming assay er en allsidig metode som passer for både små og store studier av dette komplekse multistep lokomotoriske programmet; Designene er enkelt modifisert for å øke kammerdimensjonen eller nummer 15 . Metoden gir robuste kvantitative data som er ideelle for komparativ vurdering av fluer 'grooming evne. Produksjonen av kamrene er kostnadseffektiv, og kan gjøres ved å bruke mange forskjellige maskiner (3D-skrivere, laserskjermer, CNC-fabrikker), avhengig av tilgjengelige ressurser. Teknikken tillater mellomliggende gjennomstrømning av individuelle prøver som lett kan utvides for genetiske skjermbilder og funksjonelle kretsmapningsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon og Rose Hedreen for tidlig arbeid i testing og etablering av denne metodikken og kammerdesign. Vi takker Kelly Tellez og Graham Buchan for å lese og redigere manuskriptet. Vi takker Andrew Seeds og Julie Simpson for deres banebrytende arbeid og deres råd og støtte i å foreslå bruken av Brilliant Yellow Dye (Sigma). Dette arbeidet støttes delvis av Mary E. Groff Kirurgisk og medisinsk forskning og utdanning Charitable Trust, Bronfman Science Center, og Hellman Fellows Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
