Summary
Este protocolo descreve uma técnica de ensaio de higiene pessoal escalável em Drosophila que produz dados robustos e quantitativos para medir o comportamento de limpeza. O método baseia-se na comparação da diferença na acumulação de corantes nos corpos de animais não preparados versus groomed durante um período de tempo definido.
Abstract
O comportamento de limpeza de Drosophila é um programa complexo de locomotores multi-passo que requer movimento coordenado de ambas as pernas dianteiras e as patas traseiras. Aqui apresentamos um protocolo de ensaio de grooming e um novo design de câmara que é econômico e escalável para estudos de pequena ou grande escala de grooming de Drosophila . As moscas são espalhadas por todo o corpo com corante Amarelo Brilhante e tem tempo para remover o corante dos seus corpos dentro da câmara. As moscas são então depositadas em um volume definido de etanol para solubilizar o corante. A absorvância espectral relativa de amostras de colorante e etanol para animais preparados e não untados é medida e registrada. O protocolo produz dados quantitativos de acumulação de corantes para moscas individuais, que podem ser facilmente calculados em média e comparados em amostras. Isso permite que os projetos experimentais avaliem facilmente a habilidade de preparação para estudos de animais mutantes ou manipulações de circuitos. Este procedimento eficiente é versátil e escalável. Mostramos wFluxo de ork do protocolo e dados comparativos entre animais WT e animais mutantes para o Receptor de Dopamina Drosophila tipo I ( DopR ).
Introduction
Grooming em Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) é um comportamento inata robusto que envolve a coordenação de múltiplos programas motorizados independentes 1 . As moscas da fruta limpam seus corpos de poeira, micróbios e outros agentes patogênicos que podem inibir a função fisiológica normal, como visão e vôo, ou levam a desafios imunes significativos. Na detecção e resposta a ambos mecânico 2 e activação imunitária 3, moscas repetitivamente esfregar as pernas em conjunto ou numa região do corpo alvo até que esteja suficientemente limpo e aparência progride para uma outra parte do corpo. As moscas realizam movimentos de limpeza em episódios distintos que ocorrem em grande parte nos padrões estereotipados 1 , 4 . Uma hierarquia comportamental torna-se aparente à medida que os sinais de grooming são priorizados. Circuitos e padrões de atividade foram identificados em suporte oModelo Fa que programas de limpeza na parte superior da hierarquia ocorrem primeiro e suprime sinais paralelos de áreas do corpo que são preparadas posteriormente 5 . A maior prioridade é dada à cabeça, depois ao abdômen, às asas e finalmente ao tórax 5 .
O programa de preparação em D. melanogaster é um sistema ideal para estudar circuitos neurais, sinais moleculares moduladores e neurotransmissores. Por exemplo, o comprometimento da função de neurofibromina 6 , a perda da proteína de retardamento mental frágil X de Drosophila ( dfmr1 ) 7 e a exposição ao bisfenol A (BPA) 8 causam grooming excessivo e outros comportamentos que são análogos aos sintomas humanos discretos de neurofibromatose, X frágil Síndrome e aspectos dos distúrbios do espectro do autismo e Transtorno de hiperatividade com déficit de atenção (TDAH), respectivamente. O comportamento de higienização também pode ser habituaDiferencialmente através de cepas mutantes 2 , emprestando este programa motor a estudos de plasticidade comportamental. A amplitude dos fenômenos neurológicos que podem ser modelados pela Drosophila requer uma abordagem comparativa inovadora para medir a habilidade das moscas de se prepararem.
A ação combinada de transportadores de monoaminas vesiculares e a abundância relativa de dopamina e outras aminas biogênicas no corpo demonstraram mediar o comportamento de grooming da mosca da fruta 9 , 10 . A octopamina e a dopamina estimulam a atividade comparável de higienização na pastura traseira em moscas decapitadas, enquanto a tiramina, o precursor da octopamina, também desencadeia grooming em menor extensão 7 . Foram identificados quatro receptores de dopamina em D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 DopR, dDA1, idiota ) no comportamento de grooming nas costas 15 .
O grooming pode ser indiretamente quantificado observando a extensão da limpeza pela qual um animal pode preparar-se completamente após o pó de todo o corpo com um tinte marcador ou pó fluorescente 5 , 16 . O restante de poeira deixada no corpo pode ser usado como marcador relativo para o comportamento geral. As moscas empoeiradas depois de terem dado tempo suficiente para o noivo podem estar manifestando um déficit específico no comportamento de preparação. À medida que as pesquisas de grooming se tornaram mais extensas, os protocolos incorporaram práticas como a decapitação para adicionar tratamentos farmacológicos aos nervos conectivos do pescoço 10 , estimulação tátil de cerdas para provocar a resposta de grooming 2 ,E gravação de vídeo de comportamento 15 . A observação direta de grooming pode ser facilmente estudada usando observação visual e gravação manual da freqüência e duração de eventos específicos de grooming 4 .
Projetamos uma câmara de preparação de quinze poços que pode ser construída com uma impressora 3D ou cortador a laser, e os projetos de planos estão disponíveis para reprodução 15 . O design usa duas placas centrais juntas com aberturas combinadas e separadas por malhas e duas placas deslizantes superiores e inferiores, das quais moscas e / ou corantes são carregadas, respectivamente. Depois de permitir o tempo de moscas espumadas para o noivo, depositamos-os em etanol para solubilizar o corante e medimos a absorvância desta solução no comprimento de onda do corante. Um leitor de placas pode ser usado para múltiplas amostras paralelas ou um espectrofotômetro de leitura única pode ser usado para amostras individuais. Este método minimiza o erro induzido pelo manuseio e alBaixa para que os ensaios de limpeza sejam executados em uma escala menor e econômica. Este método é derivado e modificado a partir dos métodos iniciados por Julie Simpson e Andrew Seeds, que usam câmaras de grooming maiores com elementos de aquecimento para manipulações de circuitos sensíveis à temperatura 5 . O protocolo a seguir mostra a quantificação de grooming de todo o corpo, bem como mostrando métodos alternativos para a quantificação da acumulação de corantes em partes individuais do corpo. Também apresentamos dados de comparação de amostras entre mutantes WT e DopR , bem como métodos para calcular um índice de desempenho simples para o comportamento de higiene pessoal.
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Protocol
1. Preparação
- Prepare um aspirador para mover Drosophila ao vivo de um frasco de cultura para a câmara de preparação. Aspiradores permitem a transferência de animais conscientes para as câmaras comportamentais para garantir que a anestesia não afete a observação comportamental subsequente.
- Usando tesouras cortar 1,5 pés de ID de tubo de tygon ⅛ ", OD ¼". Cortar pelo menos 1 polegada fora da ponta de uma ponta de micropipeta descartable de 1 mL. Segure um pedaço de malha quadrada de 1 cm (abertura 0,196 polegada) sobre a ponta cortada.
NOTA: A maioria das dicas de 1 mL possuem uma linha de gradação onde a ponta fica na caixa do pacote, tipicamente cortada naquela linha. - Coloque uma ponta de micropipetas fresca de 1 mL sobre a ponta de malha / corte. Observe a malha de uma barreira apertada entre as duas pontas. O interior da nova dica cria uma câmara de espera para moscas.
- Corte a ponta extrema da nova ponta da micropipeta para ampliar a abertura o suficiente para permitir a passagem de uma única mosca. O holE combinará aproximadamente a abertura da câmara de preparação (aproximadamente 1,5-2 mm de diâmetro).
- Encaixe confortavelmente as dicas aninhadas no final da tubulação do tygon. Empurre as pontas no tubo para garantir um ajuste apertado para permitir a pressão de vácuo.
- Na outra extremidade da tubulação, corte a ponta de uma ponta de micropipeta de 200 μL e encaixe na extremidade cortada na tubulação. Este é o lado "boca" do aspirador.
- Usando tesouras cortar 1,5 pés de ID de tubo de tygon ⅛ ", OD ¼". Cortar pelo menos 1 polegada fora da ponta de uma ponta de micropipeta descartable de 1 mL. Segure um pedaço de malha quadrada de 1 cm (abertura 0,196 polegada) sobre a ponta cortada.
- Prepare tubos de alíquotas de pó. Pesar aproximadamente 5 mg de corante Amarelo Brilhante em papel de pesagem tarado. Despeje a poeira em um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL e feche firmemente a tampa.
NOTA: Recomendamos o uso de luvas de nitrilo durante a preparação de alíquotas, uma vez que algumas luvas de látex são permeáveis ao corante. - Repita a etapa 1.2) para todas as amostras no experimento (uma para cada mosca em cada câmara).
- Preparar tubos de etanol (EtOH): Pipetar 1 mL de EtOH 100% em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Rotule os tubos para genótipos ou condições. </ Li>
- Repita o passo 1.4) para todas as amostras no experimento (uma para cada mosca em cada câmara). Capa e salve os tubos de EtOH para completar o ensaio de limpeza. Inclua também pelo menos uma amostra "em branco", que será apenas 1 mL de EtOH sem mosca para controles negativos.
- Montar cada câmara de limpeza, aparafusando a placa superior deslizante (com os orifícios menores), mas deixando a placa inferior (com os orifícios maiores) para a adição de poeira.
- Coloque cada câmara de preparação necessária em uma mesa com a parte superior virada para baixo. O lado da entrada da mosca está virado para baixo.
- Coloque 5 partes de alíquota de corante amarelo brilhante em cada câmara tocando o tubo contra a superfície da câmara acima do poço desejado. Toque na câmara contra a mesa para garantir que toda a poeira caia através da malha na placa superior.
- Aperte a placa inferior em cada câmara, de modo que as extremidades mais largas das aberturas cônicas voltem para fora e os orifícios não descansem sobre os poços. Proteja o botTom prenda firmemente para que não deslize e solte o tinte.
- Deslize a câmara e bata-a plana contra uma mesa algumas vezes para que a poeira caia através da malha para descansar na placa inferior.
- Deslize a placa superior da câmara para a "posição aberta" para que os pequenos orifícios alinhem com os quinze poços, permitindo a introdução de moscas em poços individuais.
2. Fly-dusting e Grooming
- Carregue uma mosca no aspirador da boca sugando suavemente uma extremidade do aspirador como se estivesse usando uma palha. Depure as moscas soprando levemente e direcionando a abertura em direção ao alvo.
- Aspire uma mosca em cada poço usado para a experiência. Depois de carregar um poço, deslize a placa superior para que a mosca seja presa na câmara e coloque a fita sobre a abertura desse poço durante o carregamento de toda a câmara para evitar a fuga da mosca enquanto carrega outros poços. Se moscas múltiplas são aspiradas para um únicoBem, deixe essa abertura descoberta até que apenas uma mosca permaneça.
- Depois de todos os poços necessários serem preenchidos com moscas, vire a câmara de modo que a placa inferior esteja para cima, de modo que a poeira tenha o potencial de revestir as moscas ao cair através da malha.
- Fixe firmemente as placas superior e inferior apertando os parafusos e vorteie a câmara para esfolar as moscas por 4 s.
- Bata a câmara (placa superior com a face voltada para baixo) contra uma mesa duas vezes para que o tinte caia para o outro lado. Em seguida, puxe a câmara para cima (placa superior virada para cima) e bata a câmara duas vezes para garantir que o corante se aplique no chão da câmara inferior longe da mosca na câmara superior.
- Para o controle de moscas que não são permitidas para o noivo, avance imediatamente para a Etapa 3 do protocolo. Para as moscas que completarão o ensaio, vá para o Passo 2.7.
- Descansa a câmara plana sobre uma mesa ou uma bancada com a placa superior para cima por trinta minutos para permitir que as moscas se preparem. Coloque o chambEm um espaço livre de vibração e ruído para manter seu ambiente constante para todos os experimentos de preparação (níveis de iluminação, umidade e temperatura). Uma incubadora de mesa à RT ou 25 ° C com controles de umidade é ideal.
3. Preparação de Amostras e Análise de Absorção
- Mantendo o nível da câmara com a placa superior para cima, desenrosque suavemente a placa inferior e remova-a da câmara, tomando cuidado para não perder corante.
- Coloque a câmara em uma almofada Fly CO 2 com baixo fluxo de ar até que as moscas sejam anestesiadas.
- Desaparafusar a placa superior da câmara. Use cuidadosamente fórceps para agarrar uma perna e mova uma mosca salpicada de cada câmara e deposite-a em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo EtOH. O tempo de transferência para 15 câmaras cada uma contendo uma mosca é de aproximadamente 3-5 min. Os experimentadores devem influenciar os tempos de transferência se / quando experimentos surpreendentes com múltiplas câmaras para assegurar o encaminhamento eficiente dos experimentos. Uma vez que cada tubo de microcentrífuga contém 1 mosca, feche a tampa e inverta o tubo três vezes para agitar e misture a solução de corante e etanol.
- Incubar tubos que contenham etanol e moscas durante 5 h à RT para garantir a remoção completa do corante da mosca em solução. Após as 5 h, vorteie brevemente cada tubo (2 s) para garantir a folga do corante das moscas.
- Alíquota de 50 μL do tubo experimental de 1,5 mL em um poço de uma placa de 96 poços, se disponível, tomando nota da localização de cada amostra na placa. Adicionar 200 μL de EtOH para diluir a amostra 5x. A diluição evita os efeitos do teto das moscas muito espolvoreadas ou grandes defeitos de grooming.
- Use um leitor de placas para analisar cada amostra a 397 nm. Alternativamente, mede a absorvância para amostras individuais e espaços em branco em um espectrofotômetro padrão no espectro visível se um leitor de placas não estiver disponível.
- Leia e grave a amostra através do leitor de placas e salve a planilha com o recordeD amostras na placa.
4. Quantificação de Resultados
- Compile resultados para todas as amostras e mede a variância para cada genótipo ou condição.
NOTA: A acumulação de tintas no tempo 0 min e no tempo 30 min são consideradas como condições separadas usando análise estatística por ANOVA unidirecional e correção Bonferroni ou outras correções para comparações paralelas múltiplas. - Calcule a diferença de porcentagem de preparação para cada genótipo / condição usando a seguinte equação: [(valor médio de acumulação de corante no tempo 0 '- valor médio de acumulação de corante no tempo 30') / valor médio de acumulação de corante no tempo 0] x 100.
- Expresse a porcentagem para cada genótipo e condição em parcelas de barras e compare em genótipos e condições.
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Representative Results
O ensaio de limpeza produz dados quantitativos para avaliar o desempenho comportamental com base no restante relativo do corante acumulado deixado nos cadáveres das moscas após um tempo de medição para grooming (30 min). As imagens de amostra do design da câmara de limpeza deslizante e as principais etapas do ensaio são destacadas na Figura 1 . As moscas agregam uma quantidade significativa de corante do pó imediato por vortex na presença de corante ( Figura 2d, 2e ). As moscas poadas podem reter uma gama de pós-ensaio de acumulação de corante ( Figura 2f, 2g ). Portanto, a acumulação de corante solubilizante em EtOH e a medição da absorvância de amostras individuais proporcionam uma avaliação reproduzível e altamente quantitativa da habilidade de preparação.
Neste estudo de DopR na regulação da grooming traseira, comparamos o desempenho de grooming de um hipomorfo forte (
Para investigar as diferenças,As habilidades de preparo dos programas de preparo da projera dianteira contra os pés traseiros, avaliamos diretamente a acumulação de corantes em partes do corpo separáveis durante a preparação ( Figura 4 ). Ao dissecar as cabeças, asas ou "corpo" (abdome / tórax / pernas) das moscas individuais pós-ensaio, conseguimos quantificar de forma confiável as diferenças e semelhanças entre os genótipos. Os achados apoiaram uma interpretação de que nenhuma diferença estava presente para os programas de preparo para a frente, pois não foram observadas diferenças significativas para as cabeças de WT Vs. DopR mutantes. No entanto, observaram-se diferenças significativas para as medidas da asa e do corpo entre os genótipos. Esta técnica suplementar para realizar o ensaio primário nas partes do corpo, em vez de moscas inteiras, permite um método simples para distinguir inicialmente os programas de anteparo e grooming. Estes resultados foram ampliados e suportados por observações comportamentais cuidadosas e gravação de vídeo ou rastreamento de componentes individuais da perna dianteira ou hComportamentos indlegentes. Todos os resultados das Figuras 2-4 são reproduzidos com permissão de Genes, Brain e Behavior 15 .
Figura 1: Drosophila Grooming Assay Workflow. Este fluxograma simplificado descreve as principais etapas do protocolo de limpeza, destacando alguns dos materiais e equipamentos necessários. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2: Quantificação de grooming com base na acumulação de tintas. (A) câmara de preparação. As moscas individuais e o corante Amarelo Brilhante são colocados em poços individuais (1 mosca: 1 poço). DimensõesE planos para produção em dados suplementares. ( B, d, f ) WT macho adulto Drosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 drosófila do sexo masculino adulto. ( B, c ) Voa antes do pó. ( D, e ) Voa imediatamente após o pó por câmara de vórtice, antes da limpeza (tempo: 0 min). ( F, g ) Voa após o grooming (tempo: 30 min). Barra de escala = 400 μm. Reimpresso com permissão de Genes, Cérebro e Comportamento 15 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3: O Receptor de Dopamina ( DopR / dDA1 / idiota ) é Requerido para a Modulação do Comportamento de Higienização. (A , c, e ) GroominG de moscas selvagens (azul) e mutantes (vermelho / laranja) medido a 0 min ou 30 min após o pó. O SEM é medido para cada genótipo e condição. (A , b ) n = 43 moscas por genótipo e condição. (A) WT e f02676 DopR voa ambos exibem comportamento preparação (+ / + 30' em comparação com + / + 0' = valor de p <0,0001, DopR f02676 30' em comparação com DopR f02676 0' = valor de p <0,0001). As moscas DopR não conseguem vestir , bem como animais WT ( DopR f02676 30 'em comparação com + / + 30' = p valor <0,001). A remoção aguda de cada genótipo em 0 'resulta em acumulação equivalente de poeira (ns = não significativa). ( B, d, f ) A diferença percentual de grooming é calculada para cada genótipo (acúmulo de corante em 0 '- tintura de acúmulo a 30' / corante accum. 0 'x 100) proporcionando um valor relativo para comparar comportamentos de grooming. ( C ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
Figura 4: Função Receptor de Dopamina Potentiates Hindleg Grooming. (A) preparação de regiões individuais de WT (azul) e DopR f02676 f02676 DopR / (vermelho) medida a 30 min após a varredura e dissecção posterior. P valor para grooming das asas = 0,0204. Valor p para o corpo = 0,0302. N = 33-35 voa para todas as condições. O SEM é medido para cada genótipo e condição. Análise estatística por One Way ANOVA e Bonferonni Correction. Reimpresso com permissão de Genes, Cérebro e Comportamento 15 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura suplementar: Método alternativo para a quantificação visual do comportamento de grooming usando NIH Image J Pixel Intensity Software. ( A ) Visualização de wilDtyphila Drosophila sob escopo de dissecação. Oval define o abdômen dorsal como a região de análise para a intensidade do pixel. ( B ) Visualização do abdômen dorsal após o pó com pigmento de tinta fluorescente Ultra Green V10. O filtro padrão para fluorescência verde captura o pigmento azul-verde. ( C ) animal WT após o revestimento com pigmento UGV10 (pré-preparo). ( E ) Animal WT após revestimento com pigmento UGV10 (pós-ginecologia). ( D ) DopRf02676 mutante homozigoto após revestimento com pigmento UGV10 (pré-preparo). ( F ) DopRf02676 mutante homozigoto após revestimento com pigmento UGV10 (pós-grooming). ( G ) Quantificação da intensidade de pixels para todas as condições. N = 15 moscas para cada genótipo ou condição. Análises estatísticas por One Way ANOVA e Bonferonni Correction. Ns = diferença não significante. *** representa p <0,001. PlFacilidade clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O ensaio de preparação é relativamente simples, mas advertimos os experimentadores a prestarem atenção especial às seguintes questões. Manter uma vedação apertada apertando os parafusos nas placas superior e inferior após a introdução de moscas e corantes é essencial para resultados reprodutíveis. O corante amarelo brilhante é muito fino e as juntas soltas permitirão perdas de corante das bordas da câmara. A irregularidade no teor de corante para cada poço poderia facilmente eliminar a quantificação de limpeza, pois o pó não uniforme aumentaria a variação e as taxas de falso positivo para os eventos de limpeza. Além disso, incentivamos os experimentadores a estar conscientes do ambiente em que optam por manter a câmara de limpeza durante o período de preparação de 30 min. A constância ambiental para temperatura, iluminação, hora do dia e umidade são essenciais para um desempenho consistente para ensaios de comportamento de Drosophila . Segurando as câmaras de limpeza dentro de uma pequena incubadora para minimizar a distração oR ambientes de laboratório variável é ideal para reprodutibilidade máxima de resultados, mas outros arranjos espaciais também podem ser bem sucedidos.
Com relação às medidas de acumulação de tintas, observamos que o corante é permeável às luvas de látex, de modo que as luvas de nitrilo são preferíveis para o manuseio e pesagem de poeiras. Tenha cuidado para não espalhar a poeira amplamente em superfícies de laboratório, pois pode facilmente manchar roupas e potencialmente contaminar superfícies ou equipamentos. A isolação de uma área e uma estação fly-station / CO 2 para experimentos é preferível para conter a exposição ao corante. Também incentivamos os experimentadores a certificar-se de usar placas transparentes de 96 poços transparentes. O pico de absorção de 397nm para corante Amarelo Brilhante está perto do espectro UV, e as placas padrão de 96 poços podem dar medidas fracas ou imprecisas para diluições de tintas. O corante também é solúvel em água como alternativa ao EtOH. No entanto, a Drosophila não se afunda facilmente na água sem vórtices significativos e pequenas bolhas de ar aloO corpo de animais tingidos apresenta menor consistência e solubilidade do corante. O etanol mostra consistentemente melhores resultados e menor variação em comparações diretas.
Nosso ensaio pode ser facilmente modificado para técnicas suplementares e estudos mais refinados, como dissecção do pós-ensaio do corpo de mosca ( Figura 4 ). Esses suplementos podem ser necessários para entender quais etapas de limpeza são afetadas, uma vez que o acúmulo de corantes apenas indica grandes mudanças comportamentais sem abordar diretamente a causa biológica ou neural fundamental. Uma vez que as diferenças são observadas, experimentos paralelos usando gravação de vídeo ou métodos de observação direta são essenciais para entender a raiz comportamental de qualquer diferença na eficiência da limpeza. Isso pode ser investigado ainda mais por quantificação visual da acumulação de partículas de poeira em partes específicas do corpo usando medidas de intensidade de pixel através do programa de software NIJ ImageJ, juntamente com o rastreamento direto da proa dianteira e traseiraComportamentos marcando imagens de vídeo. No que se refere aos métodos alternativos para a quantificação visual de poeira fluorescente, experimentos iniciais no laboratório utilizaram um pigmento de tinta fluorescente derivado do oxiclo de metal alcalino Rare Earth Metal Silicate-Aluminium. Depois de pulverizar as moscas com o pigmento de tinta fluorescente e anestesiar ou decapitar os animais após a limpeza, os corpos podem ser gravados e analisados por microscopia digital usando um filtro fluorescente padrão para GFP em um escopo de dissecação ( Dados Suplementares ). Embora este método permita uma quantificação precisa da intensidade de pixels que é paralelo aos resultados observados usando o corante Amarelo Brilhante, descobrimos que a produção deste método é relativamente lenta e as partículas de pigmento variam ligeiramente em tamanho e são menos uniformes que o revestimento observado para Brilhante Tinta amarela. No entanto, para algumas aplicações experimentais, este método alternativo é apropriado, e existe uma variedade significativa em fluo disponívelCores absolutas que podem ser úteis para aplicações de drosofila e nondrosófila ou experimentos de remoção iterativa onde a quantificação de eventos separados é essencial. Deve notar-se que o próprio pigmento da tinta é solúvel em água, mas rapidamente perde a sua fluorescência na água, prejudicando severamente a utilidade deste pigmento para medidas de absorvância padrão.
Esses tipos de métodos que visam eventos específicos da projera ou da pastura posterior são essenciais para entender a natureza precisa de um fenótipo e podem destacar possíveis circuitos neurais ou programas locomotores para investigar ainda mais. Além disso, para experiências de controle paralelo, é essencial excluir potenciais razões de comportamento não específicas que o grooming pode ser afetado. Se os animais apresentarem déficits ou anormalidades motoras amplas, é possível que os déficits de limpeza sejam secundários aos fenótipos locomotores amplos. Rastreamento de vídeo simples de animais WT versus o mutante ou cirAs condições manipuladas podem facilmente discriminar entre grandes deslocamentos de velocidade ou distância total percorrida, independentemente dos déficits de grooming.
O ensaio de preparação é um método versátil adequado tanto para estudos em pequena e grande escala desse complexo programa de locomotores multistep; Os desenhos são facilmente modificados para aumentar a dimensão da câmara ou o número 15 . O método fornece dados quantitativos robustos que são ideais para avaliar comparativamente a habilidade de preparação de moscas. A produção das câmaras é econômica e pode ser feita usando muitas máquinas diferentes (impressoras 3D, cortadores a laser, usinas CNC) dependendo dos recursos disponíveis. A técnica permite o processamento intermediário de amostras individuais que podem ser facilmente expandidas para telas genéticas e estudos de mapeamento de circuitos funcionais.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Desejamos agradecer Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon e Rose Hedreen por trabalhos iniciais no teste e no estabelecimento desta metodologia e projetos de câmara. Agradecemos a Kelly Tellez e Graham Buchan pela leitura e edição do manuscrito. Agradecemos Andrew Seeds e Julie Simpson por seu trabalho pioneiro e seus conselhos e apoio em sugerir o uso de Brilliant Yellow Dye (Sigma). Este trabalho é apoiado em parte pelo Mary E. Groff Surgical and Medical Research and Education Charitable Trust, Bronfman Science Center e Hellman Fellows Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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