Summary
В этом протоколе описывается масштабируемая индивидуальная методика анализа grooming у Drosophila, которая дает надежные количественные данные для измерения поведения ухода. Метод основан на сравнении различий в накоплении красителя на телах ухоженных и ухоженных животных за определенный период времени.
Abstract
Drosophila - это сложная многоступенчатая локомоторная программа, которая требует скоординированного движения как передних, так и задних конечностей. Здесь мы представляем протокол анализа grooming и новую конструкцию камеры, которая экономична и масштабируема для небольших или крупномасштабных исследований по уходу за Drosophila . Мухи пылиются по всему телу с помощью блестящей желтой краски и дают время для удаления красителя из их тел внутри камеры. Мухи затем осаждаются в заданном объеме этанола для солюбилизации красителя. Измеряют и регистрируют относительную спектральную абсорбцию образцов красителя-этанола для ухоженных и неопытных животных. Протокол дает количественные данные о накоплении красителя для отдельных мух, которые можно легко усреднить и сравнить по выборкам. Это позволяет экспериментальным проектам легко оценивать способность ухаживать за мутантными исследованиями на животных или с помощью схемных манипуляций. Эта эффективная процедура универсальна и масштабируема. Покажем wOrk-поток протокола и сравнительные данные между животными WT и мутантными животными для Dopamine рецептора Drosophila I типа ( DopR ).
Introduction
Уход в Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) - это надежное врожденное поведение, которое включает в себя координацию нескольких независимых моторных программ 1 . Фруктовые мухи очищают свои тела от пыли, микробов и других патогенов, которые могут препятствовать нормальной физиологической функции, такой как зрение и полет, или приводят к значительным иммунным проблемам. При восприятии и реагировании как на механическую 2, так и на иммунную активацию 3 , мухи повторно натирают свои ноги вместе или на целевую область тела, пока они не станут достаточно чистыми, а ходьба прогрессирует в другую часть тела. Мухи совершают движения в отдельных поединках, которые в основном происходят в стереотипных узорах 1 , 4 . Поведенческая иерархия становится очевидной, так как приоритетные сигналы имеют приоритет. Схемы и схемы деятельности были определены в поддержку oFA модель , которая холить программы на вершине иерархии происходят первую и подавлять параллельные сигналы от участков тела, которые впоследствии ухоженных 5. Наивысший приоритет отдается голове, затем животу, крыльям и, наконец, грудной клетке 5 .
Программа ухода в D. melanogaster - идеальная система для изучения нейронных цепей, модулирующих молекулярных сигналов и нейротрансмиттеров. Например, компромисс функции нейрофибромина 6 , потеря хрупкого Х- запаса умственной отсталости Drosophila ( dfmr1 ) 7 и воздействие бисфенола A (BPA) 8 все вызывают чрезмерный уход и другие поведения, которые аналогичны дискретным человеческим симптомам нейрофиброматоза, хрупким X Синдром и аспекты расстройств спектра аутизма и синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (ADHD), соответственно. Сходное поведение также может быть habituaВ зависимости от мутантных штаммов 2 , предоставляя эту моторную программу исследованиям поведенческой пластичности. Широта неврологических явлений, которые могут быть смоделированы Drosophila, требует нового сравнительного подхода, чтобы измерить способность мух жениться на себе.
Было показано, что совместное действие везикулярных транспортеров моноаминов и относительное обилие дофамина и других биогенных аминов в организме являются опосредующими поведением плодовых мух 9 , 10 . Октапамин и дофамин стимулируют сравнимую активность задней конечности у обезглавленных мух, в то время как тирамин, предшественник октопамина, также вызывает уход в меньшей степени 7 . Четыре рецептора допамина были идентифицированы в D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 DopR, dDA1, dumb ) в поведении 15 .
Уход можно косвенно определить количественно, посмотрев на степень чистоты, с помощью которой животное может полностью ухаживать после вытирания всего тела маркерным красителем или флуоресцентной пылью 5 , 16 . Остальная часть пыли, оставленной на теле, может использоваться как относительный маркер для общего поведения. Пыльные мухи после того, как им предоставлено достаточное время для жениха, может проявиться определенный дефицит в поведении. Поскольку исследования по уходу за больными стали более обширными, протоколы включили такие методы, как обезглавливание, чтобы добавить фармакологическое лечение на соединительные нервы 10 шеи, тактильную стимуляцию щетинок, чтобы вызвать реакцию 2 ухода,И видеозапись поведения 15 . Прямое наблюдение за ходьбой можно легко изучить, используя визуальное наблюдение и вручную регистрируя частоту и продолжительность конкретных событий 4 .
Мы разработали 15-луночную камеру для уборки, которая может быть построена с помощью 3D-принтера или лазерной резки, а чертежные чертежи доступны для воспроизведения 15 . В конструкции используются две соединенные центральные пластины с отверстиями, соответствующими друг другу и разделенные сеткой, а также две дополнительные скользящие верхние и нижние пластины, из которых загружаются мухи и / или краситель. После того, как высушенные мухи успели дойти до жениха, мы их осаждаем в этаноле, чтобы солюбилизировать краситель и измерять поглощение этого раствора на длине волны красителя. Считыватель пластин может использоваться для нескольких параллельных образцов, или для отдельных образцов может использоваться одночиповой спектрофотометр. Этот метод минимизирует ошибку, вызванную обработкой, иМинимумы для анализа холинга, которые будут выполняться на меньшем, экономичном уровне. Этот метод получен и модифицирован по методам, впервые предложенным Джули Симпсон и Эндрю Сейдс, которые используют более крупные камеры для обжига с нагревательными элементами для температурно-чувствительных схемных манипуляций 5 . Следующий протокол демонстрирует количественную оценку ухода за всем телом, а также показывает альтернативные методы количественного накопления красителя на отдельных частях тела. Мы также представляем данные сравнения образцов между мутантами WT и DopR , а также методы расчета простого индекса производительности для поведения ухода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
- Подготовьте аспиратор для перемещения живой дрозофилы из культурального флакона в камеру для ухода. Аспираторы позволяют переносить сознательных животных в поведенческие камеры для обеспечения того, чтобы анестезия не влияла на последующие поведенческие наблюдения.
- Используя ножницы, отрежьте 1,5 фута трубки tygon ID ⅛ ", OD ¼". Нанесите, по крайней мере, 1 дюйм от кончика 1 мл одноразового наконечника микропипетки. Возьмите квадратный кусок сетки размером 1 см (отверстие 0,96 дюйма) над наконечником.
ПРИМЕЧАНИЕ. У большинства кончиков 1mL есть линия градации, где кончик находится в коробке с пакетом, обычно обрезается по этой линии. - Нанесите свежий кончик микропипетки 1 мл поверх кончика сетки / среза. Наблюдайте за сеткой, образуя плотный барьер между двумя кончиками. Внутренняя часть нового наконечника создает камеру для мух.
- Отрежьте крайний наконечник нового наконечника микропипетки, чтобы расширить отверстие достаточно, чтобы обеспечить прохождение одной мухи. ХоллE будет примерно соответствовать открытию камеры для ухода (приблизительно 1,5-2 мм в диаметре).
- Плотно прилепите вложенные наконечники к концу трубки tygon. Вставьте наконечники в трубку, чтобы обеспечить плотное прилегание, чтобы обеспечить вакуумное давление.
- На другом конце трубки вырежьте кончик наконечника микропипетки 200 мкл и вставьте узкий разрез в трубку. Это «рот» стороны аспиратора.
- Используя ножницы, отрежьте 1,5 фута трубки tygon ID ⅛ ", OD ¼". Нанесите, по крайней мере, 1 дюйм от кончика 1 мл одноразового наконечника микропипетки. Возьмите квадратный кусок сетки размером 1 см (отверстие 0,96 дюйма) над наконечником.
- Подготовьте пылевые аликвотные трубки. Взвесьте приблизительно 5 мг блестящей желтой краски на взвешенной бумаге для взвешивания. Налейте пыль в микроцентрифужную пробирку объемом 0,6 мл и плотно закройте колпачок.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мы советуем использовать нитриловые перчатки во время приготовления аликвоты, так как некоторые латексные перчатки проницаемы для красителя. - Повторите шаг 1.2) для всех образцов в эксперименте (по одному для каждой мухи в каждой камере).
- Подготовьте этанольные (EtOH) пробирки: нанесите 1 мл 100% EtOH на 1,5 мл микроцентрифужные пробирки. Этикетки для генотипов или условий. </ Li>
- Повторите шаг 1.4) для всех образцов в эксперименте (по одному для каждой мухи в каждой камере). Крышка и сохранить EtOH трубы для завершения анализа grooming. Также включите по крайней мере один образец «Бланк», который будет только 1 мл EtOH без мухи для отрицательных контролей.
- Соберите каждую камеру для зачистки, завинтив скользящую верхнюю пластину (с меньшими отверстиями), но оставив нижнюю пластину (с большими отверстиями) удаленной для добавления пыли.
- Поместите каждую необходимую камеру для уборки на стол с верхней стороной вниз. Летающая сторона входа лицевой стороной вниз.
- Загрузите 5 мг бриллиантовой желтой краски в каждую камеру, постукивая трубкой по поверхности камеры над желаемой лункой. Нажмите камеру на стол, чтобы убедиться, что вся пыль попала через сетку к верхней пластине.
- Вверните нижнюю пластину на каждую камеру так, чтобы более широкие концы конических отверстий были обращены наружу, а отверстия не опирались на лунки. Защитить ботаТонер плотно, чтобы он не скользил и не отпускал краситель.
- Переверните камеру и несколько раз постучите по столу, чтобы пыль провалилась сквозь сетку, чтобы опираться на нижнюю пластину.
- Сдвиньте верхнюю пластину камеры в «открытое положение», чтобы маленькие отверстия совпали с пятнадцатью лунками, позволяя вводить мух в отдельные лунки.
2. Взлетно-пылеулавливание и уборка
- Загрузите одну муху в аспиратор, аккуратно сосать через один конец аспиратора, как будто используя соломинку. Вкладывайте мух, слегка вдувая и направляя отверстие к цели.
- Аспирируйте одну муху в каждую лунку, используемую для эксперимента. После загрузки колодца сдвиньте верхнюю пластину так, чтобы муха была заперта в камере и помещала ленту поверх отверстия этой скважины во время загрузки всей камеры, чтобы предотвратить вылет мухи при загрузке других колодцев. Если несколько мух аспирируют в синглХорошо, оставьте это открытие открытым, пока не останется только одна муха.
- После того, как все необходимые колодцы заполнены мухами, переверните камеру так, чтобы нижняя пластина была направлена вверх, чтобы пыль могла покрыть мух, пробираясь сквозь сетку.
- Плотно закрепите верхнюю и нижнюю пластины, затянув винты, и встряхните камеру, чтобы пыль мух в течение 4 с.
- Стучите камеру (верхнюю пластину лицевой стороной вниз) к столу дважды, чтобы краска попала на другую сторону. Затем переверните камеру (верхнюю пластину лицевой стороной вверх) и дважды постучите в камеру, чтобы гарантировать, что краситель оседает на дне нижней камеры от мухи, удерживаемой в верхней камере.
- Для контрольных мух, которые не допускаются к жениху, немедленно перейдите к шагу 3 протокола. Для мух, которые завершат анализ, перейдите к шагу 2.7.
- Оставьте камеру на столе или столешнице с верхней плитой вверх в течение тридцати минут, чтобы мухи могли жениться. Поместите чашкуEr в пространстве без шума и вибрации, чтобы поддерживать постоянную обстановку для всех экспериментов по укладке (уровни освещенности, влажность и температура). Идеальным является настольный инкубатор при RT или 25 ° C с контролем влажности.
3. Подготовка образцов и анализ абсорбции
- Удерживая уровень камеры с верхней плитой вверх, аккуратно отвинтите нижнюю пластину и выньте ее из камеры, следя за тем, чтобы не потерять краситель.
- Поместите камеру на подушку Fly CO 2 с небольшим воздушным потоком, пока мухи не будут обезболиваться.
- Отвинтите верхнюю пластину из камеры. Тщательно используйте щипцы, чтобы схватить ногу и перенести одну пыльную муху из каждой камеры и поместить ее в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку, содержащую EtOH. Время передачи для 15 камер, каждая из которых содержит одну муху, составляет приблизительно 3-5 мин. Экспериментаторы должны учитывать время передачи, если / при ошеломляющих экспериментах с несколькими камерами для обеспечения эффективной постановки экспериментов. Как только каждая микроцентрифужная пробирка содержит 1 муху, закройте колпачок и три раза переверните трубку, чтобы перемешивать и смешивать раствор красителя и этанола.
- Инкубируйте трубки, содержащие этанол, и мух в течение 5 часов при комнатной температуре, чтобы обеспечить полное удаление красителя с мухи в раствор. Через 5 часов кратковременно встряхните каждую пробирку (2 с), чтобы обеспечить очистку красителя от мух.
- Аликвоту 50 мкл экспериментальной трубки 1,5 мл в лунку 96-луночного планшета, если таковая имеется, с учетом расположения каждого образца на пластине. Добавить 200 мкл EtOH для разбавления образца 5х. Разбавление предотвращает потолочные эффекты сильно напыленных мух или большие дефекты ухаживания.
- Используйте планшет-ридер для анализа каждого образца при 397 нм. В качестве альтернативы измерьте поглощение для отдельных образцов и заготовок на стандартном спектрофотометре в видимом спектре, если планшетный читатель недоступен.
- Прочитайте и запишите образец через считывающее устройство для планшетов и сохраните таблицу с записьюD образцов на пластине.
4. Количественная оценка результатов
- Скомпилируйте результаты для всех образцов и измерьте дисперсию для каждого генотипа или состояния.
ПРИМЕЧАНИЕ. Накопление красителя в момент времени 0 мин и время 30 мин рассматриваются как отдельные условия с использованием статистического анализа с односторонней коррекцией ANOVA и Bonferroni или другими исправлениями для множественных параллельных сравнений. - Рассчитайте процентную разницу для каждого генотипа / условия, используя следующее уравнение: [(среднее значение накопления красителя в момент времени 0 '- среднее значение накопления красителя в момент времени 30') / среднее значение накопления красителя в момент времени 0] x 100.
- Выразите процентное соотношение для каждого генотипа и состояния на графиках и сравните по генотипам и условиям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ холинга дает количественные данные для оценки характеристик поведения, основанные на относительном остатке накопленной краски, оставшейся на телах мух после установленного времени измерения для ухода (30 мин). Образцы изображений конструкции камеры скольжения и основные этапы анализа показаны на рисунке 1 . Мухи объединяют значительное количество красителя от непосредственного напыления путем встряхивания в присутствии красителя ( рис. 2d, 2е ). Пыльные мухи могут удерживать диапазон послеаварийного накопления красителя ( рис. 2f, 2g ). Поэтому солюбилизирующее накопление красителя в EtOH и измерение поглощения отдельных образцов обеспечивает воспроизводимую и высоко количественную оценку способности ухаживать.
В этом исследовании DopR в регуляции ухода за задним лезвием мы сравнили эффективность ухода сильного гипоморфа (
Чтобы исследовать различия,Мы были непосредственно оценены накопление красителя на отделимых частях тела во время ухода ( рисунок 4 ). Рассекая головы, крылья или «тело» (живот / грудную клетку / ноги) отдельных мух после анализа, мы смогли достоверно количественно определить различия и сходства между генотипами. Полученные данные подтверждают интерпретацию того, что не было различий в программах для ухода за передними, поскольку никаких существенных различий не наблюдалось для руководителей WT Vs. DopR-мутанты. Тем не менее, существенные различия наблюдались как для измерения крыла, так и для тела между генотипами. Этот дополнительный метод для проведения первичного анализа на части тела вместо целых мух позволяет простейшему методу изначально отличать программы foreleg против hindleg grooming. Эти результаты были дополнительно расширены и поддерживались тщательными поведенческими наблюдениями и видеозаписью или отслеживанием отдельных компонентов передней ноги или hIndleg поведения. Все результаты, приведенные на рисунках 2-4 , воспроизводятся с разрешения генов, мозга и поведения 15 .
Рисунок 1: Рабочий процесс анализа дрозофилы. Эта упрощенная блок-схема описывает основные этапы в протоколе укладки, выделяя некоторые необходимые материалы и оборудование. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Количественная оценка суммирования на основе красителя. (А) Уход за камерой. Индивидуальные мухи и блестящий желтый краситель помещаются в отдельные лунки (1 муха: 1 колодец). Габаритные размерыИ чертежи для производства в дополнительных данных. ( B, d, f ) WT взрослый самца Drosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 взрослый самца Drosophila. ( B, c ) Мухи перед напылением. ( D, e ) Мухи сразу после напыления во вращающейся камерой перед укладкой (время: 0 мин). ( F, g ) Мухи после ухода (время: 30 мин). Шкала шкалы = 400 мкм. Перепечатано с разрешения генов, мозга и поведения 15 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Допамин-рецептор ( DopR / dDA1 / тупой ) необходим для модуляции поведения при уходе. (A , c, e ) GroominГ дикого типа (синий) и мутантных мух (красный / оранжевый), измеренный через 0 мин или 30 мин после запыления. SEM измеряется для каждого генотипа и состояния. ( A, b ) n = 43 мух на генотип и состояние. (А) БТ и DoPr f02676 летит как экспозиционную груминг поведение (+ / + 30' по сравнению с + / + 0' = р <0,0001 значение, DoPr f02676 30' по сравнению с DoPr f02676 0' = р значение <0,0001). DopR мухи не могут жениться, а также животные WT ( DopR f02676 30 'по сравнению с + / + 30' = p значение <0,001). Острая пыль каждого генотипа при 0 'приводит к эквивалентному накоплению пыли (ns = незначительная). ( B, d, f ). Для каждого генотипа рассчитывается процентная разница в процентах (концентрация красителя при 0 '- примеси красителя при концентрации 30' / краситель. 0 'x 100), что обеспечивает относительное значение для сравнения поведения ухода. ( C ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
Рисунок 4: Функция рецептора допамина потенцирует удержание конечности. (А) Уход отдельных областей WT (синий) и DoPr f02676 / DoPr f02676 (красного цвета) , измеренной при температуре 30 мин после напыления и последующей диссекции. P для обрезки крыла = 0,0204. P для тела = 0,0302. N = 33-35 летит для всех условий. SEM измеряется для каждого генотипа и состояния. Статистический анализ методом одностороннего анализа ANOVA и Bonferonni Correction. Перепечатано с разрешения генов, мозга и поведения 15 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок: альтернативный метод визуального количественного определения поведения при уходе с использованием программного обеспечения NIH Image J Pixel Intensity. ( A ) Визуализация wilDtype Drosophila в области рассечения. Овал определяет дорзальный живот как область анализа для интенсивности пикселей. ( B ) Визуализация дорзального живота после напыления флуоресцентным пигментом Ultra Green V10. Стандартный фильтр для зеленой флуоресценции захватывает сине-зеленый пигмент. ( C ) WT животное после покрытия пигментом UGV10 (pregrooming). ( E ) WT после покрытия пигментом UGV10 (постсъемка). ( D ) DopRf02676 гомозиготный мутант после покрытия пигментом UGV10 (pregrooming). ( F ) DopRf02676 гомозиготный мутант после покрытия пигментом UGV10 (после укладки). ( G ) Количественная оценка интенсивности пикселей для всех условий. N = 15 мух для каждого генотипа или состояния. Статистический анализ методом одностороннего анализа ANOVA и Bonferonni. Ns = незначительная разница. *** представляет ap <0,001. PlЛегко нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ холинга относительно прост, но мы будем предупреждать экспериментаторов, чтобы обратить особое внимание на следующие проблемы. Поддержание плотного уплотнения затягиванием винтов на верхней и нижней пластинах после введения мух и красителей имеет важное значение для воспроизводимых результатов. Блестящий желтый краситель очень тонкий, а свободные суставы позволят потерять краситель с краев камеры. Неравномерность содержания красителя для каждой скважины может легко сбросить количественную оценку, поскольку неравномерное напыление увеличит дисперсию и ложноположительные показатели для событий ухаживания. Кроме того, мы рекомендуем экспериментаторам знать об окружающей среде, в которой они предпочитают удерживать камеру для ухода за 30-минутным периодом ухода. Постоянное постоянство температуры для температуры, освещения, времени суток и влажности является необходимым условием для стабильной работы при анализе поведения Drosophila . Удерживая камеры для ухода за маленьким инкубатором, чтобы свести к минимуму отвлечениеR переменные лабораторные среды идеально подходят для максимальной воспроизводимости результатов, но другие пространственные механизмы также могут быть успешными.
Что касается измерений накопления красителей, мы заметили, что краситель проницаем для латексных перчаток, поэтому нитриловые перчатки предпочтительны для обработки и взвешивания пыли. Соблюдайте осторожность, чтобы не повредить пыль широко на лабораторных поверхностях, так как она легко окрасит одежду и потенциально загрязнит поверхности или оборудование. Изолирование одной области и одной площадки для полетов / CO 2 для экспериментов предпочтительнее содержать воздействие краски. Мы также рекомендуем экспериментаторам использовать ультрафиолетовые прозрачные 96-луночные планшеты. Пик поглощения абсорбции 397 нм для бриллиантового желтого красителя близок к УФ-спектру, а стандартные 96-луночные планшеты могут давать слабые или неточные меры для разведения красителей. Краситель также растворим в воде в качестве альтернативы EtOH. Тем не менее, Drosophila не легко оседают в воде без значительных завихрений и небольших пузырьков воздуха aloТело окрашенных животных демонстрирует более низкую консистенцию и растворимость красителя. Этанол показывает стабильно лучшие результаты и более низкую дисперсию в прямых сравнениях.
Наш анализ может быть легко модифицирован для дополнительных методов и более совершенных исследований, таких как рассечение пост-анализа тела мухи ( рис. 4 ). Такие добавки могут потребоваться для понимания того, на какие ступени ухода влияют, поскольку накопление красителя лишь в широком смысле указывает на поведенческие сдвиги без прямого решения фундаментальной биологической или нервной причины. Как только различия наблюдаются, параллельные эксперименты, использующие видеозапись или методы прямого наблюдения, необходимы для понимания корня поведения из любых различий в эффективности ухода. Это может быть дополнительно исследовано путем визуального количественного определения накопления пылевых частиц на конкретных частях тела с использованием мер интенсивности пикселя через программную программу NIH ImageJ, а также прямой контроль передних и задних конечностейС помощью оценки видеоматериалов. Что касается альтернативных методов визуального количественного определения флуоресцентной пыли, ранние эксперименты в лаборатории использовали флуоресцентный пигмент краски, полученный из щелочноземельного силикатно-алюминатного оксида алюминия Европиума. После напыления мух флуоресцентным пигментом краски и обезболивания или обезглавливания животных после ухода, тела могут быть записаны и проанализированы с помощью цифровой микроскопии с использованием стандартного флуоресцентного фильтра для GFP в области рассечения ( дополнительные данные ). Хотя этот метод позволяет точно определить интенсивность пикселей, что соответствует результатам, наблюдаемым с использованием блестящего желтого красителя, мы обнаружили, что пропускная способность этого метода относительно медленная, а частицы пигмента немного отличаются по размеру и менее однородны, чем покрытие, наблюдаемое для Brilliant Желтая краска. Однако для некоторых экспериментальных приложений этот альтернативный метод является подходящим, и существует значительное разнообразие в доступном флюореКоторые могут быть полезны для применений дрозофилы и недрософилы или итерационных экспериментов по пылеобразованию, где важно количественное определение отдельных событий. Следует отметить, что сам пигмент краски является водорастворимым, но быстро теряет свою флуоресценцию в воде, сильно затрудняя использование этого пигмента для стандартных мер абсорбции.
Эти методы, предназначенные для конкретных событий передних или задних конечностей, необходимы для понимания точной природы фенотипа и могут выявить потенциальные нейронные цепи или локомоторные программы для дальнейшего изучения. Кроме того, для экспериментов с параллельным контролем важно исключить потенциальные неспецифические поведенческие причины, по которым может повлиять уход. Если животные проявляют широкий моторный дефицит или аномалии, возможно, что дефицит ухаживания является вторичным по отношению к широким локомоторным фенотипам. Простое видео-отслеживание животных WT против мутанта или цираУсловия, управляемые киллетом, могут легко различать большие сдвиги в скорости или пройденном пройденном расстоянии, независимо от дефицита ухода.
Анализ grooming - это универсальный метод, подходящий как для небольших, так и для крупномасштабных исследований этой сложной многошаговой локомоторной программы; Конструкции легко модифицируются, чтобы увеличить размер камеры или номер 15 . Метод дает надежные количественные данные, которые идеально подходят для сравнительной оценки способности мух. Производство камер экономично и может быть выполнено с использованием множества различных машин (3D-принтеров, лазерных резцов, мельниц с ЧПУ) в зависимости от имеющихся ресурсов. Этот метод позволяет осуществлять промежуточную пропускную способность отдельных образцов, которые могут быть легко расширены для генетических экранов и исследований функциональных схем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы хотим поблагодарить Брайана Шепарда, Тата Удомриттируджа, Аарона Вилли, Руби Фрума, Элиз Питмон и Роуз Хедрин за раннюю работу по тестированию и установлению этой методологии и камерных проектов. Мы благодарим Келли Теллеса и Грэма Бьюкена за чтение и редактирование рукописи. Мы благодарим Эндрю Семса и Джули Симпсон за их новаторскую работу и их советы и поддержку, предлагая использовать Brilliant Yellow Dye (Sigma). Эта работа частично поддерживается благотворительным фондом хирургических и медицинских исследований и образования Мэри Э. Грофф, Научным центром Бронфмана и Программой стипендиатов Хелмана.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
