Summary
Detta protokoll beskriver en skalbar individuell grooming assay teknik i Drosophila som ger robusta, kvantitativa data för att mäta grooming beteende. Metoden är baserad på att jämföra skillnaden i färgämnesackumulering på kropparna hos icke-preparerade mot preparerade djur under en viss tidsperiod.
Abstract
Drosophila grooming beteende är ett komplext flerstegs lokomotoriskt program som kräver samordnad rörelse av både fötter och bakben. Här presenterar vi ett grooming-analysprotokoll och en ny kammardesign som är kostnadseffektiv och skalbar för små eller stora studier av Drosophila grooming. Fluor dammas över hela kroppen med Brilliant Yellow färgämne och ges tid för att avlägsna färgämnet från sina kroppar i kammaren. Fluor deponeras därefter i en bestämd volym etanol för att solubilisera färgen. Den relativa spektralabsorbansen av färgämne-etanolprover för preparerade versus ungromerade djur mäts och registreras. Protokollet ger kvantitativa data om färgämnesackumulering för enskilda flugor, vilket lätt kan medelvärdes och jämföras över prov. Detta gör att experimentella mönster lätt kan utvärdera grooming förmåga för mutant djurstudier eller kretsmanipulationer. Denna effektiva procedur är både mångsidig och skalbar. Vi visar wOrkflöde av protokollet och jämförande data mellan WT-djur och mutanta djur för Drosophila- typ I-dopaminreceptorn ( DopR ).
Introduction
Grooming i Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) är ett robust medfödd beteende som innebär samordning av flera oberoende motorprogram 1 . Fruktflugor rengör sina kroppar av damm, mikrober och andra patogener som kan hämma normal fysiologisk funktion som syn och flygning, eller leda till betydande immunförsvar. Genom att känna och reagera på både mekanisk 2 och immunaktivering 3 , flyger flugor repetitivt sina ben ihop eller på en målinriktad kroppsregion tills den är tillräckligt ren och grooming fortskrider till en annan del av kroppen. Fluor utför groomrörelser i olika sträckor som i stor utsträckning förekommer i stereotypa mönster 1 , 4 . En beteendemässig hierarki blir uppenbar som groomsignaler prioriteras. Kretskort och aktivitetsmönster har identifierats i support oFa modell som grooming program högst upp i hierarkin förekommer först och undertrycka parallella signaler från områden av kroppen som prepareras därefter 5 . Högsta prioritet ges huvudet, sedan buken, vingarna och slutligen bröstkorgen 5 .
Vårdprogrammet i D. melanogaster är ett idealiskt system för studier av neurala kretsar, modulatoriska molekylsignaler och neurotransmittorer. Till exempel, kompromiss av neurofibrominfunktion 6 , förlust av Drosophila fragile X mental retardationsprotein ( dfmr1 ) 7 och exponering för bisfenol A (BPA) 8 orsakar allvarligt grooming och andra beteenden som är analoga mot diskreta mänskliga symptom på neurofibromatos, ömtåliga X Syndrom och aspekter av autismspektrumstörningar och respekterande underskotts hyperaktivitetsstörning (ADHD). Grooming beteende kan också vara habituaTed differentiellt över mutantstammar 2 , utlåning detta motorprogram till studier av beteendets plasticitet. Bredden av neurologiska fenomen som kan modelleras av Drosophila kräver ett nytt komparativt tillvägagångssätt för att mäta flygens förmåga att gifta sig själva.
Den kombinerade verkan av vesikulära monoamintransportörer och den relativa överflödigheten av dopamin och andra biogena aminer i kroppen har visat sig förmedla fruktflödesbekämpning 9 , 10 . Octopamin och dopamin stimulerar jämförbar hindleg grooming aktivitet i decapitated flugor, medan tyramin, föregångaren av oktopamin, också utlöser grooming i mindre utsträckning 7 . Fyra dopaminreceptorer har identifierats i D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 DopR, dDA1, dum ) i hindleg grooming behavior 15 .
Grooming kan indirekt kvantifieras genom att titta på renhetsgraden genom vilken ett djur helt kan grooms efter att ha dammat hela kroppen med en markörfärg eller fluorescerande damm 5 , 16 . Återstoden av damm kvar på kroppen kan användas som en relativ markör för det övergripande beteendet. Dusty flyger efter att ha fått tillräckligt med tid för att brudgummen kan uppvisa ett specifikt underskott i grooming beteende. När grooming undersökningar har blivit mer omfattande har protokoll införlivat sådana metoder som avkapning för att lägga till farmakologiska behandlingar på nacke nerver 10 , taktil stimulering av borstburkar för att framkalla grooming respons 2 ,Och videoinspelning av beteende 15 . Direkt observation av grooming kan enkelt studeras med hjälp av visuell observation och manuell registrering av frekvens och varaktighet för specifika grooming-händelser 4 .
Vi konstruerade en femton brunnskammare som kan byggas med en 3D-skrivare eller laserskärare, och ritningarna är tillgängliga för reproduktion 15 . Konstruktionen använder två sammanfogade centralplattor med öppningar som matchas och separeras av nät och två ytterligare glidande topp- och bottenplattor, från vilka flugor och / eller färgämnen är laddade. Efter att ha tillåtit dammiga flugor tid att gifta sig, deponerar vi dem i etanol för att solubilisera färgen och mäta absorptionen av denna lösning vid färgens våglängd. En plattläsare kan användas för flera parallella prover eller en enlässpektrofotometer kan användas för individuella prover. Denna metod minimerar felet som induceras av hantering och alLows för grooming analyser ska köras på en mindre, kostnadseffektiv skala. Denna metod är härledd och modifierad från de metoder som pioneered av Julie Simpson och Andrew Seeds, som använder större hushållskammare med värmeelement för temperaturkänsliga kretsmanipulationer 5 . Följande protokoll visar kvantifieringen av grooming av hela kroppen såväl som visar alternativa metoder för kvantifiering av färgämnesackumulering på enskilda kroppsdelar. Vi presenterar också data för jämförelsegrad mellan WT och DopR- mutanter, samt metoder för att beräkna ett enkelt prestationsindex för grooming beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning
- Förbered en aspirator för att flytta levande Drosophila från en kulturflaska till vårdkammaren. Aspiratorer möjliggör överföring av medvetna djur till beteendeskammarna för att säkerställa att anestesi inte påverkar efterföljande beteendeobservation.
- Använda saxar skära 1,5 fot tygon tub ID ⅛ ", OD ¼". Ta minst 1 tum av spetsen av en 1 ml engångs mikropipettspets. Håll ett 1 cm kvadratmaskintycke (öppnande 0,196 tum) över skuren spets.
OBS! De flesta 1mL-tipsen har en graderingslinje där spetsen sitter i förpackningslådan, som vanligen skärs till den linjen. - Lägg noggrant en ny 1 ml mikropipettips över mask / skärspetsen. Observera nätformen en tät barriär mellan de två spetsarna. Insidan av det nya spetsen skapar en hållkammare för flugor.
- Skär den extrema spetsen av den nya mikropipettspetsen för att bredda öppningen nog för att tillåta passage av en enda flygning. The holE kommer ungefär att matcha öppningen av vårdkammaren (ca 1,5-2 mm i diameter).
- Passa noggrant på de nestade spetsarna på änden av tygongröret. Skjut spetsarna i röret för att säkerställa en tätt passform för att möjliggöra vakuumtryck.
- I den andra änden av slangen skärs spetsen av en 200 μl mikropipettspets och passar det smala snittet i röret. Detta är "munnen" sidan av aspiratorn.
- Använda saxar skära 1,5 fot tygon tub ID ⅛ ", OD ¼". Ta minst 1 tum av spetsen av en 1 ml engångs mikropipettspets. Håll ett 1 cm kvadratmaskintycke (öppnande 0,196 tum) över skuren spets.
- Förbered damm alikvot rör. Väg ca 5 mg Briljantgult färgämne på tappat vägningspapper. Häll dammet i ett 0,6 ml mikrocentrifugrör och tätt stäng locket.
OBS! Vi rekommenderar användning av nitrilhandskar under alikvotberedning, eftersom vissa latexhandskar är permeabla för färgämnet. - Upprepa steg 1.2) för alla prov i experimentet (en för varje flygning i varje kammare).
- Förbered etanol (EtOH) rör: Pipett 1 ml 100% EtOH i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Etikettrör för genotyper eller förhållanden. </ Li>
- Upprepa steg 1.4) för alla prov i experimentet (en för varje flygning i varje kammare). Cap och spara EtOH-rören för att slutföra grooming-analysen. Inkludera också minst ett "Blank" prov som endast kommer att vara 1 mL EtOH utan en fluga för negativa kontroller.
- Montera varje grooming kammare genom att skruva upp den glidande topplattan (med de mindre hålen) men lämna bottenplattan (med de större hålen) bort för att lägga till damm.
- Placera varje nödvändig grooming kammare platt på ett bord med övre ytan nedåt. Flygtangenten är fram och ner.
- Ladda 5 mg Brilliant Yellow färgämnesalikvot i varje kammare genom att tappa röret mot kammarens yta ovanför den önskade brunnen. Tryck kammaren mot bordet för att säkerställa att allt damm faller genom nätet till topplattan.
- Skruva bottenplattan på varje kammare så att de bredare ändarna av de koniska öppningarna vetter utåt och hålen inte vilar över brunnarna. Säkra botenTom plattan tätt så att den inte glider och släpper ut färg.
- Vänd kammaren över och slå den platt mot ett bord några gånger så att dammet faller genom nätet för att vila på bottenplattan.
- Skjut kammarens övre platta i "öppet läge" så att de små hålen stämmer med de femton brunnarna, vilket möjliggör införande av flugor i enskilda brunnar.
2. Fly-dusting och Grooming
- Ladda en fluga i munsuggen genom att försiktigt suga genom ena änden av aspiratorn som om du använder ett strå. Sätta in flugorna genom att blåsa lätt och rikta öppningen mot målet.
- Aspirera en fluga i varje brunn som används för experimentet. Efter att du har lagt i en brunn släpper du den övre plattan så att flygningen fångas i kammaren och lägger tejp över öppningen av den brunnen under laddning av hela kammaren för att förhindra att flygningen flyr medan andra brunnar laddas. Om flera flugor sugs in i en singelEja, lämna den öppningen upptäckta tills endast en fluga kvarstår.
- När alla nödvändiga brunnar är fyllda med flugor, vänd kammaren så att bottenplattan är uppåt så att dammet har potential att belägga flugorna genom att falla genom nätet.
- Skruva fast de övre och nedre plattorna genom att dra åt skruvarna och vrida kammaren för att damma flugorna i 4 s.
- Knacka kammaren (övre plattan nedåt) mot ett bord två gånger så att färgämnet faller igenom till andra sidan. Vänd sedan kammaren över (toppplatta uppifrån) och slå kammaren två gånger för att säkerställa att färgämnen sätter sig på bottenkammarens golv bort från flygplanet som hålls i överkammaren.
- För kontrollflugor som inte får gifta sig, fortsätt genast till steg 3 i protokollet. För flygningar som kommer att slutföra analysen, fortsätt till steg 2.7.
- Håll kammaren platt på ett bord eller bänkskivan med topplattan uppåt i trettio minuter för att låta flugorna bruka sig. Placera kammenFinns i ett ljud och vibrationsfritt utrymme för att hålla din miljö konstant för alla grooming-experiment (belysningsnivåer, fuktighet och temperatur). En bordplattorinkubator vid RT eller 25 ° C med fuktighetsreglering är idealisk.
3. Framställning av prov och absorptionsanalys
- Håll kammarnivån med topplattan uppåt, skruva försiktigt bottenplattan och ta bort den från kammaren, var försiktig så att du inte förlorar färgämnen.
- Placera kammaren på en Fly CO 2- kudde med låg luftflöde tills flugorna är bedövade.
- Lossa toppplattan från kammaren. Använd försiktigt tångar för att ta ett ben och flytta en dammad fluga från varje kammare och sätt in den i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande EtOH. Överföringstiden för 15 kamrar vardera innehållande en fluga är ungefär 3-5 min. Experimentärer bör vara faktorer vid överföringstider om / vid förvirrande experiment med flera kamrar för att säkerställa effektiv experimentation. När varje mikrocentrifugrör innehåller 1 fluga, stäng locket och vänd röret tre gånger för att agitera och blanda lösningen av färgämne och etanol.
- Inkubera rör innehållande etanol och flyger i 5 timmar vid RT för att säkerställa fullständig avlägsnande av färgämnet från flygningen till lösning. Efter 5 h, vortexa varje rör (2 s) kort för att säkerställa att färgämnet avlägsnas från flugorna.
- Alikvot 50 μl av experimentellt 1,5 ml rör i en brunn i en 96-brunnsplatta om det är tillgängligt, varvid man noterar platsen för varje prov på plattan. Tillsätt 200 μl EtOH för att späda provet 5x. Utspädningen undviker takeffekter av kraftigt dammade flugor eller stora grooming defekter.
- Använd en plåtläsare för att analysera varje prov vid 397 nm. Alternativt mäta absorbansen för enskilda prov och ämnen på en standard spektrofotometer i det synliga spektret om en plattläsare inte är tillgänglig.
- Läs och spela in provet genom plåtläsaren och spara kalkylbladet med rekordetD prov på plattan.
4. Kvantificering av resultat
- Kompilera resultat för alla prover och mät variationen för varje genotyp eller tillstånd.
OBS: Färg ackumulering vid tidpunkten 0 min och vid tiden 30 min betraktas som separata förhållanden med statistisk analys genom envägs ANOVA- och Bonferroni-korrigering eller andra korrigeringar för flera parallella jämförelser. - Beräkna groomprocentdifferens för varje genotyp / tillstånd med följande ekvation: [(medelvärde för ackumulering av färgämne vid tidpunkten 0 '- ackumuleringsmedelvärde vid tidpunkt 30') / medelvärde för ackumulering av färgämne vid tidpunkten 0] x 100.
- Uttryck procentsatsen för varje genotyp och tillstånd i stapeldelar och jämföra mellan genotyper och förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grooming-analysen ger kvantitativ data för att bedöma beteendets prestanda baserat på den relativa återstoden av ackumulerat färgämne kvar på kroppens flugor efter en bestämd tid för mätning för grooming (30 min). Provbilder av den glidande beklädnadskammarutformningen och större steg i analysen framhävs i Figur 1 . Flyger aggregat en signifikant mängd färgämne från omedelbar dammning genom virvelbildning i närvaro av färgämne ( Figur 2d, 2e ). Dammade flugor kan behålla ett område av färgämnesackumulering efter analys ( Figur 2f, 2g ). Därför ger solubiliserande färgämnesackumulering i EtOH och mät absorbansen hos individuella prover en reproducerbar och högt kvantitativ bedömning av groomningsförmåga.
I den här studien av DopR för reglering av hindleg grooming jämförde vi groomföreställningen hos en stark hypomorf (
Att undersöka skillnaderna ärMellan vårdförmåga hos föregångare jämfört med hindleg grooming-program, bedömde vi direkt ackumulering av färgämnen på separerbara kroppsdelar under grooming ( Figur 4 ). Genom att dissekera huvud, vingar eller "kropp" (buken / thorax / benen) hos enskilda flygningar efter analysen kunde vi på ett tillförlitligt sätt kvantifiera skillnader och likheter mellan genotyper. Resultaten stödde en tolkning att inga skillnader var närvarande för förskolningsprogram, eftersom inga signifikanta skillnader observerades för cheferna för WT Vs. DopR-mutanter. Emellertid observerades signifikanta skillnader för både vinge och kroppsmätningar mellan genotyper. Denna kompletterande teknik för att utföra den primära analysen på kroppsdelar istället för hela flugor möjliggör en enkel metod för att initialt skilja mellan föregångare och hindleg grooming-program. Dessa resultat utvidgades ytterligare och stöddes av noggranna beteendeobservationer och videoinspelning eller spårning av enskilda komponenter i förbenet eller hIndleg beteenden. Alla resultat från figurerna 2-4 reproduceras med tillstånd från gener, hjärna och beteende 15 .
Figur 1: Drosophila Grooming Assay Workflow. Detta förenklade flödesschema beskriver de viktigaste stegen i groomningsprotokollet och markerar några av de nödvändiga materialen och utrustningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kvantifiering av preparat baserat på färgämne. (A) Vård kammaren. Individuella flugor och Briljantgult färgämne placeras i enskilda brunnar (1 fluga: 1 brunn). MåttOch ritningar för produktion i kompletterande data. ( B, d, f ) WT vuxen manlig Drosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 vuxen manlig Drosophila. ( B, c ) Flyger före dammning. ( D, e ) Flyger omedelbart efter dammning genom virvelkammaren före grooming (tid: 0 min). ( F, g ) Flyger efter grooming (tid: 30 min). Skala bar = 400 μm. Reprinted med tillstånd från gener, hjärna och beteende 15 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Dopaminreceptor ( DopR / dDA1 / dum ) krävs för modulering av hygienbeteende. (A , c, e ) GroominG vildtyp (blå) och mutantflugor (röd / orange) uppmätta vid 0 min eller 30 min efter dammning. SEM mäts för varje genotyp och tillstånd. ( A, b ) n = 43 flugor per genotyp och tillstånd. (A) WT och DopR f02676 flugor både uppvisar grooming beteende (+ / + 30' jämfört med + / + 0' = p-värde <0,0001, DopR f02676 30' jämfört med DopR f02676 0' = p-värde <0,0001). DopR- flugor misslyckas med brudgummen såväl som WT-djur ( DopR f02676 30 'jämfört med + / + 30' = p-värde <0,001). Akut dammning av varje genotyp vid 0 'resulterar i motsvarande ackumulering av damm (ns = ej signifikant). ( B, d, f ) Grooming procentskillnad beräknas för varje genotyp (färgämne vid 0'-färgämne ackum. Vid 30 '/ färgämne ackum. 0' x 100) som ger ett relativvärde för jämförelse av groomningsbeteenden. ( C ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
Figur 4: Dopaminreceptorfunktion Potentierar Hindleg Grooming. (A) Klippning av enskilda regioner av WT (blå) och DopR f02676 / DopR f02676 (röd) uppmätt vid 30 min efter damning och efterföljande dissekering. P-värdet för vingehuggning = 0,0204. P-värde för kropp = 0,0302. N = 33-35 flugor för alla förhållanden. SEM mäts för varje genotyp och tillstånd. Statistisk analys på ett sätt ANOVA och Bonferonni Correction. Reprinted med tillstånd från gener, hjärna och beteende 15 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Supplerande figur: Alternativ metod för visuell kvantifiering av hygienbeteende med hjälp av NIH Image J Pixel Intensity Software. ( A ) Visualisering av wilDyp Drosophila under dissekering av räckvidd. Oval definierar dorsal buken som analysområdet för pixelintensitet. ( B ) Visualisering av dorsal buken efter dammning med Ultra Green V10 fluorescerande färgpigment. Standardfilter för grön fluorescens fångar det blågröna pigmentet. ( C ) WT-djur efter beläggning med UGV10-pigment (pregrooming). ( E ) WT-djur efter beläggning med UGV10-pigment (postgrooming). ( D ) DopRf02676 homozygot mutant efter beläggning med UGV10 pigment (pregrooming). ( F ) DopRf02676 homozygot mutant efter beläggning med UGV10 pigment (post-grooming). ( G ) Kvantificering av pixelintensitet för alla förhållanden. N = 15 flyger för varje genotyp eller tillstånd. Statistiska analyser med One Way ANOVA och Bonferonni Correction. Ns = obetydlig skillnad. *** representerar ap <0,001. PlEnkelt klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grooming-analysen är relativt okomplicerad, men vi skulle försiktighetsexperimentärer att ägna särskild uppmärksamhet åt följande frågor. Underhåll av en tät försegling genom att dra åt skruvarna på topp- och bottenplattorna efter införandet av flugor och färgämnen är avgörande för reproducerbara resultat. Briljantgult färgämne är mycket bra och lösa leder leder till förluster av färgämne från kammarens kanter. Oregelbundenheten i färgämnesinnehållet för varje brunn kan enkelt slänga av grooming-kvantifiering, eftersom ojämn dammning ökar variansen och falskt positiva hastigheter för grooming-händelser. Dessutom uppmuntrar vi experter att vara medvetna om miljön där de väljer att hålla vårdkammaren under 30 min grooming period. Miljöbeständighet för temperatur, belysning, tid på dagen och fuktighet är avgörande för konsekvent prestanda för Drosophila beteendeanalyser. Håll kammare i en liten inkubator för att minimera distrahering oR-variabla laboratoriemiljöer är idealiska för maximal reproducerbarhet av resultat, men andra rumsliga arrangemang kan också bli framgångsrika.
När det gäller färgämnes ackumuleringsmätningar har vi observerat att färgämnet är permeabelt för latexhandskar, så nitrilhandskar föredras för hantering och vägning av damm. Var försiktig så att du inte sprider damm i stor utsträckning över labbytorna, eftersom det lätt kan fläcka kläder och eventuellt förorena ytor eller utrustning. Isolera ett område och ett fly-stationen / CO 2 pad för experiment är att föredra för att innehålla färgämne exponering. Vi uppmuntrar också experter att vara säkra på att använda UV-transparenta plattor med 96 brunnar. Den absorberande toppen på 397 nm för Brilliant Yellow färgämne ligger nära UV-spektret och standardplattor med 96 brunnar kan ge svaga eller felaktiga åtgärder för färgutspädningar. Färgen är också löslig i vatten som ett alternativ till EtOH. Drosophila sinkar emellertid inte lätt i vatten utan signifikant vortexing och små luftbubblor aloNg kroppen av färgade djur visar lägre konsistens och löslighet av färgämne. Etanol visar konsekvent bättre resultat och lägre variation i direkta jämförelser.
Vår analys kan lätt modifieras för kompletterande tekniker och mer raffinerade studier, såsom dissektion av flygkroppens efteranalys ( Figur 4 ). Sådana tillskott kan vara nödvändiga för att förstå vilka groomeringssteg som påverkas, eftersom färgämnesuppbyggnaden endast i stor utsträckning pekar på beteendesskift utan att direkt adressera den grundläggande biologiska eller neurala orsaken. När skillnader har observerats är parallella experiment som använder videoinspelning eller direktobservationsmetoder avgörande för att förstå beteendemotsättningen av eventuella skillnader i grooming effektivitet. Detta kan undersökas ytterligare genom visuell kvantifiering av dammpartikelackumulering på specifika kroppsdelar med hjälp av pixelintensitetsåtgärder genom NIH ImageJ-program, tillsammans med direkt spårning av förben och hindlegBeteenden genom att värdera videofilmer. Med avseende på alternativa metoder för visuell kvantifiering av fluorescerande damm användes tidiga experiment i laboratoriet med ett fluorescerande färgpigment härrörande från alkaliskt sällsynt jordmetallsilikat-aluminatoxid Europium. Efter att de flugor torkat med fluorescerande färgpigmentet och bedövar eller dekapiterar djuren efter grooming kan kropparna registreras och analyseras genom digital mikroskopi med användning av ett standard fluorescerande filter för GFP i ett dissekeringsområde ( kompletterande data ). Medan denna metod tillåter noggrann kvantifiering av pixelintensitet som paralleller med resultaten observerade med Brilliant Yellow färgämne, fann vi att genomströmningen av denna metod är relativt långsam och pigmentpartiklarna varierar något i storlek och är mindre likformiga än beläggningen observerad för Brilliant Gult färgämne. För vissa experimentella tillämpningar är denna alternativa metod lämplig, och det finns betydande variation i tillgänglig fluoRescent färger som kan vara användbara för drosophila och nondrosophila applikationer eller iterativa dusting experiment där kvantifiering av separata händelser är nödvändiga. Det bör noteras att färgpigmentet självt är vattenlösligt men förlorar snabbt sin fluorescens i vatten, vilket allvarligt inverkar på användningen av detta pigment för standardabsorbansåtgärder.
Dessa typer av metoder som riktar sig mot specifika förben- eller bakre groomhändelser är nödvändiga för att förstå en fenotyps exakta natur och kan belysa potentiella neurala kretsar eller lokomotoriska program för att undersöka vidare. För parallella kontrollförsök är det dessutom viktigt att utesluta potentiella icke-specifika beteendeförklaringar att grooming kan påverkas. Om djuren uppvisar stora motorbrister eller abnormiteter är det möjligt att grooming underskott är sekundära mot de breda lokomotoriska fenotyperna. Enkel video-spårning av WT-djur gentemot mutanten eller cirCuit manipulerade förhållanden kan enkelt diskriminera mellan stora förändringar i hastighet eller totalt avstånd som reste, oberoende av grooming underskott.
Grooming-analysen är en mångsidig metod som passar både små och stora studier av detta komplexa flerstegs lokomotorprogram. Mönstren modifieras enkelt för att öka kammardimensionen eller nummer 15 . Metoden ger robust kvantitativ data som är idealisk för jämförande bedömning av flugens grooming förmåga. Produktionen av kamrarna är kostnadseffektiv och kan göras med många olika maskiner (3D-skrivare, laserskärare, CNC-fabriker) beroende på tillgängliga resurser. Tekniken möjliggör mellanproduktion av individuella prover som enkelt kan expanderas för genetiska skärmar och funktionella krets-kartläggningsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon och Rose Hedreen för tidigt arbete vid testning och etablering av denna metodik och kammarmönster. Vi tackar Kelly Tellez och Graham Buchan för att läsa och redigera manuskriptet. Vi tackar Andrew Seeds och Julie Simpson för deras banbrytande arbete och deras råd och stöd för att föreslå användningen av Brilliant Yellow Dye (Sigma). Detta arbete stöds delvis av Mary E. Groff Kirurgisk och medicinsk forskning och utbildning Charitable Trust, Bronfman Science Center och Hellman Fellows Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
