توصيف الفيزيائية الحيوية من وظائف سوطي للسيارات

Introduction

المحركات سوطي تمكن خلايا السباحة عن طريق تناوب خيوط الخلية حلزونية. كمية من عزم الدوران المحرك يمكن أن تولد لمدة معينة من السوط (أي الحمل لزج) يحدد سرعة السباحة. من ناحية أخرى، قدرته على تبديل اتجاه دوران تسيطر هجرة الخلايا في الاستجابة للمواد الكيميائية، وهي عملية تعرف باسم الكيميائي. الكيميائي والحركة كونها عوامل الفوعة ^1-3، والمحركات سوطي تم التعرف بشكل جيد على مدى ⁴ سنوات. وتشير أدلة متزايدة الآن أن المحرك بمثابة mechanosensor - يكشف ميكانيكيا وجود ركائز متينة ^5،6. هذه القدرة على الأرجح يساعد في إحداث الاستعمار السطحية والالتهابات ^5،7. ونتيجة لذلك، فإن الآليات التي تستشعر المحرك الأسطح ويبادر إشارات ذات مغزى ^8،9.

المحرك سوطي يمكن دراستها بسهولة عن طريق الربط في flagellأم إلى الركيزة ومراقبة دوران الخلية. وقد تحقق هذا الربط لأول مرة من قبل سيلفرمان وسيمون، الذي عمل مع متحولة polyhook في كولاي والسنانير تعلق بنجاح إلى ركائز الزجاج مع أضداد هوك ^10. تمكين فحص خلايا المربوطة الباحثين لدراسة ردود المحرك التحول إلى مجموعة متنوعة من المحفزات الكيميائية. على سبيل المثال، سيغال وزملاء العمل حفز كيميائيا الخلايا المربوطة مع المعونة من الماصات iontophoretic. التغييرات المقابلة في _التحيز CW (جزء من المحركات الوقت تدور في اتجاه عقارب الساعة، CW) مكنهم من قياس حركية التكيف في شبكة الكيميائي ^11،12. في حين كان فحص الخلايا المربوطة فعال في دراسة ردود التبديل، وكان قادرا على تقديم نظرة ثاقبة ميكانيكا السيارات على نطاق محدود من الأحمال لزجة ¹³ فقط. للتغلب على هذه المشكلة، المربوطة ريو وزملاء العمل كروية، والخرز اللاتكس لخيوط بذرة على خلايا تمسك السطوح. وكانت حباتثم تتبعها باستخدام التداخل العودة التنسيق مع ضعف الفخاخ البصرية ^14. من خلال العمل مع حبات من مختلف الأحجام، يمكن للباحثين دراسة المحرك على نطاق أوسع بكثير من الأحمال. تم تحسين هذا الاختبار في وقت لاحق من قبل يوان وبيرغ، الذي طور تقنية حبة تتبع القائم على مضخم جنبا إلى جنب مع إضاءة الليزر الظلام الميدان. طريقتهم تتبع تمكين من nanobeads المربوطة الذهب التي كانت صغيرة جدا (~ 60 نانومتر) أن المقاومة لزجة الخارجية كانت أقل مقارنة مع المقاومة لزجة الداخلية للتناوب ^15،16. وأدى ذلك إلى قياسات أقصى سرعة للتحقيق في كولاي (~ 300 هرتز). في الخامس alginolyticus، المقايسات حبة مماثلة مكنت قياسات لمعدلات الغزل في الأحمال المتوسطة لزجة (~ 700 هرتز) ^17. من خلال تمكين قياس الاستجابات الحركية على مجموعة كاملة ممكن من الأحمال لزجة (من صفر-تحميل لشبه كشك)، قدمت المقايسات حبة أداة الفيزيائية الحيوية الهامة لفهم رعملية توليد ^{orque-18،19.}

في الآونة الأخيرة، فإننا تعديل فحص يوان بيرغ لتشمل ملاقط البصرية التي مكنتنا من تطبيق مؤثرات الميكانيكية الدقيقة لمحركات الفردية ^6. باستخدام هذه التقنية، أظهرنا أن مولدات القوة التي تدوير المحرك هي mechanosensors ديناميكية - أنها إعادة تشكيلها في استجابة للتغيرات في الأحمال لزجة. فمن الممكن أن هذا استشعار الحمل يؤدي إلى تمايز الخلايا البكتيريا يحتشدون، على الرغم من أن الآليات لا تزال غير واضحة. ومن المرجح أيضا أن المحركات سوطي في الأنواع الأخرى هي أيضا mechanosensitive ^20، على الرغم من الأدلة المباشرة غير موجودة. هنا، نحن نناقش النهج القائم على مضخم (PMT) لتتبع دوران من الخرز اللاتكس المربوطة إلى خيوط سوطي ^15. بالمقارنة مع تتبع مع الكاميرات فائق السرعة، ومضخم-الإعداد هو مفيد لأنه واضح ومباشر نسبيا لتعقب الخرز واحد في الوقت الحقيقي، وأكثر من الجافية طويلةستعقد. وهي مفيدة بشكل خاص عند دراسة طويلة وقت إعادة عرض في المجمعات المحرك سوطي بسبب المحفزات البيئية ^21. على الرغم من أننا بروتوكولات التفاصيل خصيصا لكولاي، ويمكن تكييفه بسهولة لدراسة المحركات سوطي في الأنواع الأخرى.

Protocol

1. خلية التحضير

1. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها من سلالة المطلوب تحمل فليك زجة أليل ^15،22 في تريبتون مرق (السل، 1٪ ببتون، و 0.5٪ كلوريد الصوديوم)، يليه التلقيح في 1: 100 التخفيف في 10 مل السل جديدة. تنمو ثقافة في 33 درجة مئوية في حاضنة شاكر حتى OD ₆₀₀ = 0.5.
2. بيليه الخلايا في 1500 x ج لمدة 5-7 دقائق وإعادة تفريق بيليه بقوة في 10 مل من فلتر تعقيم العازلة الحركة (MB و 10 ملي الفوسفات عازلة: 0،05-0،06 M كلوريد الصوديوم، و 10 ^-4 M EDTA، 1 ميكرومتر ميثيونين، 7.0 درجة الحموضة).
3. كرر الخطوة 1.2 مرتين أخريين وإعادة تفريق بيليه النهائي في 1 MB مل.
4. القص والتعليق من المارة ذهابا وإيابا ~ 75 مرات بين اثنين من المحاقن مع 21 إلى 23 محولات قياس متصلة بواسطة البولي ايثيلين أنابيب (7-12 سم، وقطره 0.58 ملم الداخلي). الحد من الوقت الكلي لتقطيع إلى 30 - 45 ق.
5. الطرد المركزي الخلايا المنفصمة في 1500 x ج لمدة 5-7 دقائق وإعادة تفريق للبيليه في 100-500 ميكرولتر من MB.

2. الانزلاق التحضير

1. إعداد غرفة التصوير التي يقحم اثنين من أشرطة لاصقة على الوجهين بين غطاء الانزلاق وشريحة المجهر. لفحوصات الكيميائي، وتوظيف أي غرفة الموائع الدقيقة التي تمكن من تبادل MB والمنشطات الكيميائية.
2. إضافة 0.01٪ بولي-L-يسين الحل في الغرفة وبعد 5 دقائق شطف بلطف الأسطح MB (80-100 ميكرولتر).
3. إضافة 40 ميكرولتر من تعليق خلية في الغرفة وإتاحة الوقت الكافي للمرفق إلى سطح الزجاج (7-8 دقيقة). تتدفق الخلايا فاشل بإضافة 100 ميكرولتر MB على جانب واحد من الغرفة، في حين فتل الحل مع ورقة مرشح من الجانب الآخر.
4. إضافة 10-15 ميكرولتر من الخرز اللاتكس في غرفة والسماح حبات الوقت الكافي لتسوية ونعلق على الخلايا (7-8 دقيقة). شطف بلطف مع 100 ميكرولتر من MB، كما هو موضح في الخطوة 2.3، لإزالة فاشل الخرز. استخدام مجموعة من حبة الاشتراكيةZES للتجارب طويلة حتى يتوفر النقيض جيدة.

3. تتبع الخرزة

1. ضع العينة على مرحلة المجهر ومسح سطح حبات تعلق على المحركات. استخدام هدفا 40X مرحلة لإبداء الملاحظات على الرغم من أن المرحلة المجهري ليست ضرورية. بدلا من ذلك، تستخدم التصوير مشرق الميدان طالما يتم الحفاظ على النقيض كافية للتمييز بوضوح حبة مشرق على خلفية داكنة.
2. مرة واحدة وقد تم اختيار حبة، نقل مرحلة أفقيا لوضع حبة في زاوية محددة مسبقا كما هو مبين في الشكل 1B. حبات موقف في نفس الزاوية لضمان أن اتجاه دوران حبة يعرف بشكل صحيح. حبة مسار المثالي هو دائري تقريبا ولكن مسارات بيضاوية هي مقبولة.
3. الحفاظ على وتيرة أخذ العينات أعلى من ضعف وتيرة دوران المحرك لتجنب الأخطاء المرتبطة التعرج. في هذا العمل، واستخدام السيارات التي كانت الدورية في50 هرتز وعينة على ترددات التي كانت أعلى 10 مرات (500 هرتز)، للحصول على إشارة على نحو سلس.

تحليل 4. البيانات

1. مركز ومقياس الفولتية الناتج PMT والإهليليجية الصحيح في مسارات مع التحولات أفيني إذا لزم الأمر ^23. استخدام تحليل قوة الطيف لتحديد معدلات دوران ^17.
2. تحديد الزوايا القطبية، θ (ر) = ATAN (ذ (ر) / س (ر)). تحديد الاختلافات في سرعات المحرك وتبديل مع مرور الوقت عن طريق حساب ω ^14.
3. توظيف مرشح متوسطي لضمان سلاسة البيانات سرعة المحرك. ينصح نافذة تصفية أكثر من التناوب الكاملة ^23،24.

Representative Results

يظهر الإعداد مضخم في الشكل 1A. ومن المهم أن هذه الفرق لديها حساسيات عالية على مجموعة من موجات متفرقة عن طريق حبات من الفائدة. هذه الفرق يعملون هنا تعمل في نطاقات المرئية والأشعة تحت الحمراء القريبة، وكانت قادرة على كشف الضوء المتناثرة التي كتبها حبات تنيره مصدر ضوء الهالوجين. فإن ظروف الإضاءة المثلى والفولتية العرض تختلف من الإعداد واحد إلى آخر. لإعداد المستخدمة في هذا العمل، وهذا مكسب PMT ~ ¹⁰ أبريل - 10 مايو ثبت كاف. وتمت تغطية كل مضخم باستثناء فتحة 3 × 1 مم وضعه أمام مضخم. الشقوق تحد من المنطقة في الخلية عينة من الضوء الذي يمكن أن يدخل صمام تضخيم ضوئي، والشقوق هما متعامدة مع بعضها البعض. عندما يتم وضع حبة الدورية في الموقع الصحيح (الشكل 1B)، وكمية الضوء التي تدخل الزيادات مضخم كما تأتي حبةفي طريقة العرض وانخفاض كما مسار دائري ليأخذ بعيدا عن الرأي. ترددات مخرجات PMT الجهد الجيبية تشير إلى سرعة دوران والخلافات المرحلة بين الإشارات اثنين تشير إلى اتجاه دوران. استخدام الذبذبات لعرض مخرجات PMT يمكن تصور مسارات حبة في الوقت الحقيقي.

وتظهر إشارات PMT زمنية متفاوتة، ص (ر) والعاشر (ر)، من محرك تمثيلي في الشكل 2A. التعامديه من الشقوق اثنين يقدم فارق الطور بين الإشارات اثنين. وتعتمد سعة إشارة على نسبة الإشارة إلى الضوضاء وكذلك الانحراف الدوران. يشار إلى مسارات المقابلة من حبة في الشكل 2B.

رسم بياني للسرعات تقاس من محرك التمثيلي في CHEY - ويرد سلالة المحذوفة في الشكل 3A 25. تم وضع حبة لأول مرة في الزاوية اليمنى السفلى، كما رأينا في التخطيطي في الشكل 1B. يظهر السرعة الزاوية المقابلة في الشكل 3B (أعلى هيئة). المواقع حبة إلى الزاوية اليسرى السفلى المجاورة أدى إلى انقلاب علامة على سرعات المحرك (اللوحة السفلية). وهكذا، والانتقال من حبة إلى الزاوية المجاورة سيغير اتجاه الملحوظ دوران المحرك. وفي هذا الصدد، عكس زوايا انحرافي متطابقة. لذا فمن الأهمية بمكان أن يعرف مكان وجود حبة خلال قياسات لتحديد ديناميات التحول بشكل صحيح. ويبين الشكل 3C التحولات المتكررة من محرك من النوع البري بين الاتجاهين الدوران.

تم تكييف رموز مخصصة لبرامج الحصول على البيانات من عمل سابق لتسجيل البيانات على جهاز كمبيوتر ^15. إخراج PMT وAC-يقترن والمنخفضة تمرير تصفيتها مع تردد قطع من 100 هرتز. تم تمكين تتبع في الوقت الحقيقي من خلال ربط مخرجات تصفيتها إلى الذبذبات.

الشكل 1: إعداد الخرزة تعقب. أ) تخطيطي لإعداد تتبع مقرها PMT. ب) وضع مثالي للحبة (المجال الأسود) نسبة إلى اثنين من الشقوق المتعامدة. يشار إلى مسار من قبل الخطوط المنقطة. الانحراف البريد هو نصف قطر الدائرة المنقطة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ove_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 ">
الشكل 2: PMT المخرجات. أ) المنخفضة تمرير تصفيتها المخرجات من صمام تضخيم ضوئي اثنين، بعد تمركز / التحجيم. ب) مسارات حبة تم الحصول عليها من بيانات PMT، عينات أكثر من 3 ق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): حبة مسارات. أ) الرسم البياني للسرعات CCW الوحيد من محرك تمثيلا. ب) بسرعة دوران المحركات CCW الوحيد تصويرها في الزاوية اليمنى السفلى (أعلى هيئة). سرعات دوران المحرك نفسه عند وضعه في الزاوية اليسرى السفلى (اللوحة السفلية). C) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

من أجل تسهيل المربوطة حبة تتبع وتقدير الصحيح من المحركات عزم الدوران، يجب مراجعة المعلومات التالية. عند إجراء هذه القياسات مع خلايا سوطي، والقص هو خطوة حاسمة. قص يقلل من خيوط سوطي إلى مجرد كعب، وبالتالي ضمان أن يكون الحمل لزج على المحرك يرجع في الغالب إلى حبة ويمكن تقديره في الخطأ 10٪ ^16. كما يحسن قص فرص العثور على مسارات دائرية مع غرابة الاطوار موزعة بإحكام (<حبة قطرها ^14). النتائج القص غير لائقة في مسارات الضال، مما يضاعف الأخطاء في تتبع وفي حساب المؤثرات السلبية لزجة، وكذلك يؤدي إلى نسب إشارة الضوضاء الفقيرة. استخدام الذبذبات يسمح التخلص السريع من هذه البيانات. حيث من المتوقع أن تختلف مع الأنواع خصائص النشاط الحيوي من خيوط سوطي، من المرجح أن تحتاج إلى أن تتكيف أساليب القص لضمان القص كاف في تيانه البكتيريا من الفائدة. وسيلة فعالة لتقليل الأخطاء المرتبطة القص هو العمل مع الخلايا التي تفتقر إلى الجينات التي تشفر البروتينات خيوط. ويمكن بعد ذلك حبات التحقيق أن يعلق مباشرة على ربط عبر أضداد هوك.

العثور على حبة الذي المربوطة بشكل مناسب يمكن أن يكون تحديا. وذلك لأن معظم حبات في مجال الرؤية إما أن يكون عالقا على أجسام الخلايا أو سطح الزجاج. هذه الخرز لا يمكن أن تتحقق بسهولة إلى التركيز الشديد. سوف تظهر حبات أخرى ليهتز أو تدوير واضح مع سعة كبيرة أو غرابة الاطوار كبيرة (> 1.5 - قطر 2X حبة). هذه عادة ما تكون المربوطة إلى سوطي خيوط التي لم يتم قصها بشكل كامل أو استدارة في الطائرة التي يميل إلى البؤري. وأخذ العينات من هذه الخرز ينتج عادة في الضجيج العالي، والاختلافات الوقت في الأحمال لزجة قد يؤدي إلى التقليل من المحركات عزم الدوران لإعطاء حبة الحجم. وهناك جزء صغير من الخرز المربوطة الخضوع عشوائيالحركة. هذه هي مجرد خضوعه لدوران البراونية. وهناك جزء من الخرز تظهر واضحة ولا يمكن أن تتحقق في التركيز بسهولة. وهذه هي الأكثر احتمالا أن تكون المحركات التي تم المربوطة بشكل مناسب وهي المحركات من الفائدة.

ومن بين القيود المفروضة على واحد السيارات تتبع مثل تلك المذكورة هنا هو عدم القدرة على إجراء التجارب الإنتاجية العالية. كاميرا عالية السرعة التي صور منطقة أكبر من الفائدة يمكن أن يكون من المفيد في هذا الصدد. وتشمل غيرها من القيود الأخطاء المرتبطة إشارات متعددة ناشئة من الخرز الدورية متباعدة بشكل وثيق في مجال الرؤية من هذه الفرق. وأخيرا، فإن الأخطاء في تحديد الموقف الصحيح من حبة المسجلة فيما يتعلق الشقوق مضخم اثنين يؤدي إلى تقدير دقيق لديناميكية التحول.

وتشمل مزايا الإعداد الموصوفة هنا القدرة على تتبع دوران الخرز على فترات طويلة وفي الوقت الحقيقي. هذاتمكن التخلص السريع من مسارات عرضة للخطأ، وهو الأمر الذي ربما يصعب تحقيقه مع الكاميرات فائق السرعة. بالإضافة إلى ذلك، مع بعض التعديلات هذا الإعداد يمكن أن تكون متكاملة مع فحوصات تهدف إلى إخضاع الخلايا لمجموعة متنوعة من المحفزات. جنبا إلى جنب مع الحرارية للتبريد ^26، وتقنية يمكن استخدامها لقياس ردود المحركات الفردية للمؤثرات الحرارية. التكامل مع ملاقط بصرية يمكن تمكين قياسات إعادة المحركات الفردية في الاستجابة للمؤثرات الميكانيكية، كما حدث مؤخرا ^6. وأخيرا، فإن التكيف من المحرك إلى المنشطات الكيميائية يمكن قياسها باستخدام لغرفة التروية المناسبة وتضخ ^11.

غالبية الأنواع البكتيرية المعروفة هي متحركة والحركة بوساطة سوطي هي السائدة في الطبيعة. ومن المتوقع أن يستمر للمساعدة في تطوير نظرة ثاقبة البنيوي إعادة عرض والتكيف س الطرق تظاهر هناو المحرك سوطي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine Solution (0.1%)	Sigma-Aldrich	P8920	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	7307	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
1 mL Luer Slip Tip Syringe	Exel Int.	26048	http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge	Becton, Dickinson and Company	427565	http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	59-8325	http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplier Tubes	Hamamatsu	R7400U-20	Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,  0.78 ns response time  http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm precision slits	Edmund Optics	NT39-908	2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes
Oscilloscope	Tektronix	TBS 1032B	Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts  http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Pole LP/HP Filter	Krohn-Hite	3384	Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.    http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot microscope	Nikon	NA	Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube Beamsplitter	ThorLabs	BS013