Introduction
מנועי flagellar לאפשר תאים לשחות ידי החלפת חוטים תאיים סליל. כמות מומנט המנוע יכול לייצר עבור באורך נתון של השוטון (כלומר, את העומס הצמיג) מקובעת את מהירויות השחייה. מצד השני, היכולת שלה כדי להעביר את כיוון הסיבוב שולטת נדידת תאים בתגובת כימיקלים, תהליך המכונה chemotaxis. Chemotaxis ו ארסיות להיות תנועתיות גורמי 1-3, מנועים flagellar מתאפיינים היטב במשך השנים 4. הראיות המצטברות החברה עולה כי המנוע משמש mechanosensor - זה מכנית מזהה נוכחות של 5,6 מצעים מוצקים. יכולת זו מסייעת סביר המעוררים קולוניזציה משטח וזיהומים 5,7. כתוצאה מכך, המנגנונים לפיה מנוע חושי משטחים ויוזם איתות הם בעלי חשיבות 8,9.
מנוע flagellar ניתן ללמוד בקלות על ידי קושר את flagellאממ לרוטצית תא מצע והתבוננות. קשירה כזו הושגה לראשונה על ידי סילברמן וסיימון, שעבד עם מוטציה polyhook ב E. coli ו ווים לחבר בהצלחה מצעי זכוכית עם נוגדנים נגד וו 10. את assay הקשורים התאים אפשר לחוקרים ללמוד את התגובות של מתג המנוע למגוון של גירויים כימיים. לדוגמה, סגל ועמיתים לעבודה מגורה תאים קשור כימית בעזרת טפטפות iontophoretic. השינויים המתאימים הטיה CW (את החלק היחסי של מנועים הזמן לסובב עם כיוון השעון, CW) אפשרה להם למדוד את קינטיקה של הסתגלות ברשת chemotaxis 11,12. בעוד assay התא הקשור היה יעיל בחן את תשובות מתג, זה היה מסוגל רק להציע תובנה מכניקת מנוע פני טווח מוגבל של עומסים צמיגים 13. כדי להתגבר על בעיה זו, ריו ועמיתים לעבודה קשורה כדורי, חרוזי גומי כדי נימה השוברים על תאים תקועים על משטחים. החרוזים היואז מעקב באמצעות אינטרפרומטריה גב מוקד עם מלכודות אופטיות חלשות 14. הודות לשיתוף פעולה עם חרוזים בגדלים שונים, חוקרים יכלו ללמוד את המנוע על פני טווח רחב יותר של עומסים. assay זה היה שיפור מאוחר יותר על ידי יואן וברג, אשר פיתח טכניקה חרוז מעקב מבוססי מכפיל בשילוב עם תאורה כהה שדה לייזר. המעקב מופעל שיטתם של nanobeads זהב הקשור כי הם כה זעירים (~ 60 ננומטר) כי ההתנגדויות הצמיגות החיצוניות היו נמוכות לעומת ההתנגדויות הצמיגות הפנימיות סיבוב 15,16. זה הוביל את המידות של מהירויות המרביות השגה ב E. coli (~ 300 הרץ). ב V. alginolyticus, מבחני חרוז דומים מופעלים מדידות של שיעורי ספינינג בעומסים צמיגים ביניים (~ 700 הרץ) 17. בכך שהיא מאפשרת מדידות של תגובות המנוע על פני הטווח האפשרי השלם של המון צמיגה (מאפס עומס לקרוב-דוכן), החרוז-המבחנים ספקו כלי biophysical חשוב להבין את torque דור תהליך 18,19.
לאחרונה, שינינו את assay יואן-ברג לכלול פינצטה אופטית שאפשרה לנו ליישם גירויים מכאניים מדויקים מנועים בודדים 6. באמצעות טכניקה זו, הראינו כי-גנרטורים כוח לסובב את המנוע הם mechanosensors דינמי - יעשו שינויים בתגובה לשינויים המון צמיגה. יתכן כי עומס חישה כגון מפעילת התמיינות תאים לתוך חיידקים שורצים, למרות המנגנונים עדיין אינם ברורים. כמו כן סביר להניח כי מנועי flagellar במינים אחרים הם גם mechanosensitive 20, למרות ראיות ישירות חסרות. כאן, אנו דנים מבוססי מכפיל (PMT) הגישה למעקב אחר סיבוב של חרוזים לטקס הרתומים חוטים flagellar 15. בהשוואת מעקב עם מצלמות מהירות, את ההתקנה המכפילה יש יתרון משום שהוא הוא פשוט יחסית כדי לעקוב אחר חרוזים יחידים בזמן אמת ושוב הדורה ארוכהמשא. זה שימושי במיוחד כאשר לומדים ותיק שיפוץ מתחמי מנוע flagellar בשל גירויים סביבתיים 21. למרות שאנחנו פרוטוקולים בפירוט במיוחד עבור E. coli, הם יכולים להתאים בקלות ללימוד מנועים flagellar במינים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תא הכנה
- לגדול תרבויות לילה של המתח הרצוי נושאת את Flic דביק אלל 15,22 ב Tryptone מרק (TB, 1% Peptone, 0.5% NaCl) ואחריו חיסון ב 1: 100 דילול ב 10 TB מ"ל טריים. לגדול התרבות ב 33 מעלות צלזיוס חממה שייקר עד OD 600 = 0.5.
- גלולה התאים ב 1500 XG במשך 5 - 7 דקות מחדש לפזר את גלולה במרץ ב 10 מ"ל של חיץ תנועתיות מעוקר מסנן (MB; חיץ פוספט 10 מ"מ: 0.05-0.06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 מיקרומטר מתיונין, pH 7.0).
- חזור על שלב 1.2 פעמים נוספות מחדש לפזר את הגלולה הסופית 1 MB המ"ל.
- גזירה ההשעיה על ידי עובר הלוך ושוב ~ 75 פעמים בין שני מזרקים עם 21 עד 23 מתאמי מד מחובר על ידי צינורות פוליאתילן (7 - 12 ס"מ אורך, 0.58 מ"מ פנימי קוטר). הגבל את הזמן הכולל עבור הגז כדי 30 - 45 s.
- צנטריפוגה תאים הטעונים ב 1500 XG במשך 5-7 דקות מחדש לפיזורגלולה ב 100 - 500 μL של MB.
2. שקופיות כנות
- הכין תא הדמיה על ידי הרבדה שנייה דבק דו צדדי בין תלוש-כיסוי שקופיות מיקרוסקופ. עבור מבחני chemotaxis, להעסיק כל תא microfluidic המאפשר חילופי MB וממריצים כימיים.
- להוסיף 0.01% הפתרון פולי- L- ליזין בתא ואחרי 5 דקות בעדינות ולשטוף את המשטחים עם MB (80 - 100 μL).
- הוסף 40 μL של ההשעיה תא לתא ולאפשר מספיק זמן עבור התקשרות אל משטח זכוכית (7 - 8 דקות). לזרום החוצה תאים לקלף ידי הוספת 100 μL MB בצד אחד של החדר, תוך פתילת הפתרון עם נייר סינון מהצד השני.
- להוסיף 10 - 15 μL של חרוזי לטקס לתוך התא ולאפשר החרוזים זמן לפרוע באמצעותם ולצרף אל התאים (7 - 8 דקות). לשטוף בעדינות עם 100 μL של MB, כמתואר בשלב 2.3, להסיר לקלף חרוזים. להשתמש במגוון של חרוז-סיzes עבור הניסויים כל עוד ניגוד טוב זמין.
3. מעקב חרוז
- מניח את המדגם על במה מיקרוסקופ ולסרוק את השטח עבור חרוזים מצורפים מנועים. השתמש מטרת שלב 40X לבצע תצפיות למרות מיקרוסקופיה שלב לא הכרחית. לחלופין, להעסיק הדמית שדה בהיר כל עוד ניגוד ראוי נשמר להבחין חרוז בהיר בבירור על רקע כהה.
- פעם חרוז נבחרת, להזיז את הבמה רוחבית כדי למקם את החרוז בפינה שנקבעה מראש כפי שמוצג באיור 1 ב. חרוזים עמדו באותו בפינה כדי להבטיח כי כיוון הסיבוב של החרוז ידוע כראוי. מסלולו החרוז האידיאלי הוא כ עגול אבל מסלולי אליפטי הם קבילים.
- שמירה על תדר דגימה גבוה יותר מפי שניים את תדירות הסיבוב של המנוע, כדי למנוע טעויות הקשורות aliasing. בעבודה זו, להשתמש במנוע שהיה מסתובב50 הרץ ו מדגם בתדרים שהיו היה גבוה פי 10 (500 הרץ), כדי לקבל אות חלקה.
ניתוח 4. נתונים
- מרכז ולהתאים את מתחי מוצא PMT ונכון סְגַלגַלוּת ב המסלולים עם טרנספורמציות המאוחד במידת צורך 23. השתמש ניתוח כוח ספקטרום לקבוע שיעורי סיבוב 17.
- לקבוע זוויות קוטב, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). קבע את הווריאציות במהירויות מנוע ומיתוג לאורך זמן על ידי חישוב ω
14. - להעסיק מסנן חציון להחליק את הנתונים מהירי מנוע. חלון מסנן מעל שני סיבובים מלאים מומלץ 23,24.
14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההתקנה המכפילה מוצגת באיור 1 א. חשוב כי יש PMTs רגישויות גבוהות על פני טווח של אורכי גל מפוזרים על ידי החרוזים של עניין. PMTs מועסק כאן לפעול בטווחים הגלויים קרוב אינפרא אדומים, הצליח לזהות אור מפוזר על ידי חרוזים המוארים על ידי מקור אור ההלוגן. תנאי תאורה אופטימליים, לאספקת מתח ישתנו מהגדרת אחד למשנהו. עבור ההתקנה המשמשת בעבודה זו, רווח PMT ~ 10 אפריל - 10 מאי הוכיח את יעילותו. כל מכפיל היה מכוסה למעט חרך 3 x 1 מ"מ ממוצבת מול המכפיל. החרכים להגביל באזור בתא-מדגם שממנו האור יכול להיכנס photomultipliers, ואת שני החריצים הם אורתוגונליים זה לזה. כאשר חרוז מסתובב ממוקם במיקום הנכון (האיור 1B), כמות האור הנכנסת עליות המכפילות כמו החרוז מגיעבתצוגה והירידות כמו שביל המעגלי שלה לוקח אותה הרחק מהנוף. התדרים של יציאות מתח PMT סינוסי לציין את מהירות הסיבוב ואת הפרשי המופע בין שני האותות לציין את כיוון הסיבוב. שימוש אוסצילוסקופ כדי להציג את פלטי PMT מאפשר הדמיה של מסלולי חרוז בזמן אמת.
אותות PMT משתנה בזמן, y (t) ו- x (t), ממנוע נציג מוצגים איור 2 א. אורתוגונליות של שני החריצים מציגה בפיגור מופע בין שני האותות. אמפליטודות האות תלויות יחס אות לרעש, כמו גם את האקסצנטריות של סיבוב. מסלוליהן המקבילים של החרוז מסומנים בתרשים 2B.
היסטוגרמה של המהירויות נמדדו ממנוע יציג סטרייצ'י - זן נמחק מוצגת באיור 3 א 25. החרוז היה ממוקם ראשון בפינה הימנית התחתונה, כפי שניתן לראות סכמטי באיור 1B. מהירות הזוויתית המקבילה מוצגת באיור 3 ב (פנל עליון). מיצוב החרוז לפינה השמאלית התחתונה הסמוכה הביא היפוך של השלט על מהירויות מנוע (פנל תחתון). לפיכך, הזזת חרוז פינת סמוך תשתנה בכיוון הנצפה של סיבוב מנוע. בהקשר זה, באלכסון מול פינות זהות. לכן חיוני לדעת את המיקום של החרוז במהלך מדידות כדי לקבוע את דינמיקת המיתוג נכון. איור 3 ג תערוכות מעברים חוזרים ונשנים של מנוע wild-type בין שני כיווני הסיבוב.
קודים מותאמים אישית לתוכנות להרכשת נתונים הותאמו מעבודה לפני לתעד את הנתונים במחשב 15. תפוקת PMT היה AC מצמידים נמוך לעבור סינון עם תדר החיתוך של 100 הרץ. מעקב בזמן אמת היה מופעל על ידי חיבור התפוקות מסוננים אוסצילוסקופ.
איור 1: הגדרת חרוזי גשש. א) סכמטי של הגדרת המעקב המבוססת PMT. ב) המיקום האידיאלי של חרוז (יחסית שחור כדור) לשני החרכים המאונכים. המסלול מסומן על ידי קווים מקווקווים. הדואר האקסצנטרי הוא רדיוס המעגל המקווקו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: יציאות PMT. א) נמוך לעבור סינון פלטים משני photomultipliers, לאחר מרכוז / קנה מידה. ב) מסלולי חרוז מתקבלים על פי נתוני PMT, שנדגמו מעל 3 שניות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: מסלולי חרוז. א) היסטוגרמה של מהירויות CCW בלבד של מנוע נציג. B) מהירויות סיבוב של מנוע CCW בלבד צלם בפינה ימנית תחתונה (פנל עליון). מהירויות סיבוב של אותו המנוע כשהוא מוצב בפינה השמאלית התחתונה (פנל תחתון). C) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על מנת להקל על מעקב חרוז קשור ואמידה נכונה של מגבילי מנוע, את המידע הבא צריך להיבדק. בעת ביצוע מדידות אלה עם תאים והולקה בשוט, הגז הוא שלב קריטי. גזיזה מפחיתה את נימת flagellar כדי בדל גרידא, ובכך להבטיח כי העומס הצמיג על המנוע הוא בעיקר בשל החרוז ניתן לאמוד בתוך 10% שגיאה 16. גזיזה גם משפרת את הסיכוי למצוא מסלולים עגולים עם מוזרויות מופצות בחוזקה (<חרוז בקוטר 14). תוצאות גז פסולת מסלולים סוררים, אשר תרכובות טעויות מעקב בחישוב שאיפות צמיגות, כמו גם וכתוצאה מכך יחסי אות לרעש עניים. השימוש אוסצילוסקופ מאפשר היעלמות מהירה של נתונים כאלה. מאז המאפיינים ביומכנית של חוטים flagellar צפויים להשתנות עם מינים, שיטות הגז יצטרכו להתאים סביר על מנת להבטיח מריחה נאותה tהוא חיידקי עניין. דרך יעילה להפחתת טעויות קשורות גז היא לעבוד עם תאים חסרי הגנים המקודדים את חלבוני הנימה. חרוזים Probe אז יכול להיות מחובר ישירות וו באמצעות נוגדנים נגד וו.
מציאת חרוז כי הוא קשור כראוי יכול להיות מאתגר. זאת משום שרוב חרוזי שדה הראייה או יודבקו גופי התא או משטח הזכוכית. ניתן חרוזים כאלה הביאו בנקל מיקוד חד. חרוזים אחרים יופיעו לרטוט או לסובב בעליל עם אמפליטודות גדול או מוזרויות גדולות (> 1.5 - 2x קוטר חרוז). אלה הם בדרך כלל קשורים flagellar חוטים שלא היה טעון במלואו או לסובב במטוס כי הוא נוטה אל מישור המוקד. דגימה של חרוזים כאלה בדרך כלל תגרום רעש גבוה, וזמן-וריאציות המון צמיגה עלולות לגרום הערכה נמוכה מדי של מגבילי מנועים לשימוש בגודל חרוז נתון. חלק קטן מן החרוזים קשורים יעבור אקראיתְנוּעָה; אלה רק עוברים סיבוב בראונית. שבריר של החרוזים יופיע מטושטש ולא ניתן להביא בפוקוס בקלות. אלה הם הסיכוי הטוב ביותר להיות מנועים אשר היו קשורים כראוי והם מנועים של עניין.
בין המגבלות של מנוע יחיד מעקב כגון זה המתואר כאן הוא חוסר היכולת לבצע ניסויי תפוקה גבוהה. מצלמה במהירות גבוהה שתמונות אזור גדול יותר של עניין יכול להיות יתרון בעניין זה. מגבלות נוספות כוללות שגיאות הקשורות אותות מרובים הנובעים מתוך חרוזים מסתובבים צפופים בתחום המבט של PMTs. לבסוף, טעויות בקביעת המיקום הנכון של החרוז רשם ביחס לשני החרכים המכפילים תגרומנה להערכה מדויקת של דינמיקת המיתוג.
יתרונותיו של ההתקנה המתוארת כאן כוללים את היכולת לעקוב אחר הסיבוב של החרוזים על פני משכי זמן ארוכים בזמן אמת. זֶהמאפשר היעלמות מהירה של מסלולי מועדת לטעויות, משהו שאולי קשה להשיג עם מצלמות מהירות. בנוסף, עם כמה שינויי התקנה זו יכולה להיות משולבת עם מבחנים שנועדו להכפיף תאים למגוון של גירויים. בשילוב עם ותרמית קירור 26, הטכניקה יכולה להיות מועסקת על מנת למדוד את התגובות של מנועי פרט לגירויים תרמיים. אינטגרציה עם פינצטה אופטית יכולה לאפשר המדידות של שיפוץ מנועים בודדים בתגובה לגירויים מכאניים, כפי שנעשה 6 לאחרונה. לבסוף, העיבוד של מנוע ממריצים כימיים ניתן למדוד עם השימוש בתא זלוף מתאים ומשאבות 11.
רוב המינים הידועים חיידקי הם ניע ותנועתיות בתיווך flagellar הוא השולט בטבע. השיטות הפגינו כאן צפויות להמשיך לסייע בפיתוח של תובנה-שיפוץ מבני ואת הסתגלות of מנוע flagellar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
References
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C.
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C.
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C.
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
