Introduction
motores flagelares permitir que as células para nadar girando filamentos extracelulares helicoidais. A quantidade de torque do motor pode gerar para um dado comprimento do flagelo (isto é, a carga viscosa) determina as velocidades de natação. Por outro lado, a sua capacidade de mudar o sentido de rotação controla a migração celular em resposta a produtos químicos, um processo conhecido como quimiotaxia. Quimiotaxia e motilidade sendo fatores de virulência 1-3, motores flagelares foram bem caracterizado ao longo dos anos 4. Evidências crescentes agora sugere que o motor actua como um mechanosensor - lo mecanicamente detecta a presença de substratos sólidos 5,6. Esta capacidade provável ajuda no desencadeamento de colonização superfície e infecções 5,7. Como resultado, os mecanismos pelos quais o motor sentidos superfícies e iniciados de sinalização são de importância 8,9.
O motor flagelar pode ser facilmente estudado por amarrar o flagellhum a um substrato e observando a rotação celular. Esta operação foi primeiramente alcançada por Silverman e Simon, que trabalhou com um mutante polyhook em E. coli e ganchos ligados com sucesso para substratos de vidro com anticorpos anti-gancho 10. O ensaio de célula tethered permitiu aos investigadores a estudar as respostas de o interruptor do motor a uma variedade de estímulos químicos. Por exemplo, Segall e co-trabalhadores quimicamente estimulado células conectada com o auxílio de pipetas iontoforéticos. As alterações correspondentes no viés CW (a fração dos motores tempo de rotação no sentido horário, CW) lhes permitiu medir a cinética de adaptação na rede quimiotaxia 11,12. Enquanto o ensaio de células tethered foi eficaz em estudar respostas de switch, ele só foi capaz de oferecer insights sobre a mecânica do motor através de uma gama limitada de cargas viscosos 13. Para ultrapassar este problema, Ryu e colaboradores tethered esféricas, esferas de látex de filamento topos sobre as células presas às superfícies. Os grânulos eramentão rastreados usando interferometria de back-focal com fracos armadilhas ópticas 14. Ao trabalhar com contas de diferentes tamanhos, os pesquisadores poderiam estudar o motor ao longo de uma gama muito maior de cargas. Este ensaio foi posteriormente melhorado por Yuan e Berg, que desenvolveu uma técnica de talão-de rastreamento baseado photomultiplier combinada com iluminação a laser de campo escuro. Seu método de rastreamento habilitado de nanobeads tethered de ouro que foram tão pequena (~ 60 nm) que as resistências viscosos externos foram menores em comparação com as resistências viscosos internos para rotação 15,16. Isto conduziu às medições das velocidades máxima alcançável em E. coli (~ 300 Hz). Em V. alginolyticus, ensaios talão semelhantes permitiu medições das taxas de fiação em cargas intermédias viscosos (~ 700 Hz) 17. Ao permitir que as medições de respostas motoras ao longo de toda a gama possível de cargas viscoso (a partir de zero a carga de quase-box), os ensaios de Bead-forneceu uma ferramenta importante para compreender a biofísica tprocesso orque geração 18,19.
Recentemente, nós modificamos o ensaio Yuan-Berg para incluir pinças ópticas que nos permitiram aplicar estímulos mecânicos precisos para motores individuais 6. Usando esta técnica, nós mostramos que a força-geradores que giram o motor são mechanosensors dinâmicos - eles remodelar em resposta às mudanças nas cargas viscosos. É possível que tal sensor de carga provoca a diferenciação de células em bactérias enxame, embora os mecanismos permanecem obscuros. Também é provável que os motores flagelares em outras espécies também são mechanosensitive 20, apesar de evidência directa que falta. Aqui, discutimos a abordagem baseada em fotomultiplicador (PMT) para acompanhar a rotação de esferas de látex amarrados a filamentos de flagelar 15. Em comparação com o acompanhamento com câmeras ultra-rápidos, o fotomultiplicador-setup é vantajoso porque é relativamente simples para rastrear esferas individuais em tempo real e mais longa durações. É particularmente útil quando se estuda a longo tempo remodelação em complexos motor flagelar devido a estímulos do meio ambiente 21. Embora nós detalhe protocolos específicos para E. coli, que pode ser facilmente adaptado para estudar motores flagelares em outras espécies.
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Protocol
1. Preparação de células
- Crescer culturas de uma noite da estirpe desejada carregando a fliC pegajoso alelo 15,22 em Caldo de triptona (TB, 1% de peptona, 0,5% de NaCl), seguida de inoculação a diluição 1: 100 em 10 mL de TB fresco. Crescer a cultura a 33 ° C numa incubadora agitadora até DO600 = 0,5.
- Agregar as células a 1500 xg durante 5-7 minutos e re-dispersar vigorosamente o sedimento em 10 mL de tampão de filtro esterilizado motilidade (MB; 10 mM de tampão de fosfato: 0,05-0,06 M de NaCl, 10 -4 M de EDTA, 1 | iM de metionina, pH 7,0).
- Repita o passo 1.2 mais duas vezes e re-dispersar o sedimento final em 1 ml MB.
- Cisalhamento da suspensão, passando para trás e para a frente ~ 75 vezes entre duas seringas com 21 a 23 adaptadores calibre ligados por tubos de polietileno (7 - 12 cm de comprimento, diâmetro 0,58 mm interno). Limitar o tempo total para corte de 30 - 45 s.
- Centrifugar as células cortadas a 1.500 g durante 5-7 minutos e voltar a dispersar apelete em 100 - 500 mL de MB.
2. Deslize Preparação
- Preparar uma câmara de imagem imprensando duas fitas adesivas de dupla face entre um cover-derrapante e uma lâmina de microscópio. Para ensaios de quimiotaxia, empregar qualquer câmara de microfluidos que permite a troca de MB e estimulantes químicos.
- Adicionar solução de 0,01% de poli-L-lisina na câmara e depois de 5 min lave as superfícies com MB (80-100 mL).
- Adicionar 40 ul de suspensão de células para dentro da câmara e permitir tempo suficiente para a ligação à superfície do vidro (7-8 min). Fluxo de Saída células unstuck pela adição de 100 uL MB de um lado da câmara, enquanto wicking a solução com um papel de filtro a partir do outro lado.
- Adicionam-se 10 - 15? L de esferas de látex para dentro da câmara e permitir que as esferas de tempo suficiente para se estabelecer e anexar as células (7-8 min). Lave com 100 ul de MB, tal como descrito na etapa 2.3, para remover descolar grânulos. Use uma gama de talão-sizes para as experiências tanto tempo como um bom contraste está disponível.
3. Acompanhamento Bead
- Colocar a amostra em um estágio do microscópio e digitalizar a superfície para grânulos ligados a motores. Utilize uma objectiva de 40x fase para fazer observações, embora microscopia de fase não é necessário. Alternativamente, empregam imagem de campo brilhante, desde que contraste suficiente é mantida a distinguir claramente um grânulo brilhante sobre um fundo escuro.
- Uma vez que um grânulo tenha sido seleccionado, mover a fase lateralmente para posicionar o grânulo em um canto pré-determinado, como mostrado na Figura 1B. grânulos posição na mesma curva para garantir que o sentido de rotação do grânulo é correctamente conhecido. A trajetória talão ideal é aproximadamente circular, mas trajetórias elípticas são admissíveis.
- Manter a frequência de amostragem mais elevada do que duas vezes a frequência de rotação do motor para evitar erros associados com serrilhado. Neste trabalho, utilizar um motor que foi rotativo a50 Hz e a amostra a frequências que eram 10 vezes mais elevada (500 Hz), para obter um sinal bom.
Análise 4. Dados
- Centro e escalar as tensões de saída PMT e elipticidade correta nas trajetórias com transformações afins, se necessário 23. Use uma análise de poder de espectro para determinar as taxas de rotação 17.
- Determinar ângulos polares, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Determinar as variações de velocidades do motor e mudar ao longo do tempo por meio do cálculo ω
14. - Empregar um filtro de mediana para alisar os dados de velocidade do motor. Uma janela de filtro de mais de duas rotações completas é recomendado 23,24.
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Representative Results
A configuração do fotomultiplicador é mostrado na Figura 1A. É importante que os PMTs ter alta sensibilidade ao longo do intervalo de comprimentos de onda dispersa pelas esferas de interesse. Os PMTs empregadas aqui operam nas faixas visíveis e do infravermelho próximo, e foram capazes de detectar a luz dispersa pelas esferas iluminadas por uma fonte de luz halógena. As condições de iluminação ideais e tensões de alimentação irá variar de uma instalação para outra. Para a configuração utilizada neste trabalho, um ganho de PMT ~ 10 abril - 10 maio mostrou-se adequada. Cada fotomultiplicador foi coberto com excepção de uma fenda 3 x 1mm posicionado em frente do fotomultiplicador. As fendas limitar a região na célula-amostra a partir da qual a luz pode entrar nos fotomultiplicadores, e as duas fendas são ortogonais entre si. Quando um cordão de rotação está posicionado na localização correcta (Figura 1B), a quantidade de luz que entra no fotomultiplicadores aumenta à medida que o cordão vema vista e diminui como o seu percurso circular leva-o longe da vista. As frequências das saídas de tensão sinusoidais PMT indicar a velocidade de rotação e as diferenças de fase entre os dois sinais de indicar o sentido de rotação. O uso de um osciloscópio para exibir as saídas PMT permite a visualização de trajectórias grânulo em tempo real.
Os sinais PMT variáveis no tempo, Y (t) e x (t), a partir de um motor representativo são apresentados na Figura 2A. A ortogonalidade das duas fendas introduz um atraso de fase entre os dois sinais. As amplitudes do sinal dependerá da relação sinal-ruído, bem como a excentricidade de rotação. As trajectórias correspondentes do talão são indicados na Figura 2B.
Um histograma das velocidades medidas a partir de um motor representativo de uma Chey - estirpe removido é mostrado na Figura 3A 25. O grânulo foi posicionada em primeiro lugar no canto inferior direito, como se vê no esquema na Figura 1B. A velocidade angular correspondente é mostrada na Figura 3B (painel superior). Posicionando o talão para o canto esquerdo inferior adjacente resultou na inversão do sinal nas velocidades do motor (painel inferior). Deste modo, movendo-se o grânulo para uma zona adjacente irá alterar o sentido de rotação do motor observado. A este respeito, os cantos diagonalmente opostos são idênticos. É, portanto, crucial para saber a localização do cordão durante as medições para determinar corretamente a dinâmica de comutação. A Figura 3C mostra transições repetidas de um motor de tipo selvagem entre os dois sentidos de rotação.
Códigos personalizados para software de aquisição de dados foram adaptados de trabalho antes de gravar os dados em um computador 15. A saída PMT foi AC-coupled e low-pass filtrada com uma frequência de corte de 100 Hz. rastreamento em tempo real foi habilitado por ligar as saídas filtradas para um osciloscópio.
Figura 1: Configuração Bead-tracker. A) esquemático da configuração do controlo baseados em PMT. B) A posição ideal do grânulo (esfera negra) em relação às duas ranhuras ortogonais. A trajectória está indicado pelas linhas pontilhadas. A excentricidade é o raio do círculo pontilhado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: PMT saídas. A) de baixa passagem filtrada saídas dos dois fotomultiplicadores, após a centragem / descamação. B) As trajetórias talão obtidos a partir dos dados PMT, amostrados ao longo de 3 s. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Bead Trajetórias. A) Histograma de velocidades somente CCW de um motor representativo. B) velocidades de rotação de um motor só-CCW fotografada no canto inferior direito (painel superior). velocidades de rotação do mesmo motor, quando posicionado no canto inferior esquerdo (painel inferior). C) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A fim de facilitar tethered talão de rastreamento e estimativa correcta do motor-torques, as seguintes informações devem ser revistos. Ao realizar essas medições com células flageladas, corte é um passo crítico. Cisalhamento reduz o filamento flagelar a um mero topo, assegurando desse modo que a carga no motor viscoso é predominantemente devido ao cordão e pode ser estimado dentro de erro de 10% 16. Shearing também melhora as chances de encontrar trajetórias circulares com excentricidades bem distribuídos (<diâmetro talão 14). resultados de corte indevidos em trajetórias rebeldes, compostos que erros no rastreamento e no cálculo das drags viscosos, bem como resultando em relação sinal-ruído pobres. O uso de um osciloscópio permite uma rápida eliminação de tais dados. Desde são esperadas as propriedades biomecânicas de filamentos de flagelar a variar com as espécies, métodos de tosquia, provavelmente, precisam ser adaptados para garantir corte adequada em tele bactérias de interesse. Uma forma eficaz de reduzir os erros associados com cisalhamento é trabalhar com as células que não possuem os genes que codificam as proteínas de filamento. grânulos sonda pode então ser ligado directamente ao gancho por meio de anticorpos anti-gancho.
Encontrar um talão que é apropriadamente tethered pode ser um desafio. Isto é porque a maioria dos grânulos no campo de visão ou será preso aos corpos celulares ou a superfície de vidro. Essas contas podem ser facilmente postos em destaque. Outras esferas aparece para vibrar ou girar visivelmente com grandes amplitudes ou grandes excentricidades (> 1.5 - diâmetro 2x talão). Estes são tipicamente presa a flagelar filamentos que não foram totalmente cortados ou rodam num plano que é inclinado em relação ao plano focal. Amostragem de tais grânulos, normalmente resultam em maior ruído, e o tempo variações nas cargas viscosos podem resultar em uma subestimação de motores binários para uma dada pérola-tamanho. Uma pequena fração dos grânulos amarrados vai sofrer aleatóriomovimento; Estas são apenas submetidos a rotação browniano. Uma fracção dos grânulos aparecerá desfocada e não pode ser colocado em foco facilmente. Estas são mais susceptíveis de serem motores que foram amarradas de forma adequada e que se encontram os motores de interesse.
Entre as limitações de um único motor de rastreamento, como a descrita aqui, é a incapacidade de realizar as experiências de alto rendimento. Uma câmara de alta velocidade com que as imagens de uma região maior de interesse pode ser vantajoso a este respeito. Outras limitações incluem os erros associados com sinais múltiplos resultantes de grânulos de rotação espaçados no campo de visão dos PMTs. Finalmente, os erros na determinação da posição correcta do grânulo gravado com respeito aos dois fotomultiplicadores fendas irá resultar em estimativas imprecisas da dinâmica de comutação.
Vantagens da configuração aqui descrita incluem a capacidade para controlar a rotação dos grânulos durante longos períodos e em tempo real. estepermite a rápida eliminação das trajetórias propensas a erros, algo que talvez difícil de conseguir com câmeras ultra-rápidos. Além disso, com algumas modificações, esta configuração pode ser integrado com ensaios concebidos para submeter as células a uma variedade de estímulos. Combinado com termoeléctrica de arrefecimento 26, a técnica pode ser utilizada para medir as respostas de motores individuais aos estímulos térmicos. Integração com pinças ópticas pode permitir que as medições de remodelação de motores individuais em resposta a estímulos mecânicos, como tem sido feito recentemente 6. Finalmente, a adaptação do motor de estimulantes químicos pode ser medida com a utilização de uma câmara de perfusão adequada e as bombas 11.
A maioria das espécies bacterianas conhecidas são móveis e motilidade mediada por flagelar é predominante na natureza. Os métodos demonstrados aqui são esperados para continuar a ajudar no desenvolvimento de insights sobre estrutural-remodelação e a adaptabilidade of o motor flagelar.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
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