Introduction
Flagellar motorer möjliggör cellerna att simma genom att vrida spiralextracellulära filament. Mängden vridmoment motorn kan generera för en given längd av flagellen (dvs den viskösa belastningen) bestämmer simning hastigheter. Å andra sidan, styr dess förmåga att byta rotationsriktning cellmigration som svar på kemikalier, en process som kallas kemotaxi. Kemotaxi och rörlighet är virulensfaktorer 1-3, flagellar motorer har väl karakteriserad under åren 4. Montering tyder nu att motorn fungerar som en mechanosensor - det mekaniskt detekterar närvaron av fasta substrat 5,6. Denna förmåga hjälper sannolikt utlösa yta kolonisering och infektioner 5,7. Som ett resultat, de mekanismer varigenom motorn avkänner ytor och initierar signalering har betydelse 8,9.
Den flagellar motor kan lätt studeras genom uppbundna den flagellum på ett substrat och observation cell rotation. Sådan uppbindning först uppnås genom Silverman och Simon, som arbetade med en polyhook mutant i E. coli och framgångsrikt fästa krokar till glassubstrat med anti-hook-antikroppar 10. Analysen tjudrad-cell aktiverad forskare att studera svaren från motorbrytaren till en mängd olika kemiska stimuli. Till exempel, Segall och medarbetare kemiskt stimulerade bundna celler med hjälp av jontoforetiska pipetter. Motsvarande förändringar i CW partiskhet (den bråkdel av den tid motorerna snurra medurs CW) möjligt för dem att mäta kinetiken av anpassning i kemotaxi nätet 11,12. Medan den bundna cellanalysen var effektiv i att studera switch svar, var det endast möjlighet att erbjuda en inblick i motormekanik över ett begränsat område av viskösa belastningar 13. För att lösa detta problem, Ryu och medarbetare bundna sfäriska, latexpärlor till glödtråden stubbar på celler fastnat ytor. Pärlornasedan spåras med hjälp back-focal interferometri med svaga optiska fällor 14. Genom att arbeta med pärlor av olika storlekar, kan forskarna studera motorn över ett mycket bredare spektrum av laster. Denna analys senare förbättrades med Yuan och Berg, som utvecklade en fotomultiplikator baserad bead-spårningsteknik i kombination med lasermörkfältsbelysning. Deras metod aktiverat spårning av bundna guld nanobeads som var så liten (~ 60 nm) att de externa viskösa motstånd var lägre jämfört med de inre viskösa motstånd till rotation 15,16. Detta ledde till att mätningar av de högsta uppnåeliga hastigheter i E. coli (~ 300 Hz). I V. alginolyticus, liknande pärla analyser aktiverade mätningar av spinnhastigheter vid mellanliggande viskösa laster (~ 700 Hz) 17. Genom att aktivera mätningar av motoriska gensvar över hela möjliga utbud av viskösa laster (från noll-belastning till nära-stall), pärlan-analyserna gav en viktig biofysiska verktyg för att förstå torque-genereringsprocessen 18,19.
Nyligen ändrade vi Yuan-Berg analys för att inkludera optisk pincett som möjligt för oss att tillämpa exakta mekaniska stimuli till individuella motorer 6. Med denna teknik, visade vi att kraftgeneratorer som roterar motorn är dynamiska mechanosensors - de renovera som svar på förändringar i viskösa laster. Det är möjligt att en sådan lastkännande utlöser celldifferentiering in i svärmar bakterier, även om mekanismerna är fortfarande oklara. Det är också troligt att de flagellar motorer i andra arter är också mechanosensitive 20, fastän direkta bevis saknas. Här diskuterar vi fotomultiplikatorn baserade (PMT) inställning för att spåra rotation av latexpärlor bundna till flagellar filament 15. I jämförelse med spårning med ultrasnabba kameror, är fotomultiplikator-setup fördelaktig eftersom den är relativt enkelt att spåra enskilda pärlor i realtid och över långa durationer. Det är särskilt användbart när man studerar länge ombyggnad i flagellar motor komplex på grund av miljö stimuli 21. Även om vi specificera protokoll specifikt för E. coli, kan de lätt anpassas för att studera flagellära motorer i andra arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellberedning
- Växa övernattskulturer av den önskade stam som bär den klibbiga Flic allelen 15,22 i Trypton Broth (TB, 1% pepton, 0,5% NaCl), följt av inokulering vid en: 100 spädning i 10 ml färskt TB. Odla kulturen vid 33 ° C i en skakinkubator tills OD 600 = 0,5.
- Pelletera cellerna vid 1500 xg under 5-7 min och re-dispergera pelleten kraftigt i 10 ml filtersteriliserad motilitet buffert (MB; 10 mM fosfatbuffert: 0,05-0,06 M NaCI, 10 -4 M EDTA, 1 ^ M metionin, pH 7,0).
- Upprepa steg 1,2 ytterligare två gånger och åter skingra den slutliga pelleten i 1 ml MB.
- Skeva suspensionen genom att fram och tillbaka ~ 75 gånger mellan två sprutor med 21 till 23 gauge adaptrar anslutna med polyetenrör (7 - 12 cm lång, 0,58 mm innerdiameter). Begränsa den totala tiden för skjuvning till 30 - 45 s.
- Centrifugera skjuvade cellerna vid 1500 xg under 5-7 min och åter dispergerapelleten i 100 - 500 mikroliter av MB.
2. Skjut Beredning
- Förbered en avbildning kammare genom sandwiching två dubbelsidiga tejper mellan en cover-slip och ett objektglas. För kemotaxi analyser anställa någon mikroflödeskammare som möjliggör utbyte av MB och kemiska stimulantia.
- Lägg 0,01% poly-L-lysin-lösning i kammaren och efter 5 min försiktigt skölja ytorna med MB (80-100 | il).
- Tillsätt 40 mikroliter av cellsuspensionen in i kammaren och ge tillräcklig tid för bindning till glasytan (7-8 min). Strömma ut unstuck celler genom att tillsätta 100 mikroliter MB på en sida av kammaren, medan uppsugning av lösningen med ett filterpapper från den andra sidan.
- Tillsätt 10 - 15 mikroliter av latexpärlor in i kammaren och tillåta pärlorna tillräcklig tid att sätta sig och fäster vid celler (7-8 min). Skölj försiktigt med 100 mikroliter av MB, såsom beskrivs i steg 2,3, för att avlägsna unstuck pärlor. Använda en rad pärla-sizes för experimenten så länge som en bra kontrast är tillgänglig.
3. Bead Tracking
- Placera provet på en mikroskop scenen och scanna ytan för pärlor kopplade till motorerna. Använd en 40X fas mål att göra observationer även fas mikroskopi är inte nödvändigt. Alternativt använder ljusfält avbildning så länge som tillräcklig kontrast bibehålls att tydligt skilja en ljus pärla på en mörk bakgrund.
- När en vulst har valts, flyttar scenen lateralt för att positionera vulsten i ett förutbestämt hörn såsom visas i figur 1B. Positions pärlor på samma hörn för att säkerställa att rotationsriktningen av vulsten är korrekt känd. Den idealiska pärla bana är ungefär cirkulär men elliptiska banor är tillåtna.
- Bibehålla samplingsfrekvensen är högre än två gånger varvtalet för motorn för att undvika fel i samband med aliasing. I detta arbete, använda en motor som roterar med50 Hz och prov vid frekvenser som var 10 gånger högre (500 Hz), för att erhålla en jämn signal.
4. Dataanalys
- Center och skala PMT utspänningar och korrekt ellipticitet i banor med affin avbildning om det behövs 23. Använda en analys power-spektrumet för att bestämma rotationshastigheter 17.
- Bestämma polära vinklar, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Bestämma variationerna i motorvarvtal och växla över tiden genom att beräkna ω
14. - Anställa ett medianfilter för att jämna datamotorhastigheten. Ett filter fönster över två hela varv rekommenderas 23,24.
14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fotomultiplikatorn inställning visas i figur 1A. Det är viktigt att de PMTs har höga känsligheter över intervallet av våglängder sprids av pärlorna av intresse. De PMTs används här verkar i det synliga och nära infraröda intervall, och kunde detektera ljus som sprids av pärlor upplyst av en halogen ljuskälla. De optimala ljusförhållanden och matningsspänningar kommer att variera från en installation till en annan. För installationen används i detta arbete, en PMT vinst ~ 10 April - 10 Maj visat sig tillräckliga. Varje fotomultiplikator täcktes med undantag för en 3 x 1 mm slits placerad framför fotomultiplikatorn. Slitsarna begränsar regionen i det cell provet från vilken ljus kan komma in fotomultiplikatorerna, och de två slitsarna är vinkelräta mot varandra. När en roterande kula är placerad på rätt plats (Figur 1B), mängden ljus som kommer in fotomultiplikatorn ökar när kulan kommeri vyn och minskar dess cirkelbana tar bort från vyn. Frekvenserna för de sinusformade PMT spänningsutgångar indikerar rotationshastigheten och de fasskillnader mellan de två signalerna anger rotationsriktningen. Användningen av ett oscilloskop för att visa PMT utgångarna möjliggör visualisering av pärla banor i realtid.
De tidsvarierande PMT signaler, y (t) och x (t), från en representativ motor visas i figur 2A. Ortogonaliteten hos de två slitsarna introducerar en fasförskjutning mellan de två signalerna. Signalamplituderna beror på signal-till-brusförhållande samt excentriciteten för rotation. De motsvarande banor av vulsten är indikerade i figur 2B.
Ett histogram av de hastigheter som uppmätts från ett representativt motor i en cheY - borttagen stam visas i fig 3A 25. Pärlan var först placerad i nedre högra hörnet, sett i schemat i figur 1B. Den motsvarande vinkelhastighet visas i figur 3B (övre panelen). Placering av pärla till intilliggande nedre vänstra hörnet resulterade i inversion av tecknet på motorvarvtal (nedre panelen). Således kommer att flytta pärlan till ett intilliggande hörn ändra den observerade motorns rotationsriktning. I detta avseende, diagonalt motsatta hörn är identiska. Det är därför viktigt att veta var pärlan under mätningarna att korrekt bestämma kopplings dynamik. Figur 3C visar upprepade övergångar av en vild-typ motor mellan de två rotationsriktningarna.
Anpassade koder för datainsamlingsprogram anpassades från tidigare arbete att registrera data på en dator 15. PMT-utgång var AC-kopplade och lågpassfiltreras med en gränsfrekvens av 100 Hz. Realtid spårning har aktiverats genom att ansluta de filtrerade utgångar till ett oscilloskop.
Figur 1: Bead-tracker Setup. A) Schematisk bild av PMT-baserade spårningsfunktionen. B) Den idealiska position pärla (svart sfär) i förhållande till de två ortogonala slitsar. Banan indikeras med de streckade linjerna. Excentriciteten e är radien av den prickade cirkeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: PMT utgångar. A) lågpassfiltreras utgångar från de två fotomultiplikatorer, efter centrering / skalning. B) pärlan banor som erhållits från PMT data samplade över 3 s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bead Trajectories. A) Histogram av CCW-bara hastigheter på en representativ motor. B) rotationshastigheter av CCW-endast motor avbildas vid nedre högra hörnet (övre panelen). Rotationshastigheter hos samma motor när den befinner sig det nedre vänstra hörnet (nedre panelen). C) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att underlätta tjudrad pärla-spårning och korrekt uppskattning av motormoment bör följande uppgifter ses över. När du utför dessa mätningar med flagelle celler, är klippning ett kritiskt steg. Skjuvning minskar flagellära filament till en ren stub, därigenom säkerställa att den viskösa belastningen på motorn är övervägande beror på pärlan och kan uppskattas inom 10% fel 16. Klippning förbättrar också chanserna att hitta cirkulära banor med tätt fördelade excentriciteter (<pärla diameter 14). Felaktig skärresulterar i egensinniga banor, vilka föreningar fel i spårning och vid beräkningen av viskösa laggar, samt resulterar i dåliga signalbrusförhållanden. Användning av ett oscilloskop möjliggör snabb eliminering av sådana uppgifter. Eftersom de biomekaniska egenskaperna hos flagellar trådar förväntas variera med arter, klippande metoder kommer sannolikt att behöva anpassas för att säkerställa tillräcklig skjuvning i tHan bakterier av intresse. Ett effektivt sätt att minska fel i samband med skjuvning är att arbeta med celler som saknar de gener som kodar för de filamentproteiner. Sondpärlor kan sedan fästas direkt till kroken via anti-hook-antikroppar.
Att hitta en pärla som är lämpligt tjudrad kan vara en utmaning. Detta eftersom de flesta pärlor i synfältet antingen kommer att fastna till cellkroppar eller glasytan. Sådana pärlor kan lätt bringas i skarpt fokus. Andra pärlor visas att vibrera eller rotera synligt med stora amplituder eller stora excentriciteter (> 1,5 - 2x pärla diameter). Dessa är oftast bundna till flagellar trådar som inte har helt klippta eller roterar i ett plan som lutar mot fokalplanet. Provtagning av sådana pärlor kommer typiskt att resultera i högre buller, och tidsvariationer i viskösa laster kan resultera i en underskattning av motorer vridmoment för en given kula-storlek. En liten del av bundna pärlor kommer att genomgå slumprörelse; dessa är bara genomgår Brownsk rotation. En fraktion av pärlorna visas suddig och kan inte bringas i fokus lätt. Dessa är mest sannolikt att vara motorer som har uppbundna på lämpligt sätt och är motorerna av intresse.
Bland de begränsningar av enkel motor spårning såsom den som beskrivs här är oförmågan att utföra hög genomströmning experiment. En höghastighetskamera som bilderna ett större område av intresse kan vara fördelaktigt i detta avseende. Andra begränsningar inkluderar fel i samband med multipla signaler som uppstår på grund av tätt åtskilda roterande pärlor i synfältet för de PMT. Slutligen kommer fel i fastställandet av det korrekta läget av den inspelade vulst med avseende på de två Fotomultiplikatorrör slitsar resultera i oprecis uppskattning av omkopplings dynamik.
Fördelar med installationen som beskrivs här inkluderar möjligheten att spåra rotationen av pärlorna under långa tidsperioder och i realtid. Dettamöjliggör snabb eliminering av felbenägna banor, något som kanske är svårt att uppnå med ultrasnabba kameror. Dessutom, med några få modifieringar denna installation kan integreras med analyser utformade för att utsätta cellerna för en mängd olika stimuli. Kombineras med termoelektrisk kylning 26, kan tekniken användas för att mäta svaren av individuella motorer till termiska stimuli. Integration med optisk pincett kan göra det möjligt för mätningar av ombyggnad av individuella motorer som svar på mekaniska stimuli, som gjorts nyligen sex. Slutligen kan anpassa motorn till kemiska stimulantia mätas med hjälp av en lämplig perfusion kammare och pumpar 11.
En majoritet av kända bakteriearter är rörliga och flagellar-medierad motilitet dominerar i naturen. Metoderna visade här förväntas fortsätta att bidra till utvecklingen av insikter struktur ombyggnad och anpassning of flagellar motorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
References
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C.
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C.
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C.
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
