Summary
Behavioral test er den gyldne standard til bestemmelse af udfald efter hjerneskade, og kan identificere tilstedeværelsen af udviklingsforstyrrelser hos spædbørn og børn. Neurologiske reflekser er en tidlig indikator på disse abnormaliteter. Et væld af nemt opnå udviklingsmæssige refleks test i den neonatale gnaver blev udviklet og beskrevet her.
Abstract
Neurologisk refleks test er almindeligt anvendt i klinisk praksis at vurdere modningen af nervesystemet. Neurologiske reflekser er også nævnt som primitive reflekser. De er følsomme og i overensstemmelse med senere resultater. Unormale reflekser er beskrevet som et fravær, vedholdenhed, tilbagevenden eller latens reflekser, som er prædiktive indekser for spædbørn, der er i høj risiko for neurologiske lidelser. Dyremodeller for neurologiske handicap, såsom cerebral parese, ofte vise afvigende udviklingsmæssige reflekser, som ville blive observeret i humane spædbørn. De beskrevne teknikker vurdere en række neurologiske reflekser i neonatale rotter. Udviklingsforstyrrelser refleks test giver investigator en testmetode, der er ellers ikke tilgængelig i sådanne unge dyr. Den metode, der præsenteres her har til formål at hjælpe efterforskerne med at undersøge udviklingsmæssige milepæle i neonatale rotter som en metode til påvisning af tidlig debut brain skade og / eller bestemmelse af effektiviteten af terapeutiske interventioner. Den metode, der præsenteres her til formål at give en generel retningslinje for efterforskerne.
Introduction
Neurologiske reflekser eller udviklingsmæssige milepæle, er en af de tidligste vurderinger anvendes på menneskelige nyfødte og spædbørn. Neurologiske reflekser er ufrivillige og gentagne bevægelser som demonstrerer hjernestammen og rygmarv reflekser. Modning af højere kortikale netværk er kendetegnet ved udvikling migration, myelinering, og synaptogenese fremme frivillig kontrol og kortikal hæmning. Forandringer i den normale progression af centralnervesystemet evolution kan forstyrre hjernens udvikling, hvilket resulterer i unormal kortikal ledninger, funktion, og myelinering, der forårsager neurologiske refleks forsinkelser eller fravær. Menneskelige spædbørn med høj risiko for neurologisk handicap ofte vise unormale tidlige reflekser. Unormale reflekser kan præsentere som en forsinkelse i anskaffelse, fravær, langvarig tilstedeværelse eller tilbagevenden senere i livet, og er prædiktive for udviklingsforstyrrelser. 1, 2 DerforEr det vigtigt at efterligne refleks forsinkelser i eksperimentelle modeller af neurologiske handicap.
Gnavere anvendes almindeligvis som forsøgsmodeller. Rotteunger er altricial når født, og derfor alt for umoden til at foretage specifikke eller komplekse motor, sensoriske og / eller kognitive adfærdsmæssige opgaver. I denne henseende, deres udviklingsmæssige umodenhed vedrører både deres fysiske og orgel udvikling. Rotter er født hårløse med en manglende evne til at thermoregulate, er blinde, og ude af stand til at gå. Med henvisning til hjernens udvikling, væsentlig kortikal modning sker postnatalt. Nyfødte rotteunger (dagen for fødslen benævnt postnatal dag 1, fig PD1) er blevet foreslået til at nå en hjerne modning niveau, der svarer til en præmatur menneskelige hjerne af 23 - 28 uger drægtighed, mens PD7-10 unger svarer til nær- udtrykket menneskelige hjerne. 3, 4, 5, 6Denne korrelation er baseret på grove anatomiske analyser har imidlertid også blevet beskrevet andre mål for hjernens modning såsom myelinering og amplitude integreret elektroencephalogrammer. 5, 7 F.eks pre-oligodendrocytter er de fremherskende celler i udviklingslandene human føtal hjerne fra 23 - 32 uger i livmoderen, og denne maturational trin svarer til en PD1-3 gnaver. 5, 8, 9, 10 Endvidere myelinering begynder i livmoderen hos mennesker hvorimod hos rotteunger det vises i forhjernen omkring PD7-10; den nyfødte gnavere hjernen stort set ikke-myelinerede. 11, 12 Tucker et al. fandt, at amplituden integreret elektroencefalogram mønster af en P1 rotte at svare til en 23-ugers Gestation menneskelige foster, hvorimod en PD7 og PD10 Ungen er beslægtet med en 30 - 32 uger og sigt spædbarn, hhv. 7 Af disse grunde nyfødte refleks test i neonatale rotteunger giver en mulighed for at indfange ontogeni og / eller forstyrrelse af hjernens udvikling.
Batteriet af reflekser nedenfor beskrevne tilpasset fra undersøgelser af WM Fox og A. Lubics 13, 14 WM Fox var en af de tidligste undersøgere med hensyn til ontogenese af reflekser i musen. 13 Disse reflekser indbefatter, men er ikke begrænset til, lemmer gribe og placering, cliff undgåelse, oprettende, accelereret oprettende, gangart, auditory startle, kropsholdning, og øje åbning. Både forben og bagben greb (benævnt palmar og plantar greb i mennesker henholdsvis) lettes af spinalreflekser og kortikospinale inhibering fra ikke-primære motoriske områder. 15, 16 bagben anbringelse (babinskirefleks) afspejler modning af kortikospinale tarmkanalen. 16, 17, 18 Cliff unddragelse (beskyttende responser), oprettende (labyrint), og accelereret oprettende involverer integration og kommunikation mellem sanseindtryk og motorydelse (såsom dem involveret i Knurhårfremkaldt og vestibulære system). 19, 20, 21 Bevægelse afspejler bevægelse. 14 Auditory forskrækkelse vurderer akustisk stimulering og synaptiske forbindelser af gigantiske neuroner i kernen reticularis pontis caudalis. 21 Posture omfatter passende corticale-spinal / spinal-corticale projektioner, muskelstyrke og neuromuskulære innervation. 22, 23 Maturation af gamma-aminosmørsyreresistente receptorer kan korrelere med øje åbning. 24. Det er vigtigt at huske på, at de reflekser afspejler en langt mere kompliceret netværk og forudsat her er en generel sammenhæng. Desuden er disse reflekser giver en hurtig og nem metode til vurdering neurologisk udvikling på meget unge aldre, hvor mere komplekse adfærdsmæssige test er ikke mulig.
Formålet med dette dokument er at tilvejebringe en generel retningslinje for neurologisk refleks test, der let kan inkorporeres i eksperimentelle neonatale rottestudier. Den beskrevne metode blev gennemført i Long-Evans neonatal rotteunger og kvantificering af resultaterne var baseret på første dag i udseende. Den dag, refleks testning påbegyndes, og den anvendte udstyr kan modificeres til bedre at passe en anden eksperimentel model (såsom for forskellige stammer og arter). Ved at etablere den normale fysiologiske progression i reflex modning i et specifikt dyremodel, kan undersøgere vurdere virkningerne af eksterne stressfaktorer, endogene manipulationer og / eller terapeutiske indgreb for nervesystemets udvikling i neonatale rottemodeller. Samlet set brugen af reflekser som en bestemmelse af hjerne modenhed er fordelagtig forudsige perinatal hjerneskade, og er reflekterende af senere neurologiske udfald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den Animal Care og brug Udvalg, Health Sciences ved University of Alberta godkendt alle dyreforsøg.
Bemærk: Når denne protokol kan tilpasses til andre arter og stammer, er denne protokol skrevet til Long-Evans-rotter. Disse rotter er blevet vist at have overlegne motordrevne forestillinger og synsskarphed sammenlignet med andre gnaver stammer. 25, 26 Protokollen for tidsstyret graviditeter, kosttilskud, maternel inflammation og neuro-udviklingsmæssige reflekser er som følger.
1. Forsøgsdyr
- Når rotter ankommer til huset facilitet dyr, afholde sig fra enhver interaktion for en dag eller to at tillade dem at akklimatisere sig til deres nye omgivelser. Efter akklimatisering, håndtere rotterne hver dag i ca. fem dage eller når rotterne ikke længere viser tegn på stress. Menneskeskabt stress kan ændre testresultater og leannonce til abort.
- Når rotterne er komfortable, avl begynder. Placere to hunner og en han rotte i en dobbelt decker avl bur (h = 38 cm, 1.800 cm2 gulvareal) natten over (3 PM - 8 AM). Disse bure forebygge stress og overbelægning. Om morgenen under anvendelse af en overførselspipette, skylle vagina af hunrotter med ca. 0,25 ml saltvand. Opløsningen overføres til et mikrocentrifugerør.
- Placer de to hunner og mandlige tilbage i deres respektive konventionelle bure.
- Se opløsningen opsamlet i afsnit 1.2 under et lysmikroskop (100 x) for at bestemme hvilken fase af estrale periode rotten oplever og hvorvidt sperm eller ikke er til stede. Hvis der er sædceller, optage datoen som embryonisk dag (E1) (figur 1). Hvis gravid, giver den kvindelige hendes eget bur på E14.
BEMÆRK: Cellerne i det vaginale smear er klare, derfor bruge en lav lys indstilling. Sørg for, at kondensatoren er justeret til den laveste indstilling. Adbare lysstyrken kontrol for at dæmpe lyset. Hvis en lysstyrke dial er tilgængelig, sæt den til 1.
2. Kosttilskud
BEMÆRK: Denne protokol er beregnet til at vurdere de terapeutiske virkninger af kosten broccoli spire forbrug i den sidste uge af graviditeten. Vokse spirerne ifølge Wu et al. 27.
- Suge broccoli spirer frø til 2 - 3 timer. Spred frøene ud på en bordplade frø spireindretning boks og indstillet på en varm overflade til spiring.
- Vande frøene to gange daglig, en gang i AM (8 - 09:00) og en gang i PM (3 - 16:00).
- På dag fem, placere spirer ved et vindue for dagen (rosenkål skal have to blade hver og vil blive grønt i løbet af dagen).
- I slutningen af dagen, høste spirer ved forsigtigt at trække de broccoli spirer ud af den sigtede kassen og lå på en flad overflade for at tørre.
- Når spirerne er fuldstændig tørret, weigh ud 200 mg og sted i en forseglet plastpose.
- Begyndende på E14, indføre hvert gravid rotte 200 mg tørrede broccoli spirer dagligt indtil PD21 (dagen unger er vænnet).
3. Inflammation
- For at inducere inflammation og reproducere stof hvid skade i afkom, injicere gravide rotter med lipopolysaccharid (LPS) hver 12 h på E19 og E20. På dagen for injektion, bringe buret ind i laboratoriet fra huset facilitet. Tillade gravide rotter akklimatisere og blive rolig i mindst 1 time. Hvis en rotte viser kliniske tegn på permanent systemisk eller nyreskader, vil det blive aflivet straks og fjernet fra undersøgelsen.
- Afvej den gravide dæmningen.
- Opløs 200 ug / kg LPS (serotype 0127: B8) i 100 pi saltvand. Aspirer opløsningen i en 1 ml sprøjte med en 30 G ½ nål.
- Brug en ny nål til hver injektion. Lad opløsningen varme op til et par minutter for at minimere ubehag.
- Optag den tid og injicere den gravide dæmning intraperitonealt. Alternative injektioner mellem siderne for at sikre lige fordeling.
BEMÆRK: Machholz et al. beskriver ordentlig fastholdelsesanordninger og injektionsprocedurer. 28
4. Developmental Reflex Tests
- På PD1 (dagen for fødslen), fjerne unger fra dæmningen og optage fødselsvægt. Placer hvalpene tilbage i deres respektive bure og flytte dem til dyret facilitet indtil PD3. Dette sikrer maternal binding mellem dæmningen og pup.
- Optag den refleks test for pålidelig vurdering. Juster videokamera således at det er ved maksimal lukkerhastighed til frame-by-frame analyser (1 / 1.000 s). Placer videokameraet, så det er direkte over eller ved siden af rotte hvalp og alle brugte for hver refleks materialer. For eksempel, for bagben placering, anbringe kameraet ved siden af rotteunge at sikre løft og placering af bagben er fanget.
- For accelereret oprettende, anbringe kameraet over rotteunge og landing pad for at indspille evne hvalpen til højre i luften.
- Optag vægte dagligt indtil afslutningen af forsøget. På PD3, begynder neurologisk refleks (figur 4). Flyt bure i et stille rum i mindst 1 time før testning så de tilvænnes til miljøet.
- Udføre neurologisk refleks afprøvning ved en konsekvent tidspunkt hver dag som rotter er natlig. For eksempel, test mellem 09:00 til 12:00 dagligt. Holde hvalpene direkte under en varmelampe eller på en varmepude på alle tidspunkter, for at opretholde en stabil kropstemperatur på 36,5 ° C; rotteunger i denne alder mister varme nemt. Måle med en rektal temperatursonde. Hvis det gøres effektivt, behøver hvalpe kropstemperaturer ikke ændre sig, fordi de ikke fjernes fra dæmningen og strøelse længe nok. BEMÆRK: Overvåg temperaturen af varmelampe for at sikre at det ikke overstiger 37 ° C.
- forben gribe
- Begyndende på PD3, gennemføre forben fatte refleks test. Placer en stump stang mod håndfladen af hver forpote og let tryk manuelt. Lyset tryk bør være lidt fortrænge forpote at sikre, at der skabes kontakt, og hvalpene kan føle stangen. Gribning vises som fleksion af alle tal omkring stangen. Vellykket overtagelse af denne refleks opstår, når begge forpoter fat i stangen i to dage i træk.
- Scor det forben fatte:
0 for ingen gribning
1 for en vellykket gribning af én forpote (venstre eller right forpote kan angives her)
2 for en vellykket gribe af både forpoterne
- bagben gribe
- Begyndende på PD3, gennemføre bagben fatte refleks test. Placer en stump stang imod sålen af hver bagpote og let tryk manuelt. Lyset tryk bør være lidt fortrænge bagpoten at sikre, at der skabes kontakt, og hvalpene kan føle stangen. Vellykket gribning af stangen vises som fleksion af cifrene omkring stangen. Vellykket overtagelse af denne refleks opstår, når begge bagpoter fat i stangen i to dage i træk.
- Score bagbenet fatte:
0 for ingen gribning
1 for en vellykket gribe med en bagpote (venstre eller højre bagpote kan specificeres her)
2 for en vellykket gribe af både bagpoter
- oprettende
- Begyndende på PD3, begynder den oprettende refleks test. Hold godt fast hvalpen i en liggende stilling, med alle fire poter oprejst. Lad gå of hvalpen og straks starte timeren. Oprettende opnås, når pup er i stand til at vende / rulle over på alle fire poter, og hver pote er vinkelret på kroppen. Giv hver hvalp maksimalt 15 s for at nå dette mål.
- Score den oprettende:
0 for liggende på ryggen (eller 15 s for den maksimale tildelte tid)
1 til at ligge på siden (venstre eller højre side kan specificeres her) eller evne til hvalpen til højre, men i den forkerte arbejdsstillinger (eller 15 s for den maksimale tildelte tid)
2 for en vellykket oprettende og passende kropsholdning
- bagben placering
- Fra den PD4, begynde bagben placere refleks test. Hold hvalpen lodret i luften, som torsoen. Forsigtigt slagtilfælde dorsum af bagpoten med en stump overflade (såsom kanten af et bord). En korrekt placering refleks er, når rotteunge trækker den stimulerede bagben, efterfulgt af anbringelse af bagbenet på denne overflade.
- Score bagbenet placing refleks:
0 til ingen succeser
1 til placering af en bagpote (venstre eller højre bagpote kan specificeres her)
2 for en vellykket bagben placering for begge bagpoter
- Cliff Undgåelse
- Fra den PD4, begynde klinten undgåelse test. Placer rotteunge ved kanten af en flad overflade, således at forpoterne og snude af pup er over kanten. Den korrekte resultat er en beskyttende respons, hvor rotteunge vender væk fra kanten af klippen. Eksperimentatoren hånd eller et skum landing er placeret under klippen for at fange hvalpen fra efteråret.
- Score klippen undgåelse:
0 for ingen bevægelse eller falder ud over kanten
1 for forsøg på at flytte væk fra klippen, men med hængende lemmer
2 for en vellykket bevægelse væk fra klippen
- gangart
- Begynd evalueringen af gangart på PD6. Placer hvalpe i midten af en 15 cm diametis cirkel og lad hvalpen 30 s for at fuldføre opgaven. 14 En vellykket gangart udføres, når rotteunge er i stand til at bevæge begge forpoter uden for cirklen på mindre end 30 s.
- Score gangart som tiden i sekunder, det tager den rotteunge at bevæge sig uden for cirklen. Optag den tid det tager hvalpen at bevæge begge forpoter uden for cirklen. Optag 30 s, hvis hvalpen ikke er i stand til at fuldføre opgaven inden for den givne tid
- auditory startle
- Begynd analysen af auditive startle på PD10. Præsentere en kraftig støj (klokke) direkte over pup at vurdere, hvorvidt en startle response er til stede. En positiv startle respons er observeret, når hvalpen viser en 'ryk' bevægelse, væk fra lyden.
- Score auditory startle:
(Eller ingen) for ingen forskrækkelsesrespons
(Eller ja) for en positiv startle response
- Positur
- Begynd kropsholdning analyse på PD12. Placer unger på en skridsikker åben flade og observere arbejdsstillinger hvalpen har ved flytning. En umoden kropsholdning afspejles ved at trække i maven ved flytning, og vinkelret peger begge forpoter og bagpoter forhold til kroppen. Et modent kropsholdning erhverves når pup kan løfte maven fra overfladen og begge forpoter og bagpoter peger lige eller parallelt med kroppen, når man bevæger sig.
- Score kropsholdning:
0 for ingen bevægelse
1 for umodne arbejdsstillinger ved flytning
2 til moden arbejdsstillinger under bevægelse
- Eye Opening
- Begynd øjenåbnende analyse på PD12. Optag dagen begge øjenlåg åbent:
0 til ingen synlige øjne
1 for en synlig øje (venstre eller højre side kan specificeres her)
2 for to synlige øjne
- Begynd øjenåbnende analyse på PD12. Optag dagen begge øjenlåg åbent:
- Accelereret oprettende
- Begyndende på PD14, begynder accelereret oprettende test. Placer hvalpen i en liggende stilling 30,48 centimeters over et skum landing. Drop hvalpen og observere dens evne til at rette sig selv. Oprettende refererer til, når hvalpen er i stand til at slå over til bugleje og lander på sine poter.
- Score fremskyndet oprettende:
0 for faldende på ryggen
1 for at falde om på siden (venstre eller højre side kan specificeres her)
2 til landing på poterne
Bemærk: Forskellige typer af kvantificering af reflekser er tilgængelige, afhængigt af spørgsmålet om efterforskerne. Kvantificering af de reflekser kan gøres som indledende observation af en refleks, første dag i udseende indtil forsvinden af refleks, tid, det tager at held udføre opgaven, hastighed af ydeevne, og / eller forbedring af resultater over tid. 13, 14, 29, 30, 31 På cNUVÆRENDE undersøgelse blev den første dag i udseende som en score. Ved brug af flergangsfødende modeller, hvalpe fra samme kuld opfører typisk på samme måde på grund af deres genetiske sammensætning, i livmoderen og efter fødslen miljø, og ernæringsmæssig tilgængelighed. 32 Derfor kan ikke angives et enkelt pup, så en n = 1 på grund af kuld bias. Unger undersøgt inden et kuld kan midles således at hvert kuld betegner en n = 1. 32, 33 Alternativt kan flere unger i samme kuld analyseres ved hjælp af blandede effekter model, som tager hensyn unger i samme kuld. 32, 33
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidslinje for denne eksperimentelle design er vist i figur 2. 30 De metoder og resultater er tidligere blevet publiceret. 30 Formålet med undersøgelsen var at vurdere, om kosttilskud med broccoli spirer under drægtighed og før fravænning periode beskyttet afkommet fra neuroudviklingsforsinkelse fremkaldt af in utero eksponering for LPS. Timede gravide rotter blev givet intraperitoneale injektioner af saltvand (kontrol, 100 pi) eller LPS (200 ug / kg fortyndet i 100 pi sterilt saltvand) på E19 og E20 hver 12 timer. Tilfældigt udvalgte drægtige moderdyr fik også kosttilskud af tørrede broccoli spirer (200 mg / dag) fra E14 til PD21. LPS blev brugt til at efterligne moderens inflammation og broccoli spirer blev givet som en potentiel terapeutisk intervention for at beskytte afkommet. Hvalpe født naturligt på E23 (
fødselsvægt
Analyse af fødselsvægt afslørede en primær effekt af behandlingen (F (1,23) = 18,5, 0,0003), diæt (F (1,23) = 6,5, p = 0,02), og en interaktion virkning (F (1,23) = 7,4, p = 0,01). LPS, som en refleksion af maternal inflammation, resulterede i hvalpe (5,1 ± 0,2 g) født betydeligt mindre i forhold til Saline hvalpe (6,3 ± 0,2 g, Tukeys p <0,001), Saline + broccoliskud unger (6,2 ± 0,2 g, Tukeys p <0,001), og LPS + broccoliskud unger (6.0 ± 0,1 g, Tukeys p <0,01). Fødselsvægt af LPS + Broccoli spirer unger var ikke forskellig fra kontroller, hvilket tyder på, at de broccoliskud sparet LPS unger fra at blive vækst begrænses.
Neurologisk Reflex Test
gribe Reflex
Ingen effekt af behandling eller kost blev observeret for både forben og bagben fatte. Alle hvalpe var i stand til at udføre disse opgaver.
bagben Anbringelse
(F (1,23) = 6,8, = 0,02 p) blev påvist En hovedvirkning for behandling af bagbenet placering. Sammenlignet med Saline (4,3 ± 0,1 dage, Tukeys p <0,05) og Saline + broccoliskud (4,3 ± 0,0 dage, Tukeys p <0,05), blev LPS hvalpe signifikant forsinket (5,1 ± 0,3dage). Selv om udførelsen af LPS + broccoli spirer unger ikke adskilte sig fra LPS unger, de ikke længere adskilte sig fra kontroller, hvilket tyder på en forbedring af denne refleks opgave fra disse unger, der modtager LPS og ingen behandling.
Cliff Undgåelse
(F (1,25) = 6,0, p = 0,02) efter cliff undgåelse analyse blev påvist En primær virkning af behandling. LPS unger (5,8 ± 0,4 dage) var signifikant kompromitteret i at opnå denne refleks sammenlignet med saltvand (4,4 ± 0,2 dage, Tukeys p <0,05). LPS + broccoliskud unger ikke udførte anderledes end nogen af grupperne, hvilket antyder en forbedring i ydelse.
gangart
En væsentlig effekt af behandlingen (F (1,24) = 15,1, p = 0,0007), diæt (F (1,24) = 6,3, p = 0,02), og en interhandling mellem behandling og diæt (F (1,24) = 9,5, p = 0,005) blev fundet efter gangart analyser. En forsinket erhvervelse af gangart blev påvist hos LPS hvalpe (9,7 ± 0,4 dage) sammenlignet med Saline (7,5 ± 0,3 dage, Tukeys p <0,001), Saline + broccoliskud (7,7 ± 0,3 dage, Tukeys p <0,001), og LPS + broccoliskud unger (7,9 ± 0,2 dage, Tukeys p <0,01).
auditory startle
Der blev ikke observeret.
oprettende
Der blev fundet en sex virkning (F (1,43) = 16,3, p = 0,0002) til oprettende derfor mandlige og kvindelige unger blev undersøgt separat. Der blev ikke påvist forskelle for mænd. Hos kvinder en primær effekt af diæt (F (1,21) = 11,8, p = 0,002) og en interaktion virkning (F (1,21) = 15,6,p = 0,0007) blev fundet. LPS + broccoliskud unger (4,9 ± 0,4 dage) var i stand til lige tidligere i forhold til LPS unger (6,7 ± 0,6 dage, Tukeys p <0,05).
Accelereret oprettende
Den accelererede oprettende test afslørede en signifikant hovedvirkning af behandlingen (F (1,25) = 4,51, p = 0,04). LPS (17,4 ± 0,6 dage) og LPS + broccoliskud unger (16,9 ± 0,2 dage) blev forsinket i udførelse accelereret oprettende sammenlignet med Saline (16,0 ± 0,4 dage) og Saline + broccoliskud (16,4 ± 0,5 dage).
Positur
En signifikant interaktion behandlingens virkning og diæt (F (1,24) = 5,8, p = 0,02) blev påvist efter en analyse af kropsholdning. LPS + broccoliskud unger (14,9 ± 0,4 dage) havde en moden kropsholdning tidligere end LPS (17,0 ± 0,4 dage, Tukeys p <0,05).
Eye Opening
En signifikant hovedvirkning af diæt (F (1,23) = 4,71, p = 0,04) blev observeret med hensyn til øje åbning. Både saltvand + BrSp (15,9 ± 0,1 dage) og LPS + broccoliskud unger (15,4 ± 0,2 dage) opnås denne refleks tidligere end Saline (16,0 ± 0,2 dage) og LPS hvalpe (16,0 ± 0,1 dage).
Samlet set broccoli spire forbrug i slutningen af drægtigheden og den før fravænning periode var i stand til at yde beskyttelse mod LPS-induceret udviklingsmæssige forsinkelser i flere af de undersøgte reflekser. Der henvises til den refererede artikel for yderligere detaljer. 30
Figur 1. Positiv Vaginal Smør. Et eksempel på en vaginal smear afbildes med et 10X objektiv på et lysmikroskop. Denne slæde er et positivt slide påvises ved tilstedeværelse af sædceller (pil). Når der udføres en vaginal smear, kan den estrale periode af rotte vurderes som enten proøstrus, østrus, metøstrus eller diøstrus. Dette hjælper med præcist timing avl for en højere graviditet succesrate.
Figur 2. Eksperimentel udformning tidslinjen. Den eksperimentelle tidslinje for at vurdere, afkom født til dæmninger givet intraperitoneale injektioner af LPS. Kosttilskud med broccoli spirer begynder på E14 op til PD21. Dæmninger injiceres på E19 og E20 hver 12 timer (betegnet som gule pile). Maternelle vægte registreres med en vægt skala og legemstemperatur med en rektal temperatursonde dækket med smøremiddel. Hvalpe bliver født naturally på E23 (betegnet som en sort pil). Begyndende på PD3, unger gennemgår flere refleks test. På PD21, unger gennemgår åben mark test for at vurdere adfærdsmæssige reaktioner.
Figur 3. Eksempel på en tidslinje for Vurdering af Udviklingsforstyrrelser reflekser. Reflekser vises på forskellige stadier af udvikling, således, at opfange erhvervelsen af disse reflekser kræver, at test begynder et par dage før. Denne undersøgelse anvendte Long-Evans-rotteunger, men forskelle mellem stammer og arter eksisterer derfor et indledende forsøg skal udføres under anvendelse af disse datoer, som en generel vejledning. Forben greb, bagben greb, og oprettende vurderes PD3, bagben placering og klippe undgåelse om PD4, og gangart på PD6. Auditiv forskrækkelse vurderes på PD10, kropsholdning og øje åbninger på PD12, og accelereret oprettende på PD14.
Figur 4. Billeder af Developmental reflekser. Billeder af refleks test udført på PD3 i Long-Evans rotteunger. Forben greb (A), bagben greb (B), og oprettende (C) undersøgelse begynder på PD3. Cliff undgåelse (D) og bagben placering (E) afprøvning begynder på PD4. Gait (F) analyser begynder på PD6. Apparatet til accelereret oprettende er afbildet (G). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Undersøgelse Parameter | Grupper (middelværdi ± SEM) | Vigtigste effekter (p-værdi) | |||||
| Kuldstørrelse og Vægte | Saline | Saline + broccoli spirer | LPS | LPS + broccoliskud | Behandling | Kost | Interaktion |
| Kuldstørrelse (antal unger) | 13,3 ± 1,0 | 13,1 ± 1,0 | 10,3 ± 1,5 | 11 ± 1,2 | 0.03 | 0,8 | 0,7 |
| Fødselsvægt * # d | 6,3 ± 0,2 | 6,2 ± 0,2 | 5,1 ± 0,2 | 6,0 ± 0,1 | 0,0003 | 0,02 | 0,01 |
| PD7 Vægte * d | 15,0 ± 0,5 | 15,5 ± 0,4 | 11,4 ± 1,1 | 13,6 ± 0,3 | 0,0006 | 0,09 | 0,2 |
| PD21 Vægte d | 50,0 ± 1,4 | 48,7 ± 1,6 | 46,4 ± 1,2 | 48,2 ± 1,4 | 0,2 | 0,9 | 0,3 |
| Neurodevelop- mentale Reflekser | |||||||
| Forben Tag fat et | 3,0 ± 0,0 | 3,0 ± 0,0 | 3,0 ± 0,0 | 3,0 ± 0,0 | n / a | n / a | n / a |
| Bagben Tag fat et | 3,6 ± 0,3 | 3,5 ± 0,3 | 4,6 ± 0,6 | 3,3 ± 0,1 | 0,3 | 0,1 | 0,1 |
| Bagben Anbringelse * en | 4,3 ± 0,1 | 4,3 ± 0,0 | 5,1 ± 0,3 | 4,5 ± 0,2 0,02 | 0.07 | 0,2 | |
| Cliff Undgåelse * en | 4,4 ± 0,2 | 4,7 ± 0,2 | 5,8 ± 0,4 | 5,0 ± 0,4 | 0,02 | 0,4 | 0,1 |
| Bevægelse * # en | 7,5 ± 0,3 | 7,7 ± 0,3 | 9,7 ± 0,4 | 7,9 ± 0,2 | 0,0007 | 0,02 | 0,005 |
| Auditory startle en | 11,5 ± 0,3 | 11,5 ± 0,1 | 12,0 ± 0,5 | 11,8 ± 0,2 | 0,2 | 0,8 | 0,9 |
| Posture #A | 15,6 ± 0,5 | 15,9 ± 0,6 | 17,0 ± 0,4 | 14,9 ± 0,4 | 0,8 | 0,08 | 0,02 |
| Eye Åbninger en | 16,0 ± 0,2 | 15,9 ± 0,1 | 16,0 ± 0,1 | 15,4 ± 0,2 | 0,08 | 0.04 | 0,2 |
| Accelereret oprettende en | 16,0 ± 0,4 | 16,4 ± 0,5 | 17,4 ± 0,6 | 16,9 ± 0,2 | 0.04 | 1 | 0,3 |
| Oprettende #a (kvinder) | 4,9 ± 0,5 | 5,1 ± 0,4 | 6,7 ± 0,6 | 4,6 ± 0,4 | 0,09 | 0.003 | 0,0007 |
| Oprettende a (hanner) | 3,9 ± 0,2 | 4,6 ± 0,3 | 5,9 ± 1,9 | 4,2 ± 0,6 | 0,4 | 0,6 | 0,2 |
| en dag af udseende | * Signifikant forskellig mellem LPS og Saline | ||||||
| b Antal gange aktivitet blev udført | # Signifikant forskellig mellem LPS og LPS + BrSp | ||||||
| c Sekunder | |||||||
| d Grams | |||||||
Tabel 1. Vægt og Udviklingsforstyrrelser Reflex resultater. Resultater opnået fra afkom udsat for in utero inflammation og / eller diætetisk broccoli spirer tilskud. 30 Vægtene præsenteret her er fra fødslen, PD7, og PD21. De tidspunkter blev udvalgt til at repræsentere en for tidligt født, sigt, og 1-2-årige barn. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± SEM. Statistiske analyser anvendt i undersøgelsen var en to-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey post hoc-test.a = dag i udseende, b = antal gange aktiviteten blev udført, og c = den tid (s) aktiviteten blev udført, * = signifikant forskel mellem LPS og kontrol, # = signifikant forskel mellem LPS og LPS + broccoliskud. n = 5 - 7 kuld pr gruppe (værdier fra fire unger, to hanner og to hunner, inden et kuld blev midlet til at repræsentere kuld).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neurologisk refleks test er en prædiktiv mål for unormal cortical udvikling og modning, hvilket kan være af betydning under forhold, hvor åbenlys neuropatologi er ikke indlysende. Under neurologisk test, er det afgørende at sikre, at hvalpe bliver undersøgt på samme tid hver dag. Rotter er nataktive og derfor kan deres døgnrytme ændre ydeevne, hvis undersøgelserne udføres på forskellige tidspunkter i løbet af dagen. 34 Afprøvning skal afsluttes i et stille rum som høje lyde kan tilføje stress til hvalpene. 35 De hvalpe kræver et minimum af 1 time at akklimatisere sig til nye omgivelser, da transport, menneskelige håndtering, og hidtil ukendte indstillinger kan fremkalde stress i hvalpene. 35 Pups skal også testes direkte under en opvarmet lampe eller på en opvarmet pude. Jo yngre hvalpene, det mindre i stand de er i stand til at thermoregulate. 36 Af denne grund er unger gives 15s og 30 s til udførelse af oprettende på PD3 og gangart på PD6 henholdsvis. 36 Desuden kontrol hvalpe bør ikke vækst begrænset, når født, som vægt betegner en forstyrrende faktor. Kuld bør også slås ned med 8 - 10 for at give lige næring og repræsentation af køn. Når hvalpene fødes, er det vigtigt at tillade en dag for rotte for at danne en binding med dæmningen for at forhindre maternal forsømmelse.
Hvalpe skal testes en dag eller to før den dag, de erhverver den refleks for at fange udbrud af udseende. Afhængig af den eksperimentelle model, kan det være nødvendigt nogle ændringer. Nyfødte mus er meget mindre end rotter. Derfor, at størrelsen af det anvendte udstyr kan have justeres til størrelsen af de nyfødte mus. kan også være påkrævet Nogle fejlfinding. Forskellige stammer og arter kan have lidt anderledes timing for indtræden af reflekser. 13 Timingen er beskrevet i denne rapport er specic til Long-Evans-unger, med testning for nye reflekser begynder PD3, 4, 6, 10, 12 og 14 (figur 3). Investigator være nødvendigt at udføre refleks test på 2 - 3 kuld at etablere den naturlige refleks progression før eksperimentel afprøvning. Desuden, når der udfører statistiske analyser på de indsamlede data, skal forsøgslederen anvende passende teknikker til at forhindre kuld bias. Hvalpe fra samme kuld tendens til at udføre tilsvarende til hinanden, derfor kuldet betegner en n = 1, ikke den enkelte pup. 32, 33
Test neurologiske reflekser er vigtigt, fordi det er den eneste test til rådighed for nyfødte gnavere, da mere komplekse adfærdsmæssige test ikke findes i disse aldersgrupper. Ingen andre forholdsregler er tilgængelige i denne tidlige periode udover vægt og fysiske udseende. De her metoder er blevet anvendt af flere forskere, hvilket understøtter denbrug af neurologisk refleks test, især hos unge gnavere, hvor andre adfærdsmæssige test ikke er mulig. 13, 14, 29, 30, 31, 37, 38 Disse tests parallelt med refleks test udført i humane spædbørn, forudsiger neurologiske lidelser, såsom cerebral parese, og tilvejebringe yderligere oplysninger om ontogenese af neurale netværk. Fremkomsten af reflekser opstår under bestemte tidspunkter i løbet af før fravænning periode, hvilket afspejler modningen af nervesystemet. 39 En begrænsning af denne protokol er, at ikke alle forsøgsmodeller kan underkastes reflex test. Gnavere er født umodne, således at deres postnatal udvikling giver den fordel, at opfange udbrud af refleks udvikling. Andre dyremodeller sådansom lammet er født modne og udvikle sig forskelligt fra gnavere, således at nogle af det refleks test er ikke gældende for denne model. Også, refleks test er ikke et direkte mål for kognitive eller adfærdsmæssige abnormiteter, og det er usikkert, om eventuelle observerede abnormiteter er forbigående eller vedvarende.
Udover reflekser, kan adfærdsmæssige tests udføres for supplerende analyser med alderen. Dette er vigtigt, fordi afvigende refleks forsinkelser ikke altid fører til neurologiske lidelser. 2, 40 Testene indgives typisk begynder den PD21 (dagen for fravænning), når gnavere er i stand til at udføre kognitive og motoriske opgaver. Undersøgelserne omfatter bot ikke begrænset til den roterende stav, Morris water maze, og forhøjede plus labyrint. Kort fortalt er rotarodtesten udført ved at placere gnaver på en roterende stang, og optage dens ydeevne på stangen for en tidsperiode eller indtil gnaver fallsaf. Denne test evaluerer motorisk læring og styrke, samt integriteten af hjernens strukturer såsom basalganglierne og cerebellum. 41 Morris water maze består i at placere den gnaver i en pulje af mælkehvid vand, og registrere den tid, det tager den gnaver at finde en nedsænket platform. Stikord kan placeres over hver kvadrant af bassinet med den samme cue altid over platformen. Dette undersøger egocentric vs allocentric former for hippocampal medieret rumlig indlæring og hukommelse. 42 Den forhøjede plus labyrint test måler frygt og angst, samt iboende udforskende adfærd. Gnavere placeres i centrum af fire arme, to lukkede og to åbne, hævet over jorden. 43 Undgåelse og udforskende adfærd (vurderet som tid tilbragt i hver arm) af registreres gnavere. 43 Disse yderligere tests undersøge sensomotoriske og kognitiv funktion, gør det muligt for investigator somsess hvorvidt fornærmelse varer ind i voksenalderen, eller om det er forbigående.
Forsinket udvikling er prædiktive, og supplerende adfærdsmæssige test er nødvendig for at give supplerende bevis for tilstedeværelsen af en lidelse senere i livet. Desuden skal kontrolresponser optimeres før eksperimentere med strain og artsforskelle, genetiske ændringer, lægemiddeladministration, etc. Trods disse betingelser, er de beskrevne teknikker lærte hurtigt, let beherskes, billig og give vigtig information vedrørende udviklingen af nervesystem. De tilbyder en mulighed for at vurdere ontogeni og modning af nervesystemet i unger på en alder, hvor de ikke er i stand til at udføre modne adfærdsmæssige opgaver. Desuden spædbørn ofte gennemgå udviklingsmæssige refleks test, og dermed, gnaver refleks test giver et middel til translatabiliteten. Afslutningsvis er dette en glimrende metode til indledende screening af unormalneurologisk udvikling hos nyfødte, der kan føre til senere undersøgelse af kognition og adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke vores finansieringsorganer, som omfatter NeuroDevNet (en national Centres of Excellence), ALVA Foundation, Kvindernes og børns sundhed Research Institute, og University of Alberta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding | |||
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 12-711-9AM | Used for vaginal flushes. |
| Sterile Saline | Hospira | 7983254 | The solution used to collect cells during vaginal flushes. |
| 400 µL Microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-120 | Used to hold the saline solution. |
| Light microscope | Leica | Leica ATC 2000 | For observation of the saline solution. Can be any light microscope used in the lab. |
| Slides | Fisherbrand | 12-552-5 | The saline solution is placed on the slide. Can be any slides used in the lab. |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-F | To coverslip the slides. Can use any coverslips used in the lab. |
| Dietary Supplementation | |||
| Broccoli Sprouts seeds | Mumm's Sprouting Seeds | Broccoli sprouts seeds are ordered and grown in the lab. | |
| Countertop Seed Sprouter Box | Mumm's Sprouting Seeds | A box is used to germinate and grow the seeds prior to harvest. | |
| 250 mL beaker | The beaker is used to soak the seed. Any size beaker that would fit can be used. | ||
| Maternal Inflammation | |||
| Lipoplysaccharide (LPS) | Sigma | L3129 | The endotoxin used to mimic maternal inflammation. |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 309659 | Used to inject the pregnant rat. |
| Gauge (30 G x 1/2) | BD PrecisionGlide Needle | 305106 | Use the smallest needle to avoid pain and discomfort. |
| Sterile Saline (0.9% Sodium Chloride, USP) | Hospira | Saline is used to dissolve LPS. | |
| Weights | |||
| Scale | Denver Instrument | For recording the weights. Can be any scale with 2 decimal places used in the lab. | |
| Neurodevelopmental Reflexes | |||
| Thin blunt rod | Can be a paperclip or toothpick. This is for forelimb and hindlimb grasping. | ||
| Round filter paper | Whatman | 1001 150 | 15 cm diameter paper used for gait analysis. |
| Timer | Fisher Scientific | 06-662-51 | For timing the time allocated to righting and gait. |
| Blunt surface | Can be an edge of a table. This is for hindlimb placing and cliff avoidance. | ||
| Foam landing | For when the pups perform accelerated righting. | ||
| Video recorder | Sony | VCT-D580RM | To record all reflexes tested. Must be able to record at 1/1,000 fps |
| Bell | For auditory startle. | ||
| Heat lamp or pad | To maintain the body temperature of the pups underoing examination. |
References
- Farber, J. M., Shapiro, B. K., Palmer, F. B., Capute, A. J. The diagnostic value of the neurodevelopmental examination. Clin Pediatr (Phila. 24 (7), 367-372 (1985).
- Zafeiriou, D. I. Primitive reflexes and postural reactions in the neurodevelopmental examination). Pediatr. Neurol. 31 (1), 1-8 (2004).
- Clancy, B., Finlay, B. L., Darlington, R. B., Anand, K. J. S. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog. Neurobiol. , (2013).
- Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Arch. Dis. Child. 48 (10), 757-767 (1973).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr. Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with. Dev. Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Back, S. A., Riddle, A., McClure, M. M. Maturation-dependent vulnerability of perinatal white matter in premature birth. Stroke. 38, 724-730 (2007).
- Back, S. A., et al. Late oligodendrocyte progenitors coincide with the developmental window of vulnerability for human perinatal white matter injury. J. Neurosci. 21 (4), 1302-1312 (2001).
- Downes, N., Mullins, P.
- Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front. Neuroanat. 3 (5), (2009).
- Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim. Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
- Lubics, A., et al. Neurological reflexes and early motor behavior in rats subjected to neonatal hypoxic-ischemic injury. Behav. Brain Res. 157 (1), 157-165 (2005).
- Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int. J. Pediatr. , 191562 (2012).
- Hashimoto, R., Tanaka, Y. Contribution of the supplementary motor area and anterior cingulate gyrus to pathological grasping phenomena. Eur. Neurol. 40 (3), 151-158 (1998).
- Isaza Jaramillo, S. P., et al. Accuracy of the Babinski sign in the identification of pyramidal tract dysfunction. J. Neurol. Sci. 343 (1-2), 66-68 (2014).
- Donatelle, J. M. Growth of the corticospinal tract and the development of placing reactions in the postnatal rat. J. Comp. Neurol. 175 (2), 207-231 (1977).
- Palanza, P., Parmigiani, S., vom Saal, F. S. Effects of Prenatal Exposure to Low Doses of Diethylstilbestrol, o,p'DDT and Methoxychlor on Postnatal Growth and Neurobehavioral Development in Male and Female Mice. Horm. Behav. 40 (2), 252-265 (2001).
- Pantaleoni, G. C., et al. Effects of maternal exposure to polychlorobiphenyls (PCBs) on F1 generation behavior in the rat. Fundam. Appl. Toxicol. 11 (3), 440-449 (1988).
- Yeomans, J. S., Frankland, P. W. The acoustic startle reflex: neurons and connections. Brain Res. Rev. 21 (3), 301-314 (1995).
- Vinay, L., Brocard, F., Clarac, F. Differential maturation of motoneurons innervating ankle flexor and extensor muscles in the neonatal rat. Eur. J. Neurosci. 12 (12), 4562-4566 (2000).
- Geisler, H. C., Westerga, J., Gramsbergen, A.
- Heinen, K., et al. Gabaa receptor maturation in relation to eye opening in the rat visual cortex). Neuroscience. 124 (1), 161-171 (2004).
- Whishaw, I. Q., Gorny, B., Foroud, A., Kleim, J. A. Long-Evans and Sprague-Dawley rats have similar skilled reaching success and limb representations in motor cortex but different movements: some cautionary insights into the selection of rat strains for neurobiological motor research. Behav. Brain Res. 145 (1-2), 221-232 (2003).
- Prusky, G. T., Harker, K. T., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behav. Brain Res. 136 (2), 339-348 (2002).
- Wu, L., et al. Dietary approach to attenuate oxidative stress, hypertension, and inflammation in the cardiovascular system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (18), 7094-7099 (2004).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Rousset, C. I., et al. Maternal exposure to lipopolysaccharide leads to transient motor dysfunction in neonatal rats. Dev. Neurosci. 35 (2-3), 172-181 (2013).
- Nguyen, A. T., Bahry, A. M. A., Shen, K. Q., Armstrong, E. A., Yager, J. Y. Consumption of broccoli sprouts during late gestation and lactation confers protection against developmental delay induced by maternal inflammation. Behav. Brain Res. 307, 239-249 (2016).
- Black, A. M., Armstrong, E. A., Scott, O., Juurlink, B. J., Yager, J. Y. Broccoli sprout supplementation during pregnancy prevents brain injury in the newborn rat following placental insufficiency. Behav. Brain Res. 291, 289-298 (2015).
- Wainwright, P. E. Issues of design and analysis relating to the use of multiparous species in developmental nutritional studies. J. Nutr. 128 (3), 661-663 (1998).
- Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14, 14-37 (2013).
- Sergio, D. P., Sanchez, S., Ruben, V. R., Ana, B. R., Barriga, C. Changes in behaviour and in the circadian rhythms of melatonin and corticosterone in rats subjected to a forced-swimming test. J Appl Biomed. 1 (47), (2005).
- Castelhano-Carlos, M., Baumans, V. The impact of light, noise, cage cleaning and in-house transport on welfare and stress of laboratory rats. Lab. Anim. 43 (4), 311-327 (2009).
- Zimmerberg, B., Ballard, G. A., Riley, E. P. The development of thermoregulation after prenatal exposure to alcohol in rats. Psychopharmacology (Berl. 91 (4), 479-484 (1987).
- Fan, L. W., et al. Hypoxia-ischemia induced neurological dysfunction and brain injury in the neonatal rat). Behav. Brain Res. 165 (1), 80-90 (2005).
- Smart, J. L., Dobbing, J. Vulnerability of developing brain. VI. Relative effects of foetal and early postnatal undernutrition on reflex ontogeny and development of behaviour in the rat. Brain Res. 33 (2), 303-314 (1971).
- Fox, M. W. Neuro-Behavioral ontogeny: A synthesis of ethological and neurophysiological concepts. Brain Res. 2 (1), 3-20 (1966).
- Piper, M. C., Mazer, B., Silver, K. M., Ramsay, M. Resolution of neurological symptoms in high-risk infants during the first two years of life. Dev. Med. Child Neurol. 30 (1), 26-35 (1988).
- Shiotsuki, H., et al. A rotarod test for evaluation of motor skill learning. J. Neurosci. Methods. 189 (2), 180-185 (2010).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat. Protoc. 1 (2), 848-858 (2006).
- Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat. Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).
