Summary
Dettagli Questo protocollo un metodo personalizzabile per misurare la migrazione delle cellule in risposta a fattori chemiotattici che possono anche essere utilizzati per determinare la velocità di diffusione di un farmaco da una matrice polimerica.
Abstract
La migrazione cellulare è una parte vitale della risposta immunitaria, la crescita e la guarigione delle ferite. La migrazione cellulare è un processo complesso che coinvolge interazioni tra le cellule, la matrice extracellulare, e fattori chimici solubile e non solubile (per esempio, fattori chemiotattici). Metodi standard per misurare la migrazione delle cellule, quali il test camera di Boyden, lavoro contando le cellule su entrambi i lati di un divisore. Queste tecniche sono facili da usare; tuttavia, offrono poche modifiche geometrico per diverse applicazioni. In contrasto, dispositivi microfluidici possono essere usati per osservare la migrazione delle cellule con gradienti di concentrazione personalizzabili di fattori solubili 1, 2. Tuttavia, i metodi per fare test microfluidica a base possono essere difficili da imparare.
Qui, descriviamo un metodo semplice per la creazione di camere di coltura cellulare per misurare la migrazione delle cellule in risposta a gradienti di concentrazione chimica. Le nostre mi cellularimetodo della camera grazione può creare diversi gradienti di concentrazione lineare per studiare la migrazione delle cellule per una varietà di applicazioni. Questo metodo è relativamente facile da usare ed è normalmente eseguita da studenti universitari.
La camera di microcanali è stato creato inserendo un inserto acrilico nella forma della camera di microcanali finale e in una capsula di Petri. Dopo questo, poli (dimetilsilossano) (PDMS) è stata versata sopra dell'inserto. Il PDMS è stato permesso di indurire e poi l'inserto è stato rimosso. Questo ha permesso la realizzazione di pozzi in qualsiasi forma e dimensione desiderata. Le cellule possono essere aggiunti successivamente alla camera microcanali e agenti solubili possono essere aggiunti uno dei pozzi immergendo un blocco agarosio nell'agente desiderato. Il blocco agarosio viene aggiunto uno dei pozzi, e immagini time-lapse può essere preso della camera di microcanali per quantificare la migrazione cellulare. Modifiche a questo metodo possono essere fatte per una data applicazione, rendendo questo metodo higHLY personalizzabile.
Protocol
1. Produrre una Camera Microchannel per creare un gradiente di concentrazione
- Tagliare un pezzo muffa acrilica
- Ottenere un pezzo di acrilico della larghezza desiderata. Tipicamente utilizzare 1 lastre acriliche / 16 pollici di spessore. fogli più spessi sono difficili da tagliare bene e molto sottili fogli non hanno la resistenza meccanica, provocandone la rottura o ordito durante il processo.
- Creare un file CAD con la forma desiderata del pezzo acrilico per produrre una cavità all'interno del polidimetilsilossano (PDMS). Regolare la larghezza di canale e lunghezza per ottenere la sfumatura desiderato rilevante ai singoli protocolli sperimentali.
- Qui, utilizzare un pezzo acrilica delle seguenti dimensioni: due quadrati (0,254 cm x 0,254 centimetri) collegati da un canale largo 0,127 cm (lunghezza 0,254 cm) (Figura 1).
- Importare file CAD nell'apparecchiatura taglio laser e posizionare il pezzo acrilico in una taglierina laser secondo la manuil protocollo di costruttore.
NOTA: In alternativa, 3D-stampa il pezzo dalla progettazione CAD. Il vantaggio di questo metodo è che i materiali alternativi possono essere utilizzati per lo stampo; Tuttavia, la risoluzione e riproducibilità possono essere diminuiti con stampa 3D rispetto a taglio laser.
Figura 1: Computer-Aided Design (CAD) Rappresentazione della Microchannel Camera. Questa immagine descrive il disegno CAD dell'inserto acrilico necessaria per creare la camera di microcanali. 1 A) Vista superiore di disegno CAD, 1B) Vista laterale del disegno CAD con dimensioni in pollici, 1C) vista dall'alto di disegno CAD con dimensioni in pollici Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- In una barca pesare, miscelare 10 parti in peso di elastomero base commerciale (Sylgard 184) con 1 parte in peso di elastomero commerciale Catalizzatore (es Sylgard 194). In genere, mescolare 10 g di elastomero base a 1 g di elastomero Catalizzatore.
- Mescolare per combinare la base e il catalizzatore con una micropipetta per 5 min.
- Impostare una campana a vuoto e posizionare la barca pesare con PDMS nel vuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle d'aria intrappolate.
- Spegnere il vuoto e rimuovere la barca pesare. Versare il PDMS sopra dell'acrilico cut-out in una piccola capsula di Petri. Assicurarsi che i PDMS copre completamente l'inserto.
- Lasciare le PDMS per curare notturno (almeno 18 ore) a temperatura ambiente.
- Rimozione dell'inserto PDMS
- Dopo il trattamento il PDMS, rimuovere l'inserto tagliando attentamente le PDMS attorno al pezzo acrilico con un bisturi.
2. placcatura le cellule in una Camera Microchannel
- La camera di sterilizzazione per la placcatura cellule.
NOTA: Mentre PDMS possono essere sterilizzati con ossido di etilene o di altre tecniche, un trattamento UV rapido è veloce, poco costoso, e sufficiente per gli studi di coltura cellulare. La durata del trattamento UV breve non ha compromesso la struttura meccanica o l'integrità del pezzo PDMS.- In un armadio standard di coltura cellulare, coprire completamente la camera con il 70% di etanolo.
- Mettere la piastra di Petri in cappa a flusso laminare con i coperchi off.
- Chiudere il cofano e accendere la luce UV. Esporre alla luce UV per 1-2 ore.
- Aprire la cappa a flusso laminare e attendere 15 minuti per ristabilire il flusso.
- Rimuovere l'etanolo al 70%.
- Lavare le camere due volte con sterile tampone fosfato salino (PBS). Usare 1 ml di PBS per ogni lavaggio. Rimuovere PBS e consentono camere per asciugare tutta la notte con i coperchi off.
NOTA: In alternativa, invecedi utilizzare una cappa a flusso laminare, utilizzare una casella di camera UV per la sterilizzazione, se disponibile. Fare una scatola UV collocando una sorgente di luce UV nella parte posteriore di una scatola di cartone rivestito con un foglio di alluminio. Il foglio di alluminio riflette la luce per consentire un'illuminazione uniforme del campione.
- Placcatura cellule in Camera
- Contare le cellule utilizzando Trypan blu e un emocitometro.
- Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare a 400 ml di 0,4% Trypan blu e mescolare delicatamente. Applicare 100 ml di questa soluzione per l'emocitometro compilando delicatamente entrambe le camere sotto il vetrino di vetro.
- Utilizzare un microscopio con un obiettivo 10X per concentrarsi sulla griglia sul emocitometro. Utilizzare un contatore del riscontro della mano per contare le cellule senza macchia dal vivo all'interno di un set di 16 quadrati sul emocitometro.
- Contare le celle in tutte le 4 serie di 16 quadrati. Prendere il conteggio medio delle cellule dai 4 gruppi di 16 quadrati e moltiplicare per 4 5x10. Questo numero finale è il number di cellule / ml in sospensione cellulare.
- Aggiungere 2.500 cellule ad un pozzetto su ciascuna camera. Questo si traduce in una densità quasi confluenti di cellule di ~ 30.000 / cm 2.
- Consentono alle cellule di sedersi nella camera per 60 minuti prima di aggiungere supporti (Modified mezzo di Eagle Dulbecco, il 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina).
- Contare le cellule utilizzando Trypan blu e un emocitometro.
3. Blocchi Agarose Destrano Soaked
- Creazione di un blocco di agarosio
- Versare 3% agarosio nello stampo 3D stampata (2 mm x 2 mm x 2 mm).
- Consentire l'agarosio solidificare in una camera a vuoto per 30 minuti per rimuovere eventuali bolle.
- Rimuovere il blocco di agarosio dallo stampo.
NOTA: In alternativa, versare il 3% agarosio in piccola scatola di Petri con uno spessore di 2 mm. Tagliare un blocco 2 x 2 mm x 2 mm con un bisturi o altro utensile da taglio. Questo non è preciso come il sistema di stampo ma può essere un po 'più facile da fare.
- completamente submerge il blocco di agarosio in una soluzione di concentrazione desiderata del fattore chemiotattico. Per valutare la formazione gradiente di concentrazione, lavare la camera di prima con destrano fluorescente. La concentrazione ed il peso molecolare di destrano dovrebbe corrispondere a quella di un fattore solubile o farmaco di interesse.
- Mettere a bagno durante la notte il blocco di agarosio.
4. Time-lapse della diffusione Destrano di valutare la concentrazione Gradient Factor Solubile
- Posizionare il destrano intriso blocco agarosio in un piccolo pozzo piazza della camera di microcanali.
- Posizionare la camera di microcanali in un sistema di imaging cellulare o utilizzare un altro microscopio a fluorescenza con una capacità di time-lapse. Iniziare il time-lapse in base alle istruzioni del produttore.
Nota: i risultati mostrati sono prese con filtro GFP, la luce del 50%, 4/10 pH, e l'ingrandimento 4X.
5. Time-lapse di crescita delle cellule
- cellule placca nella camera di microcanali a un'estremità dellaCamera. Qui, usare 3T3 fibroblasti. Aggiungere 2.500 cellule ad un pozzetto nella camera microcanali. Contare le celle come descritto al punto 2.2.1.
- Consentono alle cellule di sedersi nella camera per 60 minuti prima di aggiungere supporti (Modified mezzo di Eagle Dulbecco, il 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina). Mantenere la camera di microcanali con cellule piastrate a 37 ° C in 5% CO 2. La migrazione cellulare attraverso il canale può essere visto con un microscopio.
- Aggiungere un marcatore o utilizzare un difetto microscopica nella camera come marcatore per servire come punto di partenza per quantificare la distanza mosse anteriori cellule.
- Stabilire una sfumatura inserendo un gel di agarosio (8 mm 3 blocco) contenente il fattore di crescita concentrata, chemio-attrattivo, farmaci o altri fattori in prova (qui, 40% FBS viene utilizzato come esempio) ad una estremità del microcanale Camera.
- Prendere immagini time-lapse del fronte delle cellule in movimento. Qui, i risultati mostrano immagini del cellulare front che sono state scattate ogni 12 h utilizzando un sistema di imaging.
- Utilizzare le immagini del fronte delle cellule di quantificare il tasso di crescita delle cellule. Calcolare il tasso di crescita dapprima utilizzando la funzione polyfit MATLAB (roipoly) per creare una maschera poligonale definito dal fronte cellulare, le pareti del canale, e il marcatore di riferimento. Le dimensioni di questa maschera producono la distanza di migrazione del fronte del quale si calcola la velocità media front cellule. Altri studi hanno utilizzato un metodo simile 8.
NOTA: Confrontare il bordo frontale crescita cellulare su ciascun fotogramma alla concentrazione del fattore solubile oggetto alla stessa distanza. Il gradiente di concentrazione fattore solubile è calcolato utilizzando un modello di diffusione 1D approssimazione. - Prendere immagini fluorescenti delle cellule usando falloidina e colorazione DAPI.
- Fissare le cellule prima di colorazione con falloidina.
- Warm 4% paraformaldeide a 37 ° C.
- Aggiungere abbastanza 4% paraformaldeide per coprire cellule. Mantenere le cellule inparaformaldeide per 10 min.
- Sciacquare due volte con PBS per 15 minuti ogni volta. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule.
- Rimuovere PBS da cellule e aggiungere la soluzione permeabilizzante sufficiente (0,1% Triton X-100 in PBS) per coprire le cellule. Lasciare soluzione per 10 min.
- Lavare due volte con PBS per 5 minuti ogni volta. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule.
- Rimuovere PBS da cellule e aggiungere una soluzione bloccante (1% di siero albumina bovina in PBS) per 20 min.
- Rimuovere la soluzione di bloccaggio e lavare 2 volte con PBS per 5 minuti ogni volta. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule.
- Da questo punto, proteggere le cellule dalla luce con un foglio di alluminio quando non viene utilizzato. Rimuovere PBS dalle cellule e aggiungere falloidina 488 diluito 1:50 in PBS per 1 ora.
- Lavare 2 volte in PBS per 5 minuti per ogni lavaggio. Usi abbastanza PBS per coprire le cellule. Quindi rimuovere PBS dalle cellule.
- Aggiungere DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) diluito 1: 1000 in PBS alle cellule per 15 min.
- Rimuovere DAPI elavare le cellule due volte con PBS per 5 minuti per ogni lavaggio.
- Rimuovere ultimo lavaggio e aggiungere abbastanza PBS per coprire le cellule. Le cellule possono ora essere ripreso con un microscopio a fluorescenza.
- Fissare le cellule prima di colorazione con falloidina.
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Representative Results
La Figura 2 mostra il movimento del fronte cellulare attraverso il canale in risposta ad un gradiente di siero bovino fetale posto all'estremità opposta del canale da cui sono placcati le cellule. La parte anteriore cella è indicato a 48 ore (Figura 2A), 72 ore (Figura 2B), 96 ore (Figura 2C), e 120 h (Figura 2D) post placcatura. Il movimento del fronte delle cellule è stato rintracciato con queste immagini time-lapse, e il tasso di distanza di migrazione e la crescita sono stati calcolati dalla funzione polyfit MATLAB. Da questo, la velocità media anteriore cella è risultato essere 13,4 micron / h (Figura 3). La Figura 4 mostra il gradiente fluorescente stabilita mettendo un blocco di agarosio imbevuto destrano ad una estremità del canale e permettendo destrano diffondere attraverso il canale per 12 h. Un'immagine time-lapse è stata presa ad ogni ora, e la fluorescenza attraverso la distanza di il canale è stata misurata e tracciata come illustrato nella figura 4 e rispetto ad un modello di diffusione 1D.
Figura 2: Cell Movimento anteriore. immagini Time-lapse del fronte delle cellule nella camera di microcanali muove attraverso il canale. La parte anteriore cella marcata in linee arancioni, e la distanza di migrazione è incluso. Questa distanza di migrazione è stato misurato dalla marcatura sulla piastra frontale della parte anteriore cella come mostrato. Una barra di scala 1 millimetro è mostrato in bianco. A) 48 ore dopo la placcatura, B) 72 ore dopo la placcatura, C) 96 ore dopo la placcatura, D) 120 ore dopo la placcatura. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3: Tasso di crescita di calcolo. Cella movimento anteriore cingolata con le immagini time-lapse. Tasso di crescita è stato calcolato utilizzando la funzione polyfit MATLAB (roipoly) per produrre velocità media davanti cella di 13,4 micron / h. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: gradiente fluorescente con destrano. intensità fluorescente misurata attraverso la distanza del canale in cui ogni riga rappresenta il gradiente in una determinata ora. ImageJ è stato utilizzato per calcolare l'intensità di fluorescenza. Questo può essere fatto utilizzando la Analizza | Misura utensile. In primo luogo, scegliere Set Misure sotto Analizzare e selezionare l'intensità. Quindi, scegliere Misura sotto analizzare al fine di ottenere aveintensità dei pixel rabbia. Questo può essere tracciata in funzione della distanza in micron, come mostrato in questa figura. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La nostra camera di microcanali può essere utilizzato per una moltitudine di scopi, tra cui la determinazione del tasso di migrazione delle cellule in risposta a fattori di crescita e fattori chemiotattici e misurando la velocità di diffusione di un farmaco da una matrice polimerica. È possibile utilizzare la nostra camera di microcanali per crescere le cellule e mettere un chemiotattico ad una estremità della camera. Le cellule crescono in risposta al chemiotattico, e la migrazione delle cellule possono essere quantificate prendendo time-lapse immagini che possono essere analizzate per determinare il tasso di migrazione delle cellule. Risultati rappresentativi di questo metodo sono mostrati in figura 3, in cui il tasso di crescita è stato determinato in 13,4 micron / h utilizzando la funzione polyfit MATLAB.
Un altro utilizzo di una camera di microcanale è misurare la velocità di diffusione di un farmaco da una matrice polimerica. Un destrano fluorescente targhetta di peso molecolare simile al farmaco di interesse può essere usata per modellare la diffusione del drug di interesse. È importante notare che i campioni devono essere manipolati con attenzione come una grande quantità di convezione interromperà il gradiente. I risultati rappresentativi di questo metodo sono mostrati in Figura 4. Un vantaggio di questo modello rispetto al dosaggio camera di Boyden è che è più applicabile ai tipi di cellule aderenti causa della superficie piana; considerando che, le cellule devono cadere attraverso un piccolo tubo nella camera di Boyden prima di aderire. Un'altra limitazione del dosaggio camera di Boyden è che è un test endpoint; pertanto, chemiotassi non possono essere visivamente osservate. Al contrario, con il nostro metodo, chemiotassi si osserva attraverso le immagini time-lapse 9. L'utilizzo di micropipette contenenti chemiotattici stato anche usato un metodo di osservazione migrazione cellulare. Tuttavia, il principale svantaggio di questo metodo è bassa produttività 10. La camera di chemiotassi Dunn è un altro test che viene utilizzato in combinazione con time-lapse imaging come esimoMetodo e dettagliato qui 11, 12. La camera consiste di due cerchi concentrici incisi sulla faccia del vetrino per creare un pozzo interno ed esterno, e un ponte separa i due pozzetti. Il chemiotattico è collocato nel pozzetto esterno, e le cellule sono autorizzati a migrare dal pozzo interno al pozzetto esterno. Questa migrazione è quantificato utilizzando time-lapse immagini che vengono analizzati utilizzando software di analisi dell'immagine. Simile al dosaggio Boyden, uno dei limiti del saggio camera di Dunn è che non può essere facilmente modificato per creare gradienti di concentrazione fattore solubili personalizzato.
Un'altra tecnica semplice per valutare la migrazione delle cellule è un in vitro scratch 13. Questo metodo è veloce e poco costoso in quanto richiede solo la creazione di un graffio nel monostrato cellulare e la cattura di immagini di migrazione delle cellule time-lapse vicino alla zero creato in precedenza. Carner, il principale svantaggio di questo metodo è che non è adatto a misurare le risposte ad un gradiente di concentrazione fattore chimica. Il nostro metodo offre il potenziale per creare un gradiente chimica e quantificare migrazione cellulare rispetto al gradiente chimica. Il metodo può essere combinato con il metodo zero, come un graffio può essere creato nel monostrato cellulare, mentre un fattore chemiotattico è presente in uno dei pozzetti nella camera microcanali. In questo modo per la quantificazione e la modellazione di guarigione delle ferite. Un'altra possibile applicazione del nostro dispositivo è quello di determinare la risposta delle cellule tumorali di agenti che inibiscono la crescita cellulare.
Altri sistemi microfluidica a base sono stati utilizzati anche per studi di migrazione cellulare 14, 15. Questi studi utilizzano tecniche litografiche con camere pulite per creare stampi master in silicio e / o lavorazione laser per creare canali microfluidica in wafer di silicio. Silicon wafer micro lavorazione può essere costoso in confronto al nostro metodo che utilizza materiali meno costosi (PDMS e acrilico) per la fabbricazione di una camera di microcanali. Il nostro dispositivo supera la limitazione di altre PDMS basato dispositivi microfluidici in cui non era possibile creare piccoli canali 3D 15. Con il nostro metodo, abbiamo creato con successo dispositivo basato su PDMS con canali di piccolo diametro. Altri studi hanno utilizzato un dispositivo microfluidico PDMS-based con due strati di microcanali e un miscelatore di gas multicanale che viene comandato da calcolatore in modo da creare gradienti arbitrari di ossigeno per studiare la migrazione delle cellule sotto diversi gradienti di ossigeno 16. Esiste la possibilità per il nostro dispositivo da utilizzare in modo simile con l'aggiunta di una camera di miscelazione gas ad una estremità della camera di microcanali.
dispositivi microfluidici sono spesso realizzati con tecniche litografiche molli; questi possono essere adattati per creare chambe migrazione cellulareRS. Questi metodi comportano la stampa di una maschera con i modelli di canale con computer-aided design (CAD). Queste maschere vengono proiettate su uno stampo pilota rivestito con un resist fotosensibile tramite litografia ottica. Dopo lo stampo master è fatta, PDMS è versato sul master e lasciato indurire per creare uno stampo PDMS che può essere utilizzato per studi microfluidici 17, 18, 19. Composti chemiotattico o chemorepulsive sono poste nella camera in alta concentrazione in uno dei serbatoi per creare gradienti 17. Mentre queste tecniche sono simili a nostro set up, possono essere costoso a causa del costo elevato della creazione dello stampo master per il sistema e l'utilizzo di camere pulite. Inoltre, questi metodi possono essere difficile per gli studenti di imparare in un ambiente basato classe. Gli inserti utilizzati nel nostro set-up per creare i canali possono essere creati con una varietà di metodi, compreso pr 3Dinting e taglio laser. Così, il sistema consente la creazione di una vasta gamma di stampi per costo relativamente basso particolare la stampa 3D diventa più accessibile e ampiamente disponibili.
PDMS basate dispositivi microfluidici per misurare la migrazione cellulare e la crescita sono stati utilizzati per una vasta gamma di applicazioni. Per esempio, in Neuroscience Research studia 20, dispositivi sono stati fabbricati usando tecniche di litografia morbida in cui il componente PDMS è stato posto su un piatto di coltura di tessuti o vetro per formare due comparti che sono stati separati da una barriera fisica con scanalature micron di dimensioni per consentire neuroni di crescere attraverso i compartimenti. time-lapse immagini sono state prese per mostrare i neuroni che attraversano la barriera. Il metodo di micropatterning utilizzato per produrre questo dispositivo è complesso, mentre il metodo di produzione per il nostro dispositivo è semplice e può essere utilizzato da ricercatori a tutti i livelli. Un altro studio ha utilizzato anche un metodo a basso costo facile per produrre un SIdispositivo di microfluidica Milar PDMS utilizzando uno stampo master creato da nastro adesivo in modo da creare l'impressione nei PDMS per la produzione di microcanali. Un vantaggio del nostro approccio sopra quello descritto in questo metodo è che i canali del nostro metodo sono fabbricati in un unico passaggio, mentre questo protocollo richiede adesione tra due strati PDMS che crea problemi con il flusso medio alle cellule 21.
In conclusione, il metodo della camera microcanale è personalizzabile e può essere utilizzato per ottenere risultati diversi. Il metodo consente la creazione di un gradiente di concentrazione al fine di soddisfare le esigenze dell'utente. Inoltre, il nostro dispositivo offre un vantaggio rispetto ai dispositivi esistenti, a causa del suo costo relativamente basso e la facilità d'uso per i ricercatori a tutti i livelli.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono programma creativo inchiesta del Clemson University e NSF CBET1254609 per la fornitura di finanziamenti per questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa Laser | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
References
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