Summary
Этот протокол подробно настраиваемый метод измерения миграции клеток в ответ на хемоаттрактанты, которые также могут быть использованы для определения скорости диффузии лекарственного средства из полимерной матрицы.
Abstract
Миграция клеток является жизненно важной частью иммунных реакций, роста и заживления ран. Миграция клеток представляет собой сложный процесс , который включает в себя взаимодействие между клетками, внеклеточного матрикса, а также растворимых и нерастворимых химических факторов (например, хемоаттрактанты). Стандартные методы измерения миграции клеток, таких как камера анализа Бойденом, работы путем подсчета клеток по обе стороны от делителя. Эти методы просты в использовании; Тем не менее, они предлагают небольшую геометрическую модификацию для различных областей применения. В отличие от этого , микрофлюидальные устройства могут быть использованы для наблюдения миграции клеток с помощью настраиваемых градиентов концентрации растворимых факторов 1, 2. Однако способы получения анализов микрофлюидики на основе может быть трудно узнать.
Здесь мы опишем простой способ для создания клеточных культур камеры для измерения миграции клеток в ответ на химические градиенты концентрации. Наши мобильные милиGration метод камера может создавать различные градиенты линейной концентрационной для изучения миграции клеток для различных применений. Этот метод является относительно простым в использовании и, как правило, осуществляется студентов.
Микроканал камера была создана путем размещения акриловую вставку в виде окончательно микроканальной камеры хорошо в чашку Петри. После этого, поли (диметилсилоксан) (ПДМС), выливалась в верхней части вставки. ПДМС был затвердеть, а затем вставка была удалена. Это позволило для создания скважин в любой желаемой формы и размера. Клетки могут быть впоследствии добавлены в микроканальной камеры, и растворимые вещества могут быть добавлены к одной из скважин путем замачивания агарозы блок в желаемом агента. Агарозы блок добавляется в одну из лунок, и время покадровой изображения могут быть взяты из микроканальной камеры для того, чтобы количественно оценить миграцию клеток. Вариации этого метода могут быть сделаны для данного применения, что делает этот метод HIGHLY настраиваемый.
Protocol
1. Производство микроканальной камеры для создания градиента концентрации
- Резка акриловый лист формы
- Получить кусок акрила требуемой ширины. Обычно используют 1/16-дюймовый толщиной акриловые листы. Более толстые листы трудно вырезать так и очень тонкие листы не обладают необходимой механической прочностью, в результате чего к их разрушению или деформации во время процесса.
- Создание CAD-файл с желаемыми формой акриловой части, чтобы произвести полости внутри полидиметилсилоксан (PDMS). Регулировка ширины канала и длины, чтобы достичь желаемого градиента, имеющую отношение к отдельным экспериментальных протоколов.
- Здесь, используйте акриловый лист следующих размеров: два квадрата (0,254 см х 0,254 см) , соединенных широким каналом 0,127 см (длиной 0,254 см) (рисунок 1).
- Импорт файла САПР в лазерной резки устройства и поместите акриловый лист в лазерный резак согласно МануПротокол дитель в.
Примечание: В качестве альтернативы, 3D-печать кусок от автоматизированного проектирования. Преимущество этого способа состоит в том, что альтернативные материалы могут быть использованы для пресс-формы; Тем не менее, разрешение и воспроизводимость может быть уменьшена с 3D-печати по сравнению с лазерной резки.
Рисунок 1: Computer-Aided Design (CAD) Представление микроканальной палаты. Это изображение показывает чертеж САПР акрилового вкладыша, необходимого для создания Микроканал камеры. 1 A) Вид сверху САПР чертеж, 1В) Вид сбоку САПР чертеж с размерами в дюймах, 1C) Вид сверху САПР чертеж с размерами в дюймах Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- В взвешивании лодки, смешать 10 частей по массе коммерческой эластомерной основе (например , Sylgard 184) с 1 частью по массе коммерческой эластомерных отвердитель (например Sylgard 194). Как правило, смесь 10 г эластомерной основе до 1 г эластомерного отвердителем.
- Движение, чтобы объединить основы и отвердителя с помощью микропипетки в течение 5 мин.
- Установите вакуумный колокол и поместите взвешивать лодку с PDMS в вакууме в течение 30 мин, чтобы удалить скопившийся воздух.
- Выключите пылесос и удалите взвешивать лодку. Налить PDMS поверх акрилового выреза в маленькой чашке Петри. Убедитесь, что PDMS полностью покрывает вставку.
- Дайте ПДМС, чтобы вылечить в течение ночи (по меньшей мере 18 ч) при комнатной температуре.
- Удаление вставки из PDMS
- После отверждения PDMS, удалите вставку осторожно срезания PDMS вокруг акриловой части с помощью скальпеля.
2. Покрытие ячеек в микроканальной палате
- Стерилизация камеру для металлизации ячеек.
Примечание: В то время как ПДМС можно стерилизовать с использованием окиси этилена или других методов, быстрое лечение УФ быстро, недорогой, и достаточно для исследования клеточных культур. Продолжительность короткого УФ лечение не ухудшают структуру или механическую целостность куска PDMS.- В стандартном шкафу для культивирования клеток, полностью закрывают камеру с 70% -ным этанолом.
- Поместите чашку Петри в колпаке с ламинарным потоком с крышками прочь.
- Закройте крышку и включите УФ-свете. Expose к УФ-светом в течение 1-2 ч.
- Откройте капот ламинарного потока и подождите 15 минут, чтобы восстановить поток.
- Удалите 70% этанола.
- Промыть камеры дважды стерильной фосфатным буферным раствором (PBS). Используйте 1 мл PBS для каждого мытья. Удалить PBS и позволяют камеры высохнуть в течение ночи с крышками прочь.
Примечание: В качестве альтернативы, вместоиспользования капот ламинарного потока, используйте камеру коробку УФ для стерилизации, если таковая имеется. Сделайте УФ коробку путем размещения источника света УФ в задней части картонной коробки выровненной с алюминиевой фольгой. Алюминиевая фольга отражает свет, чтобы обеспечить равномерное освещение образца.
- Покрытие ячеек в палате
- Граф клеток с использованием трипанового синего и гемоцитометра.
- Добавляют 100 мкл суспензии клеток в 400 мкл 0,4% трипанового синего и осторожно перемешать. Применить 100 мкл этого раствора к гемоцитометра, аккуратно заполняя обе камеры под покровным стеклом.
- С помощью микроскопа с объективом 10X, чтобы сосредоточиться на сетке на гемоцитометра. С помощью рук Tally счетчик для подсчета живых неокрашенных клеток в пределах одного набора 16 квадратов на гемоцитометра.
- Граф клеток во всех 4-х комплектов 16 квадратов. Возьмите среднее количество клеток из 4 наборов 16 квадратов и умножить на 5x10 4. Это окончательное число является Numbeг клеток / мл в суспензии клеток.
- Добавьте 2500 клеток в одну лунку в каждой камере. Это приводит к почти сливающийся плотности клеток ~ 30000 / см 2.
- Разрешить клетки сидеть в камере в течение 60 мин перед добавлением носителей (Дульбекко Modified Eagle Среднесрочная, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина).
- Граф клеток с использованием трипанового синего и гемоцитометра.
3. Декстран Пропитавшиеся агарозы Блоки
- Создание агарозном блока
- Залить 3% агарозном в 3D печатной формы (2 мм х 2 мм х 2 мм).
- Разрешить агарозы, чтобы затвердеть в вакуумной камере в течение 30 мин, чтобы удалить пузырьки.
- Удалить блок агарозы из пресс-формы.
Примечание: В качестве альтернативы, заливают 3% агарозном в небольшую чашку Петри, при толщине 2 мм. Вырезать х 2 мм х 2 мм блок 2 мм с помощью скальпеля или другого режущего инструмента. Это не так точно, как система пресс-формы, но она может быть немного легче сделать.
- Полностью submergе агарозном блок в растворе нужной концентрации хемотактической фактора. Для того, чтобы оценить образование градиента концентрации, промойте камеру сначала с флуоресцентного декстрана. Концентрация и молекулярная масса декстрана должна совпадать с растворимым фактора или лекарственного средства, представляющего интерес.
- Замочите в агарозном блок в течение ночи.
4. Покадровый декстрана Diffusion для оценки градиента концентрации Растворимый фактор
- Поместите декстран замачивают в агарозном блок в маленькой квадратной яме микроканальной камеры.
- Поместите Микроканал камеру в системе формирования изображения клеток или использовать другой флуоресцентный микроскоп с возможностью покадровой. Начинают времени покадровой в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Представленные результаты взяты с GFP фильтром, 50% света, 4/10 рН и 4-кратным увеличением.
5. Покадровый роста клеток
- Пластина клеток в микроканальной камеры на одном концекамера. При этом использовать 3Т3 фибробласты. Добавьте 2500 клеток в одну лунку в микроканальным камере. Граф клеток, как описано в разделе 2.2.1.
- Разрешить клетки сидеть в камере в течение 60 мин перед добавлением носителей (Дульбекко Modified Eagle Среднесрочная, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина). Хранить Микроканал камеру с высевания клеток при 37 ° С в 5% CO 2. Миграция клеток через канал можно рассматривать с помощью микроскопа.
- Добавить маркер или использовать микроскопический дефект в камере в качестве маркера для того, чтобы служить в качестве отправной точки для количественного определения расстояние, на котором клетка фронт движется.
- Создание градиента путем размещения агарозный гель (8 мм 3 блок) , содержащий концентрированный фактор роста, химио-аттрактант, лекарственный препарат, или другой фактор тестируется (здесь, 40% FBS , используется в качестве примера) , на одном конце микроканала камера.
- Возьмите покадровой изображения движущегося фронта клетки. Здесь, результаты показывают изображения клетки сюдант, которые были взяты через каждые 12 ч, используя систему формирования изображения.
- Используйте снимки передней ячейки для количественного определения скорости роста клеток. Рассчитайте темпы роста на первом использовании функции polyfit MATLAB (roipoly), чтобы создать многоугольной маску, определяемую передней ячейки, стенки канала и опорного маркера. Размеры этой маски дают миграционную расстояние фронта, из которого вычисляется средняя скорость ячейки фронт. Другие исследования использовали аналогичный метод 8.
Примечание: Сравнение края фронта роста клеток на каждом кадре до концентрации растворимого фактора на том же расстоянии. Растворимый градиент концентрации фактора рассчитывается с использованием 1D диффузионной модели аппроксимации. - Возьмите флуоресцентные изображения клеток с использованием фаллоидином и DAPI окрашивания.
- Fix клетки до окрашивания фаллоидином.
- Теплый 4% параформальдегида при температуре 37 ° С.
- Добавьте достаточно 4% параформальдегида, чтобы покрыть клетки. Держите клетки впараформальдегидом в течение 10 мин.
- Промыть два раза с PBS в течение 15 мин каждый раз. Используйте достаточное количество PBS, чтобы покрыть клетки.
- Удалить PBS от клеток и добавляют достаточное количество раствора permeabilizing (0,1% Тритон Х-100 в PBS), чтобы покрыть клетки. Оставьте раствор в течение 10 мин.
- Промыть два раза с PBS в течение 5 мин каждый раз. Используйте достаточное количество PBS, чтобы покрыть клетки.
- Удалить PBS от клеток и добавления блокирующего раствора (1% бычьего сывороточного альбумина в PBS) в течение 20 мин.
- Удалить блокирующий раствор и моют 2 раза PBS в течение 5 мин каждый раз. Используйте достаточное количество PBS, чтобы покрыть клетки.
- С этой точки зрения, защищают клетки от воздействия света с алюминиевой фольгой, когда он не используется. Удалить PBS из клеток и добавить фаллоидином 488 разбавленных в соотношении 1:50 в PBS в течение 1 ч.
- Мыть 2 раза в PBS в течение 5 мин для каждой стирки. Используйте достаточное количество PBS, чтобы покрыть клетки. Затем удалите PBS из клеток.
- Добавить DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) разводили 1: 1000 в PBS с клетками в течение 15 мин.
- Удалить DAPI имыть клетки дважды с PBS в течение 5 мин при каждой стирке.
- Удалить последнюю стирку и добавить достаточно, чтобы покрыть PBS клетки. Клетки теперь могут быть отображены с помощью флуоресцентного микроскопа.
- Fix клетки до окрашивания фаллоидином.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2 показано движение передней ячейки , по каналу в ответ на градиент эмбриональной телячьей сыворотки , помещенным на противоположном конце канала , откуда клетки высевают. Клетка фронт показан на 48 ч (рис 2А), 72 ч (рис 2В), 96 ч (рис 2с) и 120 ч (рис 2D) пост обшивкой. Движение фронта клеток отслеживали с этими покадровой изображений, и миграция расстояние и скорость роста были вычислены с помощью функции polyfit MATLAB. Исходя из этого, было обнаружено , что средняя скорость клеток передней до 13,4 мкм / ч (рис 3). На рисунке 4 показаны флуоресцентного градиент , установленный путем размещения декстран пропитанной агарозном блок на одном конце канала и позволяя декстран диффундировать через канал в течение 12 ч. Покадровой изображение было принято в каждый час, и флуоресценцию через расстояние канал измеряли и наносили на график , как показано на фиг.4 , и по сравнению с диффузионной модели 1D.
Рисунок 2: Клеточная перемещения фронта. Время покадровой изображения передней ячейки в микроканальным камере, движущейся через канал. Передняя ячейка отмечается в оранжевые линии, а расстояние миграции входит. Эта миграция была расстояние измеряется от маркировки на табличке на передней части передней ячейки, как показано на рисунке. Масштабная линейка 1 мм отображается белым цветом. А) 48 ч после покрытия, B) 72 ч после покрытия, C) 96 ч после покрытия, D) 120 ч после покрытия. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
е 3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 55264 / 55264fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Темп роста Расчет. Cell передний движение отслеживается с помощью покадровой изображений. Скорость роста была рассчитана с использованием функции polyfit MATLAB (roipoly), чтобы получить среднюю скорость клеток передней 13,4 мкм / ч. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Флуоресцентные Градиент с декстрана. Интенсивность флуоресценции, измеренного на расстоянии канала, где каждая строка представляет градиент в определенный час. ImageJ использовали для расчета интенсивности флуоресценции. Это может быть сделано с помощью Анализа | Мера инструмент. Во-первых, выберите Set измерения в Анализировать и выбрать интенсивности. Затем выберите Измерение под анализ, чтобы получить прярости интенсивности пикселей. Это может быть построен в зависимости от расстояния в микронах, как показано на этом рисунке. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша Микроканал камера может использоваться для множества целей, в том числе определение скорости миграции клеток в ответ на факторы роста и хемоаттрактанты и измерения скорости диффузии лекарственного средства из полимерной матрицы. Можно использовать наши микроканальной камеры для роста клеток и поместите хемоаттрактантной в одном конце камеры. Клетки растут в ответ на хемоаттрактанту, и миграции клеток может быть определена количественно путем принятия покадровой изображения, которые могут быть проанализированы с целью определения скорости миграции клеток. Типичные результаты этого метода показаны на рисунке 3, где скорость роста была определена как 13,4 мкм / ч с помощью функции polyfit MATLAB.
Другое использование нашей микроканальной камеры для измерения скорости диффузии лекарственного средства из полимерной матрицы. Флуоресцентно меченый декстран аналогичного молекулярного веса к препарату интерес, могут быть использованы для моделирования диффузии Druг интерес. Важно отметить, что образцы должны быть тщательно обработаны, как большое количество конвекции разрушит градиент. Представительные результаты этого метода приведены на рисунке 4. Преимущество данной модели по сравнению с анализом Бойден камеры является то, что она в большей степени применима к адгезивных типов клеток из-за плоской поверхности; в то время как клетки должны падать через небольшую трубку в камере Бойденом перед тем придерживаясь. Другим ограничением анализа Бойден камеры является то, что она представляет собой анализ конечной точки; Таким образом, хемотаксис не может быть визуально. В противоположность этому , с нашим методом, хемотаксис наблюдается через покадровой изображений 9. Использование микропипетки, содержащих хемоаттрактанты также использовали метод наблюдения миграции клеток. Тем не менее, главным недостатком данного способа является низкая пропускная способность 10. Хемотаксиса Данна еще один тест, который используется в сочетании с покадровой обработки изображений, как гоМетод электронной подробно здесь 11, 12. Камера состоит из двух концентрических кругов, вырезанных на лице предметного стекла, чтобы создать внутреннюю и внешнюю хорошо, и мост, разделяющий две скважины. Хемоаттрактанту помещается во внешней лунке, и клетки могут мигрировать из внутренней скважины к внешней ямы. Эта миграция количественно с помощью покадровой изображения, которые анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений. По аналогии с анализом Бойденом, одним из ограничений камеры анализа Dunn является то, что оно не может быть легко модифицирован для создания пользовательских растворимых градиентов концентрации фактора.
Другой простой метод для оценки миграции клеток является в пробирке царапина 13. Этот метод является быстрым и недорогим, как это только требует создания нуля в монослое клеток и захват покадровой изображений миграции клеток, близких к ранее созданной нуля. Howevэр, основным недостатком этого метода является то, что он не подходит для измерения ответов на градиент концентрации химического фактора. Наш метод предлагает потенциал для создания химического градиента и количественной оценки миграции клеток относительно химического градиента. Наш метод может быть объединен с методом царапания как царапина может быть создан в монослое клеток, в то время как хемотаксическая фактор присутствует в одной из скважин в микроканальной камере. Это позволяет количественной оценки и моделирования заживления ран. Другое потенциальное применение нашего устройства для определения реакции раковых клеток к агентам, которые ингибируют рост клеток.
Другие системы на основе микрофлюидики также использовались для миграции клеток исследований 14, 15. Эти исследования используют литографические методы с чистых помещений для создания мастер-форм в кремнии и / или лазерной обработки для создания микроканалов в кремниевых пластинах. Кремний Wafeобработка микро г может быть дорогим по сравнению с нашим методом, который использует более дешевые материалы (PDMS и акрил) для изготовления микроканальных камеры. Наше устройство преодолевает ограничение других PDMS на основе микрожидкостных устройств , в которых не было возможности создавать небольшие 3D - каналы 15. С помощью нашего метода, мы успешно создали устройство на базе PDMS с каналами малого диаметра. Другие исследования использовали микрожидком устройство PDMS основе с двумя слоями микроканалов и смесителем газа многоканальном что контролируется компьютером для того , чтобы создавать произвольные градиенты кислорода для изучения миграции клеток при различных градиентах кислорода 16. Существует потенциал для нашего устройства, которое будет использоваться таким же образом, с добавлением камеры смешивания газа на одном конце микроканальной камеры.
Микрожидком устройства часто делаются с использованием мягких литографических методов; они могут быть приспособлены для создания миграции клеток ChambeRS. Эти способы включают в себя печать маску с узорами каналов с автоматизированного проектирования (САПР). Эти маски затем проецируется на мастер-формы, покрытой светочувствительным сопротивление через оптической литографии. После того , как мастер - форма изготовлена, ПДМС наливают на ведущем устройстве и дают затвердеть с тем , чтобы создать PDMS формы , которые могут быть использованы для микрофлюидальных исследований 17, 18, 19. Хемоаттрактантной или chemorepulsive соединения помещают в камеру в высокой концентрации в одном из резервуаров для создания градиентов 17. В то время как эти методы аналогичны нашей их системы, они могут быть дорогими из-за высокой стоимости создания мастер-формы для системы и использование чистых помещений. Кроме того, эти методы могут быть трудно для студентов, чтобы учиться в обстановке на основе класса. Пластины, используемые в нашей настройки, чтобы создать каналы могут быть созданы с помощью различных методов, в том числе 3D-прinting и лазерной резки. Таким образом, наша система позволяет для создания самых разнообразных форм для относительно низкой стоимости, особенно в 3D-печать становится более доступным и широко доступны.
ПДМС основе микрожидкостных устройств для измерения миграции клеток и рост, были использованы для широкого круга применений. Например, в области неврологии научных исследований 20, устройства были изготовлены с использованием мягких методов литографии , в которых компонент PDMS помещают на блюдо культуры ткани или стекла, чтобы сформировать два отделения , которые были разделены физическим барьером с микронного размера канавок , чтобы позволить нейроны расти через отсеки. Время покадровой изображения были взяты, чтобы показать нейроны, пересекающих барьер. Метод micropatterning, используемого для производства данного устройства является сложным, в то время как метод производства для нашего устройства проста и может быть использован исследователями на всех уровнях. Другое исследование также используется простой метод недорогой для получения сиMilar PDMS микрожидкостных устройство с помощью мастер-формы, созданный из скотча для того, чтобы создать впечатление в PDMS для производства микроканалов. Преимущество нашего подхода по сравнению с описанным в данном методе является то , что каналы в нашем методе изготовляются на один шаг, в то время как этот протокол требует адгезии между двумя слоями PDMS , что создает проблемы , связанные с потоком среды к клеткам 21.
В заключение, наш метод Микроканал камера настраивается и может быть использован для получения различных результатов. Метод позволяет для создания градиента концентрации для того, чтобы удовлетворить потребности пользователя. Кроме того, наше устройство имеет преимущество по сравнению с существующими устройствами из-за его относительно низкой стоимости и простоты использования для исследователей на всех уровнях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают программу Креативный Inquiry Клемсон университета и NSF CBET1254609 для обеспечения финансирования этого проекта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa Laser | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
References
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).
- Darby, I., Hewitson, T. Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis. Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).
- Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. A new approach to study fibroblast migration. Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).
- Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324, 1673-1677 (2009).
- Zengel, P., et al. µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biol. , (2011).
- Chen, H. Boyden Chamber Assay. Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models. JCB. 203 (4), 691-709 (2013).
- Saadi, W., et al. Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber. Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).
- Cammer, M., Cox, D. Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette. Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).
- Wells, C. M., Ridley, A. J. Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci. Rep. 5, (2015).
- Wright, G. A., et al. On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies. Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).
- Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device. Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).
- Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research. Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).
- Tang, S. K., Whitesides, G. M. Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research). Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
- Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains. JoVE. (69), (2012).
