Summary
Bu protokol, aynı zamanda, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon hızını belirlemek için kullanılabilir chemoattractants yanıt olarak hücre göçü ölçmek için özelleştirilebilir yöntemi göstermektedir.
Abstract
Hücre göçü bağışıklık tepkilerinin, büyüme ve yara iyileşmesi önemli bir parçasıdır. Hücre göçü hücreleri, hücre-dışı matris ve çözünen ve çözünmeyen bir kimyasal faktörleri (örneğin, Kemoattraktantlar) arasındaki etkileşimleri içeren karmaşık bir süreçtir. Bu Boyden Chamber tahlilinde, bir bölücünün iki tarafında hücre sayımı yolu ile çalışma gibi hücrelerin göçünü ölçmek için standart yöntemler. Bu teknikler kullanımı kolay; Bununla birlikte, farklı uygulamalar için çok az bir geometrik değişiklik vardır. Bunun aksine, mikroakışkan cihazlar çözünür faktörlerin, 1, 2 özelleştirilebilir konsantrasyon gradyanı hücre göçü için kullanılabilir. Ancak, Mikroakiskan tabanlı deneyleri yapma yöntemleri öğrenmek için zor olabilir.
Burada, kimyasal konsantrasyon gradyanı yanıt olarak hücre göçü ölçmek için hücre kültürü odaları oluşturmak için kolay bir yöntem tarif eder. Bizim cep mibütünleştirme oda yönteminin, çeşitli uygulamalar için, hücre göçü incelemek üzere farklı doğrusal konsantrasyon gradyanları oluşturabilir. Bu yöntem kullanımı nispeten kolaydır ve genellikle lisans öğrencileri tarafından gerçekleştirilir.
Mikrokanal odası iyi bir Petri kabı içine nihai mikrokanal odasının şeklinde bir akrilik insert yerleştirerek oluşturuldu. Bundan sonra, poli (dimetilsiloksan) (PDMS) ekin üzerine döküldü. PDMS sertleşmeye bırakıldı ve daha sonra da ekleme uzaklaştırılmıştır. Bu, herhangi bir arzu edilen şekil ya da boyutta kuyu oluşturulması için izin verdi. Hücreler, daha sonra mikrokanal odasına ilave edilebilir ve çözünebilir maddeler arzu edilen maddenin bir agaroz blok ıslatılmasıyla kuyu birine eklenebilir. Agaroz blok kuyu birine ilave edilir ve zaman atlamalı görüntüler hücre göçü miktarını belirlemek amacıyla mikrokanal odasının alınabilir. Bu yöntemin varyasyonları bu yöntem HIG yapmak, belirli bir uygulama için yapılabilirhly özelleştirilebilir.
Protocol
1. Bir Konsantrasyon Gradient Oluşturma için Microchannel Chamber Üreten
- Bir akrilik kalıp parçanın kesilmesi
- istenen genişlikte akrilik bir parça elde edilir. Tipik olarak 1/16-inç kalınlığında akrilik levhalar kullanmak. Kalın yaprak onları sürecinde kırmaya veya çözgü neden gerekli mekanik gücüm yok iyi ve çok ince yaprak kesmek zordur.
- polidimetilsiloksan (PDMS) içinde bir boşluk üretmek için akrilik parça istenen şekle sahip bir CAD dosyası oluşturun. Bireysel deneysel protokollere uygun istenen degrade elde etmek için kanal genişliği ve uzunluğunu ayarlayın.
- Iki kare (0.254 cm x 0.254 cm) bir 0.127 cm genişliğinde kanal tarafından (0.254 cm uzunluğunda) bağlı (Şekil 1): Burada, aşağıdaki boyutlardan bir akrilik parça kullanın.
- manu göre bir lazer kesici akrilik parça lazer kesme aparatı içine CAD dosyasını içe ve koyunfacturer protokol.
NOT: Alternatif olarak, CAD tasarım parça 3D-yazdırın. Bu yöntemin avantajı, diğer maddeler, kalıp için kullanılabilir olmasıdır; Ancak, çözünürlük ve uyarlık lazer kesim ile karşılaştırıldığında 3D baskı ile azaltılabilir.
Şekil 1: Mikrokanal Odası Bilgisayar Destekli Tasarım (CAD) Temsil. Bu görüntü mikrokanal odasını oluşturmak için gerekli akrilik ekin çizim CAD göstermektedir. 1 A) CAD çizim, 1B) inç boyutları ile çizim CAD Side view, 1C) inç boyutları ile çizim CAD Üst bakış Üstten görünüm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Bir ağırlık teknede ticari Elastomer Sertleştirici (örneğin Sylgard 194), ağırlıkça 1 kısım ticari Elastomer baz ağırlığı (örneğin Sylgard 184) 10 kısım karıştırın. Tipik haliyle, Elastomer Sertleştirici 1 g elastomer tabanı 10 g karıştırılır.
- 5 dakika boyunca, bir mikropipet ile taban ve sertleştirme maddesi birleştirmek için karıştırın.
- bir vakum çan kurmak ve hava kabarcığı kaldırmak için 30 dakika süreyle vakum PDMS ile tartın tekne yerleştirin.
- Vakumu kapatın ve tartmak tekne çıkarın. Küçük bir Petri kabındaki akrilik cut-out üstüne PDMS dökün. PDMS tamamen ekleme kapsar emin olun.
- PDMS oda sıcaklığında (en azından 18 saat) bir gecede bekletilmelidir.
- PDMS gelen parçayı çıkarma
- PDMS kür sonra, dikkatlice bir neşter ile akrilik parçası etrafında PDMS keserek çıkartın.
2. Microchannel Odası Hücreler Kaplama
- Hücreleri kaplama hazne Sterilizasyon.
Not: PDMS, etilen oksit veya diğer teknikleri kullanarak sterilize edilebilir olsa da, hızlı bir UV muamele hücre kültürü çalışmaları için, hızlı, ucuz ve yeterlidir. kısa UV tedavi süresi PDMS parçasının yapısı veya mekanik bütünlüğüne zarar vermedi.- Standart bir hücre kültürü kabininde tamamen% 70 etanol ile bölmeyi kapsamaktadır.
- kapaklı kapalı olarak laminer akış kaputu Petri kabı koyun.
- Kaputu kapatın ve UV ışığı açın. 1-2 saat süreyle UV ışınlarına maruz kalmaktadır.
- laminer akış kaputu açın ve akışını yeniden kurmak için 15 dakika bekleyin.
- % 70 etanol çıkarın.
- steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez odaları yıkayın. her bir yıkama için 1 mL PBS kullanın. PBS kaldırmak ve odaları kapaklı kapalı bir gecede kurumasını bekleyin.
NOT: Alternatif olarak, yerineVarsa bir laminer akış kaput kullanarak, sterilizasyon UV odası kutusunu kullanın. alüminyum folyo ile kaplı bir karton kutusunun arkasında bir UV ışık kaynağı koyarak UV kutusu yapın. Alüminyum folyo örnek da aydınlatma sağlamak için ışık yansıtır.
- Odasına Hücreler Kaplama
- Tripan mavi ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- % 0.4 tripan mavisi 400 uL hücre süspansiyonu 100 ul ekleyin ve yavaşça karıştırın. nazikçe cam lamel altında iki bölmeyi doldurarak hemasitometre bu çözümün 100 mcL uygulayın.
- hemasitometre ızgara üzerinde odaklanmak için bir 10X amacı ile bir mikroskop kullanın. hemasitometre 16 meydanlarından biri kümesi içinde canlı boyanmamış hücreleri saymak için bir el taksitli sayacı kullanın.
- 16 kareler her 4 set halinde hücreleri saymak. 16 kareler 4 setleri ortalama hücre sayısını alın ve 5x10 4 ile çarpın. Bu son sayı numbe olduğunuhücre süspansiyonu hücre / ml r.
- Her bir bölme bir oyuğuna 2500 hücreleri ekleyin. Bu ~ 30,000 / cm2 'lik bir yakın konfluent hücre yoğunluğuna çevirir.
- Hücreler ortam eklemeden önce 60 dakika boyunca bölme oturmasına izin (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 penisilin-streptomisin).
- Tripan mavi ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
3. Dekstran Sırılsıklam Agaroz Blokları
- Bir agaroz blok oluşturma
- 3D baskılı kalıbın (2 mm x 2 mm x 2 mm arasında) agaroz% 3 dökün.
- 30 dakika kabarcıkları uzaklaştırmak için agaroz bir vakum odasına katılaşmasına izin verin.
- kalıptan agaroz bloğunu çıkarın.
Not: Alternatif olarak, 2 mm kalınlığında, küçük bir Petri kabı içine agaroz% 3 dökün. bir neşter ya da başka kesici alet kullanılarak bir 2 mm x 2 mm x 2 mm'lik bir blok kesin. Bu kalıp sistemi gibi kesin değil ama yapmak için biraz daha kolay olabilir.
- tamamen submergkemotaktik faktörü istenen konsantrasyonda bir çözelti e agaroz bloğu. konsantrasyon gradyanı oluşumu değerlendirmek için, floresan dekstran ile birinci bölme yıkayın. dekstran konsantrasyonu ve moleküler ağırlığı, bir çözünür faktör veya ilgi duyulan ilaç ile aynı olmalıdır.
- Agaroz blok gecede ıslatın.
Çözünür Faktörü Konsantrasyon Gradient değerlendirin Dekstran Difüzyon 4. Time-lapse
- mikrokanal odasının küçük bir kare kuyuda dekstran batırılmış agaroz blok yerleştirin.
- Bir hücre görüntüleme sisteminde mikro odasına yerleştirin veya bir time-lapse özelliği ile başka bir floresan mikroskop kullanın. üreticinin talimatlarına uygun olarak zaman atlamalı başlayın.
NOT: Gösterilen sonuçlar GFP filtresi,% 50 ışık, 4/10 pH ve 4X büyütme ile alınır.
Hücre Büyüme 5. Time-lapse
- bir ucunda, mikrokanal bölmesi Levha hücreleribölme. Burada, 3T3 fibroblastların kullanın. Mikrokanal odası içinde, bir oyuğuna 2500 hücreleri ekleyin. 2.2.1 açıklandığı gibi hücreleri saymak.
- Hücreler ortam eklemeden önce 60 dakika boyunca bölme oturmasına izin (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 penisilin-streptomisin). % 5 CO2 içinde 37 ° C'de kaplanmıştır hücrelerle mikrokanal odası tutun. kanaldan hücre göçü bir mikroskop ile görülebilir.
- bir belirteç ekleme veya mesafeyi hücre ön hamle ölçmek için bir başlangıç yeri olarak hizmet etmek üzere bir belirteç olarak odasında bir mikroskobik kusur kullanın.
- Bir agaroz jel (8 mm3 blok) ihtiva eden yerleştirerek gradyanı oluşturulması konsantre büyüme faktörü, kemo-çekici, ilaç veya diğer bir faktör, test edilen mikrokanalın bir ucunda (burada,% 40 FBS, örnek olarak kullanılıyor) bölme.
- Hareketli hücre ön time-lapse fotoğraf çekmek. Burada, sonuçlar fro hücre görüntüleri gösterirnt o bir görüntüleme sistemi kullanılarak 12 saatte çekildi.
- Hücre büyüme hızını ölçmek için hücre ön resimlerini kullanın. ilk hücre ön, kanal duvarları ve referans markeri ile tanımlanan bir çokgen maske oluşturmak için (roipoly) MATLAB polyfit işlevini kullanarak büyüme oranını hesaplayınız. Bu maskenin boyutları ortalama hücre ön hız hesaplanır hangi ön göç mesafesini verir. Diğer çalışmalar benzer bir yöntem 8 kullanmışlardır.
NOT: Aynı mesafeden çözünür faktörün konsantrasyonuna her karede hücre büyümesi ön kenarını karşılaştırın. çözünür faktör konsantrasyon gradyanı 1D difüzyon modeli yaklaşımı kullanılarak hesaplanır. - Phalloidin ve DAPI boyama kullanarak hücrelerin floresan görüntüleri çekmek.
- Phalloidin ile boyamadan önce hücreleri sabitleyin.
- 37 ° C 'de sıcak bir% 4 paraformaldehid.
- hücreleri karşılamak için yeterli% 4 paraformaldehid ekleyin. hücreleri tutun10 dakika boyunca paraformaldehit.
- 15 dakika her zaman için iki kez PBS ile durulayın. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın.
- hücreler PBS çıkarın ve hücreleri karşılamak için yeterli su-geçirimli çözeltisi (PBS içinde% 0.1 Triton X-100) ilave edin. 10 dakika süre ile çözelti bırakın.
- 5 dakika, her seferinde, PBS ile iki kez yıkanır. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın.
- hücreler PBS çıkarın ve 20 dakika çözeltisi (PBS içinde% 1 sığır serumu albümini) bloke ekleyin.
- Bloklama çözeltisi, çıkarın ve her biri 5 dakika bir zaman boyunca PBS ile 2 kez yıkanır. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın.
- kullanılmadığı zaman, bu noktadan sonra, alüminyum folyo ile ışıktan hücreleri korur. hücreler PBS çıkarın ve 1 saat süreyle PBS içinde seyreltilmiş Phalloidin 488 1:50 ekleyin.
- her bir yıkama için, 5 dakika süreyle PBS içinde 2 kez yıkayın. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın. Sonra hücrelerden PBS kaldırmak.
- 15 dakika boyunca hücreler PBS içinde 1000: DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol); 1 seyreltilmiştir.
- Kaldır DAPI veher bir yıkama için 5 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkama hücreleri.
- Son yıkama çıkarın ve hücreleri karşılamak için yeterli PBS ekleyin. Hücreler artık floresan mikroskop ile görüntülenebilir.
- Phalloidin ile boyamadan önce hücreleri sabitleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2, hücre plakalanmıştır burada kanal, zıt uca yerleştirilen fetal sığır serumu gradyanı yanıt olarak kanal boyunca hücre ön hareketini gösterir. Hücre ön 48 saat (Şekil 2A), 72 saat (Şekil 2B), 96 saat (Şekil 2C), ve 120 saat (Şekil 2B) sonrası kaplama gösterilir. Hücre ön hareketi bu zaman atlamalı görüntüleri ile takip edildi ve göç mesafesi ve büyüme oranı MATLAB polyfit işlevi tarafından hesaplanmıştır. Buradan, ortalama hücre ön hızı 13.4 um / saat (Şekil 3) olarak bulunmuştur. Şekil 4, kanalın bir ucunda bir dekstran batırılmış agaroz blok yerleştirilmesi ve dekstran 12 saat boyunca bir kanal içerisinden difiizyonla geçişine izin oluşturduğu florasan gradyanı gösterir. Bir zaman atlamalı görüntü her saatte alınır ve mesafe boyunca floresan oldu Şekil 4'te gösterilen ve 1D difüzyon modeli ile karşılaştırıldığında, bir kanal ölçülmüş ve çizilmiştir.
Şekil 2: Hücre Ön Hareketi. kanalıyla hareket mikrokanal odasında hücre ön Time-lapse görüntüler. Hücre ön turuncu çizgileri işaretlenmiş ve göç mesafesi dahildir. Bu göç mesafesi gösterildiği gibi hücre ön ön plaka üzerinde işaretleme ölçüldü. 1 mm'lik bir ölçek çubuğu beyaz gösterilir. A) 48 saat sonrası kaplama, B) 72 saat sonrası kaplama, C) 96 saat sonrası kaplama, D) 120 saat sonrası kaplama. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
e 3 "src =" / files / ftp_upload / 55264 / 55264fig3.jpg "/>
Şekil 3: Büyüme Hızı Hesaplama. Time-lapse resimlerle izlenen ön hareketi Hücre. Büyüme oranı 13.4 mm / h ortalama hücre ön hızı elde etmek için MATLAB polyfit fonksiyonunu (roipoly) kullanılarak hesaplanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Dextran'ın ile Floresan Gradient. Floresan yoğunluğu her satır belirli bir saatte degrade temsil kanalın mesafe boyunca ölçülen. ImageJ floresan yoğunluğu hesaplanması için kullanılmıştır. Bu analiz kullanılarak yapılabilir | Ölçü aracı. İlk olarak, analiz ve seçin yoğunluğu altında ayarlayın Ölçümleri seçin. Sonra altında ave almak için analiz Tedbir seçinöfke piksel yoğunluğu. Bu şekilde gösterildiği gibi, bu mikron mesafeye göre grafiğe geçirilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim mikrokanal odası büyüme faktörleri ve kimyasal çekici yanıt olarak, hücre göçü hızının belirlenmesi ve bir polimer matristen bir ilacın difüzyon oranını ölçmek de dahil olmak üzere amacıyla, bir çok kullanılabilir. Hücrelerin büyümesine ve odanın bir ucunda, bir kemoatraktanttır yerleştirmek için mikrokanal bölmesini kullanmak mümkündür. Hücreler kemoatraktan yanıt olarak büyür ve hücre göçü, hücre göçü oranını belirlemek üzere analiz edilebilir zaman atlamalı görüntü alınarak belirlenebilir. Bu yöntemin Örnek sonuçlar büyüme MATLAB polyfit fonksiyonu kullanılarak 13.4 um / h olduğu tespit edilmiştir Şekil 3 de gösterilmiştir.
Bizim mikrokanal bölmesinin başka bir kullanımı, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon oranını ölçmektir. ilgi ilaca benzer molekül ağırlığına sahip bir floresan etiketli dekstran Dru difüzyon modeli kullanılabilirilgi g. Örnekleri degrade bozacak konveksiyon büyük miktarda dikkatle ele alınması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Bu yöntemin temsil edici sonuçları Şekil 4'te gösterilmiştir. Boyden Chamber tahlilinde ile karşılaştırıldığında bu modelin bir avantajı, çünkü düz bir yüzeye ve yapışık hücre tiplerine daha uygun olmasıdır; oysa, hücreler kalarak önce Boyden odasında küçük bir tüp yoluyla düşmelidir. Boyden odası testinin diğer kısıtlılığı bir son nokta deneyi olmasıdır; Bu şekilde, kemotaksis görsel izlenememektedir. Buna karşılık, bizim yöntemi ile, kemotaksis time-lapse görüntüleri 9 ile gözlenmektedir. Kemoattraktantlar ihtiva mikropipetler kullanımı, hücre göçü gözlemlemek için bir yöntem kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemin dezavantajı, düşük verimlilik 10'dur. Dunn kemotaksi odasının th gibi zaman atlamalı görüntüleme ile bağlantılı olarak kullanılan bir deney olane yöntemi, 12 burada 11 ayrıntılı. bölme, bir iç ve dış kuyu yaratmak için cam slayt yüzünde oyulmuş iki konsantrik daireler oluşur ve bir köprü, iki kuyu ayırır. Kemoatraktan, dış oyuk içine yerleştirilir ve hücreler, dış oyuk iç oyuk göç izin verilir. Bu göç görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir time-lapse görüntüleri kullanılarak ölçülür. Boyden tahliline benzer, Dunn odası tahlil sınırlamaları biri kolayca özel çözünür faktör konsantrasyon degradeler oluşturmak için değiştirilemez olmasıdır.
Hücre göçü değerlendirmek için başka basit bir teknik, bir in vitro 13 kazımak olduğunu. sadece önceden oluşturulan sıfırdan yakın hücre göçü zaman atlamalı görüntüleri hücre tek tabaka ve yakalama bir çizik oluşturarak gerektirir Bu yöntem, hızlı ve ucuz. ancak buradaner, bu yöntemin en önemli dezavantajı, bir kimyasal faktörler konsantrasyon gradyanı tepkilerini ölçmek için uygun olmadığıdır. Bizim yöntemi potansiyeli kimyasal degrade oluşturmak için kimyasal degrade hücre göçü göreli ölçmek sunuyor. bir kemotaktik faktördür mikrokanal odası içinde kuyu birinde mevcut ise Bizim yöntem olup, hücre mono tabakasında oluşturulabilir bir çizik sıfırdan yöntemi ile birleştirilebilir. Bu ölçümü ve yara iyileşmesi modelleme için izin verir. Bizim cihazın bir başka potansiyel uygulama hücresi büyümesini önleyen maddeler, kanser hücrelerinin tepkisini tespit etmektir.
Diğer Mikroakiskan dayalı sistemler, hücre göçü çalışmaları 14, 15 kullanılmıştır. Bu çalışmalar silikon gofret mikroakışkan kanalları oluşturmak için silikon ve / veya lazer işlemede usta kalıpları oluşturmak için temiz odalar ile taşbaskı teknikleri kullanmaktadır. Silikon WAFEr mikro işleme bir mikro odasını üretmek için ucuz malzemeler (PDMS ve akrilik) kullanan bizim yöntemine göre pahalı olabilir. Bizim cihaz küçük 3D kanallar 15 oluşturmak mümkün değildi mikroakışkan cihazları dayalı diğer PDMS sınırlama üstesinden gelir. Bizim yöntem ile, başarılı küçük çaplı kanallı PDMS tabanlı aygıt oluşturduk. Diğer çalışmalar, iki mikro katmanları ve bilgisayar oksijen 16 farklı gradyanlarıyla hücrelerinin göçünü çalışma oksijen rasgele gradyanlar oluşturmak amacıyla kontrol edilen bir çok-kanallı gaz karıştırıcı ile PDMS tabanlı mikroakışkan cihaz kullanmıştır. Bizim cihaz mikrokanal bölmesinin bir ucunda bir gaz karıştırma bölmesinin eklenmesi ile benzer bir şekilde kullanılmak için potansiyel vardır.
Mikroakışkan cihazlar genellikle yumuşak litografi teknikleri kullanılarak yapılır; Bu hücre göçü Chambe oluşturmak için adapte edilebilirrs. Bu yöntemler bilgisayar destekli tasarım (CAD) ile kanal desenleri ile bir maske baskı barındırır. Bu maskeler sonra optik litografi ile karşı ışığa ile kaplanmış bir ana kalıp üzerinde tahmin edilmektedir. Ana kalıp yapıldıktan sonra PDMS ana üzerine dökülmekte ve mikroakışkan çalışmalar 17, 18, 19 için kullanılabilecek bir PDMS kalıp oluşturmak için sertleşmeye bırakılır. Kemoatraktan ya chemorepulsive bileşikler gradyanlar 17 oluşturmak için rezervuar birinde yüksek konsantrasyonda odasına yerleştirilir. Bu teknikler bizim set up benzer olmakla birlikte, onlar yüzünden sistem için ana kalıp ve temiz odalar kullanımını yaratma yüksek maliyet pahalı olabilir. öğrencilerin sınıf temelli bir ortamda öğrenmesi için ek olarak, bu yöntemler zor olabilir. kanalları oluşturmak için set-up kullanılan ekler 3D pr dahil çeşitli yöntemler ile oluşturulabilirinting ve lazer kesim. Bu nedenle bizim sistemimiz 3D baskı daha uygun ve yaygın olarak kullanılabilir hale gelir özellikle de nispeten düşük maliyetli için kalıp geniş bir yelpazede oluşturulmasını sağlar.
hücre göçünü ve büyümenin ölçülmesi için tabanlı mikro PDMS geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılmaktadır. Örneğin, nörolojik araştırma cihazları PDMS bileşeni sağlamak için mikron boyutunda yivlerle fiziksel bir bariyer ile ayrılmış iki bölmeyi oluşturmak üzere, bir doku kültür kabı veya camın üzerine yerleştirildiği yumuşak litografi teknikleri kullanılarak imal edildi, 20 çalışmaları nöronlar bölme arasındaki büyümek. Time-lapse görüntüleri bariyer geçiş nöronlar göstermek için alındı. Bizim cihaz için üretim yöntemi basit ve her düzeyde araştırmacılar tarafından kullanılabilir iken bu cihazı üretmek için kullanılan micropatterning yöntemi, karmaşıktır. Başka bir çalışmada da si üretilmesi için kolay bir düşük maliyetli bir yöntem kullanılırmikrokanalların üretmek için PDMS bir izlenim yaratmak amacıyla kapaklar oluşturulan bir ana kalıp kullanılarak Milar PDMS mikroakışkan cihaz. Tanımlanan birinin üzerine eden yaklaşımının bir avantajı bu protokol hücreleri 21 orta akış sorun oluşturan iki PDMS tabakalar arasında yapışmayı gerektiren ise eden yöntem kanalları, tek bir adımda imal edilmiş olmasıdır.
Sonuç olarak, mikro oda metodu özelleştirilebilir ve farklı sonuçlar elde etmek için kullanılabilir. yöntem, kullanıcının ihtiyaçlarına uyacak şekilde bir konsantrasyon farkı oluşturulmasını sağlar. Ayrıca, cihaz nedeniyle nispeten düşük maliyetli ve her düzeyde araştırmacılar için kullanım kolaylığı için mevcut cihazlar üzerinde bir avantaj sunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar bu proje için finansman sağlamak için Clemson Üniversitesi Yaratıcı Sorgulama program ve NSF CBET1254609 kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa Laser | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
References
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).
- Darby, I., Hewitson, T. Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis. Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).
- Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. A new approach to study fibroblast migration. Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).
- Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324, 1673-1677 (2009).
- Zengel, P., et al. µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biol. , (2011).
- Chen, H. Boyden Chamber Assay. Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models. JCB. 203 (4), 691-709 (2013).
- Saadi, W., et al. Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber. Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).
- Cammer, M., Cox, D. Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette. Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).
- Wells, C. M., Ridley, A. J. Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci. Rep. 5, (2015).
- Wright, G. A., et al. On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies. Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).
- Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device. Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).
- Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research. Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).
- Tang, S. K., Whitesides, G. M. Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research). Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
- Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains. JoVE. (69), (2012).
