Abstract
Voorwaardelijk geherprogrammeerd cellen (CRC) een duurzame werkwijze voor primaire celkweek en het vermogen om grote "levende biobanken 'van patiënt afgeleide cellijnen te ontwikkelen. Voor veel soorten epitheliale cellen hebben verschillende driedimensionale (3D) cultuur benaderingen beschreven die een verbeterde gedifferentieerde toestand ondersteunen. Terwijl CRCs hun lineage inzet voor het weefsel waaruit ze worden geïsoleerd behouden, falen ze uit te drukken veel van de differentiatie markers in verband met het weefsel van herkomst wanneer gekweekt onder normale tweedimensionale (2D) kweekomstandigheden. De toepassing van patiënt afgeleide CRC voor prostaatkanker onderzoek te versterken, is een 3D cultuur format gedefinieerd die snel (2 weken totaal) luminale celdifferentiatie in normale en tumor-afgeleide prostaat epitheliale cellen mogelijk maakt. Hierin wordt een filterelement-gebaseerd formaat beschreven voor het kweken en differentiatie van normale en kwaadaardige prostaat CRC. A detailed beschrijving van de voor cellen en -verwerking zijn voor immunohistochemische en immunofluorescentie kleuringen worden voorzien. Gezamenlijk de 3D cultuur format beschreven, in combinatie met de primaire CRC lijnen, een belangrijk middellange doorvoer modelsysteem voor hoog- biospecimen gebaseerde prostate onderzoek.
Introduction
De identificatie en toepassing van kankertherapieën die op maat gemaakt kunnen individuen een hoofddoel in kankeronderzoek. Onlangs zijn er nieuwe benaderingen ontwikkeld die zorgen voor een grotere gemak bij het opzetten van primaire celculturen potentieel verschaffen leibanen van identificeren en testen gepersonaliseerde therapieën. Bijvoorbeeld, de R-spondin gebaseerde prostate organoïde benadering 1 zorgt voor driedimensionale (3D) het kweken van normale en metastatische prostaatkankercellen in commerciële extracellulaire matrix (bijvoorbeeld Matrigel), terwijl de voorwaardelijk herprogrammeren van cellen (CRC) methode ontwikkeld aan Georgetown 2, 3 maakt gebruik van meer standaard 2D kweekomstandigheden. Met name de combinatie van een Rho kinase inhibitor (Y-27632) en bestraalde J2 murine fibroblast voedingscellen tot de onbepaalde kweken van keratinocyten CRC 2. De CRC methodologieextreem robuust, met primaire cellijnen met succes en voor onbepaalde tijd gehandhaafd van de prostaat en vele andere normale en kwaadaardige epitheliale weefsels 3. Belangrijker onze CRC technologie toegestaan voor de snelle identificatie van de etiologische basis voor terugkerend respiratoir papillomatose bij een patiënt die een aantal eerdere medicamenteuze behandelingen hadden gefaald. Voorts worden volgens normale en tumor afgeleide CRC, de succesvolle identificatie van een FDA goedgekeurde geneesmiddel, Vorinostat werd binnen twee weken na de initiële biopsie weefsel. De patiënt werd op vorinostat, waardoor de succesvolle behandeling van hun ziekte 4.
De normale prostaat bestaat uit luminale, basale en de zeldzame neuroendocriene cellen 5. Luminale cellen vormen de kolomvormige epitheellaag van de klier en drukken de androgeenreceptor (AR), en andere luminale merkers zoals cytokeratine 8 en 18 en prostate-specifiek antigeen (PSA) 6. Omgekeerd worden basale cellen gelokaliseerd onder de luminale laag en te uiten cytokeratine 5 en p63, maar lage niveaus van de AR 5. We 7, 8, 9 en 10 anderen hebben met succes gebruik prostate CRC's in preklinische mechanistische geneesmiddelgevoeligheid onderzoeken. Echter, wanneer gekweekt onder standaard 2D weefselkweekomstandigheden deze cellen niet volledig aangrijpen AR 10 signalering. Belangrijker nog, toen onder de renale capsule van immunodeficiënte muizen geplaatst, de CRC's weer normale prostaat klier architectuur en functie aan te geven dat de prostaat CRCs behouden hun lineage betrokkenheid bij plaatsing in een tolerante omgeving. De ontwikkeling van het filterelement gebaseerde celcultuur beschreven maakt de snelle (2 weken) in vitro differentiatie van prostate CRC zoals blijkt by de verhoogde expressie van de AR en AR doelwitgenen en verlaagde p63.
De filterpatronen gebruikt bevatten polycarbonaat membranen (poriegrootte 0,4 pm) die het kweken van zoogdiercellen kan ondersteunen. Het systeem, zoals ontwikkeld, maakt gebruik van normale en kwaadaardige prostaat CRC, 6 putjes en het filter inserts. Celkweekmedia J2 geconditioneerd door cellen 11 wordt in de onderste kamer en prostaatkanker differentiatie media in de bovenste kamer. De technieken die hierin beschreven ondersteunen prostaat lumen celdifferentiatie binnen een 2 week termijn, in overeenstemming met de doelstellingen van gepersonaliseerde geneeskunde. Het was ook noodzakelijk om de methoden waarmee de uitgebreide moleculaire, genetische en cellulaire profilering van de kweken te ontwikkelen. Werkwijzen voor het isoleren van DNA, RNA en eiwit uit cellen vrijgemaakt uit het filteroppervlak ontwikkeld en gestroomlijnd accurate tweede monster verwerking. Finally, de methodologie die nodig is voor het verwijderen van het filter om inbedding mogelijk te maken, snijden en voor H & E, immunohistochemische en immunofluorescentie kleuring, wordt volledig beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. De vaststelling van de 3D-Cell Culture Insert System
- Plaats 2 polycarbonaat celkweek inserts in een omgekeerde oriëntatie (filter zijde naar boven) in een plaat met 6 putjes (Figuur 1A).
- Een dunne laag van 0,1% gelatine in water aan de onderzijde van het inzetstuk en laten drogen (10-20 min) in een biologische veiligheidskast om steriliteit te handhaven.
- Herhaal stap 1.2 twee keer voor een totaal van 3 toepassingen van 0,1% gelatine op de inzetstukken.
NB: De gelatine coating limiet diffusie tussen de kamers te helpen. - Om de primaire CRC's van standaard kweekomstandigheden verzamelen, voeg 5 ml PBS aan de cultuur kolf te wassen.
- Trypsinize de cellen gebruikt (1 ml voor een T-25 en 2 ml van een T-75) 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Tik zachtjes tegen de zijkant van de kolf om te helpen bij het loskomen van de cellen. ga dan naar de trypsine reactie te stoppen en het verzamelen van de cellen door toevoeging van 5 ml compleet DMEM.
- Verzamelen de cellen in een 15 ml buis. Centrifugeer de buizen bij 4 ° C en 188 xg en tel behulp van een geautomatiseerde celtelinrichting of een hemocytometer.
- Re-schorten 600.000 CRC's in 250 ul geconditioneerde media (CM) en toe te voegen aan de juiste richting (filter naar beneden) cultuur insert (Figuur 1B). Dit wordt aangeduid als de binnenkamer.
Opmerking: CM F-media geconditioneerd door bestraalde J2 cellen en bevat 10 urn Y-27632 zoals hierboven beschreven 7, 8, 9, 11.
- Toepassen 2 ml CM aan de buitenkamer van de plaat met 6 putjes en incubeer bij 37 ° C overnacht (gedurende ten minste 18 uur).
- Verwijder voorzichtig de CM op de binnenkamer met 1 mL of 200 pi pipet en voeg langzaam differentiatie medium (DM) naar de binnenkamer met een 1 ml pipet tot vol. Wees voorzichtig om niet verstoren de cellaag.
- Controleer de culturen elke dag. Gezonde cellen verschijnen zoals in figuur 2.
- Verander het GH in de buitenkamer elke dag of om de andere dag, afhankelijk van het metabolisme van de cellen.
- Wanneer de media van de binnenkamer verandert van kleur (geel), verwijder voorzichtig de media op de binnenste filter kamer met een 1 ml of 200 pi pipet.
- Aspireren de media in de buitenste 6 wells plaat kamer met een aspiratie tip.
- Met behulp van een 1 ml pipet, langzaam toe te passen verse DM naar de binnenkamer tot de volledige. Wees niet te schrapen of anderszins verjagen de cellaag.
- Vervang de media in de buitenkamer met 2 ml vers CM.
- Handhaving van de culturen voor 2 weken, en vervolgens overgaan tot verwerking voor de gewenste bimoleculaire isolement.
Opmerking: Elke rij in 6 wells plaat, een totaal van zes inzetstukken (Figuur 1B), worden per experiment verwerkt om voldoende cellen te verkrijgen DNA, RNA of eiwit voor analyse. - Aspiraat media in de buitenkamer en spoelen met 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Haal het papier uit de binnenste kamer met een 1 ml of 200 pi pipet en voeg 500 pi PBS. Er geen krassen of anderszins de cellen op het membraan storen.
- Aspireren PBS uit de buitenkamer en verwijder PBS uit de binnenkamer met 1 mL of 200 pi pipet. Nadat de PBS is verwijderd, gaat u rechtstreeks naar de juiste toepassing hieronder beschreven. Sta niet toe dat het membraan te drogen. De cultuur kan kort worden bewaard in de PBS totdat de applicatie is klaar om te beginnen.
3. Verwerking van de Filters voor Pellet Banking
- Voeg 100 ul 0,25% trypsine-EDTA bij elke binnenkamer en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Kort zorgvuldig schudden / schrapen de cellen op het membraanoppervlak met 200 pi pipet terwijl op en neer pipetteren (vermijd puncTuring het membraan). Incubeer gedurende 1 min bij 37 ° C.
- Voeg 250 ul CM van de eerste binnenkamer en pipet zachtjes op en neer naar het filter te spoelen.
- Overdracht geresuspendeerde cellen aan de aangrenzende filterkamer die hetzelfde medium bevat en omstandigheden te herhalen en neer te pipetteren.
- Herhaal deze procedure voor elk van de inzetstukken van een aandoening. Verzamelen en overdragen cellen een 1,5 ml centrifugebuis.
- Spoel elk binnenste kamer met een extra 100-200 ui CM om eventuele resterende cellen te verzamelen. Voeg toe aan de 1,5 ml centrifugebuis in stap 3.5.
- Spin de cellen bij 423 xg in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Zuig het supernatant en was de cel pellet eenmaal met 1000 pi PBS.
- Spin opnieuw bij 423 xg in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Aspireren PBS en bevriezen bij -80 ° C voor later gebruik.
4. Het verwerken van de Filters voor RNA of DNA Isolation
- Aangezien het filter kunnen dissociëren van het inzetstuk, was het ontkoppeld filtermembraan pipetteren de extractieoplossing en neer. Verzamel zoveel van de extractie reagens mogelijk door het kantelen van de plaat met 6 putjes en aspireren van eventueel resterende vloeistof.
5. Het verwerken van de Filters voor eiwit Isolation
- Plaats het filterelement in de 6 wells plaat op het ijs. Om de binnenkamer, voeg 10 ul van proteïne lysisbuffer aangevuld met 1 mM natriumfluoride (NaF), 1 mM natrium vanadaat (NIW), 100 mM dithiothreitol (DTT) en 100 pl anti-protease cocktail.
- Schud / schrapen de cellen op het membraanoppervlak met 20 ul pipet tijdens en neer te pipetteren. Vermijd het genereren van bellen in de lysisbuffer.
- Incubeer de 6 wells plaat met filter inzetstukken op ijs gedurende 10 min.
- Herhaal schrapen en spoel het membraanoppervlak met de lysisbuffer.
- Verzamel de lysaten van de inzetstukken 6 en overbrengen in een 1,5 ml centrifugebuis op ijs.
- Spoel het eerste membraan met een extra 10 ul lysisbuffer en transfer naar het volgende filter.
- Herhaal stap 5,6 voor inzetstukken, verzamelen alle resterende lysis bufferoplossing toevoegen 1,5 ml buis (stap 5,5).
- Incubeer het monster op ijs gedurende nog 5 min.
- Centrifugeren op maximale snelheid (16.873 xg in een tafelblad centrifuge) gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Pipette lysaat supernatant in een nieuwe 1,5 ml buis.
- Overgaan tot de analyse van eiwitconcentratie of store lysaten bij -80 ° C.
6. Processing voor H & E en Immuno-kleuring
- Voeg 500 ul en 1 ml 10% NBF (neutraal gebufferde formaline) aan de binnenste en buitenste kamer en laat incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Zuig het NBF van de buitenkamer en voeg 1 ml hydroxyethyl agarose (HEA) verwerken gel om een 1,5 ml centrifuge. Langzaam smelt de agarose in een magnetron met behulp van laag vermogen en herhaalde 10-20 s pulsen totdat de agarose wordt gesmolten.
- Houd de HEA in een 37 ° C warm bad om stolling te voorkomen tot gebruik.
- Verwijder de NBF uit de binnenkamer en 25 ui gesmolten HEA toepassing op de binnenkamer en laat de agarose te stollen gedurende 2-5 min.
- Natte 2 foam histologie pads in 10% NBF en plaats een pad in een inbedding cassette (zie Figuur 3D).
- Gebruik een # 11 scalpel blade (die een zeer scherpe, puntige fijn blad heeft) aan de filter scoren vanaf de onderzijde van het inzetstukkamer, gedeeltelijk los uit de plastic insert kamer.
- Plaats een kleine hoeveelheid (100-200 ul) van NBF in een petrischaal en dompel de gedeeltelijk losgeraakt filter in de NBF (figuur 3A).
- Met een # 10 scalpel blade voorzichtig drukken tegen het midden van het filter aan de binnenkant van het inzetstuk kamer, volledig los van het filter het inzetstuk vat (Figuur 3B). Als er een deel van het filter dat nog is bevestigd aan het vat, verbreken met de scalpel.
- Snijd de HEA-gecoate filter in de helft met de # 10 mes scalpel (figuur 3C).
- Plaats elke helft van het filter op het schuimkussen in de histologie cassette bereid in stap 6.4 (Figuur 3D).
- Voeg de tweede 10% NBF doordrenkte spons om de cassette, daartussen het filter.
- Snap verzegeling van de cassette, plaats in de NBF en incubeer overnacht.
- Procesfilters in paraffineblokken voor snijden en kleuring alseerder 12 beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De celkweek insert systeem is een relatief eenvoudige en snelle procedure voor het produceren van 3D-kweken prostate CRC's die luminale celdifferentiatie ondersteunt. Een schema van het systeem wordt getoond (Figuur 1A) aandacht voor de toepassing van de gelatine coating op het onderoppervlak van het filterelement. De inzetstukken zijn alleen vernietigd voor de toepassing van de gelatine. In figuur 1B de filters in de juiste richting voor het kweken. Volgens een transparant tussenvoegen wordt een representatief beeld van een gezonde prostaat 3D CRC cultuur getoond (10x) (figuur 2). De dichte gelaagdheid van gezonde CRCs aangetoond is typisch na de oprichting en kan worden gevisualiseerd met behulp van standaard lichtmicroscopie. Tijdens de eerste inrichting, is het essentieel om de cellaag gevormd dat de werkwijze verenigbaar is met een bepaalde cellijn die geschikt hechting en la visualiserenYering cellen opgetreden.
HEA is aan de binnenzijde van het inzetstuk zoals hierboven beschreven. Na het aanbrengen van de HEA, moet erop worden gelet bij het scoren van de filter om het uit de inzetstuk (figuren 3A, 3B) te verwijderen. In alle stappen (Figuren 3A-3D), moet erop worden uitgeoefend teneinde onnodig schuiven van de HEA laag minimaliseren op het filter met cellen. De CRC laag kan gemakkelijk worden verstoord en beschadigd tijdens de overdracht naar de H & E cassette (Figuur 3D). Na excisie van de HEA-beklede filter van de kunststof buis (Figuren 3A-3C), kan het filter worden gehalveerd en verwerkt voor snijden en kleuring met standaard inbedding cassettes (Figuur 3D). Splitsen van het filter in de helft is van belang de beschikbare oppervlakte te maximaliseren kruis snijden op H & E en IF.
immunofluorescentiekleuringevenals helder veld (BF) beelden van de cellen gekweekt op het filter laag werden verzameld met behulp van een microscoop met DSU (Disk Scan Unit) draaiende schijf confocale mogelijkheden. Representatieve resultaten voor histologie en H & E kleuring wordt in een dwarsdoorsnede van het filterelement en cellen (20X) (figuur 4). Met de juiste zorg, laten we zien dat een CRC laag op de filter inserts kunnen worden doorgesneden en gekleurd, zoals gebruikelijk voor tissue histologie. Tijdens het snijden, is het mogelijk om de CRC's op losraken van het filter als intacte cellaag zoals aangetoond (figuur 4). De afbeelding toont BF meerlagige cel lagen bovenop het poreuze membraan (Figuur 5A). De afzonderlijke fluorescerende opnamen kernen (DAPI, figuur 5B), p63 (figuur 5C) en de AR (figuur 5D) getoond, zoals het samenvoegen van drie fluorescentie markers (figuur 5E). Tot slot, een composiete BF en IF overlay wordt getoond (Figuur 5F) tot vaststelling van de lokalisatie van het fluorescentiesignaal ten opzichte van de cellen en het filter. De bekleding van de DAPI vlek met de p63 IF kleuring toont duidelijk sommige cellen nog steeds in een proliferatieve toestand. De lokalisatie van AR IF kleuring in de kern is indicatief functionele reactivering van AR in prostaatcellen.
Een vergelijking tussen de IF ons filterinzetstuk systeem en een deelbaar prostaatweefsel wordt getoond (figuur 6A, 6B) naar de gelijkenis in ontwikkeling van CRC insert laag aantonen dat van de prostaat epitheel. De prostaat kanaal toont expressie van p63, in overeenstemming met prostate basale cellen. p63 kleuring wordt ook waargenomen in de CRC's op het inzetstuk. Een hoger percentage p63 tot expressie brengende cellen waargenomen in onze inzetstuk ten opzichte van het intacte weefselsectie. Bovendien, zowel nucleaire en cytoplasmatische AR gezien in de prostaat tis sue sectie en terwijl de CRC's op het filterinzetstuk toon minder algemene AR expressie, nucleair AR expressie en cytoplasmatische kleuring wordt waargenomen, vergelijkbaar met de intacte prostaat.
Figuur 1: Representatieve Beelden van de 6-well kweekplaat en invoegen dat de 3D Cultuurstelsel omvatten. (A) Omgekeerde inzetstukken voor het aanbrengen van de gelatine bekleding op de onderzijde van het filter (pijl). Een grotere afbeelding van de insert en filter Show (inzet). (B) op de juiste geplaatst inserts. De binnenste en buitenste kamers van het systeem getoond (pijlen). De boxed rij B toont hoe meerdere monsters worden verkregen voor een bepaalde experimentele conditie. Aan het einde van de 2 weken groeiperiode deze inserts kunnen worden samengevoegd om voldoende materiaal te leveren voor analyse."Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een representatief beeld van een laag van gezonde CRCs gezaaid op een transparante filtermembraan wordt getoond. Zowel de binnenste en buitenste camera's bevatte geconditioneerde media. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een representatief beeld van een filter gehalveerd in twee secties en geplaatst in een paraffine Cassette voor het inbedden. (A) Filter inzet met HEA coating na het scoren en voor de verwijdering. (B) De vrijgemaakte filterelement van het polycarbonaat vat. (
Figuur 4: Een vertegenwoordiger van H & E gekleurde dwarsdoorsnede van het filterelement en cellen (20X). Zowel het membraan (onder) en cellaag (boven) getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Een reeks Vertegenwoordiger Bright Field (BF) en Immunofluorescentie (IF) Beelden vanCellen Doorsnede van de Filter (40X). Dwarsdoorsneden van het filter en de cellen worden getoond. Een BF afbeelding van de cellen op het filteroppervlak (5A) onbesmet vergezeld gaat van beelden voor DAPI gekleurde kern (5B) en immunofluorescentie kleuring voor twee verschillende eiwitten, p63 (5C) en androgeenreceptor (AR, 5D). Een samengestelde bekleding van de celsecties (5E, F) definieert lokalisatie van de MF-signalen in het kader van de cellen en filter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Een vertegenwoordiger Immunofluorescentie (IF) Beeld van Cells Doorsnede op het filter ten opzichte van een afdeling van de prostaat epitheel van Tissue (20X).Een dwarsdoorsnede afbeelding van onze filterelement wordt getoond (figuur 6A) in vergelijking met de ductale epitheliale lagen van een intact prostaat (Figuur 6B). De kleuring van p63, de AR en de kern werd uitgevoerd zoals in figuur 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primaire cellijnen zijn een belangrijke en zich snel ontwikkelende platform voor kankeronderzoek. De cultuur insert-gebaseerde 3D-cultuur systeem ondersteunt de differentiatie van primaire prostaat CRCs binnen twee weken termijn. De CRC filter methode vertegenwoordigt een nieuwe, medium throughput methode voor prostaatkanker onderzoek. Bestaande muis PDX merken tijdrovend en zeer duur, en veel van de PDX monsters niet in kweek, beperken onderzoeker geïnitieerde experimenten en hun nut. Bovendien, terwijl slagingspercentages van de oprichting van PDX variëren sterk 13, de CRC methode heeft een hoge mate van succes bij het vaststellen van cellijnen 3. Wij beschouwen ons systeem complementair aan de R-spondin gebaseerde prostaat organoïde aanpak; heeft echter een gebrek aan succes met betrekking tot het stellen van organoids uit primaire prostaatkanker gemeld 14. Bovendien, de media, de wijze van vestiging,en onderhoud van CRC aanzienlijk eenvoudiger dan de R-spondin gebaseerde prostate organoïde benadering. Als extra voordeel kan de CRC's worden vastgesteld en gebruikt om gematched normale en tumor culturen directe moleculaire vergelijkingen testen.
Enkele technische problemen die moeten worden aangepakt bij de vaststelling van dit systeem. Ten eerste, de gelatine aangebracht op de onderzijde van het filterelement helpt, maar elimineert niet diffusie van de media door het membraan. Frequente veranderingen media worden gebruikt om de respectieve verloop van differentiatie (boven- of apicale cellaag) versus groei te handhaven (lagere of basale cellaag) omstandigheden in de kamer. Ten tweede, succesvolle 3D CRC culturen vereist een relatief hoge cel zaaidichtheid. Lagere dichtheden zaaien leverde slechte resultaten met betrekking tot de integriteit van de cel laag die zich ontwikkelt op het filteroppervlak. Dit is een veel voorkomende overweging bij het kweken van CRC's, als ze groeien het meest krachtig wanneer vastgehouden aan eent hoge celdichtheden. Tenslotte de juiste verwijdering en daaropvolgende paraffine inbedding van het intacte cellaag was kritisch voor het bepalen van de omvang van celdifferentiatie. De toevoeging van agarose hydroxyethyl (HEA) zowel verminderde celverlies en verbeterde de algemene morfologie van de cellen in vergelijking met niet-ingebedde filters (niet getoond). Eenmaal goed ingebed, werden de filters doorgesneden en verwerkt op een manier die vergelijkbaar typische cel- en weefselmonsters.
We beginnen enkel aan de architectuur van de prostaat epitheel met deze filtermethode emuleren. Bijkomende wijzigingen in de kweekomstandigheden, media en het substraat waarborgt, die gemakkelijk kan worden aangepakt. Zo kunnen geformuleerd differentiatie media die beter kunnen bevorderen luminale vs basale differentiatie snel worden getest. Aangezien lentivirale infectie van CRC's is zo gemakkelijk uitgevoerd als commerciële kankercellen 7 en 2D CRC's hebben alaldus is getransfecteerd met CAS9 / CRISPR gen-editing technologie vectoren permanent wijzigen van de genoom (gegevens niet getoond), het effect van gemuteerde, verwijderd of hersteld genen kunnen worden getest. Evenzo kan het volgen lijn mogelijk gemaakt door het introduceren lijnspecifieke reportergenen.
Naast het veranderen van de media of cellen, kunnen wijzigingen van het filteroppervlak worden getest. Verschillende filtermembraan substraten zijn commercieel verkrijgbaar. Daarnaast hebben we gevonden dat de commerciële extracellulaire matrix, een geschikte groei omgeving als aan de binnenzijde van het filter. Als een van de doelstellingen van het inzetstuk systeem beter model van de prostaat micro, misschien de meest interessante wijzigingen kunnen het invoeren van normale of tumor afgeleide stromale cellen, hetzij in co-cultuur met de CRC's binnen de grenzen van het inzetstuk of in de onderste kamer aan de groeimedia conditioneren. Het wijzigen van de insert goed met secties of cellen ontdane prostaatweefsel is ook mogelijk. In deze benadering kan stroma / epitheliale interacties kan de primaire cellen om de cellen ontdane weefsel als een matrix voor de groei.
De mogelijkheid om primaire cellen vast te stellen en vervolgens zorgen voor de voorwaarden voor hun differentiatie is een ideaal formaat voor meer biologisch relevante onderzoek naar de normale klier ontwikkeling en voor kankeronderzoek. De hierin beschreven biedt een platform waarmee een onbeperkt aantal celtypen en modificaties kunnen worden gecombineerd om het systeem aan te passen aan individuele behoeften experimentele en betrouwbaar verzamelen van de monsters voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door T32 (CA 9686-18) en TL1 (TL1TR001431) postdoctorale opleiding subsidie awards (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), alsmede U01 PAR-12-095 (Kumar) en P30 CA051008-21 (Weiner). Monster fixatie, snijden en kleuring werd uitgevoerd in de Lombardi Comprehensive Cancer Center histologie en Tissue Shared Resource. Wij danken Richard Schlegel voor nuttige discussies. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Cancer Institute en de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T.
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
