Summary
Dieser Artikel beschreibt einen Verhaltenstest , die männliche Paarungs Laufwerk verwendet in Drosophila melanogaste r Motivation zu studieren. Mit dieser Methode können die Forscher fortgeschrittene Fliegenneurogenetischen Techniken verwenden, um die genetischen, molekularen aufzudecken und zellulären Mechanismen, die diese Motivation zu Grunde liegen.
Abstract
Trotz jahrzehntelanger Forschung, bleiben die neuronalen und molekularen Grundlagen der motivierenden Staaten mysteriös. Wir haben vor kurzem eine neue, reduktionistische und skalierbares System für eingehende Untersuchung der Motivation zur Aufnahme der Antriebs der männlichen Drosophila melanogaster (Drosophila) verwenden, werden die Methoden , für die hier Detail , das wir. Das Verhaltensparadigma Zentren auf der Erkenntnis, dass männliche Gegenplatte neben Fruchtbarkeit im Laufe von wiederholten Paarungen ab und erholt sich über ~ 3 d. In diesem System konvergieren die mächtigen neurogenetische Werkzeuge zur Verfügung, in der Fliege mit dem genetischen Zugänglichkeit und vermeintlichen für das Sexualverhalten zur Verfügung Schaltplan. Diese Konvergenz ermöglicht eine schnelle Isolierung und Befragung von kleinen neuronalen Populationen mit spezifischen Motivations Funktionen. Hier stellen wir ausführlich die Planung und Ausführung des Sättigungs Assay, der verwendet wird, zu messen und Balz Motivation in der männlichen Fliege verändern. Mit dieserTest zeigen wir auch, dass niedrige männliche Paarungs Antrieb durch die Stimulierung dopaminergen Neuronen überwunden werden können. Der Sättigungs Test ist einfach, kostengünstig und robust gegenüber Einflüssen von genetischen Hintergrund. Wir erwarten, dass das Sättigungs Test viele neue Einblicke in die Neurobiologie der Motivationszustände zu erzeugen.
Introduction
Die Arbeit in Drosophila hat tief und Pionier Einblick in viele biologische Phänomene zur Verfügung gestellt, einschließlich der Art des Gens 1, Prinzipien der Embryonalentwicklung 2, zirkadianen Rhythmen 3 und die Entwicklung und die Verdrahtung des Nervensystems 4, 5, 6. Motivation bleibt weit weniger gut als diese Phänomene zu verstehen, vielleicht wegen der Einschränkungen auf den Systemen, die bisher untersucht wurden. Motivation in der Fliege wird im Rahmen des Hungers in erster Linie untersucht, die durch viele Herausforderungen mit sich bringt, um ihre verschwindend klein Nahrungsaufnahme pro Fütterung Kampf und Exoskelett, die deutliche Zeichen für eine Fettablagerung ausschließt. Folglich besteht ein Bedarf, die Systemen zu erweitern Motivation in the fly zu studieren.
Wir beschreiben eine Verhaltens Rahmen für die Untersuchung von zusammenpassenden Antriebs inDrosophila. Dieses System nutzt die neurogenetischer Werkzeuge im fly sowie die Zugänglichkeit 7, 8, 9, 10, 11, 12 und der putative Connectome seiner geschlechtsdimorphischen Schaltung 8, 13. Darüber hinaus viel von der angeborenen 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 und erlernten 22, 23, 24 sensomotorischen Schaltung Steuerung Balz wurde im Detail ausgearbeitet, eine seltene Gelegenheit,zu finden, trifft die genaue Schaltungsknoten, auf die Motivation. Vor kurzem berichteten wir , dass in der Fliege, wie beim Menschen, Dopaminspiegel 25 bis Paarung Antrieb von zentraler Bedeutung sind, 26, 27. Wir haben genetische Zugang zu den relevanten Dopamin produzierenden gewonnen und Empfangen von Neuronen in der Fliege, die Erleichterung detaillierte Molekular- und Circuit-Level - Analysen dieser konservierten Phänomen der Assays nutzen wir hier 25 beschreiben.
Wir fügen den Verhaltenstests in Zhang et al. 25 eine neue Wohnung Verhaltens Arena , die Video - Scoring ermöglicht, die wir eine 2-dimensionale (2-D) Sättigungs Test, eine wichtige Verbesserung gegenüber früheren Methoden aufrufen. Folglich ist der neue Test skalierbarer und quantifizierbar, und daher besser geeignet für die genetische Screens von Genen und in der Motivation beteiligten Neuronen. Wir verwenden diese neuen Tests, zusammen mit der Balz-Assays und neurogetische Manipulationen, zu zeigen, wie Paarung Antrieb in der Fliege zu messen und zu verändern.
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Protocol
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung (§§ 1 - 3), Durchführung (Abschnitt 4) und Analyse (Abschnitt 4) von 2-D-Sättigung-Assays. Dann dopaminerge Stimulation als Beispiel, Abschnitt 5 zeigt, wie thermogene Stimulation zu kombinieren mit 2-D-Sättigungsassays hypersexuality zu induzieren. Abschnitt 6 beschreibt drei Möglichkeiten, um die Ergebnisse der 2-D-Sättigungstests zu verifizieren. Schließlich Abschnitt 7 zeigt, wie die Erholung der Paarung Antrieb in männlichen Fliegen zu messen.
1. Die Herstellung von 8- und 32-Kammer Behavioral Arenas
HINWEIS: Jede Verhaltens Arena besteht aus mehreren Schichten aus lasergeschnittenen Kunststoffplatten zusammengehalten durch Sechskantschrauben und Flügelmuttern an jeder der vier Ecken (1A).
- Fabrizieren die Schichten der Arena. Fabrizieren jede Schicht eine Laserschneider Blätter aus Acrylkunststoff in die entsprechende Form zu schneiden (siehe 1B, 1C für Produkte).
HINWEIS: Viele Forschungs Institutions Laserschneider in ihren Maschinenhallen oder Hersteller Plätze. Wenn das Organ den Zugang zu einem Laserschneider hat, fahren Sie mit den folgenden Schritten. Wenn nicht, folgen Sie den Anweisungen in Schritt 1.2 statt.- Für jede Schicht, öffnen Sie das Design-Muster in der Software des Laser-Cutter.
HINWEIS: Die Entwürfe können in entsprechend benannten PDF - Dateien (zB 8-Kammer - Arena - Schicht 2 - Doors.pdf) zu finden in ergänzendes Material 1. Diese Datei enthält auch Anmerkungen für die Art von Kunststoff (zB verwendet werden, 1 / 8 Zoll (dh 3,175 mm) klar Acryl). Die genaue Dicke jeder Schicht ist nicht kritisch. Die Hauptanforderung ist 0,12 Zoll (3 mm) oder mehr freier vertikalen Raum in den Kammern zu ermöglichen. - Passen Sie die Lasereinstellungen (Power, Fokus, etc.) für die Art und Dicke der Kunststoff verwendet werden. Legen Kunststoff in der Laser-Cutter Bett und führen Sie den Laser-Cutter.
HINWEIS: Diese Einstellungen weitgehend auf der Basis der Laser cutte variierenr Modell und die Stärke seines Lasers. Finden Sie die entsprechenden Einstellungen auf Basis von Erfahrungen aus der Vergangenheit oder indem Testschnitte auf Schrott Kunststoff. Die tiefen hexagonal Gravuren sind in das Design einbezogen werden die Sechskantschraubenköpfe zu versenken. Diese Funktion ermöglicht eine einhändige Anziehen der Flügelmuttern und ermöglicht die Arenen flach auf der Bank zum Ausruhen (ohne Schraubenköpfe vorsteht). Dennoch tiefe Gravuren machen, ist oft schwer zu erreichen, und zeitaufwendig, mit einem Laserschneider. Dieser Schritt ist optional und kann ohne Auswirkung auf die Verhaltensergebnisse übersprungen werden. - Wenn die Türrahmen Schneiden (Layer 2, Abbildung 1A), ferner geeignete Lasereinstellungen zur Gravur der Kammernummern in das Design einbezogen werden (wie in 1B, 1C).
- Für jede Schicht, öffnen Sie das Design-Muster in der Software des Laser-Cutter.
- Legen Sie eine Bestellung mit einem Online-Laserschneiden fabricator. Laden Sie alle PDF - Design - Dateien für die 8- und / oder 32-Kammer - Arena , und geben Sie den Materialtyp (zB 1/8 Zoll (dh 3,175 mm) clear Acryl), basierend auf den Anmerkungen in den Dateien. Die Ergebnisse werden angezeigt , wie in den 1B (8-Kammer - Arena) und 1C (32-Kammer - Arena).
- Montieren Sie Arenen mit vier Sechskantschrauben und vier Flügelmuttern ausrichten und halten zusammen , um die Kunststoffschichten (1A). Die Arenen erscheint , wie in Abbildung 1D, 1E (8-Kammer) und 1F, 1G (32-Kammer).
HINWEIS: Die Nahrungsmittelwand (Schicht 4 in Figur 1A) nur dann für 2-D Sättigungsassays verwendet und in 32-Kammer - Arenen weggelassen, die in der Balz - Assays verwendet werden.
2. Nahrungszubereitung für 2-D Satiety Assay
Hinweis: Da ein 2-D-Sättigungstest 4,5 h reicht, fliegen Essen in der Arena verwendet wird Nahrung und Wasser zu versorgen. Dieses Protokoll verwendet, ist aber nicht beschränkt auf, die herkömmliche Maismehl-Agar Nahrungs fliegen.
- Teilweise montieren Sie die 2-D-Sättigungs Arena (8-Kammer) mit Schichten 3 bis 6und ziehen Sie es mit Flügelmuttern und Sechskantschrauben (Abbildung 1A für Schicht Zuweisungen sehen).
- Legen Sie frische fliegen Lebensmittel in einen sauberen, mikrowellengeeignet Flasche. Fügen Sie gerade genug Wasser , um die Unterseite der Flasche (2A) zu decken.
- Essen aus der Mikrowelle auf hoch für 30 - 45 s. Überprüfen Sie den Fortschritt und rühren alle 15 s , bis sie geschmolzen (2B). VORSICHT! Fly Essen leicht überkocht.
- Verwenden Sie ein abgestumpft 1000-ul Pipettenspitze (2C) zu langsam übertragen ~ 1 ml geschmolzen Lebensmittel in jede Kammer (2D).
- Lassen Sie Lebensmittel bei 4 ° C für ~ 10 min (Abbildung 2E) wieder zu verfestigen , bevor vollständig in die Arena (2F) zusammenbauen.
- Verwenden Sie den ausgefüllten Arena für Experimente (siehe Abschnitt 4) oder bei 4 ° C.
- Lagern Sie das übrig gebliebene Essen bei 4 ° C und Wiederverwendung.
3. Vorbereitung Virgin Frauen für Verhaltenstests
HINWEIS: 2-D Sättigungs Assays verwenden eine große Anzahl von jungfräulichen weiblichen Fliegen (~ 120-160 für eine vollständige Verhaltens Arena), die schwierig mit Standardmethoden zu sammeln. Dieser Abschnitt beschreibt einen alternativen Ansatz mit dem hs-hid Transgen auf dem Y - Chromosom 28, die erfolgreich 25, 29 bei der Balz - Assays verwendet wurde. Die Lager verwendet weiß-eyed jungfräulichen Weibchen zu erzeugen, hat den Genotyp w1118 (X) / hs-hid (Y); + / +; + / + (Bloomington Artikelnummer 24638).
- Flip fliegt in eine neue Flasche einmal 20-50% der Puppen haben geschlüpften (siehe 3A zum Beispiel) , und es gibt genug Männer (5-10) , um die Lager zu propagieren.
- Hitzeschock die ursprüngliche Flasche in einem 37 ° C heißen Wasserbad 1 h ausreichend aktivieren hs-hid Männer zu töten (3B). Nach dem Hitzeschock, wird nur Frauen aus diesen Flaschen schlüpfen und so jungfräulich bleiben, bis dieAssays.
HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass alle Seiten der Flasche gleichmäßig erwärmt (siehe 3A für Wasserlinie). Verlängern Sie diese Zeit für bis zu 2 h, wenn 1 h nicht ausreicht, um alle Männer einschläfern. - Isolieren gesammelter Weibchen für mindestens 3 d vor Experimenten zu gewährleisten , dass sie alt genug sind , um sexuell empfänglich 25, 29 zu sein.
HINWEIS: Y-Chromosom-weniger Männchen gelegentlich aus diesem Lager entstehen. Diese Männer haben weiße Augen und sind unabhängig von den Hitzeschock, weil sie nicht das hs-hid Transgen enthalten. Sie können nicht Spermien produzieren und daher nicht Empfänglichkeit bei Frauen verringern kann 30, 31.
4. Performing und Scoring 2-D Satiety Assays
HINWEIS: Es ist wichtig, das Alter des Mannes zu steuern, fliegt als Gegen Antrieb ändert sich mit dem Alter. Dieses Protokoll verwendet Männer , die 3 - 4 d alt 25
- Stellen Sie den Inkubator auf die gewünschte Temperatur (zB 23 ° C für Standard-, RT Experimente) und Luftfeuchtigkeit (> 30%). Für Inkubatoren ohne Feuchtigkeitskontrolle, eine Tasse Wasser in den Inkubator verlassen, ist ausreichend.
- Legen Sie eine 2-D-Sättigungstest Arena im Inkubator für ~ 30 min, um die Temperatur zu äquilibrieren und zur Vermeidung von Kondensation in den Kammern im Verlauf des Experiments. Die Drehtüren sollten in der offenen Position sein.
- Verwenden Sie 32 eine Fliege Aspirator 15 abzusaugen - 20 jungfräulichen Weibchen in jede Kammer der Arena (Abbildung 4).
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Weibchen und Männchen sind am selben Tag wie dem Assay nicht anästhesiert. Nach unserer Erfahrung kann die weibliche Empfänglichkeit und männliche Paarungsverhalten dabei auswirken. - Absaugen 1 Männchen in jede Kammer.
- Legen Sie die geladenen Arena im Inkubator unter einem Standard - Consumer - Camcorder (Abbildung 5) und Film für 4,5 h.
- Ergebnis Videos mit der Feststellung , wenn jeder männliche fliegen beginnt und endet jeder Paarung (dh Kopulation). Dieser Schritt kann auf den ersten zeitraubend sein. Mit etwas Übung kann man die Videos bei 5x Geschwindigkeit oder höhere Punktzahl.
HINWEIS: Da fliegt für ~ 20 min bei ~ 23 ° C (kürzere Dauer bei höheren Temperaturen) paaren 29, kann man die ersten 15 Minuten von jeder Paarung überfliegen. - Nach der Anmeldung alle Paarungszeiten, die Anzahl der Paarungen für jede Fliege Summe (siehe repräsentative Ergebnisse).
- Verwenden Sie den bereitgestellten Code ein Ethogramm zu erzeugen. Siehe Supplemental Material 2 für den Code, Anweisungen und Beispieldaten.
- Verwenden Sie CO 2 oder kalten Temperaturen , um die Fliegen zu betäuben , bevor sie zu entfernen.
5. Mit thermogene Manipulation Satiety Reverse in 2-D Satiety Assays
Hinweis: Dieses Protokoll prüft, ob thermogene Stimulation einer definierten neuronalen Population Sättigung zu überwinden. Die experimentelle flies der wärmeempfindlichen Kationenkanal TRPA1 in definierten Populationen von Neuronen (UAS-TRPA1) auszudrücken. Die Schritte gelten unten auf die Stimulation von dopaminergen Neuronen (TH-Gal4), die Aufnahme der Antriebs 25 zu fördern gezeigt wurden. Diese Schritte können in Verbindung mit anderen neuronalen Treiber verwendet werden, um andere Populationen zu entdecken, die Aufnahme der Antriebs fördern.
- Um thermogenePaarungsVerhalten in satiated Fliegen induzieren, um die Temperatur im Inkubator erhöhen ( zum Beispiel von 23 ° C bis 28,5 ° C) nach einer vollständigen 4,5 h 2-D Sättigungs Experiment abgeschlossen.
- Nachdem der Inkubator die gewünschte Temperatur erreicht, Wärme Stimulation fortzusetzen und die Paarungen Score (dh. Paarungen) der Männchen für 1 h (Repräsentative Ergebnisse sehen).
HINWEIS: Die Temperatur und die Dauer der Stimulation auf dem Genotyp variieren kann, so ist es notwendig, die optimalen Bedingungen zu beheben, die Reizüberflutung von Neuronen zu verhindern, während immer noch eine robu Herstellungst Phänotyp.
6. Mit Umwerbung und Locomotion Satiety zu überprüfen:
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden drei optionale Methoden, die verwendet werden können, um die Ergebnisse von 2-D-Sättigung Assays zu überprüfen. Sie sind nicht für jeden Test erforderlich.
- Verwenden Sie Balz Assays Sättigung zu überprüfen.
- Absaugen eine männliche und eine weibliche Jungfrau in jede der 32 Kammern in einer Balz-Arena.
- Film die Fliegen für ~ 20 min einen Standard Consumer-Camcorder verwenden.
- Ergebnis der Balz - Index (CI) zu quantifizieren Balz 25; dies ist der Bruchteil der Zeit Balzverhalten verbrachte Durchführung (Singen, folgende usw.) und Paarung (dh Kopulation) über 5 min Fenster. Dieses Fenster geht von der ersten Instanz von Balzverhalten. Wenn ein Mann nicht fliegen Balz in den ersten 15 Minuten beginnen, seine CI ist 0. Naïve WT fliegt ein CI größer als 0,9 zeigen sollte, während ein voll gestillt Fliege ein CI b haben sollteelow 0,2. Andere Balz Maßnahmen können auch 23 in Betracht gezogen werden, 33.
- Scoring Balz in 2-D Sättigungsassays
- Score die Menge an Zeit , die eine männliche fly aufwendet, über einen Zeitraum von einer 2-D Sättigungs Assay courting (beispielsweise der ersten h). Balz wird als männlich definiert jeden Schritt des Rituals Durchführung (Gesang, folgende, etc.). Anders als in Abschnitt 6.1.3, ist dieser Schritt nicht Zeit das männliche Paarungs verbringt umfassen.
- Teilen Sie die Balz Zeit oben durch die Gesamtzeit der Männchen war nicht Paarung (dh nicht kopulierenden) im gleichen Zeitraum. Wenn zum Beispiel ein männlicher Plätze für 15 min und 20 min für mates über der ersten h fliegen, ist das Verhältnis 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. Das Verhältnis wird als "Fraktion der nonmating Zeit in der Balz" gezeigt in Repräsentative Ergebnisse.
- Mit Fortbewegung Assay Erschöpfung zu bewerten
- zusammenbauen teilweise die 32-Kammer-Arena mit allen Teilen, aber die Kontrastfolie.
- Absaugen eine männliche Fliege (keine weibliche Fliegen) in jede der 32 Kammern in einer Balz-Arena.
- Film die Fliegen für ~ 10 min einen Standard Consumer-Camcorder verwenden.
- Verfolgen Sie die Fliegen mit dem MTrack2 Plugin in ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).
7. Nach der Paarung Laufwerk Wiederherstellen von 2-D Satiety Assay
- Führen Sie eine 2-D-Sättigung Test, wie in Abschnitt 4 beschrieben, aber aspirieren das Männchen fliegt am Ende des Tests aus.
- Isolierung der männlichen Fliegen bei 23 ° C für die gewünschte Anzahl von Tagen.
- Führen Sie eine 2-D - Sättigungstest mit den gewonnenen Männern und sammle ihre Paarungen (dh Paarungen) für nur 1 h (siehe Repräsentative Ergebnisse).
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Representative Results
Zur Charakterisierung Drosophila Gegen - Antrieb, 3 Tage alten, WT Canton-S Männer wurden in einem 2-D - Sättigungstest getestet. Im Laufe des Tests (4,5 h), Männchen im Durchschnitt 4,8 ± 0,3 paaren (Mittelwert ± Standardabweichung vom Mittelwert, SEM) Zeiten. Paarungen initiieren meist in den ersten 2 h (78%) (6A, 6B) und weniger häufig , wie der Test fortschreitet (6A, 6B). Dieser Rückgang ist auf den Mangel an passenden Partner nicht durch (74% Weibchen bleiben unmated im gesamten Test) oder körperliche Ermüdung (6F). Vielmehr ist dieser Effekt wahrscheinlich durch eine Abnahme in den männlichen Balz während des Tests erklärt, von 42,6 ± 8,0% (Mittelwert ± SEM) (1 st h) auf 2,0 ± 0,7% (Mittelwert ± SEM) (letzte Stunde) von nonmating Zeit (6C). Dieser Rückgang der Balz ist auch zu sehen , wenn die Männchen bei der Balz - Tests mit neuen Frauen getestet werden (Abbildung 6d, 6e) (6G, 6H) isoliert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass intern beibehalten Gegen Antrieb in männlichen Fliegen in einem 2-D-Sättigungstest gesättigt und im Laufe der Zeit erholen kann.
Die 2-D Sättigungs Assay kann auch leicht mit Drosophila neuralen Manipulationen kombiniert werden. Vor kurzem berichteten wir , dass thermogene Stimulation der dopaminergen Neuronen kehrt Paarung Antrieb in übersättigten Mann 25 fliegt. Verwendung von 2-D Sättigungsassays finden wir , dass dopaminerge Stimulation (TH> TRPA1, 28,5 ° C) am Ende des Sättigungs Assay sowohl courtship erhöht (7A, 7C, rot) und Kopulation (7A, 7B, rot). Die Umkehreffekte sind nicht mit der elterlichen Kontrolle Genotypen (- 7C, Schwarz und Grau 7A) beobachtet. Alle diese Ergebnisse sind konsistent mit der aktuellen Studie25 und legen nahe , daß die 2-D Sättigungs Assay zusammen mit den Hilfs Assays (Balz und Fortbewegung), können molekulare und neuronalen Komponenten der Paarung Antriebs sezieren verwendet werden.
Abbildung 1. Konstruktion und Montage von Behavioral Arenas. Eine 8-Kammer - Arena (für 2-D - Sättigungs Assays) besteht aus 6 Schichten , die durch Flügelmuttern und Sechskantschrauben (A) zusammengehalten werden. Eine 32-Kammer-Arena (für courtship Assays verwendet) wird in ähnlicher Weise hergestellt, aber ohne die Nahrungsmittelwand (Schicht 4). Die Arena Teile werden mit einem Laserschneider ausgeschnitten , und die Schichten werden als (B) nummeriert für 8-Kammer und (C) für 32-Kammer. Die montierten 8-Kammer - Arenen sind in (D) (Vorderansicht) und (E) (Seitenansicht mit nummerierten Schichten) gezeigt. Die montierten 32-Kammer - Arenen in ähnlicher Weise (F montiert, G), aber Layer 4 (Lebensmittel Wand) weggelassen (G) , da keine Fliege Essen in der Arena für Balz - Assays ist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Herstellung von 2-D Satiety Assays mit Lebensmitteln. Standard Drosophila Lebensmittel in einem Mikrowellensicheren Glas mit Wasser (A) gegeben. Das Essen wird aufgewärmten , bis sie geschmolzen (B). Eine stumpfe Pipettenspitze (C, Pfeil) wird verwendet , um übertragen Lebensmittel Kammern eines teilweise zusammengesetzten Verhaltens Arena (D). Das Essen wird bei 4 ° C (E) vor der Verhaltens Arena wieder verfestigt wird komplett montiert (F).pg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Generieren von jungfräulichen Weibchen aus dem w1118 (X) / hs-hid (Y) Stock. Fly Flaschen sollten Hitze schockiert sein , wenn 50 bis 80% des pupae uneclosed sind , wie durch ihre Undurchsichtigkeit (A) angegeben. Das eingesetzte Bild zeigt Muster uneclosed (oben) und geschlüpften (unten) Puppen (A). Die Flaschen werden gewogen und in 37 ° C heißes Wasserbad für 1 h mit Wasserstand unter Wasser knapp über die Unterseite der Flaschenverschlüsse gleichmäßige Erwärmung zu gewährleisten (B). Siehe den schwarzen Pfeil in (A) für Wasserbereich . Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Laden fliegt in eine Behavioral Arena. Vorsichtig absaugen und halten 15 bis 20 Frauen in der Saugvorrichtung (A). Die Pipettenspitze wird verwendet , um die Drehtür (B) zu öffnen und die Fliegen sanft in die Kammer freigesetzt (C). Verwenden Sie die Saugvorrichtung die Drehtür (D) zu schließen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Durchführen und ein 2-D Satiety Assay Aufnahme. (A) Ein Standard - Consumer - Camcorder (a) verwendet , um den Test in einem Inkubator zur Aufzeichnung auf die gewünschte Temperatur eingestellt. Der Inkubator enthält einen Kolben, von Wasser (b) und einen Feuchtigkeitsdetektor (c) die, um sicherzustellen,angemessene Luftfeuchtigkeit (> 30%). Die hergestellte 2-D - Sättigung Test wird unter den Camcorder (B) gedreht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Sättigung und Wiederherstellung von Fy Mating Drive. In einem 2-D Sättigungs Assay paaren männlichen Fliegen häufig während der ersten 2 Stunden des Tests (A, B) , jedoch sinken die Balz (C) und Paarungen (B) als der Test fortschreitet. Die fortschreitende Abnahme der Paarungsverhalten wird beibehalten , wenn Männchen auf eine Balz - Assay mit neue Weibchen übertragen werden , nachdem ein 2-D Sättigungs Assay von 0 h abgeschlossen, oder 1 h bzw. 4,5 h (D, E). Rote Pfeile zeigen auf Männchen Balz und Paarungsverhalten aufweisen, während Orange arZeilen weisen auf nicht-Paarung, nicht umwerben Fliegen (A, D). Der Rückgang der sexuellen Verhaltensweisen ist nicht das Ergebnis von körperlicher Erschöpfung, als Männer gleiches Maß an Bewegungsaktivität vor und nach dem 2-D - Sättigungstest (F) zeigen. Männer nach und nach ihre Paarung (G) und Balz (H) Werte über 3 d der Isolation von Frauen erholen. In dieser Figur *** p <0,001, ** p <0,01, ns nicht signifikant für t-Test (C, F) und Einweg-ANOVA mit Tukey post-Test (E, G, H). N = 15 - 16 für jede Bedingung für alle Experimente. Fehlerbalken stellen Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: thermogene Satiety Reversal in Male Fliegen. Wie in der Standard 2-D Sättigungs Test zeigen Männchen eine Abnahme der Paarungen über den Verlauf des Versuchs, aber thermogene Stimulation von dopaminergen Neuronen (TH> TRPA1, rot), aber nicht in der Eltern-control-Genotypen (schwarz und grau), Wiedereinsetzung in satiated Männchen (A) Paarung Laufwerk. Keine Paarungen werden erzielt , wenn die X-Achse in (A) gebrochen. Diese Umkehrung der Paarung Antrieb kann entweder mit Zahlen Paarung quantifiziert werden (B) oder der Balz (C). X-Achsen - Zahlen in (B) und (C) beziehen sich auf die Zeit in (A). Orange Hintergrundfarbe zeigt an thermogene Stimulation (A - C). In dieser Figur *** p <0,001, ns nicht signifikant für Wechselwirkungen zwischen Genotyp und Temperatur in Zwei-Wege - ANOVA mit Bonferroni Post-Test (B, C). N = 8 für jeden Genotyp (B, C). Die Fehlerbalken stellen SEM..jove.com / files / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzendes Material 1. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Supplemental Material 2. Bitte klicken Sie hier , um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Motivation Zustände können gesättigt, aufrechterhalten werden und erholte 34. Wir stellen eine 2-D Sättigungs Assay, schnell und robust all dieser Aspekte der Paarung Antrieb im fly misst. Dieser Assay eröffnet die Möglichkeit, fortgeschrittene fly genetische Manipulationen der Verwendung der molekularen und Schaltungskomponenten eines motivierten Verhalten zu untersuchen.
Der Sättigungs Assay beruht auf der Fähigkeit des männlichen erfolgreich vor Gericht und kopulieren und Paarungen zu gegebener Zeit zu beenden. Obwohl hyposexual Fliegen Gericht weniger, Low-Balz Fliegen sind nicht unbedingt hyposexual; sie können zum Beispiel Schwierigkeiten haben , zu erkennen oder die Weibchen 35 zu verfolgen. Aus diesem Grund ist die Sättigung Test am besten geeignet zum Testen von hypersexuality, einem Phänotyp, die nicht zuverlässig in einem Standard-Balz Assay beobachtet werden kann, weil naive Wildtyp-Männchen Balz Indizes nähern 1. Hypersexualität im Sättigungs Test sh zeigenOuld hier zum Alter der männlichen in unserer Erfahrung betrachtet relativ werden, ältere Männer neigen dazu, sich zu paaren etwas häufiger als die 3 Tage alten männlichen Tieren.
Wir verwendeten thermogene Stimulierung der dopaminergen Neuronen, um die neurogenetischen Manipulationen exemplifizieren, die in diesem System verwendet werden können, um die Komponenten zu untersuchen Motivation zugrunde liegt. Darüber hinaus können die Forscher auch thermogene Stimulation über ein 2-D-Sättigungstest und suchen hyper Männchen verwenden, die Sättigung langsamer zu erreichen sind. Natürlich Sättigungsassays auch mit neuronaler silencing Werkzeuge 36 kombiniert werden können, 37, Optogenetik 38, 39 Mutationen genetisch, 40, 41, Knockdown RNAi 28, 42, 43, 44 usw.
Der Sättigungs Test ist erschwinglich und skalierbar. Jede Arena kann für ~ 10 $ im Wert von Materialien hergestellt werden (plus Laserschnittkosten, falls vorhanden) und nimmt weniger Platz ein als ein Taschenbuch. die Videos Scoring ist auch eine relativ einfache Aufgabe. Ein ausgebildeter Experimentator kann eine 4,5 h Video punkten mit 8 männlich in ~ 1,5 h fliegt. Weitere High-Throughput-Screening, kann man nur die letzten 2 h erzielen, wenn die normale Fliegen sehr geringe Mengen an Paarungs Laufwerk zeigen. Alternativ kann man vor Ort die Tests alle 30 Minuten überprüfen, da dies die Mehrheit der ~ 20 min lang Paarungen erfassen wird.
Wir hoffen , dass dieses System weit angepasst werden und wird zum Entriegeln der Geheimnisse der Motivation für die Entstehung von Drosophila als ein leistungsfähiges System beitragen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K12 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/8 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K42 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 3/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8560K219 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/32 inch black delrin | McMaster-Carr | 8575K132 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| Hex screws, 1 inch long (50x) | McMaster-Carr | 92314A115 | Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas. |
| Thumb nuts (25x) | McMaster-Carr | 92741A100 | Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr). |
| Camcorder | Canon | Vixia HF R700 | Can be replaced by any consumer comcorder. |
References
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