Summary
כלי דם מהונדסים Scalable ישפרו ישימות קליניות. באמצעות מדריכי 3D מודפס ניכרים בקלות, טבעות של שריר חלק בכלי דם נוצרו ומוערמות לצורה צינורי, ויצרו שתל וסקולרית. שתלי יכול להיות בגודל כדי לענות על המגוון של ממדים עורקים אנושיים כלילית פשוט על ידי שינוי גודל המדריך מודפס 3D.
Abstract
מחלת עורקים כלילית נשאר הגורם המוביל למוות, להשפיע על מיליוני אמריקאים. עם חוסר שתלי כלי דם עצמי זמין, שתלים מהונדסים מציעים פוטנציאל גדול עבור טיפול בחולים. עם זאת, שתל כלי דם מהונדס הם בדרך כלל לא ניתן להרחבה בקלות, מחייב וייצור של תבניות מותאמות אישית או צינורות פולימר כדי להתאים לגדלים שונים, המהווים זמן רב ויקר בפועל. עורקי אדם נעו בקוטר לומן מכ 2.0-38 מ"מ עובי קיר מכ 0.5-2.5 מ"מ. יצרנו שיטה, הכינה "שיטת נחת הטבעת", שבו טבעות בגודל משתנות של רקמות של סוג התא הרצוי, מפגינות כאן עם תאי שריר חלק בכלי דם (SMCs), ניתן ליצור באמצעות מדריכים של עמודים מרכזיים לשלוט בקוטר לומן ופצצות חיצוניות להכתיב עובי בדפנות כלי דם. טבעות רקמות אלה נערמים ואז ליצור מבנה צינורי, מחקה את הצורה הטבעית של כלי דם. אורך הכלי יכול בדואר מותאם על ידי פשוט לערום מספר הצלצולים נדרשו מהווה את האורך הדרוש. בעזרת הטכניקה שלנו, רקמות של צורות צינורי, בדומה כלי דם, יכולות להיות מיוצרות בקלות במגוון מידות ואורכות כדי לענות על הצרכים של המרפאה וסבלנית.
Introduction
בטיפול של מחלת לב כלילית (CAD), כלי שייט הדם של החולה עצמו נקצרים כחומר השתל עבור ניתוח מעקפים. עם זאת, לעתים קרובות, חולים אין כלי קיימא לתרום לעצמם, ובמקרים בהם הם עושים, האתר התורם גורם נזק נוסף ניכר ויש לו סיכון רציני לזיהום. 1 שתלי כלי דם מהונדסים יכול למלא את הצורך הזה. מדרגיות היא בעל חשיבות עליונה עבור כלי הנדסה כדי לענות על המגוון הרחב של דרישות גודל כלי חולה. עם זאת, שיטות קיימות עבור כלי הנדסה אינן להרחבה בקלות, ובדרך כלל דורשות תבנה מחדש של תבניות מורכבות או פיגומי פולימר. רוב מהונדסים שתלי או לנצל פיגום צינורי פולימר כי הוא זרע עם פיברובלסטים וסקולרית, שריר חלק, או תאי אנדותל; או מתגלגל סדין בתא סביב mandrel ליצור צינור רקמות. שני שתלי כלי דם מהונדסים בניסויים קליניים מבוססים על decellularizeפלטפורמת הפולימר-ECM ד. 2, 3, 4 שתלי פולימר זמינים לשימוש תיקון כלי הדם כבר ידועים כבעלי בעיות עם patency, אשר יכולים להיווצר כנושא מרכזי עם יישום לטווח ארוך של השתל עם נוכחות פולימר מתמשכת. תבניות Tubular שמשו לפברק כולים הסלולר לחלוטין, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 אשר נהלים ידרשו עיצוב נוסף וייצור כלי לתבניות מותאמות אישית כדי לייצר כלי במגוון גדל .
השיטה המתוארת במסמך מקיף שיטה חדשנית ליצירת כלי דם מהונדסים להרחבה בקלותשתלי באמצעות מוסיף להתאמה אישית מודפס 3D וצלחות התרבות המסורתית. 14 תאים הם זורעים לתוך צלחות עם מוסיף של דואר מרכזי ואת מעטפת חיצונית. הפקדים פוסט לומן בקוטר ומאפשרים בשכבת התא עצמית להרכיב לתוך טבעת של רקמות. העובי שולט מעטפת החיצוני של הטבעת, ובכך עובי דופן של הכלי הסופי. טבעות רקמות הושלמו נערמים מכן לטופס צינורי, שתל וסקולרית. היתרון בשיטה זו, המכונה "שיטת הנחת טבעת," היא כי לכל סוג תא חסיד ניתן זורעים לתוך ההגדרה צלחת וטבעות רקמות או צינורות בכל גודל הדרושים ליישום הרצוי יכול להיווצר רק על ידי הוספת מדריך שינוי. טכניקות השוואתיות בטבעות יצירת הנדסת רקמות של רקמות להישאר קשות בקנה מידה, 15, 16 מחייב תבנה מחדש של תבניות עבור כל בגודל רצוי. בנוסף, שתל כלי דם שנעשה בשיטה זו ניתן לייצרד ב 2-3 שבועות, כמה שבועות מהר לעומת כלי מהונדסים אחרים. 6 עבור המרפאה, התאמה הפעם יכול לעשות הבדל משמעותי בטיפול בחולה המידרדר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תא הכנת תרבות
- לנצל לתאי שריר חלק אנושיים אב עורקים לרכוש מסחרי.
- שמור על תאים בתקשורת צמיחת תאים שריר חלק מורכב 88.6% 231 התקשורת, 0.1% כל אחת של אינסולין אנושי רקומביננטי (RH-אינסולין), גורם גדילה פיברובלסטים אנושי רקומביננטי (RH-FGF), גורם הגדילה באפידרמיס אנושי רקומביננטי (RH-FGF), וחומצה אסקורבית; ו -5% בכל אחת בסרום שור העובר (FBS) ו- L-גלוטמין; ו 1% אנטיביוטי / antimycotic.
הערה: כל גורם גדילה, FBS ו L- גלוטמין נרכשים כמו ערכת צמיחת תקשורת וסקולרית. - מדיה שינוי כל 48 שעות עד התאים הן כ -90% ומחוברות ומוכנים זריעת רקמות.
- חנות תאים באינקובטור בין שינויי תקשורת להתרחבות.
2. הכנת הוספת 3D מודפס סיליקון אישית צלחות צורניות
- השתמש במדפסת 3D מסחרית (למשל, Replicator מיני) עבור 3D ההדפסה מוסיפה הצלחת.
- השתמש open עיצוב תוכנת מקור 3D כגון בלנדר ליצור מודלי 3D של החיצוני פגזי הודעות המודפסים.
- לייצא את קובץ הנהג של המודל באמצעות פורמט .stl המאפשר ניידות אל התוכנה של מדפסת 3D.
- הפק הודעות מודפסות ופצצות חיצוניות באמצעות פולי (חומצה לקטית) נימה (PLA) נטענות לתוך מדפסת 3D.
- בעקבות דפוס, לבצע דקות 30 להשרות בתמיסת אתנול 70% -100% לעקר כל הוספה.
- כן סוכן ריפוי 01:10 לבסס תערובת פולימר של פולי (dimethylsiloxane) פולימר סיליקון (PDMS) ולאפשר לתערובת דגה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
- הגדר גדלים בצלחת פטרי משמש קטן (35 מ"מ), בינוני (60 מ"מ), גדול (100 מ"מ).
- הוסף 2 מ"ל, 4 מ"ל ו -6 מ"ל של סיליקון דפוקה על כל צלחת קטנה, בינונית וגדולה, בהתאמה, וליצור שכבה דקה על פני כל תחתית של צלחת פטרי.
- צור פוסטים עבור הצלחת הקטנה על ידי שפיכת PDMS לתוךצלחת 100 מ"מ עד לגובה של 7 מ"מ ולאפשר לרפא על צלחת חמה ב 60 מעלות צלזיוס למשך כ 2-3 שעות. ואז להשתמש ביופסית 5 מ"מ לחבוט הודעות גליליות. להשתמש בכמות קטנה של PDMS דפוקה כדי לאבטח כל PDMS גליל וכדי במרכז כל צלחת קטנה.
- עבור הצלחות ביניים וגדולות, לפני להשלים ריפוי של PDMS בתחתית הצלחת, למקם את ההודעות מודפס 3D 10 מ"מ ו 20 מ"מ קוטר מרכזי לתוך כל הצלחות ביניים וגדולות, בהתאמה. עבור הצלחות הגדולות, בנוסף למקום מעטפת חיצונית מודפס 3D על 66.7 מ"מ equidistance בקוטר מהתפקיד.
- אפשר כל מנה לרפא באוויר הפתוח על פלטה חשמלית ב 60 מעלות צלזיוס למשך כ 2-3 שעות, מה שמאפשר 18 שעות עבור degassing של הפולימר. תקן רכיבים מודפסים לצלחת באזור הנאה והכיוון כפי שניתן לראות באיור 1.
- הוספת פתרון של אתנול 70% במים מזוקקים 30% במשך 30 דקות לחלק הפנימי של כל PLAtes עבור עיקור ולאחר מכן לכסות כל צלחת.
- בזהירות לשאוב אתנול כל צלחת ולאפשר לאוויר יבש.
- מסדרים בכל צלחת בארון בטיחות ביולוגית (BSC) ליד כלפי מעלה המכסה, שלה. לחשוף לוחות ומכסים לאור UV תחת BSC במשך 30 דקות כדי להשלים עיקור. טכניקה סטרילית מבוצעת עם כל צעד אחרי חשיפה לקרינת UV.
3. הכנת הידרוג הפיברין, מתזמן עם לתאי שריר חלק ותחזוקה של צלחות
- מערבבי פתרון של ג'ל הפיברין המכיל מדיה צמיחה + 0.01%-β1 TGF בסכומים של 0.5 מיליליטר, 1.1 מיליליטר ו 1.81 מיליליטר עבור גדלי צלחת קטנים, בינוניים וגדולים, בהתאמה.
- הוסף 40 μL, 88.4 μL ו -145 μL של תרומבין, ממלאים של 100 U / mL, לכלי התקשורת של כל צלחת קטנה, בינונית וגדולה, בהתאמה. מערבולת בעדינות כל צלחת ביד כדי להבטיח תרומבין כי הוא מעורב באופן שווה בתוך התקשורת.
- לאחר מכן, להוסיף 1601; L, 354 μL ו 580 פיברינוגן μL, ממלאי של 20 מ"ג / מ"ל, טיפה חכם מעגלית לתערובת תרומבין-מדיה על כל צלחת קטנה, בינונית וגדולה, בהתאמה. מערבולת בעדינות ביד כדי להבטיח ערבוב והפצה של הידרוג'ל לתוך שכבה אחידה.
- אפשר הידרוג'ל לרפא במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
- Trypsinize לתאי שריר חלק התרחבה צלחות תרבית תאים 150 מ"מ ו צנטריפוגות פי פרוטוקולים סטנדרטיים. הגלולה וכתוצאה מכך יש resuspended ב 3 מיליליטר של תקשורת בידול מורכבת של 98% - 231 תקשורת, FBS 1% לבין 1% אנטיביוטי / antimycotic.
- במרץ לערבב התאים על ידי titrating מעלה ומטה עם טפטפת 2 מ"ל להתפרק בכל גושי תאים. ספירת תאים עם hemocytometer וליצור ההשעיה תא של 2 x 10 6 תאים / מ"ל, 1.0 x 10 7 תאים / מ"ל ו 1.4 x 10 7 תאים / מ"ל עבור צלחות קטנות, ביניים וגדולות, בהתאמה.
- הוסף 1 מ"ל של כל int ההשעיה תאOA מקביל 50 חרוטי מיליליטר שכותרתו קטן, בינוני וגדול. הגדרת חרוטים נוספים 50 מיליליטר בצורה הזו כל טבעת רקמה נוספת הרצויה.
- הוסף מדיה בידול לכל חרוטי להשיג כרכים זריעת סופי של 2 מ"ל, 4 מ"ל ו 5 מ"ל עבור כל ספינה קטנה, בינונית וגדולה, בהתאמה. ואז, בזהירות pipet את פתרון התא מבחינת ירידה על גבי הידרוג'ל המוכן בכל צלחת מקבילה.
- מקום צלחות לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- תקשורת בידול שינוי כל 48-72 שעות עבור כל צלחת. במקרה של הצלחת הגדולה, לשנות תקשורת בתחילה לאחר 24 שעות, ולאחר מכן לשנות את זה כל 48-24 שעות כדי לפצות על צפיפות זריעת תא הגדולה.
- לאחר 2-4 ימים המצלצלים יהיו נדבקו לחלוטין כלפי לכתוב, להוסיף 10 μL, 20 μL ו -35 μL של-β1 TGF לכל טבעת קטנה, בינונית וגדולה, בהתאמה. לאחר חשיפת TGF-β; 1 ל -24 שעות לפחות, טבעות מוכנות יטופל.
4. אסיפה של כלי דם לבנות ותחזוקה
- לפני הייצור של מבנה כלי הדם הסופי, מכל מיוחד נוצר כדי להחזיק את הכלי הושלם.
- עבור כלי השיט הקטן, ליצור צלחת גבוהה לסידור טבעת על ידי חיתוך קטע 2 אינץ 'את החלק העליון של צינור חרוטי פוליקרבונט 50 מיליליטר, ואז PDMS מדביק את הקצה לחתוך לתוך צלחת 35 מ"מ. השתמש במכסת החרוטים כמו מכסת הצלחת.
- עבור הטבעת הגבוהה כלי ביניים וגדולים לערום צלחות, לחתוך צינור פוליקרבונט בקוטר 1.75 אינץ 'לתוך 2.5 סעיפי אינץ לאורכו לשמש קירות הצלחת הגבוהים. לקבלת תחתית הצלחת הגבוהה, לחתוך גיליון פוליקרבונט 0.125 אינץ 'בעובי לחתיכות מעגלות בקוטר 2 אינץ'. באמצעות מלט אקריליק ממס, לחייב את סעיף פוליקרבונט הצינור אל יצירת החתך העגולה. השתמש המכסה של צלחת פטרי 60 מ"מימ כמו המכסה על הצלחת הגבוהה.
- 3D pדפס הודעות 5, 10 ו 20 מ"מ בקוטר 50 מ"מ אורך.
- הוסף 10 מ"ל של סיליקון דפוקה לכל מיכל. לפני הריפוי המלא של PDMS, מרכזי למקם כל פוסט שנוצר בשלב 4.1.3 לתוך כל מכל קטן, בינוני, גדול.
- אפשר לרפא על סט צלחת חם עד 60 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות.
- לעקר עם תמיסה של אתנול 70% עם 30% מים מזוקקים במשך 30 דקות.
- בזהירות לשאוב אתנול כל מכולה ואז ולאפשר לאוויר יבש BSC. לאחר מכן, לארגן את המכולות בשכונה עם כל צלחת להציב ליד כלפי מעלה המכסה, שלה. לחשוף מכולות לאור UV תחת BSC עבור 30 דקות נוספות עבור עיקור נוסף. השתמש בטכניקה סטרילית עם כל צעד אחרי חשיפה לקרינת UV.
- בעזרת מלקחיים יפים מאוד, להסיר בזהירות כל טבעת הידרוג'ל שריר חלק בחוזק התגלגלה מהמוצב שלה ולהעביר למכל הגדול יותר בהתאמה שלה עם ההודעות הגבוהות.
- השתמש זוגמלקחיים בכל יד ולהרים צד אחד של ההטבעה מהתפקיד, ואחר כך את השני. היזהר כדי להגן ולשמור על לומן.
- בצע את ההעברה עם השנייה זה שיטה ריקה, זזה תחילה בצד אחד, אז בצד השני של הטבעת על העמוד הגבוה. שימוש בתנועות עדינות, הדרגתיות, ועבודת circumferentially, לאט לדחוף את הטבעת כלפי מטה על העמוד הגבוה. בהמשך מחסנית טבעות רקמה עד אורך כלי הרצוי הושג, עם כל צלצול הוספת כ 1-2 מ"מ אורך כדי לבנות הושלמה.
- עם ערימת הטבעת ממוקמת על ההודעות מודפסות 3D גבוהות, להפוך את הצלחת כך בפוסט מקביל עם משטח העבודה.
- שימוש micropipette, להוסיף 40, 80 ו -160 μL של תרומבין בריכוז של 100 U / mL בעדינות אל פני השטח החיצוניים של כל כלי שיט קטנים, בינוניים וגדולים, בהתאמה. תוך הוספת תרומבין, לאט לסובב את הצלחת כדי להבטיח אפילו כיסוי של כל המשטחים של המבנה.זה יהיה הבסיס עבור דבק הפיברין מנוצל כדי להבטיח את מבנה מחסנית טבעת בימים הראשונים שלאחר הבנייה.
- לאחר מכן, הוסף 40, 80 ו -160 μL של פיברינוגן בריכוז של 20 מ"ג / מ"ל כל מבנה קטן, בינוני, גדול, בהתאמה, באמצעות micropipette בעוד סיבוב לבנות במהירות. תרומבין ו פיברינוגן להגדיר במהירות לג'ל שהיה מוצק מעורב. בשל הזמן הקצר ריפוי, להחיל את פיברינוגן במהירות שווה ככל האפשר.
- הוסף 20 מ"ל של התקשורת בידול לכל מיכל מחזיק את המבנה. מקום כלי לתוך 37 ° C חממה עד הצורך. שינוי בתקשורת כל 3-5 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפגן כאן הוא ייצור של 3 גדלי שתל שונים מהונדסים וסקולרית (איור 1), מראה כי שיטת נחת הטבעת (RSM) הוא ניתן להרחבה. כדי להוכיח את יישימות, 3 גדלים כלי שונים שנבחרו לתאם לגודל כלי האדם בפועל עבור השמאלי הקדמי היורד העורק (קטן; לומן בקוטר = 4 מ"מ) 17, יורד האאורטה (ביניים; לומן קוטר = 10 מ"מ) האאורטה עולה (גדול; לומן קוטר = 20 מ"מ) 18. עובי דופן הוא כ -500 מיקרומטר עבור טבעות קטנות, וכ -1,500 מיקרומטר הן טבעות ביניים וגדולות. כל כלי הפגין בנוי על ידי ערמת 6 טבעות, שהשוותה ל באורך של כ 6 מ"מ עבור הכלי הקטן 9 מ"מ עבור כלי ביניים וגדולים. אורך מבוסס על עובי הדופן של כל טבעת פרט.
ניתוח היסטולוגית גילהcellularity גבוהה בכל גדלי הטבעות (איור 2). חומר אדום מתחם ג'ל הפיברין. בטבעות קטנות, כמות קטנה של ג'ל הפיברין שיורית נתפסה על הקצה החיצוני של הטבעת. בשנת ההטבעות הגדולות, כמה ג'ל הפיברין תבל את התוכן הסלולרי. בשנת כתם Trichrome של מייסון, סימנים של ייצור הקולגן (בסימן כחול) ניתן לראות את טבעות ביניים וגדולות.
כדי לקבוע פנוטיפ התא הבא היווצרות טבעת, טבעות רקמות נותחו באמצעות immunofluorescence עבור נוגדנים אלפא-חלקה יקטין שרירים (SMA) ו tropomyosin (איור 3). כל גדלי הטבעת נמצאו חיוביות הם הנוגדנים כדי לוודא כי הפנוטיפ שריר החלק נשמר.
בדיקות מתיחה בוצעו על הטבעות בגדלים השונות כדי לקבוע תכונות המכאניות שלהם (איור 4). U-ארוך, mechaniמכשיר בדיקת קאל, שמש מתיחת מבחן טבעות קטנות ביניים וכלי, בעוד Instron שמש טבעות וכלי גדולות מבחן מתיחה. מודולוס אלסטיות (E), חוזק מתיחה האולטימטיבי (UTS) וכוח כישלון (FS) נאספו נתונים. מגמה עקבית נצפתה עם הגדלת כוח התאמה לצלצל הגדלת גודל כלי שיט.
תא זריעת המספר הדרוש ליצירת טבעות מגוונות בגודל גדל בכ באופן ליניארי עם שטח פנים זריעה (איור 5). על מנת ליצור טבעות גדולות, לפחות 14 מיליון תאים היו נחוצים כדי ליצור את הטבעות בגודל אב עורקים בבטן.
שש טבעת ערימות, או כלי, נבדקו על יכולת לעמוד זרימה. בונה הועמסו מערכת טפטוף לפי הזמנה (איור 6) נתון לזרום עד 5 דקות ב זרם החל 100 עד 417 מ"ל / דקה. ספינות היומסוגל לעמוד זרימה. דולף מינור נצפה בקצות הכלי, על המחברים למערכת זלוף.
איור 1: בניית הכלי המהונדס לשנותם. א) תרשים של התהליך של דרוג כלים מהונדסים, החל בהכנת צלחת, זריעת תאים ובניית כלי. הפגין שלוש טבעות בגדלים שונות B) וכלי C). ד) כלי גדול נציג לחלוטין ביולוגי דומת רקמה טבעית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ניתוח היסטולוגית. רונג> H & E וכתמי Trichrome של מסון להראות cellularity קיימא לאורך עובי הטבעת לכל גדלי הטבעת. Trichrome כתם לגלות אזורים של ייצור הקולגן שמציינים (חיצים כחולים) כחולים. טבעות גדולות הראה הפיברין ג'ל וביניהם, ככל הנראה בזכות קיפול של שטח הפנים יחסית גדול של גיליון התא. ברי סולם: טבעות קטנות = 200 מיקרומטר; טבעות ביניים = 200 מיקרומטר; וטבעות גדולות = 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ניתוח Immunofluorescence עבור סמני שריר חלק. כל גדלי הטבעת היו חיוביים עבור חלבוני התכווצות שריר חלק יקטינו שריר α-חלקה (SMA) ו tropomyosin (Tm). ברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר.עומס / 55,322 / 55322fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: ניתוח בדיקות מתיחה. עקומות מתח-זן לכל הגדלים של טבעות וכלי הראו מגמה כללית של גידול כוח correlating עם העלייה בגודל טבעת / כלי. טבעות וכלים נמתחו circumferentially. פרמטרים העריכו מן הגרפים היו מודולוס אלסטיות, חוזק מתיחה אולטימטיבי וכוח כישלון (המפורטים בטבלת 1). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: תא זריעת קורלציה מספר לגלוש זריעהאזור אס. בהתבסס על תאי שריר חלק אנושיים אב עורקים. שטח הפנים מוגדר כאזור את צלחות היווצרות טבעת בין הפיקוד המרכזי לבין קיר הצלחת או המעטפת חיצונית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: כלי שש טבעת נתון ניתוח זלוף. א) מערכת זלוף בהתאמה אישית עבור בדיקות זרימה. B) כלי תכנון הנדסיים נטענים לתוך מערכת זלוף. שלושה כלי נבדקו זלוף דליפות של עד 5 דקות תחת תנאי הזרימה. הכלי נותר יציב תחת זרם, עם דולף הקטין על המחברים לקצה הכלי מחוברים בצינור המערכת. אנא לחץ כאן לצפייהגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 1 אנימציה: הפגנה של זרימת זלוף באמצעות כלי מהונדסים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)
| קָטָן | ביניים | גָדוֹל | |||||
| טבעות | מודולוס אלסטיות (kPa) | 13.6 ± 2.25 | (N = 6) | 14.5 ± 1.2 | (N = 3) | 17.2 ± 2.2 | (N = 4) |
| חוזק מתיחה האולטימטיבי (kPa) | 34.5 ± 10.2 | 39.6 ± 2.98 | 50.9 ± 10.6 | ||||
| כוח כישלון (kPa) | 34.5 ± 10.2 | 39.6 ± 2.98 | 50.9 ± 10.6 | ||||
| כלי | מודולוס אלסטיות (kPa) | 49.7 ± 2.80 | (N = 3) | 59.8 ± 3.90 | (N = 2) | 79.8 ± 10.1 | (N = 2) |
| חוזק מתיחה האולטימטיבי (kPa) | 115 ± 6.90 | 137 ± 12.0 | 192 ± 86.9 | ||||
| כוח כישלון (kPa) | 96.2 ± 12.2 | 60.7 ± 12.1 | 173 ± 92.2 | ||||
טבלה 1: מאפייני מתיחה של טבעות המדורגות וכלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת נחת טבעת מציג יתרונות רבים על פני שיטות לבנות רקמות מהונדסות וסקולרית נוכחיות. RSM ניתן להתאים ליצור כלי אנושי בכל גודל על ידי פשוט התאמה אישית של פגז הפוסט וחיצוני ממדים. השיטה שלנו מאפשרת התפתחות הכלים מהונדסים ללא פולימר המורכב אך ורק של תאים אנושיים במהירות משפיל תמיכה בחומר הנמצא בתהליך ריפוי הפצע הטבעי של הגוף. שתל פולימרים ידועים כגורמי restenosis במרפאת ויכול להיות בעייתי אם כלול שתלים מהונדסים. מספר סלולארי זריעה צריך להיות שונה עבור כל טבעת רקמה בגודל שונה. גרף של מספר התא אל שטח פן הזריעה מוצג באיור 5 שממנה מספר הזריעה יכול להיות מקורב ו / או אקסטרפולציה. יצוין כי בסוג התא כאן הם השתמשו בתאי שריר אנושיים אב עורקים חלקים. כדי להתאים את RSM לסוגי תאים שונים, גודל תא קצב התפשטות צריכות להילקחצפיפות שיקול וזריעה אופטימלית נקבעה. לדוגמא, יש לנו גם יצרו טבעות פיברובלסטים אנושיות באמצעות RSM, ולא מצאו כי לפחות 2x מספר התא נדרש לעומת SMCs. לכל אורך הספינה הרצוי ניתן לבנות באמצעות תוספת של טבעות. ערימות טבעת כבר בתרבית של עד 2 חודשים נותר יציב. טבעות ביניים וגדולות הן שמרו על עובי הקיר המתאים 1,500 מיקרומטר למרות שהם כל שנבנו צלחת 60 מ"מ ו -100 מ"מ, בהתאמה, על פי הצעה של המעטפת החיצונית בצלחת 100 מ"מ. זו מציגה את השירות של המעטפת החיצונית לשליטה וקבלת עובי הדופן המתאימה כלי נתון. בשלב 3.3.1, TGF-β1 מתווסף כי זה ידוע כממריץ את ייצור הקולגן 19 ויש לו את האפקט שנצפה של הידוק הטבעות. ברגע המצלצל מתגלגל לחלוטין, מנה אחת של-β1 TGF מתווספת בשלב הסופי, וההטבעות מוכנות ליום שימוש 1 מאוחר יותר. TGF-β1 עושה להגביר את ייצור הקולגן טבעות, כפי שניתן לראות בתמונות Trichrome (איור 2).
תאי הטבעות הקטנות יותר עגולים וקומפקטי, ואילו ב -2 גדלים גדולים יותר, תאים לאורך השולים החיצוניים להציג תואר של יישור עם קצה הרקמות יחד עם תאים מיושרים אחרים. זה אחרון עשוי להצביע בשלב מאוחר יותר של בגרות תא, התפתח תוכן תא גבוה יותר טבעות הגדולות, ולכן מידה רבה יותר של איתות אינטר לעודד בגרות. interspersion ג'ל פיברין בטבעות גדולות עשוי להצביע על כך יריעות תא גדולות יותר נוטות להתקפל מעט כפי שהם מתגלגלים. התמונות היסטולוגית מראות תופעה זו נלקחו יום 1 בא גליל טבעת מלאה חצים למעלה ובכך ניתן להבין כי הג'ל הפיברין, אשר לוקח 2 שבועות כדי לבזות בתרבות, היה עדיין להיות נוכח. Culturing מצלצל עבור 2 שבועות לפחות צריך לבזות את הג'ל הפיברין, והותיר אחריו קונסטרוקציה הסלולר באופן מלא.
NT "> יקטין שריר אלפא-חלקה (SMA) מהווה את החוטים הדקים המאפשרים התכווצות tropomyosin הוא חלבון התכווצות. 20, 21 שניהם SMA ו tropomyosin נכח כל טבעות הגודל, עם האות החזק ביותר, המופץ ביותר בצורה האחידה בתוך ביניים טבעות. תופעה זו עשויה לנבוע רמה גבוהה יותר של צפיפות תאים וארגון, מגרה גידול בפיתוח שיטת התכווצות.מודולוס אלסטיות מציין את האלסטיות של הטבעות, ואת E הגדלת מקטן טבעות גדולות מצביעה עליית קולגן ואלסטין ייצור. חוזק מתיחה אולטימטיבי הוא הכח הגבוה ביותר שעבר על הטבעות בלי לשבור. אי כוח הוא נקודת כשל רקמות. עבור הטבעות, UTS שווה FS. עבור הכלי, UTS הוא גדול מ FS, אשר מראה כי הכח האולטימטיבי של הכלי מיוחס שילוב של תרומה מכאנית מכל הטבעותבתוך הכלי, ואת נקודת הכשל בשל הטבעת החלשה.
כוחו של כלי מהונדסים שלנו שכב בטווח kPa, ואילו כלי אדם יליד יש עוצמות בטווח מגפ"ס. על מנת לחזק את הכלי שלנו כלפי כי כלי ילידים, אנו חוקרים טכניקות כדי להגדיל את ייצור תאי מטריקס, על הפיה של קולגן ואלסטין. גורמי גדילה המקדמים את ייצור הקולגן והאלסטין מיושמים כיום הטבעות שלנו לחקור האם מאפייני מתיחה יגדלו.
בנוסף תכונות מכאניות, פעולות פונקציונליות של התכווצות שרירים רלוונטיות ביצועי כלי. גירוי והתכווצות שרירים על ידי גורמים כגון אצטילכולין ואפינפרין יכול לשמש כדי לבדוק את כוח התכווצות שרירים. ניסויים כאלה נבחנים למחקרים העתידיים שלנו.
בסך הכל, התוצאות שלנו מראות כי שיטת נחת הטבעת וניתן לשנותם בקלותלהשיג במגוון גדלים רקמה וסקולרית מהונדסים. קנה מידה על הכלי האנושי הגדול ביותר, כגון 40 מ"מ לומן האאורטה בקוטר, ידרוש ככל הנראה פיתוח של vasorum ושה, על נימי הדם הזעיר באופן טבעי בתוך כלים בגודל גדולים, אשר במעבדה שלנו כרגע היא מפתחת. בנוסף, שכבת תא האנדותל (כלומר, אינטימה) כי בדרך כלל קווי לומן של שכבת התקשורת חשובה להקמה ופרמטרים המודינמיים נכונים בתוך סיר. המעבדה שלנו עובדת בימים אלה על יצירת אינטימה בערימת טבעת SMC שלנו באמצעות תאי אנדותל כלי דם אנושיים. עם טכנולוגיות משולבות אלו, כולים מהונדסים יצטרכו ישימים יותר למרפאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לעמיתי במעבדה לאם אחינו עמאר Chishti ו Bijal פאטל לסיוע מסוגם עם מתרבותה היסטולוגיה ותא. המימון ניתן על ידי הקרן הננורפואה אוניברסיטת Wayne State (CBP), סטארט-אפ קרנות לב וכלי דם מכון המחקר זרע גרנט (MTL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Aortic Smooth Muscle Cells | ATCC | PCS-100-012 | vascular smooth muscle cells |
| Medium 231 | Gibco (Life Technologies | M-231-500 | media specific to vascular smooth muscle cells |
| Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PSC-100-042 | growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability |
| Replicator Mini 3D printer | MakerBot | N/A | 3D printer |
| Poly(lactic acid) 3D ink (PLA) | MakerBot | N/A | 3D printer filament |
| Poly(dimethlysiloxane) (PDMS) | Ellworth Adhesives | 3097358-1004 | polymer for gluing plate parts |
| Fibrinogen | Hyclone Labratories, Inc. | SH30256.01 | fibrin gel component |
| Thrombin | Sigma Life Sciences | F3879-5G | fibrin gel component |
| Tranforming Growth Factor-Beta 1 | PeproTech | 100-21 | growth factor for stimulating collagen production |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | for cell counting |
| Polycarbonate tubing | US Plastics | PCTUB1.750X1.625 | material for making tall, ring stacking plates |
| Polycarbonate sheet | Home Depot | 409497 | material for making tall, ring stacking plates |
| Adhesive polymer solvent | SCIGRIP | 10799 | material for making tall, ring stacking plates |
| Instron 5940 | Instron | N/A | tensile testing machine |
| U-Stretch | Cell Scale | N/A | tensile testing machine |
| Smooth Muscle Actin | MA5-11547 | Thermo Fisher | antibody |
| Tropomyosin | MA5-11783 | Thermo Fisher | antibody |
References
- Luciani, G. B., et al. Operative risk and outcome of surgery in adults with congenital valve disease. ASAIO J. 54 (5), 458-462 (2008).
- Lawson, J. H., et al. Bioengineered human acellular vessels for dialysis access in patients with end-stage renal disease: two phase 2 single-arm trials. Lancet. 14 (387), 2026-2034 (2016).
- McAllister, T. N., et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet. 373 (9673), 1440-1446 (2009).
- Wystrychowski, W., et al. First human use of an allogeneic tissue-engineered vascular graft for hemodialysis access. J Vasc Surg. 60 (5), 1353-1357 (2014).
- Konig, G., et al. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30 (8), 1542-1550 (2009).
- Gui, L., et al. Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days. Tissue Eng Part A. 20 (9-10), 1499-1507 (2014).
- Sundaram, S., Echter, A., Sivarapatna, A., Qiu, C., Niklason, L. Small-diameter vascular graft engineered using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells. Tissue Eng Part A. 20 (3-4), 740-750 (2014).
- Quint, C., Arief, M., Muto, A., Dardik, A., Niklason, L. E. Allogeneic human tissue-engineered blood vessel. J Vasc Surg. 55 (3), 790-798 (2012).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 31 (108), 9214-9219 (2011).
- Dahl, S. L., et al. Readily available tissue-engineered vascular grafts. Sci Transl Med. 2 (68), (2011).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Meier, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells alter remodeling of completely biological engineered grafts implanted into the sheep femoral artery. J Cardiovasc Transl Res. 7 (2), 242-249 (2014).
- Pinnock, C. B., Meier, E. M., Joshi, N. N., Wu, B., Lam, M. T. Customizable engineered blood vessels using 3D printed inserts. Methods. S1046-2023 (15), 30184-30185 (2015).
- Blakely, A. M., Manning, K. L., Tripathi, A., Morgan, J. R. Bio-Pick, Place,and Perfuse: A New Instrument for Three-Dimensional Tissue Engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (7), 737-746 (2015).
- Gwyther, T. A., et al. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).
- Fearon, W. F., et al. Changes in coronary arterial dimensions early after cardiac transplantation. Transplantation. 27 (6), 700-705 (2007).
- Erbel, R., Eggebrecht, H. Aortic dimensions and the risk of dissection. Heart. 92 (1), 137-142 (2006).
- Ha, D. M., et al. Transforming growth factor-beta 1 produced by vascular smooth muscle cells predicts fibrosis in the gastrocnemius of patients with peripheral artery disease. J Transl Med. 14, 39 (2016).
- Skalli, O., et al. Alpha-smooth muscle actin, a differentiation marker of smooth muscle cells, is present in microfilamentous bundles of pericytes. J Histochem Cytochem. 37 (3), 315-321 (1989).
- von der Ecken, J., et al. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
