Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kuş sperm toplama Cloacal masaj ve Sperm DNA izolasyonu

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/55324
Automatic Translation
1, 2
1Environmental and Conservation Sciences Program, North Dakota State University, 2Department of Biological Sciences, North Dakota State University

Summary

Bu iletişim kuralı cloacal Masaj, kuşlar ve kuş sperm bir ticari ekstraksiyon kiti değişiklikleri ile kullanarak çıkarma DNA meni toplamak için bir non-invaziv el ile teknik açıklar.

Abstract

Meni topluluğu çeşitli sperm kalitesi, sperm telomer dynamics ve epigenetik ilgili çalışmalar da dahil olmak üzere uygulamalar için yararlı olabilir. Kuşlar biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan konulardır ve tekrarlanan sperm örnekleri içeren çalışmaları için idealdir. Ancak, az kaynak şu anda toplamak ve kuş sperm DNA ayıklamak nasıl öğrenmek isteyenler için kullanılabilir. Burada cloacal Masaj, kuş sperm toplamak için bir nazik, non-invaziv el ile teknik açıklayın. Ne kadar bu teknik literatürde kurulur, kullanılabilir açıklamaları öğrenmek zor olabilir. Ayrıca DNA kuş meni bir ticari ekstraksiyon kiti değişiklikleri ile kullanarak çıkarma hakkında bilgi sağlar. Cloacal masaj kolayca herhangi bir küçük ve orta boyutlu erkek kuş üreme durumda kullanılabilir. Koleksiyon meni hemen motilite testleri için kullanılan, veya burada açıklanan protokol sonrası DNA ekstraksiyon için dondurulmuş. Bu ayıklama protokolü için kuş sperm rafine ve başarıyla birçok ötücü türü (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanusve Turdus migratorius toplanan örnekleri üzerinde kullanılan ) ve bir columbid (Columba livia).

Introduction

Sperm kalitesini ve rekabet1, sperm telomer dynamics2, epigenetik3ve benzer konular, ilgili sıra onlar biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılır ve sperm kolayca cloacal kullanarak tatmak mümkündür çalışmaları için ideal konular kuştur Masaj. Cloacal masaj meni kuşlar4,5,6toplamak için bir nazik, non-invaziv manuel tekniktir. Yinelenen örnekleri kolayca elde edilebilir ve hiçbir özel araç alan veya laboratuvar gerçekleştirmek basit yapmak gerekli. Cloacal masaj yıllardır kullanılıyor olsa da, mevcut gelen açıklamalar yazılı öğrenmek zordur. Bu yayın belirsizlik cloacal masaj öğrenmede yer ve zamanı azaltmak için tasarlanmıştır.

Meni cloacal masaj kullanarak kuşlardan toplanan hemen hareketliliği değerlendirme4,7 veya suni tohumlama8için kullanılan veya gelişmiş görüntüleme ve DNA ekstraksiyon gibi diğer kullanımlar için dondurulmuş. Sperm örneği ötücü kuşlar küçük ama yoğun paketlenmiş sperm barındırır. DNA sperm9özel koruyucu özellikleri üstesinden gelmek için değişiklikleri ile sadelik için bir ticari ekstraksiyon kiti kullanılarak elde edilir. Çıkarma sonra sperm telomerlerin qPCR10kullanılarak ölçülebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu iletişim kuralı omurgalı hayvan konular içerir ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kuzey Dakota Eyalet Üniversitesi tarafından onaylandı.

1. meni koleksiyonundan bir ötücü kuş cloacal masaj kullanarak

Not: Cloacal masaj bir çoğalma etkin kuşlar sadece üzerinde etkili meni koleksiyonu tekniktir, ancak başarıyla uygun esir durumlarda Üreme mevsimi dışında yapılan. Üreme faaliyet cloacal masaj kullanmadan önce hedef türler için tespit edilmelidir. Bu teknik yakalama üzerine yabani kuş vurmak ya da esaret altında düzenlenen kuşlar kullanılabilir.

  1. (İçinde durumu doğurmak) bir erkek kuş ile başlayan sigara dominant el pençesinde bander'ın aktarım kuş dominant el palm (şekil 1) dokunmadan ventral yan ile.
    1. Kuş başı lateral palmiye kenarına en yakın olduğundan emin olun. Hafif baş ve orta parmak, yüzük ve serçe kullanarak güvenli. Bu kuşun havalandırma ve kuyruk maruz bırakır.
    2. Kuş bacaklar gevşek veya hafifçe ölçülü palmiye kullanarak bırakın.

Figure 1
Resim 1 : Kavrama cloacal masaj için. Kuş hafifçe dominant el palm ve pinky parmak tarafından güvenli baş dokunmadan ventral yan ile sabitlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Baskın işaret parmağı ve başparmak lağım üstün sonu her iki tarafında yerleştirin ve hafifçe parmak birlikte kuyruk ( Şekil 2) doğru çok hafif basınç uygularken çimdik. Lağım cloacal mukoza (pembe iç) açığa çıkar.
    Not: kuş ise cloacal tümsek küçük olabilir şu anda meni, üreten ve lağım evert zordur. Tecrübesiyle, çoğalma etkin ve etkin olmayan erkek5,11cloacas arasında ayırt etmek kolaydır.

Figure 2
Resim 2 : Parmak pozisyonu ve cloacal tümsek. Lağım üstün sonuna (A) hafif basınç uygulayarak çıkar. Bir çoğalma aktif erkek ötücü içinde cloacal tümsek açıktır ve firma (B). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Sigara dominant el ile kuyruk el stabilize etmek için tabanının dorsal tarafta parmağı yastık yerleştirin ve diplidir lağım hemen altında parmak ucu yerleştirin.
    Not: Kısa ve yumuşak küçük resim cloacal masaj gerçekleştirmek için avantajlıdır ve kaza sonucu yaralanma kuş korur.
  2. Baskın başparmak hareket derin ve cranially lağım kalma orta basınç ile tekrarlayan bir hareket. Kuş cinsel ilißki kadar devam edin. Bireysel bağlı olarak, bu genellikle 1 ve birkaç düzine vuruşları arasında sürer.
  3. En kısa zamanda kuş cinsel ilißki, meni mikrohematokrit tüp içinde toplamak. Cloacal masaj birden fazla cinsel ilißki elde etmek için yineleyin.
    Not: Ötücü meni hafif kahverengi ve genellikle biraz kalın bir tutarlılık vardır. Beyaz ve koyu maddelerden lağım atılır meni değildir ve meni örnek kontamine. Az miktarda kan lağım bulunan görünümünü veya içinde ile karışık meni genellikle masaj sırasında çok fazla baskı tarafından neden olur.
  4. DNA ekstraksiyon için 1 x PBS (pH 7,4) 20 µL ile microcentrifuge tüp meni yerleştirin. Not: 1 x PBS içinde depolanan meni suni tohumlama için uygun değildir, ancak DNA ekstraksiyon daha sonraki bir tarihte kullanılan-80 ° C'de saklandığında PBS Oda sıcaklık olabilir veya soğutulmuş ama meni örnek yatırılır sıvı bir durumda olması gerekir.
    1. Sperm örnek varlığı seyreltilmiş örnek (şekil 3) bileşik mikroskop altında küçük bir miktar görüntüleyerek doğrulayın.
  5. -80 ° C'de seyreltilmiş meni ayıklama kadar saklayın.

2. çıkarma DNA'ın kuş meni

Not: Bu iletişim kuralı birden fazla ticari DNA ekstraksiyon kitleri ile test edilmiştir, ancak sadece bir DNA kiti12ile kullanıldığında başarılı oldu. Değiştirilen kiti Protokolü adım simgesiyle *.

  1. Dithiothreitol (DTT) suda 1 M çözeltisi hazırlamak ve bir vortex.* kullanarak mix
    1. Aliquot DTT çözüm ve -20 ° c kadar kullanımdan hemen önce saklayın. Elde edilebilir için her örnek, 1 M DTT solution.* 10 µL gerektirir
  2. 20 mM Tris-Cl, pH 8.0 içeren bir arabellek hazırlamak; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; ve % 4 SDS. Bu buffer.* 90 µL ayıklanmasını her örneği gerektirir
    1. Arabellek, oda sıcaklığında saklayın. Çöktürülmüş Eğer o dissolve.* 56 ° c sıcak
  3. Bir rocker veya shaker 65 içeren bir kuluçka Onceden ° C.*
  4. Hemen çıkarma işlemine başlamadan önce 10 µL DTT çözüm 10 örnekleri açılan Eğer adım 2.2 her örnek elde edilebilir, örneğin 900 µL arabellek artı 100 µL DTT çözüm için hazırlanan tampon 90 µL ile karıştırın. Bu karışım DTT-buffer.* adı verilecek
  5. 70 µL 1 x PBS tüm seyreltilmiş meni örnek ve iyi bir vortex.* kullanarak karıştırın
  6. 100 µL eklemek DTT-tampon ve 10 µL İndinavir K çözüm örnek. Girdap 20 saniye sonra bir rocker veya shaker.* 1 saat önceden ısıtılmış kuluçka makinesine kuluçkaya
  7. 200 µL tampon AL ve 200 µL eklemek taze alkol (% 100) ve 20 seconds.* için girdap
  8. Tüm örnek bir spin sütuna aktarmak ve 6.000 x g. atma 1 dakikada toplama tüp santrifüj kapasitesi.
  9. Sütun yeni bir tüp yerleştirin ve 500 µL hazırlanan tampon AW1 ekleyin. 1 6.000 x g. atma dakikada toplama tüp santrifüj kapasitesi.
  10. Sütun yeni bir tüp yerleştirin ve 500 µL hazırlanan tampon AW2 ekleyin. 6.000 x g. adlı 1 dakika santrifüj atmak akışı aracılığıyla ve sütun geri televizyonda yer.
  11. 3 dakika 20.000 x g. atma, koleksiyon tüp santrifüj kapasitesi ve sütun bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirin.
  12. Damlalıklı 35 AE µL arabellek sütun membran doğrudan ve oda sıcaklığında 5 güncellemeler için kuluçkaya
  13. 1 dakikada 14.000 x g. atma spin sütun santrifüj kapasitesi ve ayıklanan örnekleri-80 ° C'de depolayın

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cloacal masaj ve açıklanan protokol birçok ötücü türü ve bir columbid (Tablo 1) gerçekleştirilen ayıklama DNA'yı kullanarak. Sperm meni örneklerinin cloacal masaj tarafından toplanan varlığı 400 X büyütme (şekil 3) seyreltilmiş numune bir bileşik mikroskop altında küçük bir miktar ile ilgilenen tarafından doğrulandı. DNA sperm örneği açılan house burada açıklanan protokolü kullanarak serçeler toplanan sonra sekiz örnekleri Jel Elektroforez (üç örnek şekil 4' te görülebilir) bir DNA merdiven ile çalıştırın. Bulaşması olmadan farklı gruplar sekiz yüksek kalitede DNA başarılı yalıtım gösteren örnek şerit içinde görüldü. Bu iletişim kuralını kullanan çıkarılan diğer örnekleri Spektrofotometre (bakınız Tablo 1) kullanarak DNA toplama için değerlendirildi.

Figure 3
Şekil 3: iki küçük ötücü spermi. Bu sperm örnekleri ev finch (Haemorhous mexicanus), cloacal masaj yaptı ve bir ev serçesi (Passer domesticus), doğru tarafından elde edildi 2016 yılında Fargo, ND içinde sıkışmış. Örnekleri her 20 µL PBS içinde seyreltilmiş ve 1000 X ve 400 X büyütme, bileşik mikroskop altında sırasıyla görüntülenebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : DNA Jel Elektroforez Sperm DNA'sı. Üç ev serçe sperm çıkarılan DNA örnekleri bir jel bir DNA merdiven ile çalıştırın. Farklı grup, yüksek kalitede DNA başarılı ayıklama gösteren varlığını unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ev serçesi (Passer domesticus) Yonga serçe (Spizella passerina) House finch (Haemorhous mexicanus) Amerikan robin (Turdus migratorius) Kaya güvercini (Columba livia)
Toplanan örneklerin sayısını 156 3 2 2 2
Çıkarılan örneklerin sayısını 90 3 2 2 2
Sperm toplama başarı oranı % 98 % 75 % 100 % 67 % 67

Tablo 1: türler ve örnekleri toplanan ve bugüne kadar çıkarılan. Yayın sırasında örnekleri 4 ötücü tür ve 1 columbid açıklanan protokolünü kullanarak işlendi. Sperm toplama başarı oranı her hangi bir örnek başarıyla denedi toplam numarası dışında elde edildi yüzde ifade eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz küçük ve orta ölçekli kuşlar üreme etkin durumda sperm toplama ve kuş sperm DNA ayıklanması için basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Açıklanan Sperm DNA ekstraksiyon protokolü bir kit basitlik için değiştirilebilir, ancak kuş meni kullanmak için rafine. Sperm lizis standart ayıklama kimyasallar9,13tarafından dayanıklı ve sperm örneği ötücüler toplanan oldukça küçük (genellikle bir kaç microliters). Bu faktörler DTT uygun bir konsantrasyon kullanarak ve 65 ° C'de kuluçka başarıyla üstesinden sorunlar mevcut Bu yöntemi kullanarak, biz sürekli DNA kullanılabilir miktarda sperm telomer uzunluğu (genellikle arasında 40-250 ng/µL, boşalmak birim bağlı olarak) qPCR çözümlenmesi için izole ettim.

DTT fenol/kloroform tepki13ile birlikte kuş sperm DNA ayıklamak için daha önce kullanılmış. Fenol/kloroform reaksiyonlar DNA yalıtmak için etkili, ama onlar daha zaman alıcı, daha tehlikeli ve duman kukuIeta gerektirir. Bir önemli bizim ayıklama Protokolü sadece bir marka ve ekstraksiyon kiti, muhtemelen küçük hacimli örnek başlatma nedeniyle türü ile kullanıldığında başarılı geçtiğine kısıtlamasıdır. Çok küçük sperm örneği (1 µL) ya da düşük sperm yoğunluğu ile örnekleri DNA yetersiz DNA örneği mevcut nedeniyle başarılı ayıklama engel olabilir, ama zaman içinde durumu doğurmak kuşlar üzerinde cloacal masaj yapılır Biz bu sorunla karşılaştı değil . Bu sorunu önlemek için cloacal masaj hemen çıkarma için birikmiş birden fazla cinsel ilißki toplamak için tekrar edilebilir.

Cloacal masaj yıllardır kullanılmakta ve birçok tür1,4,5,6,7,15,16,17ve bir kuşlar birçok durumda sperm toplama hızlı ve etkili anlamına gelir. Yakalanabilir vahşi veya eğitimsiz kuşlar ile ilgili çalışmalar için bir madde ile benim ve menisini isteyerek mevduat erkek kuş inandırıcı itimat toplama yöntemlerine göre daha etkili olur4. Testisler veya seminal glomera diseksiyon tarafından başka bir sperm koleksiyonu yöntemdir, ancak bu koruma amaçlı ya da tekrarlanan örnekleme4,14için bir seçenek değil. Birincil cloacal masaj tekniği gösteri olmadan öğrenme güçlüğü kısıtlamasıdır. Yazılı açıklamalar çoğu kez anlamak ve işlemi uygulamak öğrenmek için yetersiz. Cloacal masaj ayrıntılı olarak gösteren tarafından biz öğrenme zamanı ve zorluk tekniği öğrenmek isteyenler için azaltmak umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Ve Jeffrey Kittilson laboratuvarı için destek biz Jose Noguera cloacal Masaj, erken hakkında yardım almak için teşekkür ederiz. Bu eser bir ND EPSCoR FAR0022429 Ödülü BJH için tarafından desteklenmiştir. Yayın ücreti cömertçe NDSU bölümü Biyolojik Bilimler tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microhematocrit capillary tubes Fisherbrand 22-362566 Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow.
Microcentrifuge tubes Any
1x PBS Any Used for storing semen samples prior to DNA extraction.
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Tris base Sigma-Aldrich 10708976001 Any supplier can be used.
EDTA Sigma-Aldrich 1233508 Any supplier can be used.
NaCl Sigma-Aldrich 793566 Any supplier can be used.
SDS Sigma-Aldrich 1614363 Any supplier can be used.
QIAamp DNA micro kit Qiagen 56304 Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
  2. Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
  3. Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
  4. Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
  5. Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
  6. Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
  7. Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
  8. Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
  9. Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
  10. Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
  11. Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).
  12. QIAamp DNA Micro Handbook. , Third edition (2014).
  13. Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
  14. Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
  15. Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
  16. Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
  17. Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı 132 Sperm kuş DNA cloacal Masaj ayıklama ötücü
Kuş sperm toplama Cloacal masaj ve Sperm DNA izolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kucera, A. C., Heidinger, B. J.… More

Kucera, A. C., Heidinger, B. J. Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm. J. Vis. Exp. (132), e55324, doi:10.3791/55324 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter