Introduction
Malaria är ett betydande globalt hälsoproblem. 1 Allvarlig malaria kännetecknas delvis av cerebral inblandning och är ofta en dålig prognostisk faktor. Cerebral involvering är vanlig hos barn under fem års ålder i områden med hög malariotransmission och utgör den främsta orsaken till malariärrelaterad död i den åldersgruppen. 1 Medan aggressiv behandling kan vara livrädd, kan detekteringen av cerebral malaria, särskilt i tidiga skeden, vara svårt. De patologiska processerna som är involverade i cerebral malaria innefattar mikrovaskulär störning och hjärnödem, vilket kan leda till svår hjärnsvullnad. I denna artikel presenterar vi ett magnetiskt resonansbildningsprotokoll (MRI) som möjliggör helhjärnans in vivo avbildning av experimentell cerebral malaria (ECM). Hela hjärnans högupplösta bildhanteringsmetoder har i stor utsträckning underutnyttjats i denna sjukdom, även om det är litet känt om hur ECM initierar i det centralaNervsystemet eller vilka specifika mekanismer som leder till sjukdomen. In vivo MR, som täcker hela hjärnan, utgör ett viktigt forskningsverktyg för att få en bättre förståelse för ECM-patologi. MRI kan bedöma global cerebral hjärnsvullnad, som nyligen har erkänts vara en viktig prediktor för död, inte bara i ECM, men också i human cerebral malaria. 2 , 3 Svår hjärnsvullnad uppträder vid dödlig sjukdom och representerar en av flera patologiska särdrag mellan ECM-modellerna och den mänskliga sjukdomen, en sjukdom som kännetecknas av både inflammatoriska och mikrovaskulära förändringar. 4
ECM kan induceras i CBA- eller C57BL-möss genom infektion med dödlig Plasmodium berghei ANKA. 5 Uppkomsten av ECM uppträder vanligen mellan dag 6 och 10 efter infektion och resulterar i montering, ataxi, andningsöd och koma, vilket leder till rapId död. 4 Den snabba murin Coma and Behavior Scale (RMCBS) är ett bra betyg för att utvärdera kliniska symptom på ECM. Den består av 10 parametrar, var och en av 0 till 2, med ett maximalt poäng på 20. 6 Nyligen visade vi god överenskommelse mellan svårighetsgraden av RMCBS-poäng i ECM-möss och patologiska förändringar som demonstrerats av MR. 7 I detta protokoll beskriver vi ECM-induktion i möss och in vivo magnetisk resonansbildning av möss med ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som rapporterats i den här artikeln utfördes i enlighet med riktlinjerna för Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA) kategori B och GV-SOLAS-standardens riktlinjer och godkändes av de lokala tyska myndigheterna i Karlsruhe (Regierungspräsidium Karlsruhe , Tyskland). Observera att biosäkerhetsnivå 2 gäller för mygg och Plasmodium berghei ANKA sporozoit arbete.
1. Infektion
- Infektera Anopheles stephensi myggor med Plasmodium berghei ANKA genom att mata dem i 15 minuter på en gametocytemisk mus. Håll smittade myggor vid 80% luftfuktighet och 21 ° C.
- Samla kvinnliga myggor från deras bur 17 till 22 dagar efter blodmålet. Placera dem på is för att bedöva dem.
- Använda tångar placera tre till fyra myggor på en glasskiva täckt med en droppe kall RPMI-medium. Placera bilden under ett mikroskop. <Li> Använda tångar, sträck noga myggan mellan huvud och kropp. Isolera spyttkörteln med hjälp av en spruta och en nål. Upprepa proceduren med de återstående myggorna.
- Samla spytkörtlarna från glasrutan genom att suga upp dem med en glaspipett och samla dem i ett 1,5 ml centrifugrör.
OBS: Beroende på infektionshastigheten kan vanligen 8 000 till 15 000 smittsamma sporozoiter erhållas per spottkörtel. - För ungefär 3 minuter smashar de isolerade spytkörtlarna i centrifugröret med en liten plastpinne för att isolera sporozoiterna från spyttkörtelvävnaden.
- Centrifugera i 3 minuter vid 1000 xg och 4 ° C för att rena sporozoiterna från den återstående vävnaden.
- Pipettera supernatanten, som innehåller sporozoiterna (SPZ), till ett nytt centrifugrör och räkna de renade sporozoiterna i en Neubauer-hemocytometer.
- Justera koncentrationen av renade sporozoiter till 10 000 / ml genom tillsats av phOsfatbuffrad saltlösning.
- Injicera totalt 1 000 sporozoiter (0,1 ml) i svansvenerna hos inavlade C57BL / 6-möss för att initiera infektion. För att underlätta injektionerna placera C57BL / 6-mössen i en fasthållare och placera svansarna i varmt vatten (ungefär 37 ° C) för att hjälpa till med visualisering av svansvenerna.
OBS! Injektionen är en kort procedur som kan utföras inom några sekunder. - En gång dagligen kontrollerar blodstegs parasitemi på blodutslag från dag 3 och framåt efter SPZ-infektionen.
OBS: Övervakning parasitemi har tidigare visualiserats i en JoVE-artikel av Mueller et al. 8 - Bedöm musen en gång dagligen med snabba murinkomma och beteendeskala (RMCBS), från och med dag 5 efter sporozoitinjektionen.
OBS! En detaljerad beskrivning av detta förfarande, inklusive en videodemonstration, har publicerats av Caroll et al. 6 - utvärderaMössen med MRI-avbildning enligt RMCBS-poängen och den forskningsfråga som ska behandlas. 6
2. Inställning för magnetisk resonansbildningsinställning
- Utför MR på en 9.4T liten djurskanner med hjälp av en volymresonator för radiofrekvensöverföring och en 4-kanalig fasad array-mottagarespole. Slå på det temperaturstyrda vattenbadet till 42 ° C för att behålla muskets kroppstemperatur.
- Inducerar anestesi i en kammare med 2% isofluran och tryckluft tills musen inte längre reagerar på en tånklämma. Underhålla anestesi vid 1-1,5%.
- Placera en svansvenekateter i musens svansvene. Placera musen för MR genom att placera den benägen och med en knäppt tillbaka på en djurbädd utrustad med ett huvudlock och en tandbalk för att minimera huvudrörelsen. Var försiktig så att du inte räta muskulaturens ryggrad.
- Anslut ett kontrastmedelinsprutningssystem till svansvenekateteren. Använd ett skräddarsyddat injektionssystem fyllt med en Gd-DTPA (0,3 mmol / kg) spruta eller använd PE-rör ansluten till en Gd-DTPA (0,3 mmol / kg) spruta.
- Applicera dexpanthenol ögonsalva till båda ögonen. Placera 4-kanalsfasad-array yta mottagare huvudspolen på musens huvud. Placera en andningsplatta på musens baksida och anslut den till en andningsövervakningsanordning.
3. Imaging Protocol
OBS: Välj bildsekvenser från protokollet enligt nedan enligt de forskningsfrågor som ska behandlas. Alla listade parametrar gäller för MRI-programvaran, men kan behöva justeras om andra program används.
- Börja med att genomföra en lokaliseringsskanning för att se till att musens hjärna ligger i magnetens isocenter.
- För att kvalitativt bedöma det vasogena ödemet, använd 3D T2-vägd bildbehandling genom att välja en multi-slice RARE-sekvens.
- Ange följande paRammetrar i MR-programvaran: upprepningstid = 2.000 ms, ekotid = 22 ms, isotrop upplösning = 0,1 mm, synfält = 20 x 10 x 12 mm 3 ; Matris = 200 x 100 x 120, vändvinkel = 90-180 °; (Spin-echo) och sällsynta faktor = 8. Starta sekvensen och vänta 10 min 48 s för att skaffa de rada bilderna.
- För att kvantitativt bestämma vasogen ödem utföra T2-relaxometri genom att välja en multi-skiva, multipel spin-ekosekvens.
- Använd följande parametrar: repetitionstid = 3,100 ms, ekotid = 8-136 ms i inkrement på 8 ms, antal skivor = 17, skivtjocklek = 0,7 mm, i planlösning = 0.116 mm x 0.116 mm, synfält 20 X 20 mm 2 , matris = 172 x 172, vändvinkel = 90-180 grader; (Spinn-eko). Starta sekvensen och vänta 8 min 53 s för att skaffa de rada bilderna.
- För att kvantitativt bedöma både vasogen ödem och cytotoxiskt ödem, utför diffusionsvägd imaging / apparent diffusion coe(ADC) kartläggning genom att välja en spin-eko EPI-diffusionssekvens.
- Använd följande parametrar: repetitionstid = 3.400 ms, ekotid = 20 ms, skivtjocklek = 0,7 mm, antal skivor = 17, antal diffusionssensibiliserade riktningar = 30, b värde = 1.500 s / mm 2 , 5 = 3 ms , Δ = 9 ms, partiell Fourier-kodningsaccelerationsfaktor = 1,51, synfält = 12 x 15 mm 2 , matris = 96 x 128, upplösning i planet = 0.125 mm x 0.117 mm, vändvinkel = 90-180 grader, och Antal mättningsskivor (sagittal) = 1. Börja sekvensen och vänta 7 min 56 s tills de råa bilderna är inköpta.
- För att bedöma mikrohemorrhagor, använd 3D T2 * -viktad bildbehandling. Välj en flödeskompenserad FLASH-sekvens.
- Ange följande parametrar i MR-programvaran: upprepningstid = 2.000 ms, ekotid = 22 ms, isotrop upplösning 0,08 mm, synfält = 32 x 15 x 8 mm 3 , matrisstorlek = 400 x 188 x 100 och fLäppvinkel = 12 grader. Starta sekvensen och vänta 15 min 40 s för att skaffa de rada bilderna.
- För att bedöma arteriell patency, använd tid för flyg angiografi genom att välja en 3D FLASH-sekvens.
- Använd följande parametrar i MR-programvaran: upprepningstid = 16 ms, ekotid = 3,5 ms, skivtjocklek = 0,07 mm, upplösning i planet = 0.104 x 0.104 mm, synfält = 20 x 20 x 10 mm 3 , matris = 192 x 192 x 142 och flipvinkel = 15 grader. Starta sekvensen och vänta 7 min 16 s tills bilderna förvärvas.
- För att bedöma blod-hjärnbarriäravbrott, använd 3D T1-vägd bildbehandling före och efter en kontrasteringsinjektion av 0,3 mmol / kg. Välj en radiofrekvens-bortskämd FLASH-sekvens med en global radiofrekvens excitation.
- Använd följande sekvensparametrar i MR-programvaran: upprepningstid = 5 ms, ekotid = 1,9 ms, isotrop upplösning = 0,156 mm, synfält 20 x 18,7X 18,7 mm 3 , matris 128 x 120 x 120 och vändvinkel = 8,5 °; Starta sekvensen och vänta 1 min 14s tills bilderna är förvärvade.
4. Bildbehandling och analys
- För att analysera blod-hjärnbarriäravbrott, subtrahera 3D-icke-förstärkta T1-viktiga bilder från förbättrade T1-viktade bilder med det aritmetiska verktyget eller bildräknareverktyget i ImageJ. Utvärdera subtraheringsbilderna för en signalökning, vilket motsvarar blod-hjärnbarriärstörning. 9
- För att analysera hjärnvolymen, använd inbyggda 3D T1- eller 3D T2-viktiga dataset. Avgränsa hjärnan från olfaktorisk lampa till cerebellum med hjälp av segmenteringsredigeraren. 10
- Vasogent ödem
- Behandla T2-relaxometri-data med MRI-mjukvaran eller använd ett icke-linjärt minsta kvadratpassningsförfarande. 11 Processdiffusionsvägda data för att erhålla ADC-kartor med hjälp av MR-sofTware eller FDT verktygslåda (se material tabell ).
- Placera regioner av intresse manuellt i de olika anatomiska regionerna.
OBS! Automatisk placering av intressanta regioner kan registreras felaktigt på grund av betydande hjärnans svullnad. T2-tiderna och ADC-värdena för de valda anatomiska regionerna erhålles på detta sätt.
- För att analysera mikrohemoragvolymen, avgränsa mikrohemorrhag, som förefaller vara ojämna, mörka foci på T2 * -viktade dataset, med hjälp av segmenteringsredigeraren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hos C57BL / 6-möss kan de första kliniska symptomen på ECM observeras mellan dag 6 och 10 efter infektion med P. berghei ANKA- sporozoiter. ECM utvecklas hos 60-80% av infekterade möss och fortskrider snabbt till koma och död inom 24 till 48 timmar. Däremot möss som inte utvecklar ECM dör efter den andra veckan efter infektion från allvarlig anemi på grund av hyperparasitemi. 12
Vid MR-avbildning är de tidigaste tecknen på ECM synliga i olfaktorisk glödlampa, som tillhör det olfaktiva systemet på musen och ligger i den rostrade delen av hjärnan. 7 , 13 En ökning av blod-hjärnbarriäravbrott (ses på kontrastförstärkta T1-viktiga bilder) och en vätskebevakning (ökning av T2-signalen på T2-viktiga bilder, T2-relaxometri och diffusionsvägd bildbehandling) indikerar tidigt vasogent ödemI olfaktorisk glödlampa som redan är närvarande i mild sjukdom (RMCBS-poäng 20-16) och börjar spridas när sjukdomsgraden ökar. Relativa T1-signalbilder bidrar till att upptäcka subtil blod-hjärnbarriärstörning ( Figur 1 ). Blod-hjärnbarriäravbrott och vasogentödem framskrider på ett visst sätt. Dessa patologiska förändringar spreds längs rostral migrationsströmmar, en migrerande väg för neuroblaster, mot hjärnstammen, som nås i mycket allvarlig sjukdom (RMCBS sår 9-0). På T2-kartor kan svårighetsgraden av vasogen ödem kvantifieras genom att dra regioner av intresse till specifika anatomiska regioner, såsom visas i figur 2 . För varje region kan en T2-avslappningstid som ökar med ökande ödem erhållas. Tillsammans med vasogen ödem och blod-hjärnbarriärstörning börjar hjärnsvullnad, eftersom ECM-svårighetsgraden ökar. Hjärnvolymen som indikerar ödem börjar öka signifikant hos måttligt sjuka möss som comPared till baslinjen och ytterligare ökningar av allvarligt sjuka möss ( Figur 3 ).
Mikrovaskulär patologi, som framgår av mikrohemorrhag och en ökning av kärlkänslighetskontrast (motsvarande långsam flöde) inträffar efter de första tecknen på blod-hjärnbarriärstörning och vasogen ödem och kan visualiseras med T2 * -viktad bildbehandling. Mikrohemorrhager förekommer övervägande i luktlampan ( Figur 4 ). Antalet mikrohemorrhagor ökar med progressiv sjukdom. Med progressiv sjukdom är mikrohemorrhagor också uppenbara i cortex, basal ganglia, cerebellum, vit materia och hjärnstam.
Minskad arteriell patency ses av angiografi vid tidpunkten för flygning som ett tecken på makrovaskulär försämring parallellt med mikrovaskulära förändringar. Sårinfarkt är inte ett nyckelfynd i ECM. I mycket allvarlig sjukdom är dock fokusområdenaADC-minskning kan identifieras, vilket indikerar cerebrala infarkt.
Figur 1: Blood-brain Barrier Disruption. ( A ) En representativ koronal 3D T1-vägd bild. En ökning av T1-signalen är synlig i den centrala delen av olfaktoriska lampan. ( B ) På motsvarande T1-relativsignalbild (T1-kontrastbilden subtraherad från T1 efter kontrastbilden) är kontrasteragens extravasering lättare att avgränsa. Kontrastmedel extravasation är synlig i de främre kortikala regionerna (vita pilar). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: T2 Koppla avometry. Prov T2-kartor i olika höjder från en svåra sjuk mus med en RMCBS-poäng på 5 ( A ) och från baslinjescanningen ( B ) visas i färgskala, i gråskala och i gråskala med ROI som färgade överlagringar. Mörkblå = RMS, grön = cortex, turkos = extern kapsel, gul = basal ganglia, ljusblå = DMS, orange = thalamus och röd = hjärnstam Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Brainvolymmätningar. Hjärnvolymen ökar signifikant hos måttligt sjuka möss (RMCBS 15-10). Representativa värden på 10 möss visas. Data presenteras som den genomsnittliga standardavvikelsen. Ett parat Elevens t-test användes för att analysera skillnaderna i bhVid svullnad mellan grupper. Hos moderat / allvarligt sjuka möss ökade hjärnvolymen signifikant jämfört med baslinjen (p = 0,021 / 0,001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Microhemorrhages. Representativa T2 * -viktade bilder av en mus före starten av blodstegsinfektion ( A ) och på dag 8 efter infektion med ett RMCBS-poäng på 14 ( B och C ) visas. I den första bilden är inga mikrohemorrhågor tydliga ( A ), medan i andra och tredje bilderna flera mikrohemorrhagor är synliga, med övervägande i olfaktorisk glödlampa (B: plankoronalbild, C: 3D-projektion med segmenterade mikrohemorrhagor).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna artikel beskriver vi ett helhjärtat MR-protokoll för att avgränsa förändringar i experimentell cerebral malaria. Vi tror att MR har underutnyttjats i malariaprojekt hittills och hoppas att våra protokoll kommer att hjälpa andra utredare. Vi skulle vilja beskriva några ytterligare punkter som kan vara till hjälp.
Om allvarligt sjuka möss avbildas är positionering avgörande. På grund av ökat intrakraniellt tryck är möss mottagliga för döden, och därför bör den cervikala ryggraden inte sträckas. Anestesi bör också hållas till ett minimum. Om möss med mild sjukdom avbildas är den bästa tidpunkten för MRI 12-24 timmar före förväntad inledning av de första kliniska symptomen. Milt vasogent ödem i olfaktorisk glödlampa är synligt hos möss som inte uppvisar några kliniska tecken på ECM (RMCBS-poäng på 20).
Längden av MR-protokollet i sig kan anpassas enligt den specifika forskningsfrågan. Den minsta protoCol bör inkludera en T2-vägd sekvens eller T2-relaxometri och en T2 * -vektad sekvens för att bedöma närvaron av vasogen ödem och mikrohemorrhage / mikrovaskulär försämring. För att få bilder av bra kvalitet bör rörelseartiklar hållas till ett minimum. Rörelsen kommer att minskas genom korrekt musposition och genom att hålla andningsfrekvensen vid ca 60-80 andetag per minut.
Andra in vivo bildbehandling metoder, såsom intravital mikroskopi, visar löftet vid visualisering av patologiska förändringar i ECM på cellulär nivå. 14 , 15 , 16 , 17 Jämfört med MR, kan intravital mikroskopi erbjuda hög rumslig upplösning till kostnaden för att endast omfatta ett begränsat kortikalt område. MRI kan däremot täcka hela hjärnan med en upplösning på upp till 80 μm. MR kan därför styra ytterligare cellulära undersökningar genom att identifieraPrekektionsställena - början av sjukdomen - såväl som sjukdomsstadiet, som sedan kan bedömas med hjälp av ytterligare metoder. MR-fynd i ECM kan jämföras med patologiska förändringar som detekterats med MR i human cerebral malaria. Både human och experimentell cerebral malaria visar vasogent ödem i områden av neurogenes, liksom mikrovaskulär patologi, såsom sekundär cerebral infarkt i vattendrag. 7 , 18 Vit och grå substans påverkas på liknande sätt, och hjärnans svullnad i både mänsklig och experimentell cerebral malaria innebär hjärnstammen i svår sjukdom och förklarar komatos tillståndet. 2 , 7
Vi hoppas att in vivo imaging hjälper till att riva upp den underliggande patologiska mekanismen för cerebral malaria, som för närvarande förblir elusiv. Eftersom ödem och hjärnsvullnad knappt syns ex vivo, migThods för att visualisera denna patologi in vivo är nyckel och kommer att bidra till att förbättra utvärderingen av nya terapier och vaccinationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Miriam Reinigs tekniska assistans erkänns tacksamt. AH erhöll finansiering från en postdoktorsk stipendiat vid Medicinska fakulteten vid Heidelbergs universitet. MP stöds av ett memorial stipendium från Else-Kröner-Fresenius Foundation. AKM är mottagare av en mammaledighet stipendium från DZIF-akademin för det tyska centrumet för infektionsforskning (DZIF). JP är mottagare av en Heidelberg Research Center for Molecular Medicine (HRCMM) Karriärutvecklingsfellowship. Vi bekräftar dessutom tacksamt Julia M. Sattler och Friedrich Frischknecht för att ge en exemplifierande film av sporozoitrörelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001747 | for anesthesia |
| Dotarem | Guebert | 1086923 | Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL |
| Amira (Image Processing Program) | FEI Group | Version Amira 5.3.2 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., | Release 2012b | |
| FDT toolbox | FMRIB's Software Library | http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html |
References
- World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
- Seydel, K. B., et al. Brain swelling and death in children with cerebral malaria. N Engl J Med. 372 (12), 1126-1137 (2015).
- Penet, M. F., et al. Imaging experimental cerebral malaria in vivo: significant role of ischemic brain edema. J Neurosci. 25 (32), 7352-7358 (2005).
- de Souza, J. B., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes Infect. 4 (3), 291-300 (2002).
- Curfs, J. H., van der Meide, P. H., Billiau, A., Meuwissen, J. H., Eling, W. M. Plasmodium berghei: recombinant interferon-gamma and the development of parasitemia and cerebral lesions in malaria-infected mice. Exp Parasitol. 77 (2), 212-223 (1993).
- Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), (2010).
- Hoffmann, A., et al. Experimental Cerebral Malaria Spreads along the Rostral Migratory Stream. PLoS Pathog. 12 (3), e1005470 (2016).
- Mueller, A. K., Behrends, J., Blank, J., Schaible, U. E., Schneider, B. E. An experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei. J Vis Exp. (84), e50829 (2014).
- Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
- Nag, N., Mellott, T. J., Berger-Sweeney, J. E. Effects of postnatal dietary choline supplementation on motor regional brain volume and growth factor expression in a mouse model of Rett syndrome. Brain Res. 1237, 101-109 (2008).
- Giri, S., et al. T2 quantification for improved detection of myocardial edema. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 56 (2009).
- Engwerda, C., Belnoue, E., Gruner, A. C., Renia, L.
- Zhao, H., et al. Olfactory plays a key role in spatiotemporal pathogenesis of cerebral malaria. Cell Host Microbe. 15 (5), 551-563 (2014).
- Nacer, A., et al. Experimental cerebral malaria pathogenesis--hemodynamics at the blood brain barrier. PLoS Pathog. 10 (12), e1004528 (2014).
- Nacer, A., et al. Neuroimmunological blood brain barrier opening in experimental cerebral malaria. PLoS Pathog. 8 (10), e1002982 (2012).
- Pai, S., et al. Real-time imaging reveals the dynamics of leukocyte behaviour during experimental cerebral malaria pathogenesis. PLoS Pathog. 10 (7), e1004236 (2014).
- Shaw, T. N., et al. Perivascular Arrest of CD8+ T Cells Is a Signature of Experimental Cerebral Malaria. PLoS Pathog. 11 (11), e1005210 (2015).
- Potchen, M. J., et al. Acute brain MRI findings in 120 Malawian children with cerebral malaria: new insights into an ancient disease. AJNR Am J Neuroradiol. 33 (9), 1740-1746 (2012).
