Mätning och modellering kontraktila Torkning i Human hornlagret

Summary

Den här artikeln beskriver en metod för att kvantifiera det dynamiska tork beteende och mekaniska egenskaper hos hornlagret genom mätning spatialt upplöst i planet tork förskjutningar av cirkulära vävnadsprover vidhäftade en elastomersubstrat. Denna teknik kan användas för att mäta hur olika kemiska behandlingar förändrar torkning och vävnads mekaniska egenskaper.

Abstract

Stratum corneum (SC) är det mest ytliga hudskiktet. Dess kontakt med den yttre miljön innebär att denna tissueskiktet utsätts för både rengöringsmedel och dagliga variationer i omgivande fukt; vilka båda kan förändra vatteninnehållet i vävnaden. Minskningar i vattenhalt av svår barriärdysfunktion eller luftfuktighet låg kan ändra SC styvhet och orsaka en ansamling av torkspänningar. I extrema förhållanden kan dessa faktorer orsaka mekanisk bristning av vävnaden. Vi har etablerat en hög genomströmning metod för att kvantifiera dynamiska förändringar i de mekaniska egenskaperna hos SC vid torkning. Denna teknik kan användas för att kvantifiera förändringar i torkningsbeteende och mekaniska egenskaper hos SC med kosmetiska rengöringsmedel och fuktkräm behandlingar. Detta uppnås genom att mäta dynamiska variationer i rumsligt upplösta i planet tork förskjutningar av cirkulära vävnadsprover vidhäftade en elastomer-substrat. I planet radiella förskjutningar ACQuired under torkning azimutalt genomsnitt och utrustade med en profil baserat på en linjär elastisk sammandragnings modell. Dynamiska förändringar i tork stress och SC elasticitetsmodul kan sedan extraheras från den anpassade modell profiler.

Introduction

Den yttersta skiktet av epidermis, eller stratum corneum (SC) består av kohesiva corneocyte celler omgivna av en lipid rik matrix ^{1, 2.} Sammansättningen och strukturell integritet SC är viktigt för att upprätthålla korrekt barriär funktionalitet ^3, vilket förhindrar invasion från mikroorganismer och motstår både mekaniska krafter och stor förlust vatten ^4. Kapaciteten personliga hygienprodukter för att bibehålla eller försämra hudens barriärfunktion är av stort intresse för huden vård och kosmetikindustrin ^5. Den dagliga applicering av personliga hygienprodukter är känd för att ändra de mekaniska egenskaperna hos SC ^{6, 7, 8.} Till exempel kan ytaktiva medel som ingår i kosmetiska rengöringsmedel orsaka signifikanta ökningar av elasticitetsmodulen och en uppbyggnad avtork spänningar i SC, vilket ökar vävnaden benägenhet att spricka ^{7, 9.} Glycerol som finns i nästan alla kosmetiska moisturizers kan mjukna SC och minska uppbyggnaden av torkspänningar ^{8, 10, 11,} vilket minskar sannolikheten för vävnadsbrott.

Metoden beskrivs i den här artikeln är i stånd att kvantifiera det dynamiska tork beteende och mekaniska egenskaper SC torkning i kontrollerade miljöer ^{7, 8.} Tidigare har denna teknik visat sig vara i stånd att belysa effekten av olika kosmetiska produkter på förändringar i det dynamiska tork beteende och mekaniska egenskaper hos SC vävnad. Detta uppnås genom att kvantifiera torkning-inducerad krympning av humant SC vävnad vidhäftad till en mjuk elastomer-substrat, passande torknings förskjutningar med en enkelkontraktilitet modell, och sedan extraktion av elasticitetsmodul och torkning stress från den anpassade profilen. När det krävs tester av flera SC prover, erbjuder denna metod en snabbare alternativ till enaxlig tensometry utnyttjar betydligt mindre vävnad och ger mer fysiologiskt relevant torkning genom att förhindra avdunstning från provet undersida.

Protocol

En undantagna godkännande (3002-13) att bedriva forskning med hjälp av vävnadsprover avidentifierade enligt Department of Health and Human Services föreskrifter, 45 CFR 46,101 (b) (4) beviljades. Full tjocklek hud tas emot från elektiv kirurgi. I den här artikeln, är vävnadskällan 66-årig vit kvinna bröst.

1. Framställning av Elastomer Coated Täck

1. I en 20 ml glasflaska, blanda 0,107 g Sylgard 184 härdare med 5,893 g bas. Den totala blandningen massan är 6 g med en bas för härdare förhållande av 55: 1.
2. Efter blandning med en glasstav för att säkerställa homogenitet, placera glasflaskan i en vakuumkammare och avgas att ta bort alla bubblor.
3. Placera en glaskupa-slip (55 mm x 25 mm) i mitten av en spinnbeläggare. Lägg ~ 1 ml av blandningen på mitten av täckglas. Använd en 5000 mikroliter pipett med slutet avskuren med sax. Spin belägga täckglas vid 2000 rpm under 60 s.
   1. Upprepa detta process att skapa 5-6 substrat.
4. Härda täckglas i en ugn under 12 h vid 60 ° C.
5. Använda ett rakblad för att delvis avlägsna elastomerfilmen från en offersubstrat. Använda en outplånlig markör för att markera ovansidan av elastomerfilmen och den exponerade glaset.
6. Montera provet på ett inverterat mikroskop och använda en fjärrfokus tillbehör för att spela in skillnaden i z-höjd mellan de fokalplan hos de båda varumärkena. Detta motsvarar den elastomersubstrattjockleken, h.

2. Framställning av stratum corneum

1. Använda ett vattenbad eller uppvärmd omrörarplatta för att värma en glasbägare halv fylld med avjoniserat vatten (DW) till 60 ° C. Inne i ett biologiskt säkerhetsskåp, sänk hela tjockleken mänsklig hud i vattnet under 4 min.
2. Överför omedelbart hudprovet i en bägare innehållande DW kyldes till <10 ° C under 4 min. Hälften fylla bägaren minimerar stänk av biologiskt material.
3. Ta bort skinnet från bägaren och placera i en petriskål, och försiktigt isolera epidermis med hjälp av ett par böjda nosed vävnads pincett.
4. Placera isolerade epidermis basalsidan nedåt i en petriskål fodrad med gasbinda. Säkerställa basalskiktet är helt i kontakt med gasbinda.
   1. Blötlägg gasväv i en 0,25% (vikt / volym) av typ IX-S svinpankreas trypsinlösning löst i 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning under 6-8 timmar vid rumstemperatur. Lägg bara tillräckligt trypsin i behållaren för att väta gasväv.
5. Lyft gasväv med vävnads pincett och flyter den i en behållare delvis fylld med DW. Dra försiktigt SC att skilja den från gasväv.
6. Tvätta stratum corneum 3-4 gånger i DW att avlägsna kvarvarande epidermal vävnad som sitter kvar på SC.
7. Flyta isolerad SC i en lösning av 0,4% glycin max (sojaböna) trypsininhibitor i DW. Använda en plattskakanordning för omröring av vävnaden under 10 min.
8. Float SC i en petriskål delvisfylld med DW. Använda en plattskakanordning för omröring av vävnaden under 10 min.
9. Torka den isolerade SC blad på en ultrafina plastnät under 48 timmar vid rumstemperatur (25 ° C, 40% relativ fuktighet (RH)).
10. Separera SC från nätet och skär ut enskilda cirkulär R = 3 mm radie prover med ett cirkulärt hål. Markera mitten av den yttersta ytan med en liten spiral märke med outplånlig markör. Detta ger en visuell signal för igenkänning av ovansidan av SC.
    OBS! Outplånligt märke bör tillämpas i mitten av provet, där tork deformationer blir minsta. Detta kommer att minimera effekterna av markören på inspelade torkförskjutningsprofiler.

3. Prov behandling och deponering

1. Agitera SC prover för 30 min i 15 ml DW innehållande 90 fil fluorescerande markörpärlor (505/515 nm, 1 | j, m diameter, karboxylat-modifierade). Denna inlåning pärlor på SC ytan
   OBS: Även om avsättning av lARGE antal pärlor på SC kan marginellt långsam torkning i förhållande till prover utan pärlor närvarande ¹² kommer det att maximera den rumsliga upplösningen av i planet deformation fält som därefter kan erhållas. Bör därför göras Valet av pärla tillsatta volymen ad hoc.
2. Ta SC prover och placera dem i en petriskål delvis fylld med DW.
3. Delvis fördjupa ett substrat i DW på en flack vinkel av 15-30 °.
4. Stift en kant av den flytande SC provet vid kontaktlinjen mellan substratet och vattengränsytan. Vertikalt dra tillbaka substratet från vattnet kommer smidigt laminera SC provet till substratet utan rynkor eller infångade luftbubblor.
5. Upprepa steg 3,4 att placera upp till 6 SC prover på varje substrat. Lämna åtminstone en 2-3 mm gap mellan prov och undvika provlamine nära substratet kanten. Detta förhindrar torkning av ett prov påverkar tork förskjutningar i en annan. Torka de monterade SC prov i laboratorieförhållanden under 60 minuter. Detta tillåter restvatten mellan SC och substrat för att avdunsta och säkerställer fullständig vävnadsvidhäftning.
   OBS: I detta läge, SC prover kan behandlas med en kemisk eller kosmetiska formuleringar ^{7, 8} genom att placera substraten upp och ned i en önskad lösning för en erforderlig tidsperiod. Upprepa steg när behandlingssteget 3,6 utförs. Efter torkning kan verifieras ofullständig vidhäftning av SC prover till underlaget genomfallande ljusmikroskop. Trapped bubblor under prov SC eller trasig kanterna kommer att bilda tydlig kontrast variationer i provet med väl definierade kanter.
6. Skapa en fuktkammare genom att placera en petriskål delvis fylld med vatten i en hermetiskt tillsluten behållare.
7. Place substrat in i kammaren under 24 h ekvilibrera till en relativ fuktighet av 99%. Placera inte substraten i Petri skålen.

4. Mikroskop Omgivningskontroll

1. Uppnå kontroll av miljöförhållanden genom en fuktreglering system anslutet till ett mikroskop monter perfusion kammare. Detaljer av fuktreglering systemet tillhandahålls i German et al. (2013) ⁷ och Liu och tyska (2015) ^8.
2. Montera substratet på mikroskopet, placera perfusionskammaren över substratet och försegla kanterna hos perfusionskammaren till elastomeren med användning av vakuum fett.
3. När monterad, jämvikt intern luft till 99% RH före experiment. Detta förhindrar avdunstning av vatten före experimentering. När avbildning i avsnitt 5 eller 7 har börjat minska inre luftfuktigheten till önskat värde.
   OBS: I den här artikeln, är SC prover torkas till 25% RH

5. Imaging i Plane Tork Förskjutningar

1. Förvärva bilder av SC prover med en inverterad microscope med 1X objektiv. Excite fluorescerande pärlor med hjälp av en lätt motor med FITC-filter (503-530 nm emissionsbandpass). Flera prover kan avbildas sekventiellt under torkning med hjälp av en automatiserad xy-plattformen.
2. Spela fluorescerande och transmitterat ljus bilder med hjälp av en digital CCD-kamera med en upplösning på 1392 x 1040 pixlar. Synfältet för varje bild är 8,98 x 6,71 mm, vilket gör att en enda bild för att fånga en hel SC prov. Ta bilder med en frekvens på 10 min under 16 h.

6. Substrat Förberedelse för tjockleksmätning

1. I en kemisk dragskåp, placera en ml silan (3-aminopropyltrietoxisilan, ≥98%) i några små plastlock. Placera elastomersubstrat från avsnitt 1 och locket i en sluten behållare under 5 timmar. Tillåter inte substrat för att komma i direkt kontakt med silanen.
2. Tillsätts 5 mg EDC (N - (3-dimetylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide hydroklorid; ≥99%) i ett 1,5 ml rör. tillsätt 500 mikroliter av DW till EDC. Röra om lösningen under 10 s med en vortexblandare.
3. Lägg 0,076 g natriumtetraborat och 0,1 g borsyra till 20 ml DW. Blanda med hjälp av en magnetomrörare vid 70 ° C (1 h). Lägg borsyra till pH 7,4.
4. Tillsätt 20 ml boratbuffert till en 50 ml centrifugrör. Tillsätt 60 mikroliter av 1 ^ m pärlor (535/575 nm, karboxylat-modifierade) till boratbuffert. Slutligen, tillsätt 200 mikroliter av EDC lösning till flaska. Skaka röret för att blanda pärla lösning och häll sedan i en 10 cm diameter petriskål.
5. Ta bort silanerad substrat från behållaren och placera dem elastfilm sidan nedåt i pärlan lösning. Gör så långsamt för att förhindra bubblor från fastnar. Två substrat kommer att passa i varje petriskål.
6. Lämna substrat för att flyta i pärlan lösning under 45 minuter.
7. Använd pincett för att ta bort substraten från pärlan lösning, skölj sedan i DW att avlägsna obundna pärlor.
8. Lufttorka substraten. Blåser komprimerad luft överelastomerfilmytan minskar bildandet av vattenfläckar.
9. Täta substrat i en ogenomskinlig ruta för att förhindra fotoblekning av pärlorna tills SC prov nedfall.

7. Imaging Tjocklek på SC

1. Insättning SC prov på ett substrat med hjälp av avsnitt 3. Utför steg 3,1 utan att lägga fluorescerande pärlor till DW. Dessutom, tillämpa en 5 mikroliter droppe outspädd fluorescerande markör pärla lösning (505/515 nm, 0,1 pm diameter) på ytan av varje deponerad SC provet med en pipett innan du slutför steg 3,6.
2. Upprätta mätningar av SC tjocklek med hjälp av mikroskop med 40x objektiv. Mäta tjockleken på SC prover över tid med hjälp av en fjärrkontroll fokus tillbehör för att spela in skillnaden i z-höjd mellan de två pärla skikt fokalplan belägna vid SC-substrat gränssnitt och ovansidan av SC.
3. Mäta tjockleken på 3 regioner i varje SC provet över en 3 h torktiden. tjocklekenav SC prover når ett stabilt tillstånd värde inom denna tidsram ^åtta.

8. Kvantifiera och modellering Tissue Deformation

1. Använd Particle Image Velocimetry ¹³ för att erhålla spatialt upplösta i planet tork förskjutningar från de fluorescerande bilderna vid varje inspelad tid steg.
2. Använd MATLAB att få azimutalt genomsnitt radiella och azimutiska förskjutnings profiler från förskjutningsfältet för varje radiellt symmetrisk SC prov.
   OBS: Ett exempel dataset (med rubriken "d.mat") och MATLAB-kod (med rubriken "PIV-processing.m ') som utför både detta steg och steg 8,3 har anordnats i den kompletterande information.
3. Montera radiella förskjutningsprofiler till en modell ^{7, 8, 14, 15, 16} beskriver torknings SC som en krympande linjär elastisk cirkulationsr skiva av tid varierande tjocklek, h _SC, radie, R, och elasticitetsmodulen, E _SC, vidhäftat till ett deformerbart elastiskt underlag med elasticitetsmodulen, E. Antag SC har en väl definierad och konstant Poissons tal, ν _SC = 0,4 ^{7 , 8.} Skaffa bäst passar med minst minsta kvadrat tillvägagångssätt.
   OBS: Den modell som användes för montering beskriver radiella förskjutningar i form av modifierade Besselfunktioner är:
   (1)
   med , och
   Termen motsvarar ett inträngningsdjup som ges av,
   menas ett substrat styvhet parameter; giltig när provstorlekar är mycket större än substrattjockleken. Här är de parametrar, och sig betecknar substrattjockleken Poissons tal. Poissons tal av silikonelastomeren substratet ¹⁷ är ν = 0,5.
4. Erhålla modellparametrar a och β vid varje tidssteg från de minsta kvadratanpassning av ekvation (1) till den radiella förskjutningen profilen.
   1. Anställ passande parameter β att erhålla SC elasticitetsmodul, E _SC, använda uttrycket,
      
   2. Använd passande parameter α att erhålla tidsvarierande kontraktila tork stress, PSC, att använda uttrycket,
      

Representative Results

Figur 1 (a) visar ett representativt fluorescerande bild av en SC prov belagd med fluorescerande pärlor (avsnitt 3). Motsvarande transmitterat ljus bild av provet visas i figur 1 (b) som överdras med ett koger tomt på rumsligt upplösta torkförskjutningar som bildar efter 16 h torkning vid 25% RH På grund av den cirkulära symmetrin av proverna, kan dessa förskjutningar vara azimutalt medelvärde. Figur 1 (c) visar radiell (u _r, fast röd linje) och azimutiska (u _θ, streckad blå linje) förskjutningsprofilerna plottas mot dimensions radiella positionen r / R. Här, R betecknar medelvärdet SC prov radie, r / R = 0 betecknar prov centrum och r / R = 1 betecknar kanten. Standardavvikelser vid varje radiell position är betecknade med de skuggade regionerna kring medelvärdet. Dessa variationer i första hand orsakas av strukturell heterogenitet SC ³ <sup>, ^{7, 12.} Hela torkning, azimutala förskjutningar förblir små. Radiell förskjutning profiler ökar dock monotont från mitten och utåt och växa i storlek tills en jämvikt uppnås.

Figur 1: Cirkulär SC prov (6,2 mm diameter) fäst till en elastomer substrat med elasticitetsmodul E = 16 ± 1 kPa efter torkning under 15 timmar i en 25 ± 1% RH miljö. (A) Fluorescerande bild av SC prov belyser de deponerade fluorescerande markör pärlor används för att spåra spatialt upplöst i planet tork förskjutningar. (B) Quiver tomt på spatialt upplösta i planet tork förskjutningar överlagras på en överförd ljusbild av SC provet. (C) azimutalt genomsnitt radial (u _r, fast röd linje) ochazimutal (u _θ, blå streckad linje) förskjutningar av provet avsatt mot dimensions radiell position, r / R. Positiva värden på u _r motsvarar kontraktila förskjutningar. Skuggade regioner som omger de linjerna indikerar standardavvikelsen om medelvärdet vid varje radiell position. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Profiler som registrerats vid 30 min intervaller är plottade i figur 2 (a) och visar tidsutvecklingen för i planet förskjutningar. Den genomsnittliga SC tjocklek, h _SC, är avsatt i figur 2 (b). Minskningar av SC under torkning främst ske under de första två timmarna.

Figur 2: (a)Överlagring av radiell förskjutning profiler (u _r, fasta röda linjer) vid 30 minuters intervall under en 15 h torkperiod i 25% RH avsatt mot dimensions radiell position r / R för en typisk SC prov. Positiva värden på u _r motsvarar kontraktila förskjutningar. (B) Genomsnittlig SC provtjocklek, (h _SC, n = 3), avsatt mot torktid. (C) radiell förskjutning profiler från (a) överlagras med minimiminstakvadrat passar (blå streckad linje) i ekvation (1) för det första och sista inspelade radiell förskjutning profil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Montering förskjutning profiler med den linjära elastiska kontraktiliteten modell som beskrivs av ekvation (1) ger ytterligare inblick i de mekaniska egenskaperna hos tork SC. Förskjutning profiler en t varje tidssteg är försedda med modellen med användning av ett minimum minsta kvadrat tillvägagångssätt, såsom visas i fig 2 (c). Den kontraktila torkning stress, P _SC, och elasticitetsmodulen, E _SC, därefter extraheras från modellen vid varje tidssteg. Genomsnittliga förändringar i dessa parametrar (baserat på 3 individuella SC prover) visas respektive i figurerna 3 (a) och 3 (b). Båda parametrarna öka snabbt under de första 2 h torktiden och nå en platå inom 5 timmar.

Figur 3: (a) var i genomsnitt SC elasticitetsmodul, E _SC, avsatt mot torktid under en 15 h period. (B) Genomsnittlig sammandragande tork stress, P _SC, avsatt mot torktid under en 15-timmarsperiod."_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I den här artikeln beskriver vi en teknik som kan användas för att mäta den dynamiska tork beteende och mekaniska egenskaper av mänsklig SC. Tidigare studier har visat att denna teknik kan användas för att kvantifiera effekterna av miljöförhållanden och kemiska produkter som vanligen används i kosmetiska rengöringsmedel och moisturizers på den dynamiska torkbeteende SC ^{7, 8.} Det finns ett antal viktiga steg i protokollet. För det första, SC sväller särskilt med vatteninnehåll; därför mätningar av SC tjocklek såväl som i planet förskjutningar är viktigt för att noggrant förutsäga elasticitetsmodulen och torkning spännings magnitud. För det andra prover behöver vara helt vidhäftas till substratet. Ofullständig adhesion, icke-radiellt symmetriska prover eller prover med små revor eller hål bör undvikas eftersom de kommer att avsevärt påverka fördelningen av tork deformationer och de radiella förskjutningsprofilerna använderd för modellanpassning.

Tekniken kan användas om ett fuktighetsreglerande systemet inte är tillgängligt. Utan miljökontroll kommer vävnadsprover torka i laboratoriemiljö ^12. Som sådan bör laboratoriemiljön kontinuerligt övervakas och underhållas, som torkning beteende och repeterbarheten av resultaten kommer att påverkas av både dygns och säsongsmässiga variationer i temperatur och luftfuktighet.

För närvarande, är tekniken begränsad endast för prover som kan vidhäfta till substratet och inducerar deformationer inom elastomerfilmen. Medan tekniken kan lätt anpassas till testprover som undergår mindre i planet förskjutningar, genom att reducera substratet elasticitetsmodulen ^12, kommer resultat från prover som helt enkelt glida över substratet saknar mening.

Många in vivo och ex vivo tekniker som kan bedöma tork beteende och mekaniskegenskaper för SC har rapporterats ^{3, 8, 9, 10, 18, 19, 20, 21.} Men in vivo tekniker kan inte helt skilja mekaniska förändringar i SC från de underliggande epidermala och dermala skikten. Dessutom kan ex-vivo-tekniker vanligtvis bara bedöma ett prov per experiment. Den metod som vi rapporterar i denna artikel kan upp till 6 SC prover som skall bedömas per experiment. Storleken på substratet och miljökammaren men kan skalas upp för att möjliggöra fler prover som skall bedömas samtidigt. Vi uppskattar för n = 6 SC prover, en tidsplan för ~ 13 timmar krävs för beredning och testning, exklusive substrat härdning och vävnads jämvikt. I jämförelse, uppskattar vi enaxlig tensometry testning skulle kräva merän två gånger denna period. Betydligt mindre SC vävnad krävs också per enskilt prov (0,28 cm ²⁾ i jämförelse med de som krävs för tensometry ⁹ (2,5 cm ^2). Denna teknik möjliggör mer fysiologiskt relevant torkning ytterligare genom att förhindra avdunstning från undersidan av SC vävnad. Förutom att bedöma torkning beteende och mekanik i SC, tror vi att denna teknik kan också tillämpas på studier av polymera eller kolloidala system som bildar en sammanhängande film vid torkning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicone elastomer base	Dow-Corning	1064291
Silicone elastomer Curing Agent	Dow-Corning	1015311
FluoSpheres Carboxylate 0.1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8803
FluoSpheres Carboxylate 1 µm yellow green fluorescent 505/515	Thermo Fisher	F8823
FluoSpheres Carboxylate 1 µm nile red fluorescent 535/575	Thermo Fisher	F8819
Trypsin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	T6567
Trypsin inhibitor type II-s	Sigma-Aldrich	T9128
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0294
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P7059
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	E7750
Vortexer mixer	VWR	58816-123
6 mm diameter hole punch	Sigma-Aldrich	Z708860
SOLA 6-LCR-SB	Lummencor light engine	No.3526
Cfi Plan Achro Uw 1X Objective	Nikon Plan UW	MRL00012
CFI Plan Fluor 40X Oil Objective 1.3 na - 0.20 mm wd	Nikon Plan Fluor	MRH01401
Nikon Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon	MEA53200
Clara-E Camera	Andor	DR-328G-C02-SIL
Remote Focus Attachment E-RFA Ergo Design	Nikon	99888
Ti-S-E Motorized Stage	Nikon	MEC56110