Summary
स्थिर और एक अमाइन-रिएक्टिव प्रोटीन पार लिंकर एक उपन्यास दो आयामी पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए युग्मित का उपयोग कर असंशोधित ऊतक lysate से देशी प्रोटीन परिसरों को अलग करने के लिए एक विधि (पृष्ठ) प्रणाली प्रस्तुत किया है।
Abstract
वहाँ शुद्ध और एकल प्रोटीन और पेप्टाइड्स के अध्ययन के लिए कई अच्छी तरह से विकसित तरीके हैं। हालांकि, सबसे सेलुलर कार्यों बातचीत प्रोटीन परिसरों का नेटवर्क है, जो अक्सर जांच के लिए अपने बाध्यकारी क्योंकि गैर सहसंयोजक और आसानी से शोधन तकनीक से परेशान है मुश्किल हो जाता है के द्वारा किया जाता है। इस काम को स्थिर करने और दो आयामी पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर असंशोधित ऊतकों से देशी प्रोटीन परिसरों को अलग करने की एक विधि का वर्णन है। ऊतक lysate एक गैर denaturing नीली देशी पॉलीएक्रिलमाइड जेल पर लोड किया जाता है, तो एक विद्युत प्रवाह जब तक प्रोटीन जेल में कुछ ही दूरी पर माइग्रेट करती लागू किया जाता है। जेल माइग्रेट प्रोटीन युक्त पट्टी तो excised और एमाइन प्रतिक्रियाशील पार जोड़ने अभिकर्मक dithiobis (succinimidyl प्रोपियोनेट) है, जो सहसंयोजक प्रोटीन परिसरों स्थिर साथ इनक्यूबेट है। जेल पार से जुड़े परिसरों युक्त पट्टी फिर एक सोडियम dodecyl सल्फेट पॉलीएक्रिलमाइड जेल में डाला जाता है, और टीवह परिसरों पूरी तरह से अलग होती है। विधि तकनीक और सबसे आण्विक जीव विज्ञानियों के लिए परिचित सामग्री पर निर्भर करता है, जिसका अर्थ यह सस्ती और जानने के लिए आसान है। यह पर्याप्त रूप से बहुत बड़ी परिसरों को अलग करने की क्षमता में सीमित है, और सार्वभौमिक सफल नहीं किया गया है, वहीं विधि अच्छी तरह से अध्ययन किया परिसरों की एक विस्तृत विविधता पर कब्जा करने में सक्षम था, और संभावना ब्याज की कई प्रणालियों के लिए लागू है।
Introduction
सामान्य सेलुलर समारोह प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्य क्रिया 1, 2 पर निर्भर है। नतीजतन, मानव रोगों अक्सर विधानसभा और विभिन्न प्रोटीन परिसरों 3 के व्यवहार में अव्यवस्थाएं द्वारा चिह्नित हैं। इस तरह बातचीत को चिह्नित करने की क्षमता इसलिए महत्वपूर्ण है। इन मुलाकातों का पता लगाने के वर्तमान साधन लक्ष्य प्रोटीन, अक्सर उनके बातचीत भागीदारों की पुल-डाउन के बाद की शुद्धि की आवश्यकता है। पारंपरिक शोधन अंतर centrifugation, वर्षा, और / या क्रोमैटोग्राफी 4 द्वारा पूरा किया है। इन विधियों, समय लेने वाली हैं प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन के लिए बदल दिया जाना चाहिए, और अक्सर कम पैदावार में परिणाम। आधुनिक शुद्धि के तरीकों, एक पर कब्जा अणु 5 के लिए बाध्य मोती के साथ भरी हुई स्तंभों पर पेप्टाइड टैग की संलयन प्रोटीन लक्षित करने के लिए, प्रतिरक्षक अवक्षेपण या निकासी के बाद शामिल"> 6। हालांकि यह कई प्रोटीन के एक्स्टेंसिबल है, यह लक्ष्य के अनुक्रम संशोधन की आवश्यकता है, संभवतः निर्माणों कि अपने सामान्य बाध्यकारी भागीदारों के लिए आत्मीयता में अलग हो जाती है। कुछ प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्य क्रिया के नाजुक प्रकृति का मतलब है इस विधि लागू नहीं किया जा सकता कई स्थितियों के लिए। इसके अतिरिक्त, पुल-डाउन प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्य क्रिया मैप करने के लिए इस्तेमाल किया assays एक सटीक सेलुलर चित्र स्वतंत्रता और चारा प्रोटीन की गैर देशी स्तरों में से प्रतिबंधित डिग्री की वजह से कैप्चर नहीं कर सकते,।
आदर्श रूप में, प्रोटीन परिसरों, उनके मूल राज्यों में पता लगाया जा सकता है शुद्धि या पुल-डाउन की आवश्यकता के बिना। ब्लू देशी पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन-पृष्ठ) सोडियम dodecyl सल्फेट पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) के लिए एक कम denaturing विकल्प के रूप में विकसित की है, और जैविक नमूनों 7 से कुछ प्रोटीन और परिसरों में से अलग होने के लिए अनुमति देता है किया गया था। हालांकि, बी एन-पृष्ठ में प्रोटीन एक lar के आधार पर अलगआकार, प्रभारी, तीन आयामी संरचना, और संघ अन्य अणुओं के साथ सहित चर, की जीई संख्या। इन कारकों में से बातचीत अक्सर प्रोटीन की सह-जुदाई, कुल गठन, और गरीब प्रोटीन बैंड संकल्प में परिणाम। दो आयामी देशी-पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन इन समस्याओं को 8 में से कुछ का समाधान करता है, लेकिन सभी नहीं,।
देशी जुदाई से संबंधित जटिलताओं को नाकाम करने के लिए, कुछ लेखकों ऐसे dithiobis (succinimidyl प्रोपियोनेट) के रूप में एमाइन प्रतिक्रियाशील पार जोड़ने अभिकर्मकों, (डीएसपी), का उपयोग ऊतक lysates 4 में प्रोटीन परिसरों पर कब्जा करने की। ये इलाज किया lysates तो विकृत और, एसडीएस-पृष्ठ से अलग कर दिया, जबकि देशी आकार और प्रोटीन परिसरों का मेकअप संरक्षण किया जा सकता है। हालांकि, बाद से क्रॉस-लिंकिंग अभिकर्मकों और ऊतक lysates में प्रोटीन एक से दूसरे अणु की निकटता के आधार पर प्रतिक्रिया आजादी के कई डिग्री है और प्रसंभात्य बातचीत कर सकते हैं, अविशिष्ट पृष्ठभूमि पार-linking ज्यादा हो सकती है, विशेष रूप से ध्यान केंद्रित किया नमूनों में। यह कठिन व्याख्या परिणाम मिल सकते हैं।
यहाँ, हम एक संकर बी एन-पृष्ठ / एसडीएस-पृष्ठ पद्धति के उपयोग का प्रदर्शन,, multimer-पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (multimer-पृष्ठ) करार दिया अलग और जटिल मिश्रण में प्रोटीन विधानसभाओं पता लगाने के लिए। प्रारंभ में, सेल lysate बी एन-पृष्ठ के माध्यम से पॉलीएक्रिलमाइड जेल में निलंबित कर दिया है। lysate युक्त जेल तो क्रॉस-लिंकिंग अभिकर्मक डीएसपी के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहा है। छद्म स्थिर और थोड़ा जेल जुदा हो गए, प्रोटीन बहुत कम nonspecifically प्रतिक्रिया की संभावना है, जिसका अर्थ है पृष्ठभूमि पार लिंकर प्रतिक्रियात्मकता कम है। क्रॉस-लिंकिंग के बाद, जेल बैंड excised और एसडीएस-पृष्ठ के माध्यम से अलग होती है। उसके एवज में जेल तो आम तौर पर पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ जुड़े किसी भी तरह से विश्लेषण किया जा सकता। इस विधि अतिरिक्त शुद्धि या पुल डो की आवश्यकता के बिना, जुदाई और असंशोधित ऊतक lysate में देशी प्रोटीन परिसरों का पता लगाने के लिए अनुमति देता हैएन।
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Protocol
1. ऊतक तैयारी
- 4x बी एन-पृष्ठ नमूना बफर (200 मिमी बीआईएस (2-hydroxyethyl) एमिनो Tris (hydroxymethyl) मीथेन (बीआईएस Tris), 200 मिमी NaCl, 40% w / v ग्लिसरॉल, 0.004% एस काकरेज़ी, पीएच 7.2 के 10 एमएल तैयार करें )।
नोट: यह स्टॉक समाधान अग्रिम में किया और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। - में 750 μL DH 2 1x वाणिज्यिक प्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल युक्त हे 4x नमूना बफर के 250 μL पतला। भंवर और बर्फ पर ठंड।
- एक साफ Dounce homogenizer के 30 स्ट्रोक के साथ 1 एमएल 1x ठंडा बी एन-पृष्ठ नमूना बफर में लक्ष्य ऊतक के 20 मिलीग्राम homogenize।
नोट: इस प्रदर्शन प्रयोग के लिए, लक्ष्य ऊतक पूरी चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों है। एकरूपता के बाद, नमूने solubilize और झिल्ली प्रोटीन के वैद्युतकणसंचलन की अनुमति के लिए हल्के डिटर्जेंट जैसे 2% digitonin के साथ इलाज किया जा सकता है। - 14,000 XG पर एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए homogenate, और अपकेंद्रित्र स्थानांतरण 30 मिनट अघुलनशील सेलुलर सामग्री गोली के लिए। afteआर centrifugation, बर्फ पर एक साफ ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला छानना।
- bicinchoninic एसिड (बीसीए) या इसी तरह के प्रोटीन quantitation परख का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए निर्माता निर्देशों का पालन करें।
- homogenate नमूना (रों) डिटर्जेंट शामिल हैं, जलीय घोल 0.25% Coomassie के लिए homogenate समाधान लाने के लिए पर्याप्त में 5% Coomassie ब्लू जी 250 की मात्रा में जोड़ें।
2. बी एन-पृष्ठ
- पतला 25 एमएल 20x नीले देशी (बी एन) में बफर स्टॉक (1.0 एम बीआईएस Tris, 1.0 एम tricine, पीएच 6.8) वैद्युतकणसंचलन 475 मिलीलीटर DH 2 0.002% Coomassie ब्लू युक्त 1x चल बफर के 500 एमएल बनाने के लिए हे।
- अगर नमूने डिटर्जेंट होते हैं, बजाय 1x चल बफर 0.02% Coomassie युक्त के 250 एमएल और एक अन्य 250 एमएल कोई भी युक्त हैं।
- चिल बफर (रों) 4 डिग्री सेल्सियस के लिए।
- साफ है और एक पॉलीएक्रिलमाइड जेल निर्माता के निर्देशों के अनुसार कैसेट डालने का कार्य इकट्ठा।
- बाद जैल polymerized है, DH 2 हे के साथ कैसेट कुल्ला और निर्माता के निर्देशों के अनुसार वैद्युतकणसंचलन तंत्र को इकट्ठा।
- अच्छी तरह कंघी निकालें और 1x बी एन-पृष्ठ चल रहा है बफर के साथ कुओं भरें। बफर के साथ पूरे भीतरी कक्ष भरने जब तक नमूने लोड किए गए हैं से बचें।
- अगर नमूने डिटर्जेंट होते हैं, जिसमें 0.02% Coomassie ब्लू बफर के साथ कुओं भरें।
नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर चरणों 2.7-2.9 निष्पादित करें।
- अगर नमूने डिटर्जेंट होते हैं, जिसमें 0.02% Coomassie ब्लू बफर के साथ कुओं भरें।
- जेल लोडिंग सुझावों का उपयोग करना, वांछित कुओं में प्रोटीन की 20 माइक्रोग्राम युक्त homogenate के एक मात्रा विंदुक। किसी भी अप्रयुक्त कुओं में 1x बी एन-पृष्ठ नमूना बफर के एक बराबर मात्रा पिपेट।
नोट: में जोड़ने के लिए homogenate के उचित मात्रा की गणना करने के बीसीए परख से निर्धारित प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग करेंकुओं। - बाद नमूने लोड किए गए हैं, 1x बी एन-पृष्ठ चल रहा है बफर के साथ भीतरी कक्ष भरें। यकीन है कि जेल पूरी तरह से बफर में डूबे हुए है रहो। इसके बाद, स्तर निर्माता ने संकेत दिया करने के लिए 1x चल बफर के साथ बाहरी कक्ष भरें।
- अगर नमूने डिटर्जेंट होते हैं, जिसमें 0.02% Coomassie ब्लू 1x बफर, और डाई से मुक्त 1x चल बफर के साथ बाहरी कक्ष के साथ भीतरी कक्ष भरें।
- बिजली की आपूर्ति करने के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें, और 150 वी पर जेल में प्रोटीन Electrophorese जब तक डाई बैंड 2 सेमी की प्रगति ~ परत को हल करने में। बंद करो और बिजली की आपूर्ति काट दें।
3. क्रॉस-लिंकिंग
नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर कदम 3.1-3.6 निष्पादित करें।
- वैद्युतकणसंचलन तंत्र एकत्रित न, और अलग जेल कैसेट की कांच शीशे। निकालें और स्टैकिंग परत त्यागें।
- ध्यान से सिर्फ डाई सामने के निचले किनारे से नीचे जेल काट दिया। लेनाइस कटौती के रूप में चिकनी और सीधे रूप में संभव बनाने के लिए परवाह है, और फिर जेल के अप्रयुक्त टुकड़ा त्यागें। यह एक ~ 2 सेमी चौड़ा, पॉलीएक्रिलमाइड जेल की क्षैतिज पट्टी है, जो homogenate नमूना में सभी प्रोटीन में शामिल होंगे छोड़ देंगे।
- जेल पट्टी के किनारों के साथ किसी भी अप्रयुक्त भाग दूर ट्रिम।
- ध्यान से एक छोटे कंटेनर में 10 एमएल फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में पट्टी रखें, और धीरे 30 मिनट के लिए संतुलित करने के लिए शिखावर्तन द्वारा मिश्रण।
- संतुलन के बाद, त्यागने और एक अन्य 10 एमएल के साथ पीबीएस बदलें। पिपेट 500 25 μL मिमी डीएसपी पीबीएस में डाइमिथाइल sulfoxide में भंग कर दिया है, और 30 मिनट के लिए के रूप में ऊपर (कदम 3.4) मिश्रण जारी है।
- डीएसपी समाधान बंद डालो। unreacted डीएसपी बुझाने के लिए 0.375 एम Tris 2% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) युक्त (hydroxymethyl) aminomethane हाइड्रोक्लोराइड (Tris-एचसीएल), पीएच 8.8, के 10 एमएल जोड़ें। 15 मिनट के लिए शिखावर्तन जारी रखें।
4. एसडीएस-पृष्ठ
- जेल पट्टी बुझाने जाता है, एसडीएस-पीए तैयारजीई जेल समाधान मानक तरीकों 9 के अनुसार। बहुलकीकरण अभिकर्मकों न जोड़ें।
- बुझाने के बाद, कमरे के तापमान को ΒΝ जेल पट्टी लौटने के लिए, और एक नई जेल कैसेट में पट्टी डाली।
- ऐसा करने के लिए, ध्यान से जेल ले सकते हैं और एक साफ जेल कैसेट स्पेसर प्लेट पर रखें।
- ओरिएंट पट्टी तो डाई सामने के नीचे (नई कैसेट के शीर्ष यानी, पक्ष है कि बी एन-पृष्ठ दौरान दूर कूच नई कैसेट के शीर्ष के सबसे करीब जाना चाहिए के सबसे नजदीक है, जेल पट्टी को पहली से फ़्लिप किया जाना चाहिए ओरिएंटेशन)। 3 चित्र देखें।
- पट्टी ऐसी है कि इसके ऊपरी किनारे यहां तक कि जहां कवर प्लेट के ऊपरी किनारे हो जाएगा के साथ निहित है जगह (यानी, यह नई जेल के शीर्ष पर हो जाएगा)। यकीन है कि डाई सामने गिलास प्लेट की क्षैतिज किनारों के समानांतर है बनाओ।
- स्पेसर दीवारों में से एक के खिलाफ excised पट्टी के एक तरफ पुश, टी पर कक्ष छोड़नेवह जेल के लिए दूसरे पक्ष डाला जा करने के लिए और एक प्रोटीन मानक या सीढ़ी लोड करने के लिए।
- जेल पट्टी के निचले किनारे किसी भी दांतेदार या असमान क्षेत्रों शामिल हैं, तो ध्यान से उन्हें दूर काटा। वर्तमान है, वे जेल के दौरान जाल बुलबुले डालने का कार्य होगा।
- एक बार जेल पट्टी सही ढंग से रखा जाता है, स्पेसर प्लेट पर कवर प्लेट करना। किसी भी फंस हवाई बुलबुले बाहर पुश करने के लिए कोमल दबाव लागू करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल डालने का कार्य उपकरण इकट्ठा करने के लिए जारी रखें।
- हल करने जेल बफर करने के लिए बहुलकीकरण अभिकर्मकों जोड़ें, और तैयार जेल कैसेट में डाल, एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग कर। excised बी एन-पृष्ठ जेल पट्टी के नीचे ~ 2 सेमी जेल कैसेट भरें, स्टैकिंग परत के लिए कमरा छोड़ने के लिए।
- डाला जेल के शीर्ष पर 100 μL butanol जोड़ें, और हल करने की परत की बहुलकीकरण के लिए 30 मिनट के लिए अनुमति देते हैं। butanol बंद डालो।
- स्टैकिंग जेल समाधान के लिए बहुलकीकरण अभिकर्मकों जोड़ें। एक serolog का उपयोग करनाiCal पिपेट, स्टैकिंग परत डालना जेल कैसेट में सभी शेष खाली जगह को भरने के लिए।
- जेल कैसेट झुकाएँ तक क्रमबद्धता परत तो यह जेल पट्टी के नीचे अंतरिक्ष भरता है, और हवा के बुलबुले फंस नहीं कर रहे हैं डाल दिया जाता है।
- स्टैकिंग जेल बफर जेल पट्टी के नीचे खाली जगह भर जाता है, धीरे-धीरे स्तर स्तर को जेल कैसेट वापस जाएँ।
- लगभग अतिप्रवाह, स्टैकिंग जेल बफर के साथ excised जेल पट्टी के बगल में खाली जगह को भरने के लिए जब तक जारी रखें।
- स्टैकिंग परत 30 मिनट के लिए भाजन करने की अनुमति दें।
नोट: जबकि जेल polymerizing है 10x एसडीएस-पृष्ठ चल रहा है बफर (250 मिमी Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris), 1.9 एम ग्लाइसिन, 1% एसडीएस) बनाओ। यह भी पहले से बने होते हैं और कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता। - 450 एमएल DH 2 हे में 50 एमएल 10X एसडीएस-पृष्ठ चल बफर स्टॉक पतला 1x काम कर बफर बनाने के लिए।
- बाद स्टैकिंग परत polymerized है, घनघोर से जेल कैसेट को दूरउपकरण, DH 2 हे के साथ कुल्ला, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार वैद्युतकणसंचलन तंत्र को इकट्ठा।
- 1x एसडीएस-पृष्ठ चल रहा है बफर के साथ पूरी तरह से भीतरी कक्ष भरें, इसके बाद के स्तर का निर्माता ने संकेत दिया करने के लिए बाहरी कक्ष भरें।
- एक आणविक भार सीढ़ी या उचित प्रोटीन मानक के साथ excised जेल पट्टी के बगल में अंतरिक्ष लोड करें।
- बिजली की आपूर्ति करने के लिए इलेक्ट्रोड संलग्न, और 120 वी पर नमूने Electrophorese जब Coomassie डाई जेल बंद चलाता है, बंद करो और बिजली की आपूर्ति काट दें।
- जेल एंटीबॉडी बाध्यकारी 10 से electroblotting और प्रोटीन का पता लगाने के मानक तरीकों का उपयोग कर विश्लेषण करें।
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Representative Results
इस प्रदर्शन के प्रयोग में, multimer-पृष्ठ पूरे चूहे के मस्तिष्क lysate पर प्रदर्शन किया था। उसके एवज में अलग प्रोटीन polyvinylidene diflouride (PVDF) झिल्ली पर मिट, और फिर प्रोटीन परिसरों के लिए फार्म में जाना जाता है के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच कर रहे थे। चित्रा 1 दो तरह से प्रोटोकॉल की एक मान्यता को दर्शाता है। सबसे पहले, हम दिखाना है कि पार से जुड़े प्रोटीन, एक को कम करने के एजेंट के अलावा द्वारा cleavable हैं जिसका अर्थ है मनाया उच्च आणविक भार प्रजातियों पार जोड़ने अभिकर्मक से बनते हैं, और प्रोटोकॉल (चित्रा 1 ए) के किसी अन्य घटक के कारण नहीं हैं । दूसरा, हम दिखाना है कि क्रॉस-लिंकिंग, डिटर्जेंट (चित्रा 1 बी) के अलावा के प्रति संवेदनशील है, जिसका अर्थ है क्रॉस-लिंकिंग complexed प्रोटीन के लिए विशिष्ट और उस यादृच्छिक जेल पर निकटता बंद की वजह से कम से कम है वे प्रतिक्रियाओं है। चित्र 2 यह दर्शाता है कि विधि resp पर कब्जा करने में विफल रहता हैiratory जटिल द्वितीय, लेकिन अन्यथा दोनों घुलनशील और झिल्ली से बंधा परिसरों पर कब्जा करने के लिए व्यापक लागू है।
चित्र 1: multimer-पृष्ठ विधि का सत्यापन। (ए) में जेल डीएसपी के साथ पार जोड़ने के द्वारा प्रोटीन परिसरों की कैद dithiothretol (डीटीटी) द्वारा दरार के प्रति संवेदनशील है। Multimer-पृष्ठ (A1) के बिना या के साथ पूरे चूहे के मस्तिष्क lysate पर प्रदर्शन किया गया था (A2) 5 मिमी Tris / एसडीएस बुझाने समाधान में शामिल dithiothretol। जेल PVDF झिल्ली पर electroblotted किया गया था, और उसके बाद kinesin भारी श्रृंखला के लिए जांच की। एक उच्च आणविक भार बैंड दोनों झिल्ली पर मनाया जाता है, संभावना है सभी या kinesin मोटर प्रोटीन परिसर का हिस्सा करने के लिए इसी। एक अतिरिक्त बैंड 126 केडीए डीटीटी का इलाज दाग पर, kinesin भारी श्रृंखला पेप्टाइड की आणविक द्रव्यमान में होने वाली है। Dithiothreitol एक कम करने एजेंट है, और करोड़ रिवर्स करने में सक्षम हैडीएसपी में डाइसल्फ़ाइड बांड वर्तमान cleaving द्वारा ओएसएस-लिंकिंग। kinesin कुल इसलिए डीटीटी द्वारा दरार के प्रति संवेदनशील है। (बी) प्रोटीन जटिल कब्जा डिटर्जेंट denaturing के अलावा के प्रति संवेदनशील है। Multimer-पृष्ठ पाठ में वर्णित के रूप में एसडीएस (बाएं) या ट्राइटन X-100 (दाएं) lysate नमूने में जोड़ा गया था, और फिर बर्फ पर इनक्यूबेट की बढ़ती मात्रा (0 2%) को छोड़कर, पूरे चूहे के मस्तिष्क lysate पर प्रदर्शन किया गया था पहले जेल लोड करने से पहले 30 मिनट के लिए। अंतिम जैल PVDF झिल्ली पर मिट, और α-synuclein के लिए जांच कर रहे थे। बढ़ती आणविक भार के कम से कम तीन बैंड मनाया जाता है, अ-synuclein को मोनोमर, टेट्रामर और octamer क्रमश: इसी। oligomeric बैंड के संकेत तीव्रता में वृद्धि डिटर्जेंट एकाग्रता के साथ कम होती है, यह दर्शाता है कि पार से जोड़ने प्रभावकारिता देशी प्रोटीन रचना की निर्भर है। VI के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण EW।
चित्र 2: multimer-पृष्ठ का उपयोग कर प्रोटीन परिसरों पर कब्जे का प्रदर्शन। (ए) घुलनशील और झिल्ली से बंधा प्रोटीन परिसरों (ए) पूरे चूहे के मस्तिष्क lysate या (बी) lysate, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2% digitonin साथ इनक्यूबेट पाठ में वर्णित के रूप में multimer-पृष्ठ प्रदर्शन से से कब्जा कर लिया गया। जैल तो मिट गया और PVDF झिल्ली विभिन्न परिसरों में से घटकों के लिए जांच की। उच्च आणविक भार प्रजातियों झिल्ली acetylated ट्यूबिलिन, जो सूक्ष्मनलिकाएं स्थिर करने के लिए जाना जाता है के लिए जांच पर मनाया जाता है। Dynein और kinesin बहु सबयूनिट 1.5 एमडीए और 380 केडीए, क्रमशः की आणविक वजन के साथ मोटर प्रोटीन परिसरों हैं। झिल्ली इन परिसरों में घटकों के लिए मिट उच्च आणविक भार प्रजातियों दिखा। इसके अलावा, multimer-पृष्ठ सफलतापूर्वक गHSP90 डिमर aptured। अ-synuclein रूपों tetramers और octamers, साथ ही न्यूरोटोक्सिक उच्च आणविक भार oligomers। octamer और उच्च वजन प्रजातियों में से एक लकीर मिट झिल्ली पर देखा जाता है। VDAC dimerization भी मनाया जाता है। उच्च आणविक भार प्रजातियों झिल्ली माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों मैं और चतुर्थ के घटकों के लिए मिट पर पाया जाता है। हालांकि, झिल्ली SDHA, जटिल द्वितीय के एक सदस्य के लिए मिट, कोई भी उचित उच्च आणविक भार बैंड प्रदर्शित नहीं करता है। AcetTUB: acetylated α ट्यूबिलिन; βTUB: β ट्यूबिलिन; Dynein: dynein भारी श्रृंखला; HSP90: गर्मी झटका प्रोटीन 90; Kinesin: भारी श्रृंखला kinesin; NDUFS3: माइटोकॉन्ड्रियल परिसर का लोहा सल्फर केंद्र 3 मैं; VDAC: Porin; SDHA: माइटोकॉन्ड्रियल जटिल द्वितीय के succinate डिहाइड्रोजनेज; COXIV: माइटोकॉन्ड्रियल जटिल चतुर्थ के साइटोक्रोम ग oxidase। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: जनरल multimer-पृष्ठ प्रवाह संचित्र। (ए) इस तरह के बी एन-पृष्ठ नमूना बफर में homogenizing के रूप में गैर denaturing तरीकों का उपयोग कर तैयार ऊतक lysate। (बी) बी एन-पृष्ठ जेल में पिपेट lysate, तो बी एन-पृष्ठ चल बफर में वैद्युतकणसंचलन (150 वोल्ट) प्रदर्शन करते हैं। नमूना हल करने जेल में 2 सेमी विस्थापित करने के लिए जब तक डाई सामने माइग्रेट कर लिया है ~ की अनुमति दें। (सी) स्टैकिंग परत और हल करने परत के अप्रयुक्त भाग निकालें। (डी) पीबीएस में जेल पट्टी डूब, और 30 मिनट के लिए मिलाते हुए के साथ संतुलित करना। (ई) पीबीएस निकालें, और पीबीएस में जेल पट्टी युक्त 2.5 मिमी डीएसपी फिर से डूब। 30 मिनट के लिए हिला। (एफ) डीएसपी समाधान निकालें, फिर फिर से डूब 375 मिमी Tris में जेल पट्टी 2% एसडीएस युक्त, और 30 मिनट के लिए हिला। जेल पट्टी में मौजूद परिसर अब क्रॉस द्वारा स्थिर रहे हैंरों जोड़ने। (G) घुमाएँ जेल 180 ° पट्टी और एक नया एसडीएस-पृष्ठ जेल में डाला। दोनों stacking और परतों को हल करने में शामिल हैं। (एच) वैद्युतकणसंचलन (120 वोल्ट) द्वारा नमूना का समाधान करें। (आई), जेल पट्टी और स्टैकिंग परत निकाल तो आवश्यक के रूप में परत को हल करने का विश्लेषण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्य क्रिया हर काम जीवित चीजों बाहर ले जाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस वजह से, वे गहन जांच और अनुसंधान के अधीन हैं। Multimer-पेज, पर कब्जा करने को अलग करने, और प्रोटीन परिसरों की एक विस्तृत श्रृंखला का विश्लेषण के लिए एक उपन्यास विधि है। हम पहले से रोग से जुड़े प्रोटीन α-synuclein 11 की oligimerization का अध्ययन करने के लिए अपने प्रयोज्यता प्रदर्शन किया है। हालांकि, यह कई प्रोटीन परिसरों को एक्स्टेंसिबल के रूप में चित्रा 2 में प्रदर्शन किया है। प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करने के अन्य तरीकों की तुलना में, multimer-पृष्ठ अपनी सादगी और संक्षिप्तता की वजह से लाभदायक है। ऊतक के नमूने से समय पूरी तरह से अलग करने के लिए एसडीएस जेल लगभग 8 घंटे है। के बाद से पता लगाने ठेठ वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा किया जा सकता, प्रोटोकॉल का पता लगाने सीमा पुल डाउन प्रयोगों से जुड़े लोगों से काफी कम के साथ, असंशोधित ऊतक lysate पर किया जा सकता। साथ ही, सबसे अच्छी तरह से सुसज्जित आणविक जीव विज्ञान laboratories थोड़ा अग्रिम निवेश के साथ तकनीक प्रदर्शन करने के लिए सक्षम हो जाएगा। के रूप में बाद में चर्चा की है, multimer-पृष्ठ से संबद्ध चुनौती के सबसे समस्या निवारण और प्रत्येक प्रोटीन काम्प्लेक्स का अध्ययन करने के लिए विधि के अनुकूलन के साथ आता है।
multimer-पृष्ठ सबसे आण्विक जीव विज्ञानियों के लिए सुलभ होना चाहिए, वहीं इसकी सफलता शोधकर्ता के कौशल और अनुभव पर निर्भर है। गंभीर, काटने और नई एसडीएस जेल में बी एन जेल पट्टी के फिर से कास्टिंग सावधानी से किया जाना चाहिए। यह जेल पट्टी उन्मुख करने के लिए इतना है कि वैद्युतकणसंचलन समानांतर बैंड में एसडीएस जेल में स्थानांतरित करने के लिए प्रोटीन का कारण बनता है महत्वपूर्ण है। जेल पट्टी कुटिल डाली है, तो प्रोटीन बैंड एक दूसरे में विस्थापित करेगा और डेटा खो जाएगा। विशेष रूप से बड़ी परिसरों के लिए, एसडीएस-पृष्ठ जेल में कास्टिंग से पहले जेल पट्टी घूर्णन इसी तरह महत्वपूर्ण है। इस बड़े परिसरों, जो बी एन-पृष्ठ जेल में बहुत दूर चले गए नहीं हो सकता है, और अधिक समय देता है को हल करने लेय में खींच लिया जा करने के लिएएसडीएस-पृष्ठ जेल के आर। महत्वपूर्ण रूप से, क्रॉस-लिंकिंग की वजह से प्रोटीन आकार और शारीरिक विशेषताओं में परिवर्तन भी विश्लेषण दौरान विचार किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, इस तरह के α-synuclein के रूप में कुछ कम आणविक भार प्रोटीन,, अच्छी तरह से PVDF झिल्ली पर बनाए रखा नहीं कर रहे हैं, लेकिन उनके पार से जुड़े oligomers 12 कर रहे हैं। यह तुलनात्मक विश्लेषण को उलझाने सकते हैं, और ध्यान में रखा जाना चाहिए।
जब पहली बार के लिए multimer-पृष्ठ से एक जटिल अलग है, यह विधि मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम तीन सत्यापन / समस्या निवारण परीक्षण सुझाव देते हैं। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करें कि ब्याज की पेप्टाइड जेल पट्टी के छांटना तक multimer-पृष्ठ प्रोटोकॉल का पालन करते हुए बी एन जेल में माइग्रेट करती है, तो, रोक PVDF झिल्ली पर पट्टी दाग, और ब्याज की सबयूनिट के लिए जांच। अगर कोई संकेत है, जटिल होने की संभावना बी एन जेल में प्रवास नहीं था, जिसका अर्थ यह अधिक झरझरा किया जाना चाहिए, या नमूना निराकरण में आगे विस्थापित करने के लिए अनुमति दी जानी चाहिएआईएनजी परत। एक संकेत की उपस्थिति की पुष्टि कि कम से कम अनबाउंड सबयूनिट जेल में चले गए। इस स्तर पर, यह पूरा परिसर की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए मुश्किल हो जाएगा। सबयूनिट के सबूत बी एन जेल पट्टी में पाया जाता है, तो दूसरे टेस्ट पर आगे बढ़ें। एक क्रॉस-जोड़ने कदम बिना multimer-पृष्ठ को पूरा करें तो PVDF झिल्ली और सबयूनिट के लिए जांच पर दाग। सबयूनिट एसडीएस की उपस्थिति में denature और एसडीएस जेल में सामान्य रूप से माइग्रेट कर लेना चाहिए। यदि यह नहीं होती है, वहाँ की संभावना शोधकर्ता तकनीक के साथ कुछ समस्या है। बी एन जेल पट्टी खराब कटौती दी गई हो, कुछ प्रोटीन पीछे छोड़, या एसडीएस जेल गलत ढंग से कास्ट किया गया है। अंत में, एक शामिल पार लिंकर दरार कदम के साथ multimer-पृष्ठ प्रदर्शन करते हैं, तो दाग और जांच, के रूप में चित्र 1 में चर्चा की। यह पुष्टि परिसर के एकत्रीकरण डीएसपी के अलावा की वजह से है, और नहीं multimer-पृष्ठ प्रोटोकॉल के किसी अन्य भाग के एक अप्रत्याशित परिणाम। दरार एक कम करने में परिणाम चाहिएडी-तीव्रता कुल बैंड और इमेजिंग पर एक वृद्धि-तीव्रता सबयूनेट मोनोमर बैंड। यदि कोई भी कुल बैंड सामान्य मल्टीमीयर-पेज से नहीं देखा जाता है, लेकिन डीएसपी साफ हो जाने पर मोनोमर बैंड तीव्रता में बढ़ जाता है, तो जटिल शायद इसे एसडीएस जेल में बना लेता है, लेकिन हल करने वाली परत में स्थानांतरित करने में असफल रहा।
अपने वर्तमान राज्य में, बहुपर-पृष्ठ कई प्रोटीन परिसरों पर लागू होता है, लेकिन यह एक आकार-फिट नहीं-सभी प्रोटोकॉल नहीं है। प्रत्येक परिसर की जटिलता के लिए इसे संशोधित करने की आवश्यकता है एक आम समस्या 2 चित्रा में प्रदर्शित की गई है: कब्जा किए गए कॉम्प्लेक्स अक्सर इतने बड़े होते हैं कि वे एसडीएस-पेज पर बमुश्किल माइग्रेट करते हैं यह एसडीएस जेल की चिपचिपापन को बदलकर या लंबी अवधि के लिए वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रबंधित किया जा सकता है। एक अतिरिक्त जटिलता जेल पर दो से अधिक बैंड की सामयिक उपस्थिति है। क्रॉस-लिंकर के साथ अपूर्ण प्रतिक्रिया से इंटरमीडिएट आणविक वजन बैंड 13 के वितरण में परिणाम हो सकता है। यह इसे अलग कर सकता हैनिर्धारित करने के लिए एक से अधिक बैंड physiologically महत्वपूर्ण oligomeric मध्यवर्ती, या आंशिक क्रॉस-लिंकिंग की बस अनपेक्षित परिणाम के प्रतिनिधि हैं कि क्या ficult। झिल्ली प्रोटीन है कि विश्लेषण से पहले solubilized किया जाना चाहिए के लिए, यह भी प्रभाव डिटर्जेंट की पसंद प्रोटीन परिसरों के व्यवहार पर है कि विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। झिल्ली प्रोटीन solubilize के लिए इस्तेमाल किया डिटर्जेंट बाध्यकारी भागीदारों के साथ उनकी रचना, संगठनों को प्रभावित करता है, और काम करता है 14, 15। डिटर्जेंट विकल्प भी प्रभावों पार जोड़ने 16 की प्रभावकारिता। इस प्रकार, यह है कि आदर्श solubilizing की स्थिति जटिल अध्ययन किया जा रहा साथ अलग अलग होंगे की संभावना है।
Multimer-पृष्ठ कभी कभी, एक जटिल पर कब्जा करने में विफल रहता है के रूप में चित्रा 2. Succinate डिहाइड्रोजनेज में SDHA धब्बा पर दिखाया जाता है 124 केडीए माइटोकॉन्ड्रियल परिसर द्वितीय, जो काफी छोटा है कि यह जेल में आसानी से आगे बढ़ना चाहिए है का हिस्सा है।यह नहीं पाया गया है कि इंगित करता है कि multimer-पृष्ठ पर कब्जा करने में असमर्थ था। इस तरह के मामलों में कई संभावित कारण हो सकते है। अधिकांश पार जोड़ने अभिकर्मकों दो प्रतिक्रियाशील समाप्त हो जाती है, जो एमिनो एसिड पक्ष श्रृंखला के साथ सहसंयोजक संबंधों फार्म में होते हैं। दक्षता, जिसके साथ पार जोड़ने अभिकर्मकों कब्जा प्रोटीन परिसरों प्रतिक्रियाशील अवशेषों के लिए अपनी पहुंच पर निर्भर है। डीएसपी के मामले में, क्रॉस-लिंकिंग विलायक उजागर प्राथमिक और माध्यमिक एलिफैटिक अमीनो समूहों, लाइसिन 17 की आम तौर पर ε अमीनो समूहों की acylation द्वारा पूरा किया है। लाइसिन अवशेषों सामान्य रूप से प्रोटीन सतह पर पाए जाते हैं, लेकिन हाइड्रोफोबिक केन्द्रों में अपने कभी ज़ब्ती पार जोड़ने 13 की दक्षता घट जाती है। जटिल द्वितीय के सब यूनिटों mitochondrial झिल्ली में दफनाये गए और डीएसपी के लिए दुर्गम रह सकती है, digitonin 18 के साथ solubilization के बाद भी। इस तरह के एमीलोयड oligome के रूप में बहुत बड़े और घनी पैकिंग परिसरों,रुपये भी पार जोड़ने अभिकर्मकों के लिए सतह लाइसिन अवशेषों की उपलब्धता सीमित हो सकती। नतीजतन, प्रोटीन विधानसभाओं के इन प्रकार multimer-पृष्ठ के साथ संगत नहीं हो सकता है। यह भी संभव है कि Coomassie ब्लू, जो हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों और धनायनित अवशेषों को बांधता है, कुछ मामलों में 19 पीबीएस और ब्लॉक क्रॉस-लिंकिंग में संतुलन के बाद lingers। यह कमी या multimer-पृष्ठ से प्रभावित oligomers का पता लगाने को खत्म हो सकता है। इस प्रकार, विधि सभी प्रोटीन संघों की विशेषताओं के लिए एक सार्वभौमिक परख नहीं है, और जहां quantitation में वांछित नहीं माना जाना चाहिए। हालांकि, multimer-पृष्ठ एक सस्ती, प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण करने के लिए अपेक्षाकृत तेजी से उपकरण है, और अन्य स्थापित साधन के साथ विचार किया जा सकता।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
एनआईएच / NIDA DA034783 द्वारा समर्थित। हम multimer-पृष्ठ के साथ तकनीकी सहायता के लिए ब्रायन A किललिंगर धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
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