Summary
stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.
Abstract
arındırıcı ve tek proteinler ve peptidler çalışmak için pek iyi gelişmiş yöntemler vardır. Bununla birlikte, en çok hücresel işlev, sıklıkla, kovalent olmayan ve kolay bir saflaştırma teknikleri ile bozulmuş olan bir bağlanma araştırılması için zor olan etkileşimli protein komplekslerinin ağlar tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu çalışma, stabilize edici ve iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez ile modifiye edilmemiş dokusundan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem tarif eder. Doku lisatı, protein jel içine kısa bir mesafede yer değiştirmektedir kadar sonra bir elektrik akımı uygulandığında, bir denatüre edici olmayan mavi doğal poliakrilamid jel üzerine yüklenir. Taşınan protein ihtiva eden jel şeridi daha sonra kesilmiş ve kovalent protein kompleksleri stabilize amin reaktif çapraz bağlama reaktifi ditiobis (sukinimidil propionat) ile inkübe edilir. çapraz bağlı kompleksler ihtiva eden jel şeridi daha sonra bir sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel içine dökülür, ve t,O kompleksleri tamamen ayrılır. yöntem ucuz ve öğrenmesi kolay, yani teknikleri ve en moleküler biyologlar için tanıdık malzemelere dayanır. yeterince aşırı büyük kompleksleri ayırmak için yeteneği sınırlıdır ve evrensel başarılı olmamıştır da, yöntem iyi çalışılmış komplekslerinin çeşitli yakalamak başardı ve ilgi birçok sistemde muhtemelen geçerlidir.
Introduction
Normal hücre fonksiyonlarını protein-protein etkileşimleri, 1, 2 bağlıdır. Bunun bir sonucu olarak, insan hastalıkları genellikle çeşitli protein kompleksleri 3 montajı ve davranış düzensizlik tarafından işaretlenir. Böyle etkileşimleri karakterize yeteneği dolayısıyla çok önemlidir. Bu etkileşimlerin tespit Mevcut araçları genellikle etkileşim ortakları çekme-aşağı ve ardından hedef proteinler, saflaştırılmasını gerektirir. Geleneksel saflaştırma diferansiyel santrifüj, çökeltme ve / veya kromatografi 4 ile gerçekleştirilir. Bu yöntemler zaman alıcıdır, her bir hedef protein için değiştirilmesi gerekir, ve genellikle düşük verimlerle sonuçlanabilir. Modern saflaştırma yöntemleri, bir yakalama molekülü 5 bağlanmış boncuklarıyla yüklenmiş sütunlar üzerinde bağışıklık çökeltmesi ya da ekstre proteinleri hedef peptid etiketleri kaynaşmasını içerenBu, bir çok proteinin şekilde uzatılabilir da "> 6., Potansiyel olarak her zamanki bağlanma partnerleri için afinite açısından farklılık yapılarda ortaya çıkan hedef sekansı, bir modifikasyonunu gerektirir. Bazı protein-protein etkileşimleri, hassas doğası, bu yöntem uygulanabilir olmayabilir demektir birçok senaryolara. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri eşleştirmek için kullanılan açılan tahliller nedeniyle özgürlük ve yem proteinin yerli olmayan seviyelerinin kısıtlı derecelerde, doğru bir hücresel resim toplayamaz.
İdeal olarak, protein kompleksleri saflaştırma veya çekme aşağı gerek kalmadan, doğal hallerine tespit edilebilir. Mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE), sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için daha az denatüre alternatif olarak geliştirilen ve biyolojik örnekler 7 bazı proteinler ve komplekslerin ayrılması için izin veriliyordu. Bununla birlikte, BN-PAGE'de proteinler lar göre ayırmakdiğer moleküllerle boyut, yük ve üç boyutlu yapı ve birlikte dahil olmak üzere değişkenlerin ge sayısı. Bu faktörlerin etkileşimler genellikle proteinlerin eş ayrılması, agregat oluşumu ve kötü protein bandı çözünürlüğü ile sonuçlanır. İki boyutlu yerli-poliakrilamid jel elektroforezi bu sorunların 8, hepsi bir giderir, ama.
Doğal ayrılması ile ortaya çıkan komplikasyonları aşmak için, bazı yazarlar, doku lysate'lerin 4 protein kompleksleri yakalamak için bu ditiyobis (süksinimidil propionat) gibi amin-reaktif çapraz bağlama reaktifleri, (DSP) kullanır. Bu muamele edilmiş Lizatlar daha sonra denatüre edilmiş ve protein kompleksleri doğal boyutu ve makyaj korurken, SDS-PAGE ile ayrılabilir. çapraz bağlama reaktifleri, doku lizatlarında başka bir molekülün yakınlığı ve proteinlere dayalı tepki Bununla birlikte, çok serbestlik derecelerine sahip ve stokastik, spesifik olmayan arka plan çapraz etkileşim-linking özellikle konsantre örneklerinde, yüksek olabilir. Bu zor-yorumlama sonuçlara yol açabilir.
Burada, bir hibrid BN-PAGE / SDS-PAGE yöntemiyle kullanımını gösteren, ayrı ve kompleks karışımlar protein derlemeleri tespit etmek için, multimeri-poliakrilamid jel elektroforezi (multimer-PAGE) olarak adlandırılır. Başlangıçta, hücre lizatı, BN-PAGE ile poliakrilamid jel içinde süspansiyon haline getirilir. lizat içeren Jel daha sonra çapraz bağlama reaktifi DSP ile reaksiyona sokulur. Sözde hareketsiz ve biraz jeli üzerinde ayrıldı, proteinler arka çapraz bağlayıcı tepkime azalır, yani daha az spesifik olmayan bir tepki muhtemeldir. Çapraz bağlanma sonrası, jel, bantlar kesilir ve SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Elde edilen jel daha sonra, tipik olarak poliakrilamid jel elektroforezi ile ilişkili herhangi bir yolla analiz edilebilir. Bu yöntem, ilave saflaştırma veya çekme Dow gerek kalmadan, modifiye edilmemiş doku lizatındaki doğal protein komplekslerinin ayrıştırılması ve algılanması amacıyla sağlarn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Doku Hazırlanması
- 4x BN-PAGE numune tampon maddesi (200 mM Bis (2-hidroksietil) amino-tris (hidroksimetil) metan (Bis-Tris), 200 mM NaCI,% 40 a / h gliserol,% 0.004 Ponceau S, pH 7.2, 10 mL hazırlanması ).
NOT: Bu stok solüsyon önceden yapılmış ve 4 ° C'de saklanabilir. - 1x ticari proteaz inhibitörü kokteyli içeren 750 uL dH 2 O 4x numune tamponu 250 uL seyreltin. Girdap ve buz üzerinde soğuk.
- Temiz bir Dounce homojenleştirici 30 vuruş 1 mL 1x buz soğukluğunda BN-PAGE numune tampon maddesi içinde, hedef doku, 20 mg homojenize edilir.
NOT: Bu gösteri deneme için, hedef doku bütün sıçan beyni dokudur. Homojenleştirmeden sonra, numuneler çözünür ve zar proteinlerinin elektroforezi izin vermek üzere hafif bir deterjan gibi% 2 digitonin ile muamele edilebilir. - 30 dakika çözünmeyen hücre içeriği: pelet 14,000 x g'de bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne Homojenat, ve santrifüj aktarın. AfteR santrifüj, buz üzerinde temiz bir tüp içine süpernatant süzün.
- bisinkoninik asit (BCA) ya da benzer protein kantitatif analizi kullanılarak Üst faz, protein konsantrasyonunu ölçmek için üretici talimatları takip edin.
- Homojenat örnek (ler) deterjan ihtiva ise,% 0.25 Coomassie için homojenat çözüm getirmek için yeterli bir sulu çözelti içinde% 5, Coomassie Mavi G-250, bir miktar ilave edin.
2. BN-PAGE
- 25 ml 20x mavi yerli seyreltin (BN) içine tampon stok (1.0 M Bis-Tris, 1.0 M Trişin, pH 6.8) elektroforez 475 ml dH 1x çalışan tampon 500 mL olmak üzere% 0.002 Coomassie Blue ihtiva eden 2 O.
- Numuneler deterjan ihtiva bunun yerine% 0.02 Coomassie içeren 1x çalışan tampon 250 mL ve hiçbiri içeren başka bir 250 mL olun.
- 4 ° C'ye soğutma tamponu (ler).
- Temizleyin ve üretici talimatlarına göre kaset dökme bir poliakrilamid jel toplayın.
- Jeller polimerize sonra, DH 2 O ile kaseti yıkayın ve üretici talimatlarına göre elektroforez aygıtı monte edin.
- Kuyucuklu bir tarak çıkarın ve 1x BN-PAGE çalışma tamponu ile kuyu doldurun. Numuneler yüklenene kadar tampon ile bütün iç odasının doldurulması kaçının.
- Numuneler deterjan ihtiva ise,% 0.02 Coomassie Blue içeren tampon ile kuyu doldurun.
NOT: 4 ° C'de adımları 2.7-2.9 gerçekleştirin.
- Numuneler deterjan ihtiva ise,% 0.02 Coomassie Blue içeren tampon ile kuyu doldurun.
- Jel yükleme ipuçları kullanarak, arzu edilen kuyulara proteinin 20 ug içeren homojenat bir hacim pipetle. kullanılmayan herhangi bir kuyulara 1x BN-PAGE numune tampon maddesi eşdeğer bir hacmi Pipet.
Not: eklemek için homojenat uygun hacmi hesaplamak için bir BCA aracıyla tespit protein konsantrasyonunu kullanmakuyu. - Örnekler yüklendikten sonra, 1 x BN-PAGE çalışma tamponu ile iç bölmeyi doldurmak. Jel tamamen tampon altında olduğundan emin olun. Daha sonra, üretici tarafından belirtilen seviyeye 1x çalışma tamponu ile dış oda doldurun.
- Numuneler deterjan ihtiva ise,% 0.02 Coomassie mavisi içeren 1 x tampon ve boya içermeyen 1x çalışan tamponu ile dış hücre iç bölmeyi doldurmak.
- güç kaynağına Elektrotlar ve boya bant katmanı çözme içine ~ 2 cm ilerler kadar 150 V'de jelde proteinleri Electrophorese. Dur ve güç kaynağını kesin.
3. Çapraz bağlanma
NOT: 4 ° C'de Adımları 3.1-3.6'da gerçekleştirin.
- elektroforez aygıtı sökün ve jel kasetinin cam levhaların ayrılması. Çıkarın ve yığma tabakasını atın.
- Dikkatle boya ön alt kenarının altında jel kesti. almakBu kesim olarak yumuşak ve düz bir şekilde mümkün kılmak için bakım ve daha sonra jel kullanılmamış parça atılır. Bu homojenat, numunedeki tüm protein içerecektir geniş bir ~ 2 cm, poliakrilamid jel yatay şerit bırakacaktır.
- Jel şeridin kenarları boyunca kullanılmamış herhangi bir kısmı Trim.
- Dikkatli bir şekilde küçük bir kap içinde 10 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içine şerit yerleştirin, yavaşça dengelenmeye 30 dakika nutation karıştırın.
- Dengelemeden sonra, atmak ve başka bir 10 mL PBS ile değiştirin. Pipet 500 uL 25 mM DSP PBS içine dimetil sülfoksit içerisinde çözündürüldü ve 30 dakika boyunca, yukarıdaki (aşama 3.4) karıştırın.
- DSP çözümü kapalı dökün. Reaksiyona girmemiş DSP gidermek için% 2 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren 0.375 M tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (tris-HCl), pH 8.8, 10 ml ekleyin. 15 dakika üğrüm devam edin.
4. SDS-PAGE
- Jel şerit söndürme iken, SDS-PA hazırlanmasıStandart yöntemler 9'a göre GE jel çözeltileri. Polimerizasyon reaktif eklemeyin.
- Söndürüldükten sonra, oda sıcaklığına kadar ΒΝ jel şeridi dönmek ve yeni bir jel kasetine şerit dökme.
- Bunu yapmak için, dikkatle jel alıp temiz bir jel kaset boşluk tabağa yerleştirin.
- Orient boya ön alt yani BN-PAGE sırasında en uzak tarafında yeni bir kaset üstüne yakın gereken yeni kasetinin üst (en yakın olan ve şerit, jel şeridi, önceden gelen çevrilmiş olmalıdır oryantasyon). Şekil 3'e bakınız.
- Üst kenarı da kapak plakasının üst kenarı olacak burada ile yer alacağı şekilde şerit yerleştirin (yani, yeni bir jel üstünde olacaktır). boya ön cam levha yatay kenarlarına paralel olduğundan emin olun.
- t yer bırakarak ara duvarların birine karşı kesilmiş şeridin bir yan itinjel o diğer tarafı dökülecek ve bir protein standardı veya merdiven yüklenmesine olanak sağlamaktadır.
- Jel bandın alt kenarı bir tırtıklı veya alanlar varsa, dikkatli bir şekilde kesilmiş. Eğer mevcut ise, bunlar jel sırasında tuzak kabarcıklar dökme olacaktır.
- Jel şerit doğru bir biçimde pozisyonlandığı zaman, ara plaka üzerinde kapak plakası yerleştirin. sıkışan hava kabarcıklarını dışarı itmek için hafif bir baskı uygulayın.
- Üretici talimatlarına göre jel-dökme aygıtı monte devam edin.
- çözündürücü jel tamponuna polimerizasyon reaktifleri ekleyin ve serolojik bir pipet kullanarak hazırlanan jel kaset içine dökün. istif tabakası için oda bırakmak için, kesilmiş BN-PAGE jel şeridin altında yaklaşık 2 cm jel kaseti doldurun.
- döküldü jel üst üzerinde 100 uL butanol ekleyin ve çözme tabakasının polimerizasyonu için 30 dakika izin verir. butonalün kapalı dökün.
- Istifleme jeli çözeltisine polimerizasyon reaktifleri ekleyin. Bir serolog kullanmaik pipet, jel kasetinde kalan boş alanı doldurmak için istifleme tabaka dökülür.
- bu jel bir şeridin altında alanı doldurur ve hava kabarcıklarının değildir bu nedenle yığın tabaka dökülür gibi jel kaseti yatırın.
- istifleme jeli tamponu jel şeridin altında boş alanı doldurur, giderek düzeyde bir taban üzerine jel kaseti döndürür.
- yaklaşık taşmaları o kadar bir sonraki istifleme jeli tamponu ile kesilmiş jel şerit boş alanı doldurmak için devam edin.
- istifleme tabaka 30 dakika boyunca polimerize olmaya bırakın.
Not: jel polimerize ise 10 x SDS-PAGE çalışma tamponu (250 mM tris (hidroksimetil) aminometan (tris), 1.9 M glisin,% 1 SDS) konur. Bu aynı zamanda önceden yapılmış ve oda sıcaklığında saklanabilir. - 1x çalışma tamponu yapmak için 450 ml dH 2 O içine 50 ml 10X SDS-PAGE çalışma tamponu stokunu.
- istifleme tabaka polimerize sonra, dökme elde edilen jel kaseti çıkarmakcihaz, dH 2 O ile durulayın ve üretici talimatlarına göre elektroforez aygıtı monte edin.
- Bundan sonra, imalatçı tarafından belirtilen seviyeye dış bölmeyi doldurmak, 1 x SDS-PAGE çalışma tamponu ile tamamen iç bölme doldurun.
- Bir sonraki bir molekül ağırlığı merdiven ya da uygun protein standardı ile kesilmiş jel şeride yer yükleyin.
- güç kaynağına elektrotları takın ve Coomassie boyası jel kapalı çalışır zaman 120 V'ta örnekleri Electrophorese, dur ve güç kaynağı ayırın.
- 10 bağlayıcı antikor tarafından elektrobeneklenme ile ve protein saptaması standart yöntemler kullanılarak jel analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu gösteri deneyinde, multimeir-PAGE bütün sıçan beyni lizatının gerçekleştirildi. Elde edilen ayrılan proteinler poliviniliden diflouride (PVDF) membran üzerinde lekelenir ve sonra kompleksler oluşturmak üzere bilinen proteinlere karşı antikorlar ile problanmıştır. Şekil 1, iki ile protokolünün bir doğrulama gösterir. İlk olarak, çapraz bağlanmış proteinler, çapraz bağlama reaktifi ile oluşturulmaktadır gözlenen daha yüksek molekül ağırlıklı türlerin, yani bir indirgeyici maddenin eklenmesiyle bölünebilecek ve protokol (Şekil 1A) herhangi bir başka bileşenine bağlı olmadığını göstermek . İkinci olarak, bu durum, çapraz-bağlama, çapraz-bağlama kompleks proteinlerine özel ve jel üzerinde yakınlığı nedeniyle rasgele reaktivite en aza indirecek anlamı, deterjanlar (Şekil 1B) ilave duyarlı olduğunu göstermektedir. Şekil 2, bir yöntem resp yakalamak için başarısız olduğunu göstermektedirAksi iratory kompleksi II de, ancak çözünebilir ve zara bağlı kompleksleri, hem yakalamak için geniş ölçüde tatbik edilebilir olmasıdır.
Şekil 1: multimer-PAGE yönteminin doğrulanması. -Jel DSP ile çapraz bağlama ile protein kompleksleri (A), yakalama dithiothretol (DTT) ile bölünmeye karşı duyarlı olan. Multimer-PAGE (A1) ya da kaplamalı olmayan bütün sıçan beyni lizat üzerinde gerçekleştirilmiştir (A2), 5 mM Tris / SDS su verme çözeltisi dahil dithiothretol. Jel PVDF membran üzerinde elektrobotlandı ve kinesin ağır zincir için problanmıştır. Yüksek moleküler ağırlıklı bir bandı benzer şekilde tümünü veya kinesin motoru protein kompleksinin kısmına uygun olarak, her iki membranlar üzerinde görülmektedir. DTT ile muamele blot üzerinde 126 kDa, kinesin ağır zincir peptid moleküler kütlesi meydana gelen ek bir band bulunmaktadır. Ditiyotreitol, bir indirgeyici madde, ve cr geri yapabiliyorDSP disülfid bağı mevcut bölünmesiyle OSS bağlama. kinesin agrega DTT ile bölünmeye karşı hassastır. (B) protein kompleksi yakalama deterjanlar denatüre edici ilave duyarlıdır. SDS (sol) veya Triton X-100 (sağ) lizat numuneleri ilave edildi ve daha sonra buz üzerinde inkübe edildi, artan miktarlarda (% 0 ila 2) dışında, metinde anlatıldığı gibi multimer-PAGE bütün sıçan beyni lizat üzerinde gerçekleştirilmiştir ilk jel yüklemeden önce 30 dakika karıştırıldı. Nihai jeller PVDF üzerinde lekelenir ve α-sinüklein için problanmıştır. artan molekül ağırlığı en az üç grup, sırasıyla, monomerin, tetramer ve oktameri-sinüklein 'a karşılık gelen gözlenir. Oligomerik bantlarının sinyal yoğunlukları etkinliğini çapraz bağlama doğal protein konformasyonunun bağlı olduğuna işaret etmektedir, artan deterjan konsantrasyonu azalır. Vi lütfen tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu Ew.
Şekil 2: multimer-PAGE kullanılarak protein kompleksleri yakalama gösterilmesi. (A) Çözünür ve zara bağlı protein kompleksleri (A), bütün sıçan beyni lizatı veya metinde anlatıldığı gibi multımer-PAGE yöntemiyle, 4 ° C'de 1 saat boyunca% 2 digitonin ile inkübe (B) lizattan yakalandı. Jeller daha sonra lekelenir ve PVDF membranları çeşitli komplekslerinin bileşenleri için problanmıştır. Yüksek moleküler ağırlıklı türler mikrotübülleri stabilize etmek için bilinen asetile tubulin için problanmıştır zar üzerinde gözlenmektedir. Ve dinein kinesin sırasıyla 1.5 MDA ve 380 kDa'lık bir molekül kütlesine sahip çoklu bir alt birim motoru protein kompleksleridir. Bu komplekslerin bileşenleri için lekelenen membranlar, yüksek molekül ağırlıklı türlerin göstermektedir. Buna ek olarak, multimeri-PAGE başarıyla CHSP90 dımerı aptured. a-Sinükleinin tetramerler ve oktamer, aynı zamanda, nörotoksik, yüksek molekül ağırlıklı oligomerler oluşturur. oktamer ve daha yüksek ağırlıklı türlerin bir çizgi lekelenir zar üzerinde görülür. SSVD dimerizasyon de gözlenmektedir. Yüksek moleküler ağırlıklı türler mitokondriyal kompleksleri I ve IV bileşenleri için lekelenen zarlar üzerinde tespit edilir. Bununla birlikte zar, uygun olan herhangi bir yüksek molekül ağırlıklı grup göstermeyen, SDHA, kompleks II 'nin bir elemanı için lekelenir. AcetTUB: α-tubulin asetile; βTUB: β-tübülin; Dinein: dinein ağır zincir; HSP90: Isı şoku proteini 90; Kinesin: ağır zincir kinesin; NDUFS3: mitokondriyal kompleks demir-sülfür merkezi 3 I; SSVD: porin; SDHA: mitokondriyal kompleks II süksinat dehidrojenaz; COXIV mitokondriyal kompleks IV sitokrom C oksidazı. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: Genel multimer-PAGE akış şemasıdır. (A), örneğin BN-PAGE numune tampon maddesi içinde homojenize olarak denatüre edici olmayan yöntemler kullanılarak doku lizat hazırlayın. (B), BN-PAGE jeli pipetleyin lizat daha sonra BN-PAGE çalıştıran tamponda elektroforez (150 Volt) gerçekleştirmek. boya ön geçirilmiş kadar numune çözme jele ~ 2 cm geçirmek için izin verir. (C), istif tabakası ve çözme tabakanın kullanılmayan kısmı çıkartın. (D) ile PBS içinde jel şeridi daldırın ve 30 dakika boyunca çalkalama ile dengeye getirin. (E) PBS çıkarın ve 2.5 mM DSP içeren PBS içinde jel şerit yeniden daldırın. 30 dakika çalkalayın. (F) DSP çözeltisini çıkarın ve ardından% 2 SDS ihtiva eden 375 mM Tris, jel şerit yeniden su altında ve 30 dakika çalkalayın. Jel şeridi içinde bulunan Kompleksi hemen Cros stabilizes-bağlama. (G) jel 180 ° şerit ve yeni bir SDS-PAGE jel içine dökme döndürün. Her iki istifleme ve katmanlar çözme içerir. (H) 'elektroforesis (120 volt) ile örnek giderin. (I), daha sonra gerektiğinde tabaka çözme analiz, jel şerit ve istifleme tabakayı çıkarın. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-protein etkileşimleri canlılar yürütmek her görev için önemlidir. Bu nedenle, bunlar yoğun inceleme ve araştırma konusudur. Multimer-PAGE yakalama ayrılması ve protein kompleksleri çok çeşitli analiz etmek için bir yeni yöntemdir. Daha önce hastalıkla bağlantılı protein α-sinüklein 11 oligimerization okuyan uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. Şekil 2'de gösterildiği gibi Bununla birlikte, pek çok protein kompleksleri için uzatılabilir. protein kompleksleri okuyan diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, multimeri-PAGE basitliği nedeniyle ve kısalık avantajlıdır. doku örneğinden zaman tam SDS jel, yaklaşık 8 saat olan ayrılmış için. Algılama tipik western blot ile yapılabilir için, protokol açılan deneyleri ile bağlantılı çok daha düşük tespit limitleri ile, modifiye edilmemiş doku lizatındaki gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, en iyi donatılmış moleküler biyoloji soylarınaratories biraz açık yatırımla tekniğini gerçekleştirmek mümkün olacak. daha sonra tartışıldığı üzere, multimeri-PAGE ile bağlantılı cebine en giderme ve çalışılan her bir protein kompleksi yöntemi optimize gelir.
multimeir-PAGE en moleküler biyologlar için erişilebilir olması gerekirken, başarı araştırmacının beceri ve deneyimine bağlıdır. Kritik olarak, yeni, SDS jel içine BN jel bandın kesilmesi ve yeniden döküm bakımı yapılmalıdır. Elektroforez paralel bantlar SDS jel içine geçirmek için proteinlerin neden olduğu şekilde jel şeridi yönlendirmek önemlidir. Jel şerit eğri döküm durumunda, protein bantları birbiri içine göç edecek ve veriler kaybolacaktır. Özellikle büyük kompleksleri için SDS-PAGE jeli içine döküm öncesinde jel şeridin Benzer önemlidir. Bu çözme laye içine çekilmiş olması çok uzak BN-PAGE jeli içine göç etmiş olabilir büyük kompleksler, daha fazla zaman verirSDS-PAGE jel r. Önemli bir şekilde, çapraz bağlama neden olduğu protein boyut ve fiziksel özelliklerine değişiklikler ayrıca analiz sırasında göz önüne alınmalıdır. Örneğin, bu gibi α-sinüklein gibi bazı düşük molekül ağırlıklı proteinler, iyi PVDF membranları üzerinde tutulan değildir, ancak bunların çapraz bağlı oligomerler 12 vardır. Bu karşılaştırmalı analizleri etkileyebilecek edebilir ve dikkate alınmalıdır.
İlk kez multımer-PAGE ile bir kompleks ayırma, yöntem doğrulamak için önemlidir. Biz üç doğrulama / giderme testleri düşündürmektedir. İlk olarak, söz konusu peptid, daha sonra, durdurma PVDF zarı üzerine şerit leke jel şeridin eksizyonu kadar multimeri-PAGE protokolü izlenerek BN jel içine geçer sağlamak ve ilgi konusu alt-birimi için sonda. sinyal ise, karmaşık bir olasılıkla daha gözenekli yapılmalıdır, ya da örnek RESOLV içine daha fazla göç etmesine izin olmalıdır, yani BN jel içine taşınmıyorduing katmanı. bir sinyalin varlığı, en azından bağlanmamış alt-birim jel göç onaylar. Bu aşamada, tam kompleksinin varlığını teyit etmek zor olacaktır. alt-biriminin kanıtı BN jel şeridi algılanırsa, ikinci test hareket. , Bir çapraz bağlama aşaması olmadan multımer-PAGE gerçekleştirmek daha sonra alt-birimi için PVDF membran ve prob üzerine leke. alt birim SDS varlığında denatüre SDS jeline normal geçmeleri gerekmektedir. Bu gerçekleşmezse, muhtemelen araştırmacının tekniği ile bazı sorun var. BN jel şeridi kötü arkasında bir protein bırakarak kesilmiş olabilir, ya da SDS jel yanlış dökme olabilir. Şekil 1 'de ele alındığı gibi, son olarak, daha sonra leke ve prob, bir de çapraz bağlayıcı bölünme aşaması ile multimer-PAGE gerçekleştirin. Bu multimerdir-PAGE protokolünün diğer bazı bölümünün beklenmedik sonucu kompleksinin toplama DSP eklenmesi nedeniyle olduğu doğrulanırsa değil. dilinim bir azaltmaya yol açmalıdırD-yoğunluk toplam bant ve görüntüleme sırasında artmış yoğunluklu alt birim monomer bandı. bir toplu bant, normal multimer-PAGE görüldüğü takdirde, ancak yoğunluğu monomer bandı artar DSP koparıldıktan sonra, kompleks muhtemelen SDS jeli üzerine yapılmış, ancak çözme katmana göç başarısız olmuştur.
Mevcut durumda, multimeri-PAGE birçok protein kompleksleri için geçerli olmakla birlikte, bir tek kalıpta tüm protokol değildir. Muhtemelen ilgi her kompleks için değiştirilmesi gerekiyor. Ortak bir problemi, Şekil 2'de gösterilmiştir: Çekilen kompleksler genellikle ancak SDS-PAGE üzerinde göç o kadar büyüktür. Bu SDS jel gözenekliliğe değiştirmek veya daha uzun zaman dönemleri için elektroforezi tarafından idare edilebilir. Diğer bir sorun da jel üzerinde ikiden fazla bantların arada bulunmasıdır. Çapraz bağlayıcı ile tamamlanmamış reaksiyon orta molekül ağırlıklı bant 13 bir dağıtım neden olabilir. Bu dif yapabilirsinizBirden fazla bantlar fizyolojik açıdan önemli oligomerik ara maddeler, ya da kısmen çapraz bağlanma, sadece istenmeyen sonuçlar temsili olup olmadığını belirlemek için ficult. Analizden önce eritilmesi gerekir zar proteinleri için, deterjan seçimi protein komplekslerinin davranışları üzerindeki etkisini dikkate almak da önemlidir. Membran proteinleri çözmek için kullanılan bir deterjan 15, bağlama ortakları ile konformasyonları, dernekler etkiler ve 14 çalışır. Deterjan seçimi de etkiler 16 çapraz bağlama etkinliğini. Böylece, ideal eritici koşulları karmaşık çalışılan ile değişecektir olasıdır.
Şekil 2. Süksinat dehidrogenaz SDHA blot üzerinde gösterildiği gibi, multimer-PAGE zaman zaman jele kolayca hareket etmelidir kadar küçüktür 124 kDa mitokondriyal Kompleks II parçası olan, bir kompleksini yakalamak için başarısız olur.o saptanmadığını multimeir-PAGE yakalamaya açamadı olduğunu gösterir. bunun gibi olgularda birçok olası açıklamaları var. En çok çapraz bağlama reaktifleri, amino asit yan zincirleri olan kovalent bağlar oluştururlar, iki tepkin ucu içerir. verim hangi çapraz bağlama reaktifleri yakalama protein kompleksleri reaktif artıkları kendi erişilebilirliğine bağlıdır. DSP durumda, çapraz-bağlama, solvent maruz primer ve sekonder alifatik amino grupları, lisin 17 genellikle ε-amino gruplarının asilasyonu ile gerçekleştirilebilir. Lizin kalıntıları genellikle protein yüzeyinde bulunan, ancak hidrofobik merkezlerinde kendi zaman ayırma 13'e çapraz bağlama etkinliğini azaltmaktadır. Kompleks II alt-birimleri mitokondriyal zarın gömülü ve hatta digitonin 18 çözünme sonrasında, DSP erişilemez olabilir. Böyle amiloid oligomer olarak çok büyük ve yoğun paketleme kompleksleri,r, aynı zamanda çapraz bağlama maddeleri, yüzey lizin kalıntılarının kullanımını sınırlayabilir. Bunun bir sonucu olarak, bir protein düzeneklerinin bu tür multimeri-PAGE ile uyumlu olmayabilir. Hidrofobik bölgeleri ve katyonik artıkları bağlanan Coomassie Blue, ve bazı durumlarda 19 PBS ve bloklar çapraz bağlama bölgesindeki dengelemeden sonra uzayıp olması da mümkündür. Bu, azaltan veya multimer-PAGE ile etkilenen oligomerlerin algılama ortadan kaldırabilir. Bu durumda, yöntem, tüm protein ilişkileri karakterize etmek için, evrensel deney değildir, ve miktar, istenen yerde olduğu düşünülmemelidir. Bununla birlikte, multimeri-PAGE protein kompleksleri analizi için ucuz, nispeten hızlı bir araç ve diğer kurulan aracı ile birlikte kabul edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
NIH / NİDA DA034783 tarafından desteklenir. Biz multimeir-PAGE ile teknik yardım için Bryan A. Killinger teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
