Summary
En fremgangsmåte for å stabilisere og å separere naturlig forekommende protein komplekser fra umodifisert vev lysat ved anvendelse av et amin-reaktivt protein tverrbinder koplet til en ny to-dimensjonal polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) system er presentert.
Abstract
Det er mange velutviklede metoder for rensing og studere enkle proteiner og peptider. Imidlertid er de fleste cellefunksjoner utføres av et nettverk av interagerende protein komplekser, som ofte er vanskelige å undersøke fordi deres binding er ikke-kovalent og lett forstyrret av renseteknikker. Dette arbeid beskriver en fremgangsmåte for å stabilisere og å separere naturlig forekommende protein-komplekser fra umodifisert vev ved hjelp av todimensjonal polyakrylamidgelelektroforese. Tissue Lysatet ble applisert på en ikke-denaturerende blå-nativ polyakrylamidgel, da en elektrisk strøm tilføres til proteinet migrerer en kort avstand inn i gelen. Gelen strimmel inneholdende det overførte protein blir deretter skåret ut og inkubert med det amin-reaktive fornetningsmiddel ditiobis (suksinimidylpropionat), som kovalent stabiliserer proteinkomplekser. Gelen strimmel inneholdende tverrbundne kompleksene blir deretter støpt i en natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel, og than komplekser separeres fullstendig. Metoden baserer seg på teknikker og materialer kjent for de fleste molekylærbiologer, mao det er billig og lett å lære. Selv om det er begrenset i sin evne til tilstrekkelig skille ekstremt store komplekser, og har ikke vært universelt vellykket, metoden var i stand til å fange opp et bredt utvalg av godt studert komplekser, og er trolig aktuelt for mange systemer av interesse.
Introduction
Normal cellulær funksjon er avhengig av protein-protein interaksjoner 1, 2. Som et resultat, er sykdommer hos mennesker ofte preget av forstyrrelser i sammenstillingen og oppførselen til forskjellige proteinkomplekser 3. Evnen til å karakterisere slike interaksjoner er derfor kritisk. Nåværende metode for å oppdage disse interaksjonene krever rensing av target-proteiner, ofte etterfulgt av rullegardin av deres samvirkende partnere. Konvensjonell rensing oppnås ved differensiell sentrifugering, utfelling og / eller kromatografi 4. Disse metodene er tidkrevende, må endres for hver målproteinet, og resulterer ofte i lave utbytter. Moderne rensemetoder involverer fusjon av peptid-koder til målproteiner, etterfulgt av immunoutfelling eller ekstraksjon på kolonner som er lastet med glassperler bundet til et molekyl fange 5,"> 6. Selv om dette er utvidbar til mange proteiner, krever den sekvens modifikasjon av målet, og muligens gi konstruksjoner med forskjellig affinitet for de vanlige bindingspartnere. Den sarte natur noen protein-protein-interaksjoner betyr at denne metode ikke kan være aktuelt til mange scenarier. i tillegg har rullegardin tester anvendt for å kartlegge protein-protein-interaksjoner kan ikke fange opp et nøyaktig cellulær bilde, på grunn av begrenset frihetsgrader og ikke-native nivåer av agn protein.
Ideelt sett kunne proteinkomplekser påvises i sine opprinnelige tilstander, uten behov for rensing eller rullgardin. Blå nativ polyakrylamidgel-elektroforese (BN-PAGE) ble utviklet som en mindre denaturerende alternativ natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE), og gjør det mulig for separasjon av noen proteiner og komplekser fra biologiske prøver 7. Imidlertid proteiner i BN-PAGE separerer basert på en large antall variabler, inkludert størrelse, ladning, tredimensjonal struktur, og assosiasjon med andre molekyler. Interaksjoner av disse faktorene ofte resultere i ko-separering av proteiner, aggregatdannelse, og fattig proteinbåndet oppløsning. Todimensjonal innfødte polyacrylamidgelelektroforese løser noen, men ikke alle, av disse problemene 8.
For å unngå komplikasjoner forbundet med naturlig separasjon, noen forfattere bruker amin-reaktive tverrbindingsmidler, som for eksempel ditiobis (suksinimidylpropionat) (DSP), for å fange opp proteinkomplekser i vev lysater 4. Disse behandlede Lysatene kan så denatureres og separert ved SDS-PAGE, og samtidig bevare den opprinnelige størrelsen og sammensetningen av proteinkomplekser. Men siden kryssbindingsreagenser reagere basert på nærhet av et molekyl til et annet, og proteiner i vev lysatene har mange frihetsgrader og kan samhandle stokastisk, ikke-spesifikk bakgrunn kryss-linking kan være høy, spesielt i konsentrerte prøver. Dette kan føre til vanskelige å tolke resultatene.
Her viser vi bruken av en hybrid BN-PAGE / SDS-PAGE-metoden er betegnet multimer-polyakrylamid-gel-elektroforese (multimer-PAGE), for å skille og påvise proteinsammensetningene i komplekse blandinger. I utgangspunktet er cellelysat suspenderes i polyakrylamidgel via BN-PAGE. Lysat inneholdende gel blir deretter omsatt med den tverrbindingsreagens DSP. Pseudo-immobilisert og litt adskilt på gelen, proteiner er mye mindre sannsynlig til å reagere ikke-spesifikt, noe som betyr bakgrunn kryssbinder reaktivitet er redusert. Etter tverrbinding, blir gelbåndene tatt ut og separert ved hjelp av SDS-PAGE. Den resulterende gel kan deretter analyseres med noen midler som typisk assosieres med polyakrylamidgelelektroforese. Denne metoden gjør det mulig for separasjon og påvisning av naturlig forekommende protein komplekser i umodifisert vev lysat, uten behov for ytterligere rensing eller trekk-down.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vevspreparering
- Fremstill 10 ml av 4x BN-PAGE-prøvebuffer (200 mM Bis (2-hydroksyetyl) amino-tris (hydroksymetyl) metan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% vekt / volum glycerol, 0,004% Ponceau S, pH 7.2 ).
Merk Denne stamløsningen kan fremstilles på forhånd og lagret ved 4 ° C. - Fortynn 250 ul 4x prøvebuffer i 750 ul dH 2 O inneholdende 1 x kommersiell protease inhibitor cocktail. Vortex og chill på is.
- Homogen 20 mg målvev i 1 ml 1x iskald BN-PAGE-prøvebuffer med 30 slag av en ren Dounce homogenisator.
MERK: For denne demonstrasjonen eksperiment, er målet vev hele rottehjernevevet. Etter homogeniseringen, kan prøvene behandles med et mildt vaskemiddel, slik som 2% digitonin å oppløseliggjøre og tillate elektroforese av membranproteiner. - Overfør homogenat tilsettes til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 14 000 xg i 30 minutter for å pelletere uløselige cellulære innhold. after sentrifugering dekanteres supernatanten til et rent rør på is.
- Følge produsentens instruksjoner for å måle supernatant proteinkonsentrasjonen ved hjelp av bicinchoninic syre (BCA) eller lignende proteinkvantifisering analysen.
- Hvis homogenatprøven (e) inneholder vaskemiddel, tilsett en mengde på 5% Coomassie Blå G-250 i vandig oppløsning er tilstrekkelig til å bringe den homogenatet løsningen til 0,25% Coomassie.
2. BN-PAGE
- Fortynn 25 ml 20x blå native (BN) elektroforesebuffer lager (1,0 M bis-tris, 1,0 M tricin, pH 6,8) i 475 ml dH 2 O inneholdende 0,002% Coomassie-blått for å utgjøre 500 ml av 1 x rennende buffer.
- Hvis prøvene inneholde vaskemiddel, i stedet gjøre 250 ml av 1 x rennende buffer inneholdende 0,02% Coomassie og ytterligere 250 ml inneholdende ingen.
- Chill-buffer (r) til 4 ° C.
- Rense og sette sammen en polyakrylamidgel helle kassett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Etter at gelene har polymerisert, skyll kassetten med dH 2 O og montere elektroforeseapparaturen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fjern vel kammen og fylle brønnene med 1x BN-PAGE rennende buffer. Unngå å fylle hele det indre kammer med buffer inntil prøvene er lastet.
- Hvis prøvene inneholde vaskemiddel, fylle brønnene med bufferen inneholdende 0,02% Coomassie-blått.
MERK: Utfør trinn 2,7-2,9 ved 4 ° C.
- Hvis prøvene inneholde vaskemiddel, fylle brønnene med bufferen inneholdende 0,02% Coomassie-blått.
- Ved hjelp av gel-lasting tips, pipetter et volum på homogenat inneholdende 20 ug protein i de ønskede brønner. Pipetter et ekvivalent volum av 1 x BN-PAGE-prøvebuffer inn i eventuelle ubrukte brønner.
MERK: Bruk av proteinkonsentrasjonen bestemt fra BCA-analyse for å beregne passende volum av homogenatet for å legge tilbrønnene. - Etter at prøvene er lastet, fylle det indre kammer med 1x BN-PAGE rennende buffer. Vær sikker på at gelen er fullstendig neddykket i buffer. Deretter fylles det ytre kammer med 1x rennende buffer til det nivået som er angitt av produsenten.
- Hvis prøvene inneholde vaskemiddel, fylle det indre kammeret med 1x buffer inneholdende 0,02% Coomassie-blått, og det ytre kammer med fargestoff-fritt 1x rennende buffer.
- Koble elektrodene til strømforsyningen, og electrophorese proteinene i gelen ved 150 V inntil farvebåndet skrider ca. 2 cm inn i oppløsningslaget. Stoppe og koble fra strømforsyningen.
3. Cross-linking
MERK: Utfør trinn 03.01 til 03.06 ved 4 ° C.
- Demontere elektroforeseapparaturen, og skille glassrutene i gelen kassetten. Fjern og kast stabling lag.
- Klipp forsiktig gelen like under nedre kant av fargefronten. Taseg for å gjøre dette kutt så glatt og rett som mulig, og deretter forkaste den ubrukte del av gel. Dette vil etterlate en ~ 2 cm brede, horisontale bånd på polyakrylamidgel, som vil inneholde alle proteiner i homogenatprøven.
- Trimme bort eventuelle ubrukte partier langs kantene av gelen strimmel.
- Forsiktig plassere strimmelen i 10 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS) i en liten beholder, og forsiktig blandes med nutasjon i 30 minutter for å ekvilibreres.
- Etter ekvilibrering, kast og erstatte PBS med ytterligere 10 ml. Pipetter 500 mL av 25 mM DSP oppløst i dimetylsulfoksyd i PBS, og blanding fortsettes som beskrevet ovenfor (trinn 3.4) i 30 min.
- Hell av DSP løsning. Tilsett 10 ml av 0,375 M tris (hydroksymetyl) aminometan-hydroklorid (tris-HCl), pH 8,8, inneholdende 2% natriumdodecylsulfat (SDS) for å bråkjøle det ureagerte DSP. Fortsett nutation i 15 min.
4. SDS-PAGE
- Mens gel strimmel bråkjøling, forberede SDS-PAGE gel-løsninger i henhold til standardmetoder 9. Ikke legg Polymerisasjon reagenser.
- Etter stopping, returnerer den ΒΝ gelen strimmelen til romtemperatur og støpes båndet inn i en ny gel kassett.
- For å gjøre dette, nøye plukke opp gel og plassere den på en ren gel kassett spacer plate.
- Orienter strimmelen slik at undersiden av fargefronten er nærmest toppen av en ny kassett (dvs. den siden som reiste seg lengst i løpet av BN-PAGE bør være nærmest toppen av den nye kassetten, gelen strimmelen skal vendes fra sin tidligere orientering). Se figur 3.
- Plasser strimmelen slik at dens øvre kant ligger selv med hvor den øvre kant av dekkplaten vil være (dvs. det vil være på toppen av den nye gel). Pass på at fargefronten er parallell med de horisontale kantene av glassplaten.
- Presse en side av det utskårede strimmelen mot den ene av avstands vegger, slik at rommet i than andre siden for gelen skal helles, og et protein som standard eller stige som skal lastes.
- Hvis den nederste kant av gelen strimmel inneholder eventuelle ujevne områder, må du kutte dem bort. Hvis til stede, vil de bobler felle i løpet gel helling.
- Så snart gelen Stripen blir posisjonert riktig, legge dekkplaten over avstandsplaten. Påfør lett trykk for å presse ut eventuelle luftbobler.
- Fortsett å montere den gel-hellende apparat i henhold til produsentens instruksjoner.
- Legg polymerisasjons-reagenser til den oppløsende gel buffer, og helle i den fremstilte gel kassetten, ved hjelp av en serologisk pipette. Fyll gelen kassetten til ~ 2 cm under det utskårede BN-PAGE-gel strimmel, for å gi plass for stabling lag.
- Tilsett 100 ul butanol over toppen av den helles gel, og tillate 30 min for polymerisering av det løse lag. Hell av butanol.
- Legg polymerisasjons-reagenser til stable geloppløsning. Ved hjelp av en serological pipette, hell stable lag for å fylle alle resterende tomrom i gelen kassetten.
- Vippe gelen kassetten som stable lag helles slik at det fyller ut rommet under gelen strimmel, og luftbobler blir ikke fanget.
- Som stablings gelbuffer fyller tomrommet under gelen strimmel, gradvis komme tilbake gelen kassetten til nivå fotfeste.
- Fortsett å fylle det tomme rom ved siden av det utskårede gelen strimmel med stablings gelbuffer, inntil det nesten renner over.
- Tillat stable lag for å polymerisere i 30 minutter.
MERK: Lag 10 x SDS-PAGE rennende buffer (250 mM tris (hydroksymetyl) aminometan (tris), 1,9 M glycin, 1% SDS), mens gelen polymerisering. Dette kan også gjøres på forhånd og oppbevares i romtemperatur. - Fortynn 50 ml 10X SDS-PAGE rennende buffer lager inn i 450 ml dH 2 O for å 1x arbeids buffer.
- Etter stablingen lag har polymerisert, fjerner gelen kassetten fra helleapparat, skyll med dH 2 O, og montere den elektroforese apparat i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fylle det indre kammer helt med 1x SDS-PAGE løpebuffer, deretter fylle det ytre kammeret til det nivået som er angitt av produsenten.
- Legg den plass ved siden av det utskårede gelen strimmel med en molekylvekt på stige eller passende proteinstandard.
- Feste elektrodene til strømforsyningen, og electrophorese prøvene ved 120 V. Når Coomassie fargestoff renner av gelen, stoppe og koble fra strømforsyningen.
- Analyser under anvendelse av standard metoder for elektroblot og protein påvisning av antistoffbinding 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette demonstrasjonseksperimentet ble multimer-PAGE utført på helrot-hjernelysat. De resulterende separerte proteiner ble blottet på polyvinylidendiflourid-membraner (PVDF), og deretter probet med antistoffer mot proteiner som er kjent for å danne komplekser. Figur 1 viser en validering av protokollen på to måter. For det første demonstrerer vi at de tverrbundne proteiner er spaltbare ved tilsetning av et reduksjonsmiddel, hvilket betyr at den observerte høymolekylære arten dannes av tverrbindingsreagenset og ikke skyldes noen annen komponent i protokollen ( figur 1A ) . For det andre demonstrerer vi at tverrbinding er følsom for tilsetning av vaskemidler ( figur 1B ), noe som betyr at tverrbindingen er spesifikk for kompleksdannede proteiner, og at tilfeldig reaktivitet på grunn av nærhet på gelen minimeres. Figur 2 viser at metoden ikke fanger respiratory kompleks II, men ellers har bred anvendelse for å fange både løselige og membranbundne komplekser.
Figur 1: Validering av multimer-PAGE-metoden. (A) Capture av proteinkomplekser ved in-gel kryssbinding med DSP er følsomme for spaltning ved dithiothretol (DTT). -Multimer-PAGE ble utført på hel rottehjerne uten lysat (A1) eller med (A2) 5 mM dithiothretol inkludert i Tris / SDS-quenching løsning. Gelen ble elektroblottet på PVDF-membraner, og deretter probet for kinesin tung kjede. En høy molekylvekt bånd observert på begge membraner, sannsynligvis korresponderer til hele eller deler av den kinesin motor proteinkompleks. Det er et ytterligere bånd som forekommer ved 126 kDa i DTT-behandlet blot, den molekylære massen av kinesin tung kjede peptid. Ditiotreitol er et reduksjonsmiddel, og er i stand til å reversere crOss binding ved å spalte disulfidbindingen til stede i DSP. Den kinesin aggregat er derfor følsomt for spaltning av DTT. (B) proteinkompleks fangst er følsom for tilsetning av denaturerende detergenter. -Multimer-PAGE ble utført på hel rottehjerne-lysat som beskrevet i teksten, med unntak av økende mengder (0 til 2%) av SDS (venstre) eller Triton X-100 (til høyre) ble tilsatt til lysatprøvene, og deretter inkubert på is i 30 minutter før den belastes den første gelen. De endelige geler ble blottet over på PVDF-membraner, og probet for α-synuclein. Minst tre bånd med økende molekylvekt er observert, svarende til a-synuclein monomer, tetramer, og oktamer, henholdsvis. Signalintensitetene for de oligomere båndene avta med økende vaskemiddelkonsentrasjon, noe som indikerer at tverrbindende effekt er avhengig av naturlig forekommende protein conformation. Klikk her for å VIew en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Påvisning av fangst av proteinkomplekser ved hjelp av multimer-PAGE. (A) Oppløselige og membranbundne proteinkomplekser ble tatt ut fra (A) hel rottehjerne lysat eller (B) lysat ble inkubert med 2% digitonin i 1 time ved 4 ° C, ved å utføre multimer-PAGE som beskrevet i teksten. Gelene ble deretter blottet og PVDF-membranene undersøkt for komponenter av forskjellige komplekser. molekyltyper høy molekylvekt ble observert på membranen probet for acetylert tubulin, som er kjent for å stabilisere mikrotubuler. Dynein og kinesin er multi-subenhet motor protein komplekser med molekylvekter på 1,5 MDa og 380 kDa, respektivt. Membranene også blottet for komponentene i disse kompleksene viser høy molekylvekt. I tillegg multimer-PAGE med hell captured den HSP90-dimer. a-synuclein danner tetramerer og oktamerer, samt nevrotoksiske høymolekylære oligomerer. Den oktamer og en strek av høyere vektforbindelse blir sett på Blottet membranen. VDAC dimerization er også observert. blir detektert molekyltyper høy vekt på membranene også blottet for komponenter av mitokondrielle komplekser I og IV. Imidlertid er membranen blottet for SDHA, et medlem av komplekset II, viser ikke noen passende høy molekylvekt band. AcetTUB: acetylert α-tubulin; βTUB: β-tubulin; Dynein: dynein tung kjede; HSP90: varmesjokkprotein 90; Kinesin: kinesin tung kjede; NDUFS3: jern-svovel sentrum 3 av mitokondriell kompleks I; VDAC: porinet; SDHA: suksinat-dehydrogenase-komplekset av mitokondriell II; COXIV: cytokrom C oksidase mitokondriell kompleks IV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Generell multimer-PAGE flytskjema. (A) Fremstill vev lysat ved anvendelse av ikke-denaturerende metoder, slik som homogenisering i BN-PAGE-prøvebuffer. (B) Pipetter lysat til BN-PAGE-gel, og deretter utføre elektroforese (150 volt) i BN-PAGE rennende buffer. Tillat prøven å migrere inntil fargefronten har migrert ~ 2 cm inn i den oppløsende gel. (C) Fjern stabling lag og ubrukte delen av det løse lag. (D) Senk gelen strimmel i PBS, og ekvilibreres med risting i 30 min. (E) Fjern PBS, og re-senk gel strimmel i PBS inneholdende 2,5 mM DSP. Det hele rystes i 30 min. (F) Slett DSP-løsning, deretter re-senk gel strimmelen i 375 mM Tris inneholdende 2% SDS, og rist i 30 min. Komplekser som er tilstede i gelen strimmelen blir nå stabilisert ved korss binding. (G) Drei gelen strippe 180 ° og støpt inn i en ny SDS-PAGE-gel. Omfatte både stabling og løse lag. (H) Løs prøven ved elektroforese (120 volt). (I) Slett gel strimmel og stabling lag, og deretter analysere løse lag etter behov. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-protein interaksjoner er viktig for hver oppgave levende ting gjennomføre. På grunn av dette, de er gjenstand for intens gransking og forskning. Multimer-PAGE er en ny fremgangsmåte for å fange, separere og analysere et bredt spekter av proteinkomplekser. Vi har tidligere demonstrert sin anvendbarhet til å studere oligimerization av sykdomsassosiert protein α-synuclein 11. Det er imidlertid utvides til mange proteinkomplekser, som vist i figur 2. Når sammenlignet med andre metoder for å studere proteinkomplekser, er multimer-PAGE fordelaktig på grunn av dens enkelhet og kortfattethet. Tiden fra vevsprøve til fullstendig atskilt SDS-gel er ca. 8 timer. Da påvisning kan gjøres ved typisk Western blot kan protokollen utføres på umodifisert vev lysat, med deteksjonsgrenser mye lavere enn de som er forbundet med rullegardin eksperimenter. I tillegg er mest velutstyrte molekylærbiologi Laboratories vil være i stand til å utføre teknikken med liten investering på forhånd. Som omtalt senere, de fleste av utfordringene knyttet til en multimer-PAGE kommer med feilsøking og optimalisere fremgangsmåten for hver proteinkompleks studert.
Mens multimer-PAGE bør være tilgjengelig for de fleste molekylærbiologer, er dens suksess avhenger av forskerens dyktighet og erfaring. Kritisk må skjære og gjenstøping av BN gelen strimmelen inn i den nye SDS-gel gjøres med forsiktighet. Det er viktig å legge gelen remsen slik at elektroforese forårsaker proteinene å vandre inn i SDS-gel i parallelle bånd. Hvis gelen strimmelen er støpt hakket, vil proteinbåndene migrere inn i hverandre, og data vil bli tapt. Spesielt for store komplekser, roterende gelen strimmel før støping av den inn i SDS-PAGE-gel er likeledes viktig. Dette gir større komplekser, som ikke kan ha migrert meget langt inn i BN-PAGE-gel, mer tid til å bli trukket inn i den løse Layer av SDS-PAGE-gel. Viktig er det at endringer i proteinstørrelse og fysikalske egenskaper forårsaket av kryssbinding bør også tas hensyn til ved analyse. For eksempel har noen lavmolekylære proteiner, slik som α-synuclein, er ikke godt tilbakeholdt på PVDF-membraner, men deres tverrbundne oligomerer er 12. Dette kan forvirre komparativ analyse, og må tas i betraktning.
Når separering av et kompleks av multimer-PAGE for første gang, er det viktig å validere metoden. Vi foreslår tre validering / feilsøkingstester. Først at peptidet av interesse migrerer inn i gelen BN ved å følge den multimer-PAGE-protokoll til fjerning av gelen strimmelen, deretter stoppe, blot stripe på PVDF-membran, og sonden for subenheten av interesse. Hvis det ikke er noe signal, den komplekse sannsynligvis ikke vandrer inn i BN gelen, noe som betyr at det bør gjøres mer porøs, eller prøven bør få lov til å migrere videre inn i resolving lag. Tilstedeværelse av et signal som bekrefter at i det minste ubundet subenheten vandret inn i gelen. På dette stadiet, vil det være vanskelig å bekrefte tilstedeværelse av hele komplekset. Hvis bevis på underenheten påvises i BN gel strimmel, gå videre til den andre testen. Utføre multimer-PAGE uten et kryssbindingstrinn, da blot på PVDF-membran og probe for subenhet. Den subenheten skal denaturere i nærvær av SDS og migrere normalt inn i SDS-gel. Hvis dette ikke skjer, er det sannsynlig noe problem med forskerens teknikk. BN gel strimmel kan ha blitt dårlig kuttet, slik at noen proteiner bak, eller SDS-gel kan ha vært støpt på feil måte. Avslutningsvis gjør multimer-PAGE med en inkludert tverrbinder splittingstrinn, da blot og probe, som beskrevet i figur 1. Dette bekrefter aggregering av komplekset er på grunn av tilsetningen av DSP, og ikke en uventet konsekvens av noen annen del av multimer-PAGE-protokollen. Spaltingen bør resultere i en redusertd-intensitet aggregat båndet og en økt intensitet subenheten monomer bånd etter avbildning. Hvis ingen aggregat bånd sett fra normal multimer-PAGE, men monomerenhetene bånd øker i intensitet når DSP spaltes, er det komplekse sannsynlig gjort det til SDS-gel, men mislyktes i å migrere inn i det løse lag.
I sin nåværende tilstand, er multimer-PAGE anvendelig til mange proteinkomplekser, men er ikke en størrelse passer alle protokoll. Det må trolig endres for hvert kompleks av interesse. Et vanlig problem er vist i Figur 2: fangede komplekser er ofte så store at de knapt migrerer på SDS-PAGE. Dette kan bli styrt ved å endre porøsiteten av SDS-gel-elektroforese eller utfører for lengre perioder av gangen. En ytterligere komplikasjon er sporadisk tilstedeværelse av mer enn to bånd på gelen. Ufullstendig reaksjon med tverrbindingsmidlet kan resultere i en fordeling av liggende molekylvekts bånd 13 som. Dette kan gjøre det DIFligere for å avgjøre hvorvidt multiple bånd er representative for fysiologisk viktige oligomere mellomprodukter, eller bare utilsiktede konsekvenser av delvis tverrbinding. For membranproteiner som må oppløseliggjøres før analyse, er det også viktig å vurdere virkningen at valget av vaskemiddel har på virkemåter for proteinkomplekser. Det vaskemiddel som brukes til å oppløseliggjøre membranproteiner påvirker sine konformasjoner, forbindelser med bindingspartnere, og fungerer 14, 15. Vaskemiddel valg påvirker også den effekt av tverrbindings 16. Dermed er det sannsynlig at den ideelle løsende forholdene vil variere med komplekset blir studert.
Multimer-PAGE av og til svikter for å fange opp et kompleks, slik det er vist på SDHA blot i figur 2. suksinat-dehydrogenase er en del av den 124 kDa mitokondrie-komplekset II, som er liten nok til at det skal bevege seg lett inn i gelen.At det ikke ble oppdaget indikerer at multimer-PAGE var ikke i stand til å fange den. Tilfeller som disse har mange mulige forklaringer. De tverrbindingsmidler inneholder to reaktive ender, som danner kovalente bindinger med aminosyre-sidekjeder. Den effektivitet med hvilken kryssbindingsreagenser fangst proteinkomplekser er avhengig av deres tilgjengelighet til reaktive rester. I tilfelle av DSP, blir tverrbindingen oppnås ved acylering av løsningsmiddeleksponerte primære og sekundære alifatiske aminogrupper, vanligvis e-aminogruppene i lysin 17. Lysinrester er normalt finnes på proteinflaten, men deres annen håndtering i hydrofobe sentre reduserer effektiviteten av tverrbindings 13. De subenheter av komplekset II er begravet i mitokondriemembranen, og kan forbli utilgjengelig til DSP, selv etter solubilisering med digitonin 18. Svært store og tett pakking-komplekser, slik som amyloid oligomers, kan også begrense tilgjengeligheten av overflate lysinrester til tverrbindingsmidler. Som et resultat av dette kan disse typer proteinsammensetningene ikke være kompatibel med multimer-PAGE. Det er også mulig at Coomassie-blått, som binder seg til hydrofobe områder og kationiske rester, henger etter ekvilibrering i PBS og blokker tverrbinding i noen tilfeller 19. Dette kan redusere eller eliminere deteksjon av oligomerer som påvirkes av multimer-PAGE. Således er fremgangsmåten ikke en universell assay for å karakterisere alle protein forbindelser, og bør ikke betraktes hvor mengdebestemmelse i ønskelig. Imidlertid er multimer-PAGE en billig, relativt rask verktøy for analysering av proteinkomplekser, og kan vurderes sammen med andre etablerte metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Støttet av NIH / NIDA DA034783. Vi takker Bryan A. Killinger for hjelp i forbindelse med multimer-PAGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
