Isolare e analisi cellule del pancreas Mesenchima mediante citometria di flusso

Introduction

omeostasi energetica e la digestione degli alimenti nei mammiferi dipendono da una corretta funzione pancreatica. Il pancreas adulto è composto da due principali compartimenti cellulari: il esocrina e il sistema endocrino. Cellule esocrine, comprese le cellule acinari che producono e secernono enzimi digestivi e le cellule dei dotti che trasportano questi enzimi per l'intestino, comprendono oltre l'80% della massa pancreatica totale ^1. Cellule endocrine, che includono le cellule beta produttrici di insulina e glucagone cellule alfa producono, sono organizzati nelle isole di Langerhans che sono incorporati nel tessuto esocrino e secernono ormoni per regolare i livelli di glucosio nel sangue ^2.

Cellule pancreatiche acquisiscono il loro destino differenziata attraverso una altamente regolamentato, processo a più gradi ^3. L'evidenza suggerisce che spunti estrinseci forniti da neuronale, endoteliali e cellule mesenchimali guidare la differenziazione delle cellule del pancreas e la proliferazione in tha embrione ^{3, 4, 5.} Un esempio è il requisito dell'aorta per la specifica dei primi precursori pancreatici ^6. Più tardi in fase di sviluppo, le cellule endoteliali sono stati mostrati a svolgere un ruolo centrale nello sviluppo di entrambe le cellule endocrine e esocrine del pancreas e di promuovere la differenziazione delle cellule beta ^{4, 6, 7.} Cellule mesenchimali hanno dimostrato di sostenere la sopravvivenza e l'espansione di progenitori pancreatici comuni, principalmente attraverso la secrezione del fattore di crescita FGF10 ^{8, 9.} Abbiamo inoltre dimostrato che queste cellule supportano la proliferazione di endocrine ed esocrine precursori, nonché di cellule differenziate (comprese le cellule acinari e beta) nel pancreas embrionale ^5. Recentemente, cellule mesenchimali sono stati ulteriormentedimostrato che regolano il differenziamento cellule endocrine ^10.

Nell'adulto, funzione delle cellule beta e massa sono stati mostrati dipendere cellule nel loro microambiente, tra neuronale, immunitario, e le cellule endoteliali, nonché periciti ^{11, 12, 13.} Durante la ferita, le cellule endoteliali sono stati mostrati a reclutare le cellule immunitarie al pancreas per promuovere la replicazione delle cellule beta ^13. Le cellule endoteliali sono state ulteriormente mostrati per produrre componenti della matrice extracellulare (ECM) per sostenere l'espressione di insulina e beta-cellule funzione ^14. Abbiamo recentemente dimostrato l'esigenza di pericytes isolotto per la funzione delle cellule beta ^11. Infine, le cellule dello stroma pancreatica sono stati mostrati per regolare la progressione di adenocarcinoma del dotto pancreatico (PDAC) ^{15, 16.} Tuttavia, l'identità di spunti estrinseci che guidano lo sviluppo del pancreas, la funzione, e tumorigenesi sono in gran parte sconosciuti.

Identificare spunti forniti dalle cellule del microambiente del pancreas richiede caratterizzare i geni e le proteine ​​espresse da queste cellule. Questo dipende isolare queste cellule dal pancreas per effettuare l'espressione genica e proteomica e / o stabilire linee cellulari. Qui, vi proponiamo un metodo per isolare le cellule mesenchimali del microambiente del pancreas utilizzando tessuti digestione enzimatica e fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) di entrambi cellule immunofluorescently-etichettati o cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti. Questo protocollo è stato eseguito con successo per isolare e analizzare proteina fluorescente gialla (YFP) esprimente cellule mesenchimali del embrionale, neonatale e adulta del pancreas ^{5, 17.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase P	Roche	11213865001
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-15KU	The effective units should be at least 2,000 unitz/mL protein
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	04-127-1A
EDTA	Biological Industries	01-862-1A
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
Goat IgG serum	Sigma-Aldrich	G9023
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
RNAse inhibitor	Invitrogen	N8080119
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11965092
L-Glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Penicillin-streptomycin	Biological Industries	03-031-1B
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride
1.5 mL tubes	Sarstedt	72 690
15 mL conical tube	Corning	430052
Round Bottom Polystyrene 5 mL tube	Corning	352008	FACS tube. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands
5 mL tube with 35 μm cell strainer Snap Cap	Corning	352235	FACS tube
70 μm cell strainer	Miltenyi Biotec	130-098-462
Heating block with agitation	Eppendorf	ThermoMixer C
Centrifuge	ThermoFisher	Heraeus Megafuge 40R
Steromicroscope	Nikon	SMZ 745
Cell sorter	BD Biosciences	FACSAria IIu
flow cytometer	Beckman Coulter	Gallios