Summary
中和機構を用いた WEHI 164 細胞抗 TNF モノクローナル抗体の相対的な抗アポトーシス活性測定のためのプロトコルを次に示します。このプロトコルは同じ生物学的機能を持つ異なる分子の中和力を比較するのに役立ちます。
Abstract
このプロトコルは、抗 tnf α モノクローナル抗体を用いたマウス線維芽細胞細胞モデル (WEHI 164) における tnf α のアポトーシス活性中和の測定を示しています。さらに、このプロトコルは、融合蛋白質などの他の抗 tnf α 分子を評価に使用できます。ここで採用されている携帯電話のモデルは、追加のストレス因子が細胞培養条件 (例えば、血清剥奪) に誘導される tnf α によるアポトーシスに敏感です。この手順に関する試料調製、セル希釈、アポトーシス誘導、吸光光度測定結果をお約束する重要なキー操作を強調表示、この分析法を実行する方法を例示しています。このプロトコルでは、アポトーシス誘導および記録、低い不確かさの値につながる効率的な信号に関するベスト パフォーマンス条件を明らかにします。
Introduction
生物学的効力量 (質量で表される) は蛋白質の物理化学的測定に対し関連する生物学的特性にリンクされている製品の試金される属性に基づいて生物学的活性の定量的な尺度であります。他の分析方法論とともに、効力テストは、製品の適合性、安定性、および比較研究の一部として実行されます。この意味で、効力の測定、製品バッチと市場承認後臨床試験のすべての段階において重要な品質属性 (CQAs) または承認基準を満たすことを実証する使用されます。
アポトーシスはプログラムされた細胞死、細胞は、ウイルスや環境によってセルを強調しているときに感染しているときに自然に発生する要因その妥協細胞生存率と機能1,2。とりわけ、アポトーシス抑制、または生物学的中和です免疫炎症性疾患などの慢性疾患の治療を中心に、Mab の主知られている治療上のメカニズムの一つ抗 TNF 分子は p55 と p75 細胞表面の受容器3、最後に細胞をアポトーシスに導く信号経路を防ぐと腫瘍壊死因子アルファ (tnf α) の相互作用をブロックすることによってその治療特性を発揮します。
Tnf α はいくつかの慢性的な病気の4の炎症を引き起こすことができます。Tnf α は自然免疫系と疾患5のこの種の主な俳優の歩哨であるマクロファージから分泌される細胞外の環境にも。共通パスとして tnf α の規制緩和は、これらの病気の病因に関連付けられます。制御なしと一定の誘導と細胞ストレスの下では、tnf α は関節リウマチ、クローン病、その他の病理組織学的プロファイル6に繋がる細胞死と組織の変性を誘導します。
TNF とその受容体の相互作用をブロックする TNF 拮抗薬は、症状を軽減し、これらの疾患の進行を妨げるの効果的な療法としてますます使用されています。今日では、抗 TNF 製剤、広く全身さらに関与する組織の変性を防ぐ、このサイトカイン濃度を制御する使用されます。この意味で、薬の生物学的効果を達成するために特定の能力を記述するため再現性と堅牢な生物検定法を提供することが不可欠です。
中和アッセイの開発中にステップで識別されるこの議定書、クリティカルで-生物学的効力の測定に成功は強調表示されます、バイオ分析メソッドを実行するために必要なスキルに重点。このバイオ分析法は、医薬品の臨床試験済みの標準物質と比較されたとき異なるバッチまたは抗 TNF の間有用な比較情報を提供します。
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Protocol
1 ですメディアとソリューションの準備
- 培養液の準備: 10% RPMI 1640 FBS、pH 7.4。 。
- 準備アッセイ培: RPMI 1640 フェノールレッドなく 1 %fbs、pH 7.4 。
- セル洗浄ソリューションを準備: 0.02 %edta、pH 7.4 DPBS Mg と Ca 無料ソリューションです 。
- 細胞剥離液の準備: 1 mm EDTA 0.125% トリプシン。
- 100 mL のトリプシン-EDTA と滅菌 500 mL フラスコへの転送の 0.25% 溶液を解凍 。 100 ml のセルの
- ミックスは、ソリューションを洗って 15 ml を 15 mL 滅菌チューブに分注します。使用するまで-80 ° C に-70 で店 。
- 0.22 μ m 膜を介してこれらのソリューションをフィルター処理し、使用前に少なくとも 30 分間、37 ° C の暖かい 。
- アポトーシス誘導原液 3.3 μ G/ml で tnf α ソリューションを準備します。
- プライマリ コンテナーで完全溶解までミックス フィルター滅菌水の 500 μ L で tnf α の解散 20 μ g.
- 15 mL 滅菌チューブに転送し、5.5 mL DPBS Mg と Ca 無料ソリューションをこのチューブに追加します。優しく渦のミキサーを使用してミックスします 。
- 因数 70 μ L 部分にソリューション。0.5 mL マイクロ チューブと-80 で店に各因数を調剤 ° C
- アポトーシス誘導ソリューションの準備: 40 ng/mL で tnf α ソリューション。
- アポトーシス誘導の在庫ソリューション、25 ° C で 10 分間で水浴の抱卵の因数を解凍
- 4.939 mL アッセイ培地 15 mL 滅菌チューブに 3.3 μ G/ml tnf α ソリューションの 61 μ L を追加することによって 40 ng/mL にアポトーシス誘導原液を希釈します 。
- 10 の渦のミキサーでミックス s; このソリューションは使用する前に新鮮な準備する必要があります 。
- Th eneutralization アッセイに使用前に、少なくとも 30 分の 37 ° C の解決策を暖かい 。
- 基板ソリューションを準備: カスパーゼ 3/7 グロ ソリューション 7 , 8。
- 雪解けの緩衝液のカスパーゼ (カスパーゼ 3/7 グロ バッファー) 使用前に 12 h 。
- カスパーゼ緩衝液および基板 (カスパーゼ 3/7 グロ基板) 座る別途 25 ± 5 ° C で混合する前に 30 分間みましょう 。
- インバージョンによる基板バイアルとミックスするカスパーゼ バッファー溶液 10 mL を転送します 。
- 維持 25 ± 5 ° C、使用までの光保護します
。 注: ソリューションは室温で 6 時間安定した 。
2。細胞培養とカウント
- 細胞融解と最初のサブカルチャー。
- -80 ° C で冷凍庫から WEHI 164 細胞 9 1 つのバイアルを外し、氷浴にそれらを転送します 。
- 凍結細胞を完全に解凍するまで上下に予め温めておいた培養液 1 ml ピペットします 。
- 15 mL 滅菌チューブに予め温めておいた培養液 9 mL を分注します 。
- 15 mL 滅菌チューブに細胞懸濁液を転送、逆転で 5 回を軽く混ぜる 。
- 清 125 x g で 3 分間破棄に細胞懸濁液を遠心し、細胞ペレットを非集計します 。
- は、チューブに培地 5 mL を追加します。完全に再停止されるセルになるまで混ぜる 。
- セルのカウント、500 μ L マイクロ チューブ、50 μ L 0.4% トリパン ブルーのミックスに細胞懸濁液を 50 μ l 添加を転送します。セルをカウントし、0.5 × 10 6 セル/mL に調整します。以下手順 2.2 を参照してください 。
- 75 mL 細胞培養用フラスコに予め温めておいた培地の 13 mL を追加します 。
- 0.5 × 10 6 セル/mL 細胞培養用フラスコを達成し、37 ° C および 5% の CO 2 を一晩インキュベート ステップ 2.1.6 から十分な細胞懸濁液容積を調剤します 。
- セルカウントします
。 注: を参照してください参照 10。- 2.1.6 のステップから診断に 0.05 mL を転送ソリューションを使用して、トリパン ブルー色素排除を使用して顕微鏡下で細胞密度を決定します 。
- 細胞および実行可能なセルの合計数を定量化します 。
- 0.5 × 10 6 セル/mL に細胞懸濁液を調整します
。 式 1
V 培 (mL) =
V 培 (mL) = (5 mL - V 細胞懸濁液)
V 培 (mL) = WEHI 164 の調整ボリューム細胞懸濁液
NVC 実行可能な WEHI 164 細胞/mL の数 =
V 培 (mL) = 0.5 6 セル/mL の 10 倍を達成するために細胞懸濁液に追加アッセイ培ボリューム
0.5 x 10 6 ターゲット細胞密度を =
- 細胞剥離と 2 番目と 3 番目のサブカルチャー
。 注: 真空システムは、フラスコからソリューションを削除する使用できます。使い捨てのまたはガラスの滅菌ピペットを使用ことができます。ピペットは、綿を詰まらせる場合上部で、使用する前に削除する必要があります。- T フラスコ 1 mL 滅菌ピペットと真空を使用して細胞培養から培養培地を削除します 。 文化 T フラスコに
- セル洗浄の調剤 5 mL ソリューションは優しく、ミックス、溶液を廃棄します。この手順を 2 回繰り返します
。 注: 培地の完全な除去は効率的な細胞の剥離にとって重要です 。
- T フラスコに細胞剥離溶液 15 mL を加え、37 ° C、5% CO 2 でインキュベーターで 3 分間放置します 。
- では、顕微鏡下でフラスコ内壁に取り付けられている細胞の有無を確認します。文化 T フラスコ 20 mL 滅菌ピペットを使用してからセルを削除し、50 mL の生殖不能の管にそれらを分配します 。
- 清 125 x g で 3 分間破棄に細胞懸濁液を遠心し、別の 5 mL の培養液でペレットを再懸濁します 。
- セルをカウントし、方程式 1 に従って目的のセルの濃度に到達する十分な培養液を追加します 。
- 72 cm 2 T フラスコにこの懸濁液を追加し、37 ° C、5% CO 2 で一晩インキュベートします 。
- サブカルチャーの少なくとも 2 倍、中和でそれらを使用する前にセルの試金します。次の 2 日の 2.3.1-2.3.8 の手順を繰り返します 。
- 細胞懸濁液をアッセイします。
少なくとも 3 つのパスを持つ
- 選択 WEHI 164 サブカルチャー。手順 2.1 を参照してください 。
- デタッチと 2.2 と 2.3 のこのプロトコルの手順に従ってセルをカウントします 。
- 式 1 によると 0.5 × 10 6 セル/mL に細胞懸濁液を希釈します 。
- は、中和の試金のためのこの細胞懸濁液を使用します。使用するミキサー前に渦によってすべての細胞懸濁液をミックスします 。
3。抗体作製および希薄
- mab 定量。
- 280 UV 吸収を通じて分析サンプル、コントロールのサンプル、参照物質の濃度を決定する nm の大量絶滅 (1.39) 係数 11 を使用しています
。 注: 元の濃度は、医薬品ラベルから取ることができます。ただし、これは UV 吸収によって確認する必要があります 。
- 280 UV 吸収を通じて分析サンプル、コントロールのサンプル、参照物質の濃度を決定する nm の大量絶滅 (1.39) 係数 11 を使用しています
- モノクローナル抗体希釈。
2 mL のマイクロ チューブ、2 mg/mL までの DPBS Mg と Ca 無料ソリューション千九百六十八で独立して
- Dilute すべてサンプル。3 通、空白として DPBS Mg と Ca 無料ソリューションを使用して紫外線吸収によるこの濃度を確認します 。
- 5 のストックのタンパク質溶液を混ぜて渦のミキサーを使用して s 。
- 0.9 mL アッセイ培地の mAb 各 2 mg/mL の溶液の希釈 100 μ L. ボルテックス ミキサー
- ミックス 5 s.
注: これらのソリューションは、200 μ G/ml の濃度を持っています。各 3 通の希釈液の調製を行う必要があります 。
- 希釈 10 ・ #181;アッセイ培地の 0.99 ml 各 200 μ G/ml mAb ソリューションの L。5 のミックス s 渦のミキサーを使用しています。これらのソリューションは、2 μ G/ml の濃度を持っています。中和法でそれらを使用する前に各 3 通のシリアル希薄を実行します 。
- は、3 つの独立したマイクロ プレートで抗 tnf α モノクローナル抗体希釈液を作る。それぞれ独立した 3 通から複製を作り、表 1 に示すように 1 つのマイクロ プレートで調剤。物質を参照 < テーブルの fo:keep-together.within-ページ =「1」fo:keep-と-next.within-ページ =「常に」fo:text-整列 =「センター」>
プレート 1 皿 2 プレート 3 井戸 サンプル 井戸 サンプル 井戸 サンプル B2:B11 の標準物質 B2:B11 コントロールのサンプル B2:B11 分析サンプル C2:C11 C2:C11 C2:C11 D2:D11 分析試料 D2:D11 参照物質 D2:D11 コントロールのサンプル E2: e11 e2: e11 e2: e11 F2:F11 コントロールのサンプル F2:F11 分析試料 F2:F11 参照物質 G2:G11 G2:G11 G2:G11 。
- 各参照の実行モノクローナル抗体希釈サンプル、または制御、表 2 に示すよう
。 注: この表に記載されている抗 TNF モノクローナル抗体濃度は中和試験で最終的な濃度ではありません。
Tできる 2: 抗 TNF モノクローナル抗体希釈液。 抗 TNF モノクローナル抗体のシリアル希薄がこの表に示されています。この表に記載されている最終濃度はありません、アッセイの濃度どこ抗 tnf α モノクローナル抗体 (mAb 希釈 + 培養培地、細胞懸濁液) の 3 倍希釈されました。行は太字で表す 3、5、7、9、および 10 のラインから来る希釈非うち太字の行は、3、4、および 6 行からの希釈を表しています。これらのシリアル希薄は、ちょうど中和試験を実行する前に行われます。希釈する前に上下に 3 回をピペッティングにより混合する注意する必要がありますプレート柱 アッセイ ボリューム培 (μ L) ボリュームの標準物質、分析試料またはコントロールサンプル (uL) アッセイ プレート (ng/mL) 中濃度 2 0 230 2000 3 150 150 2 行目から 1000 4 75 3 行目から 75 500 5 100 3 行目から 50 333 6 75 ライン 4 から 75 < td> 2507 75 75 行 5 から 166 8 75 6 行目から 75 125 9 75 75 往復m ライン 7 83 10 75 9 行目から 75 41 11 150 行 10 から 75 13 。
- 25 ± 5 ° C で使用するまでプレートを維持します 。
4。中和 WEHI 164 細胞アッセイ
- ボルテックスこの議定書のいずれかの手順で調剤する前にすべてのセルの懸濁液 (0.5 × 10 6 セル/mL)
- ミックス
。 注: このセクションで 37 ° C、30 分前に使用する各ソリューションをウォームします 。
- 各列 2 に 11 および G に B 線から移動プレートの 60 の井戸に細胞懸濁液の転送 50 μ l
- MAb リファレンス、サンプル、およびコントロールの転送 50 μ L マイクロ プレートに希釈。 図 1 に示されたパターンに従います 。
- 各ウェルにアポトーシス誘導ソリューションの追加 50 μ L.
- WEHI 164 の 50 μ L の携帯電話コントロールを使用してセル、3 つの井戸で調剤。アッセイ培 150 μ L の最終巻に各ウェルをもたらすします 。
- は、WEHI 164 細胞の 50 μ L の混合物の毒性の制御とアポトーシス誘導溶液 50 μ L を使用します。アッセイ培 150 μ L の最終巻に各ウェルをもたらすします 。
- 、Tnf α の制御、アポトーシス誘導溶液 50 μ L を使用し、アッセイ培 150 μ L にそれをもたらします 。
- ブランク、アッセイ培養液だけで 150 μ L を使用します 。
- プレート蒸散効果を避けるために培地の 150 μ L で残りの井戸を埋める 。 他の 2 つのマイクロ プレートで 2 回繰り返し手順
- 4.1.1-4.1.9.
注: マイクロ プレートは: 0.666 mAb 最終濃度、および、0.083、0.042、0.014 0.028 0.056 0.111 0.167、0.333 の 0.004 μ g/mL 。
- のマイクロ プレート内のサンプルをロードは、 図 1 に示されるようにします
。
図 1: アッセイ プレートのサンプル処分。G11 に B1 はプレートでも座標であり、サンプル希釈液が配置される位置を記述します。行方不明の座標は、コントロールとアッセイ培 (A1 A12 と H1 H12) でいっぱいの井戸です。このサンプル (プレートの前方および逆の希釈) がランダムに分布は、媒体またはその他の変数の蒸発による結果にバイアスを排除するのに役立ちます。一度に 1 つのアナリストによって各マイクロ プレートされることをお勧めします。R: s: 参照サンプル、CS: コントロールのサンプル、Dil: 希釈。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください 。
- 37 ° C、5% CO 2 16 ± で 3 版を孵化させなさい 2 h.
- 25 ± 5 ° C で使用する前に 30 分立つカスパーゼ 3/7 グロ試薬ができます 。
- 追加 100 μ L のサンプルやコントロールなどすべての井戸にこの試薬 。
- すぐに井戸に調剤後 25 ± 5 ° C で 3 分間のマイクロ プレート渦のミキサーを用いた板を振る 。
- 2.5 ± 0.5 h 25 ± 5 ° C、光から保護用の皿をインキュベートします 。
- マイクを挿入します。ルミノに roplates し、次のセクションを完了します 。
5。結果の分析
- 発光検出のソフトウェアを使用しての発光モードとエンドポイント関数を選択します 。
- 選択 96 ウェルの明確な底板と列 1 および 12 を除く 80 内部井戸 。
- 1,250 ms と 10 の積分時間を選択読む前にマイクロ プレートをミキシングのため s.
- 井戸の標準物質、分析物質およびコントロールのサンプルが配置され、対応する濃度を識別するを選択します 。
- 、ルミノとマイクロ プレートでのサンプルを読む 。
- は、結果の分析に第 4 パラメーターの式を使用します。用量反応曲線を 図 2 で示したグラフします
。
図 2: 用量反応曲線。発光 (細胞生存率) と抗 TNF モノクローナル抗体濃度が描かれています。モノクローナル抗体の抗 TNF 保護を記述する第 4 パラメーター式は、モデルとして使用されました。EC50 斜面の変化としてグラフに代表される各分析で 50% の細胞死を引き起こす tnf α の量を中和することができるモノクローナル抗体の濃度であります。バーは、各 mAb 濃度の発光の標準偏差をについて説明します。x 抗 TNF Ab 濃度を表し、y は、ng/ml、対数関数として描かれている 任意の発光ユニットの発光応答。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
。 注: 4 番目のパラメーター式 C 効果濃度 (EC50) 50 です。エフェクター機能によって、標準物質、分析サンプル、コントロールのサンプルを比較するこの値が使用されます 。
- 相対強度を計算すると、100% 参照物質を修正、サンプルのポーテンシーを算出し、それに応じて制御します
。 注: これらの値は、 図 3 に示したです
。
図 3: 、EC50s とその値を計算に使用される数式。EC50 値または C パラメーター標準エラーとして描かれている不確実性があります。EC50s の相対的な効力のサンプルとリファレンスの結果比較が描かれています。Α と信頼区間を計算 = 0.05。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください 。
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Representative Results
(コントロール) と線量応答グラフ
図 1は、mAb 濃度対発光応答を表します。このシグモイド関数セル換散のためのアッセイ培地のカスパーゼ 3 および 7 のリリースを例示しています。細胞死は、血清飢餓に加えて、tnf α シグナル誘導によって強化されています。したがって、抗 tnf α 分子 (mAb) は (立体障害) によって細胞の TNF 受容体との相互作用を抑制すること、サイトカインと対話します。これによりより高いモノクローナル抗体濃度で細胞の生存。
コントロールのメソッドで使用された: のアッセイと細胞培養培地、細胞に加えて、tnf α プラス アッセイ培と文化 mediumalone を試金。発光を差しこみ、アポトーシス細胞アッセイ培 FBS 飢餓下で単独では受けなかった。また、tnf α が、培養培地で耕作されるだけで細胞が生き残るか確かに。
別の重要なコントロールは、アッセイ培だけです。これは、制御により分子干渉中、カスパーゼ基板を消化できるタンパク質具体的に関する理解したがって誤発光信号を示します。EC50 と相対的な効力の結果は、表 3に描かれています。
| サンプル | EC50 | 相対的な力価 (%) | 信頼区間 (%) | RDS (%) |
| 参照物質 | 2,415億 | 100 | -- | -- |
| 243.6 | ||||
| 234.2 | ||||
| 解析サンプル | 225.2 | 99.7 | 86.0 115.1 | 8.5 |
| 240.3 | ||||
| 円 258.8 | ||||
| コントロールのサンプル | 230.5 | 97.1 | 86.5 108.7 | 6.9 |
| 264 | ||||
| 248.4 |
テーブル 3: 相対効力結果。分析試料は、固定 100% 効力を参考として表に示す知られている効力サンプルと比較されます。関係は、各サンプルの EC50 と計算されます。間隔は 95% の確度で計算されます (α = 0.05)。RSD: 相対標準偏差。
表 3は、参照 mAb と調査の下でサンプルの間の割合の相対的な効力を示します。比較参照の 80 ~ 120% の範囲内と見なされます。ただし、参照がバッチ間の大きい可変性を持つ時したがって、承諾の範囲を変更できます。したがって、製造、物理化学的特性と受容の間隔を引き締めの短い期間内に参照バッチを選択することが望ましい。
この表は、ある参照場合に分析試料がある 99.7% の力、100% の力を示しています。この結果は、サンプルによる tnf α の中和能力が、参照のそれに匹敵するということです。これらの Mab で、サイトカインの過剰発現に関連する病気を制御できることが期待されます。
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Discussion
この特性は、高価な時間のかかる臨床試験を実施する前に事前開発中の分子の生物学的挙動を決定するのに役立ちます。また、バッチのリリースの承認薬製品のことをお勧めします。これらの試いる分子は、その作用メカニズムに関する適切な生物学的効果を持っている場合を判断するのに役立つことを言及する価値があります。このチュートリアルで提供されるバイオ分析法が異なる抗 TNF 分子の比較に重要です。一般的な物理化学的方法にもかかわらずこの方法論は生物学的手段、効力とエフェクターの機能の完全なと完全の意義をこのように示して品質属性として薬の有効性を判断することができます。
一般的には、tnf α に細胞アポトーシス応答性は実行する研究者のための困難な作業をすることができます。この生物学的方法を標準化する前に日常的に使用される細胞バンクの特性評価によるトラブルシューティングを実施できます。一例は、細胞応答の可変性を細胞老化12に係る期間内です。この問題は-80 ° C で凍結マスターの細胞バンクを用いた除去します。ワーキング ・ セル ・ バンクは R によって行われた DOE 調査の要件をカバーするのに十分な大きさである必要があります & D または品質管理研究室で使用するための 1 年間。また、このプロトコル中のどの段階でも細胞にそれらを追加する前に温度安定化ソリューションを使用してこの応答を修正できます。少なくとも 3 つのパスは、中和試験を実行して、細胞は適応と人口動態12,13による連続培養で栽培されている時間の長さを制限する前に行う必要があります。
Tnf α 分子は、この蛋白質の効力が大幅に損なわない場合安定化、凍結融解サイクルから保護されなければなりません。製剤引用14サイトカインの準備のため、他の場所で再構成したサイトカインを保存するときが示唆された tnf α の濃度はプロトコルの成功にとって重要です。サイトカインは細胞の応答性は、細胞 1 個あたりの受容器の数によって異なります。したがって、最適な tnf α 濃度は、細胞密度とライン15,16に依存します。我々 は 13.3 ng/mL の最終濃度に希釈して tnf α と 25,000 細胞/ウェルの周り曲線を用いた細胞密度を調整しました。したがって、各 tnf α 濃度の細胞密度は検証する必要があります。
カマチョ ・ ビジェガスら1.25 ng/mL の tnf α の最終的な集中を報告します。このグループはまた、ストレス細胞因子9,17,18としてアクチノマイシン D を使用します。私たち代わりに、FBS から 10% に変更アッセイ培地培地から 1% WEHI 164 tnf α だけで、プロトコルから別の変数を排除することで細胞のアポトーシスを誘導する強力なストレス信号を与えます。他のグループは、MTT を用いた細胞生存率を報告します。紫外可視吸光物質が培養培地または彼ら自身 (例えばフェノール、赤い吸収細胞に存在する吸光光度法ではなくカスパーゼ 37に敏感な発光基板を用いた方法論細胞) の信号と干渉することができます。したがって、アッセイの感度は、発光物質 (背景) 培養液中の存在は想定されていませんので、この Ac DEVD pNA luminescentreactant を使用して増加させました。
このメソッドの制限は、それが、tnf α に敏感な細胞にのみに適用されることができることです。他のセルの行をテストする必要があり、サイトカイン濃度を最適化された細胞応答の調整。一次電池のラインや体内分析; を使用していない我々 としては、絶対応答が測定ことはできませんさらに、代わりに、最初のメソッドの調整のため直交等温滴定熱量測定 (ITC) 実験が示唆されました。ITC からの情報は、開発中の新しい分子と tnf α の親和性を確立するため、生物学的方法の初期条件を指定するために便利です。
この方法は研究者の基底の相対的な応答を取得するための参照物質を持って新しい分子をテストする場合に便利したがって、バイオより良いまたはセルの保護に関する分子応答の評価をお勧めします。それは、他の抗 tnf α 蛋白質に適用できます。例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ、セルトリズマブ、またはゴリムマブ19の相対的生物学的効力の評価に適用されます。しかし、これらのすべての抗 tnf α 分子ある; サイトカインの異なる親和性したがって、その濃度を個別に調整する必要があります。このメソッドのもう一つの利点は、実験の開始と実行しやすく、結果の達成の間の短時間、安価な動物モデルに比べています。さらに、このメソッドは、mAb は、mAb は、tnf α 三量体を認識されて示唆している完全にアクティブな tnf α 分子との相互作用を計測し、分子がなかった変更ストレージまたは実験室の操作中に。その一方で、純粋な物理化学的アッセイ結果がまだあいまいです。たとえば、tnf α と従来の elisa 法を用いたモノクローナル抗体の相互作用は、サイトカインの化学固定化のための構造の変化に関連アイテムをすることができます。したがって、親和性が影響を受ける可能性、測定が侵害されました。また、ITC の解析中に希釈のソリューションは、tnf α や tnf α 三量体形成、モノクローナル抗体の相互作用、または人工エピトープの生成を抑制、モノクローナル抗体の構造を変更できます。この方法で細胞ラインの使用を要求できる;それにもかかわらず、tnf α に対する保護は、生体内で反応を模倣の興味深い結果を与えることができます。
わかりやすいし再現する方法を考案しました。発光は、フェノールレッドまたは他の紫外可視吸光物質によってマスクできませんと、ほぼすべての培地添加剤は細胞の育成に使用できます。この変更は、細胞、サイトカイン治療後生存率の完全な検出応答を要求の研究で研究者を支援します。少なくとも 3 つのセルの通路とセル密度調整は、中和法を実行する前にわれること。また、サイトカインとその濃度を安定化と同様、地球温暖化と CO2濃度を,培とソリューションは、アッセイの成功のための重要なステップです。全体的には、この手順を説明の in vitro生物学的試験を使用して、参照、および開発中のサンプルを比較する mAb とサイトカイン tnf α を中和するために必要です。
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Disclosures
著者がある何も開示するには
Acknowledgments
この作品は国立科学評議会によって支えられたし、技術 (CONACYT)、メキシコ、研究のデザインに参加せずに PEI CONACYT 2015 220333 を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | -- |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | -- | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
References
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