Summary
Kombineret precursor isotopmærkning og isobar tagging (cPILOT) er en kvantitativ proteomics strategi, der forbedrer prøve multiplexing kapaciteter isobare tags. Denne protokol beskriver anvendelsen af cPILOT til væv fra et Alzheimers sygdom-musemodel og vildtypekontroller.
Abstract
Der er en stigende efterspørgsel til at analysere mange biologiske prøver til sygdom forståelse og biomarkør opdagelse. Kvantitative proteomics strategier, der tillader samtidig måling af flere prøver er blevet udbredt og i høj grad reducere eksperimentelle omkostninger og tider. Vores laboratorium udviklet en teknik kaldet kombineret forstadium isotopmærkning og isobar tagging (cPILOT), hvilket forbedrer prøve multipleksing af traditionel isotopmærkning eller isobare tagging tilgange. Global cPILOT kan anvendes på prøver hidrørende fra celler, væv legemsvæsker eller hele organismer og giver information om de relative protein forekomster på tværs af forskellige prøvebetingelser. cPILOT virker ved 1) anvendelse af lave pH bufferbetingelser for selektivt dimethylate peptid N-terminaler og 2) ved hjælp af høj pH bufferbetingelser at mærke primære aminer med lysinrester med kommercielt tilgængelige isobare reagenser (se tabel of Materials / Reagenser). Graden afprøve multiplexing tilgængelig er afhængig af antallet af prækursor anvendte etiketter og isobare tagging reagens. Her præsenteres en 12-plex analyse ved anvendelse let og tung dimethylering kombineret med seks-plex isobare reagenser til at analysere 12 prøver fra musevæv i en enkelt analyse. Forbedret multipleksering er nyttig til reduktion af eksperimentel tid og omkostninger og endnu vigtigere, tillader sammenligning på tværs af mange prøvebetingelser (biologiske replikater, sygdomsstadie, medicinsk behandling, genotyper eller langsgående tidspunkter) med mindre eksperimentelle bias og fejl. I dette arbejde er det globale cPILOT fremgangsmåde anvendes til at analysere hjerne, hjerte, og levervæv tværs biologiske gentagelser fra en Alzheimers sygdom musemodel og vildtypekontroller. Global cPILOT kan anvendes til at studere andre biologiske processer og er indrettet til at øge prøve multiplexing til over 20 prøver.
Introduction
Proteomics involverer ofte analyse af mange prøver anvendt til bedre at forstå sygdomsprocesser, enzym kinetik, post-translationelle modifikationer, respons på miljømæssige stimuli, reaktion til terapeutiske behandlinger, biomarkører eller narkotika mekanismer. Kvantitative metoder kan anvendes til at måle de relative forskelle i proteinniveauer tværs prøverne og kan være etiket-fri eller involvere isotopmærkning (metabolisk, kemisk eller enzymatisk). Stabile metoder isotop mærkning er vokset i popularitet, fordi de tillader mange prøver, der skal analyseres samtidigt og er velegnet til prøver fra forskellige celler, væv legemsvæsker eller hele organismer. Isotopmærkning metode 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 stigning eksperimentel gennemløb,samtidig reducere købet tid, omkostninger og eksperimentel fejl. Disse fremgangsmåder anvender precursor massespektre til at måle relative mængder af proteiner fra peptidtoppe. I modsætning hertil isobare tagging reagenser 8, 9, 10 generere reporter ioner, der enten er detekteret i MS / MS eller MS 3 11 spektre og disse toppe anvendes til at rapportere om relativ hyppighed af proteiner.
Den nuværende state-of-the-art i proteomics multiplexing er enten en 10-plex 12 eller 12-plex isobar tag analyse 13. Forbedret prøve multiplexing (dvs.> 10 prøver) metoder er blevet udviklet af vores laboratorium for væv 14, 15, 16, 17, og af andre til analyse af celler 18 sup>, 19, 20, væv 21 eller målrettede peptider 22. Vi udviklede en forbedret multiplexing teknik kaldet kombineret forstadium isotopmærkning med isobar tagging (cPILOT). Global cPILOT er nyttig til at hente information om de relative koncentrationer af alle proteiner på tværs af forskellige prøvebetingelser (≥12) 14. Figur 1 viser en generel cPILOT arbejdsgang. Tryptiske eller Lys-C peptider er selektivt mærket ved N-terminalen med dimethylering anvendelse af lav pH 2 og ved lysinrester med 6-plex reagenser ved hjælp af høj pH. Denne strategi fordobler antallet af prøver, der kan analyseres med isobare reagenser, som bidrager til at reducere eksperimentelle omkostninger og derudover reducerer eksperimentelle trin og tid.
cPILOT er fleksibel som vi har udviklet andre metoder til at studere oxidativ posttranslationel modifikationer, herunder 3-nitrotyrosin-modificerede proteiner 14 og cysteinholdige peptider med S-nitrosylering (oxcyscPILOT) 23. Vi har også udviklet en aminosyre selektiv tilgang, cystein cPILOT (cyscPILOT) 17. MS 3 erhvervelse med en top-ion 11 eller selektiv-y1 -ion metode 15 kan reducere reporter ion interferens og forbedre kvantitativ nøjagtighed cPILOT. Anvendelsen af MS 3 i erhvervelse fremgangsmåde kræver en høj opløsning instrument med en orbitrap masseanalysator selvom lav opløsning ion trap instrumenter også kan arbejde 24.
Tidligere har cPILOT blevet anvendt til at undersøge leverproteiner 16 fra en Alzheimers sygdom musemodel. Her beskriver vi, hvordan du udfører globale cPILOT analyse ved hjælp af hjerne, hjerte og lever homogenater at studere rolle periphery i Alzheimers sygdom. Dette forsøg omfatter biologisk replikation. På grund af den alsidighed cPILOT, kan interesserede brugere bruge teknikken til at studere andre væv for en række biologiske problemer og systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Mus blev købt fra en uafhængig, non-profit biomedicinsk forskning institution og har til huse i afdelingen for Laboratory Animal Resources på University of Pittsburgh. Alle dyr protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Pittsburgh.
1. Protein Ekstraktion og Frembringelse af peptider til Kemisk tagging
- Uddrag protein fra væv, celler eller legemsvæsker.
- Homogenisere 60-90 mg væv (f.eks hjerne, hjerte og lever) i phosphatpuffer saltvand (1x PBS) med 8 M urinstof (500 uL) under anvendelse af en mekanisk homogenisator. Protease eller phosphataseinhibitorer kan tilsættes til pufferen, hvis nødvendigt. I dette projekt, blev de ikke brugt. Brug følgende parametre for homogenisatoren: lysering matrix A-perler, 4 m / s, 20 s. Hjertevæv kan kræve op til 9 cyklusser af homogenisering.
BEMÆRK: Protease eller phosphataseinhibitor s kan tilsættes til pufferen, hvis nødvendigt. De blev ikke anvendt i denne undersøgelse.- Fjern vævshomogenat fra lyserende rør og overfør til et mikro-centrifugerør. Skyl lysering rør med 100-500 pi PBS med 8 M urinstof og kombinere skylleopløsningen med vævshomogenat.
- Centrifuger homogeniserede væv (9447 xg, 4 ° C, 15 min) og den ovenstående væske opsamles.
- Homogenisere 60-90 mg væv (f.eks hjerne, hjerte og lever) i phosphatpuffer saltvand (1x PBS) med 8 M urinstof (500 uL) under anvendelse af en mekanisk homogenisator. Protease eller phosphataseinhibitorer kan tilsættes til pufferen, hvis nødvendigt. I dette projekt, blev de ikke brugt. Brug følgende parametre for homogenisatoren: lysering matrix A-perler, 4 m / s, 20 s. Hjertevæv kan kræve op til 9 cyklusser af homogenisering.
- Bestemme proteinkoncentrationen ved anvendelse af en bicinchoninsyre (BCA) ifølge producentens anvisninger.
BEMÆRK: Yderligere fortynding med buffer kan være nødvendig, hvis proteinkoncentrationen er for høj. De resulterende koncentrationer for prøver fra disse væv var i mellem 6-13 ug / uL.- Valgfrit: Tilføj en intern kvalitetskontrol standard (f.eks bovint alfa casein eller andet exogent protein) med forholdet 1 ug standard: 100 pg protein prøve.
- Tilsættes 100 ug (100 x 10 -6 g) protein fra hver prøve til individuelt mærkede mikrocentrifugerør. Volumenet er afhængig af proteinkoncentrationen (se trin 1.2).
- Tilføje dithiothreitol (DTT) (40: 1 reagens til prøve mol forhold) til hver prøve. Der inkuberes ved 37 ° C i 2 timer. Beregningen for det molære forhold er baseret ud proteinmasse af bovint serumalbumin (BSA), som er 66,5 x 10 3 g / mol.
- Tilføje iodacetamid (IAM) (80: 1 reagens til prøve mol forhold) til hver prøve. Inkuber på is i mørke i 2 timer. Denne reaktion udføres på is i 2 timer for at forhindre sidereaktioner.
- Tilføje L-cystein (40: 1 reagens til prøve mol forhold) til hver prøve. Inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Tilsæt 20 mM Tris-buffer med 10 mM CaCl2 (pH 8,2) for at fortynde urinstof til en slutkoncentration på 2 M.
- Tilføje L-1-tosylamido-2 phenylethyl (TPCK) -behandlet trypsin (50: 1 substrat til enzym mol forhold) til hver prøve og inkuberes ved 37 ° C i 24 timer.
- Stands protein fordøjelse ved flash-frysning af prøven i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C indtil yderligere bearbejdning.
3. Prøve Afsaltning
- Re-syrne prøverne ved at tilsætte myresyre (FA). Tilsæt så FA til opnåelse af en slutkoncentration på 0,1%. Hvis prøverne er oprindeligt ved -80 ° C, optøs prøverne på is, før man igen forsuring.
- De-salt peptiderne under anvendelse af C18 hydrofil lipofil afbalanceret (HLB) 10 mg patroner som tidligere beskrevet 16.
- Tør prøver ved vakuumcentrifugering (5 Torr, 45 ° C, 77 xg) til et volumen på ~ 10 pi.
4. dimethylering Mærkning (N-terminaler)
- Rekonstruere peptider i 1% eddikesyre (0,25 ng / nl) opløst i højtryksvæskechromatografi (HPLC) eller nano-rensede kvalitet vand. Fjerne en 50 μG portion til en ny mikro-centrifugerør (1,5 ml) og gemme resten ved -80 ° C.
- Tilsæt 8 pi 60 mM (4%) CH2O (37% vægt / volumen) eller 60 mM (4%) 13 CD 2 O (20% vægt / volumen) til prøverne for mærkning med let eller tung dimethylering henholdsvis . Typisk tilsættes 4 pi af reagens pr 25 ug peptider (trin 4.2, 4.3, 4.6).
- Tilføje 8 pi af 24 mM NaBH3CN eller 24 mM NaBD CH3CN til prøverne mærket med let eller tung dimethylering hhv.
- Vortex og rystes på et rør rysteapparat i ~ 10 minutter ved stuetemperatur.
- Stands reaktionerne ved at tilsætte 16 pi af 1% ammoniak (~ 28-30% v / v) i 5 minutter. Typisk tilsættes 8 pi reagens pr 25 ug af peptider.
- Re-syrne reaktionsblandingerne ved tilsætning 8 pi af 5% FA (98% v / v).
- Kombiner de lette og tunge dimethylerede peptider (figur 1) for at danne i alt seks prøver. Se tabel 1
- Udfør prøve afsaltning ifølge trin 3.2 og 3.3.
5. isobare Tagging (Lys-rester)
- Rekonstituer 100 ug dimethylerede peptider (1 pg / pl) i 100 mM tri-ethyl ammonium (TEAB) puffer (pH ~ 8,5).
- Forberede isobare reagenser som angivet i fabrikantens protokol (se tabel of Materials / Reagenser).
- Tilføje solubiliserede isobare reagenser (41 pi) til peptider og vortex for ~ 10 s. Ryst prøverne på en mikro-centrifugerør rysteapparat i ~ 1 time. Stands reaktionerne med 8 pi hydroxylamin (10% vægt / volumen) og inkuber prøverne i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Samle de seks mærkede prøver i en enkelt blanding og afsalte (trin 3,1-3,3) eller opbevares ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
BEMÆRK: Til forbedring proteom dækning og dybde, er en flerdimensional separeringsstrategi foreslåetsåsom stærk kationbytter (SCX).
6. Stærk kationbytter
- Udfør SCX som pr producentens protokol (se Materialer tabel).
- Forberede ~ 1 ml ammoniumformiat opløsninger (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, og 500 mM) med 10% acetonitril (ACN), 0,1% FA (pH 3).
- Fjern den røde hætte fra toppen af pipettespidsen og tryk pipettespidsen med pakning opslæmning for at sikre, at pakningsmaterialet er mod bunden af pipettespidsen.
BEMÆRK: Kritisk: Smid ikke pipettespidsen indtil udgangen af protokollen. - Placer centrifugen adapteren på toppen af en mikro-centrifugerør (2 ml) og fastgør pipettespidsen inde.
- Tilføj 150 pi SCX rekonstituering buffer til pipettespidser.
- Centrifugeres pipettespidserne i 6 minutter ved stuetemperatur (4.000 xg). Gentag dette trin to gange mere og smid affaldet.
- Opløs peptides i 150 pi SCX rekonstitutionsbuffer. Sikre, at pH er 3.
- Tilføj peptider til pipettespidser, centrifuge (se 6.1.5), og holde eluenten.
- Overføre filteret og pipetten til en ny mikro-centrifugerør (2 ml) og tilsæt 150 pi 20 mM ammoniumformiat opløsning. Centrifugeres i 6 minutter ved stuetemperatur (4.000 xg) og holde eluenten.
- Gentag trin 6.1.8 yderligere syv gange med successive koncentrationer (dvs. 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM og 500 mM) ammoniumformiat.
- Overføre de otte SCX fraktionerne til mikrocentrifugerør (1,5 ml) og koncentrere dem ved hjælp centrifugal fordampning (se trin 3.3).
7. væskekromatografi-Tandem-massespektrometri (LC-MS / MS) og MS 3
- Rekonstituer peptiderne i massespektrometri kvalitet vand med 0,1% FA, filtreres og anbringes i en autosampler hætteglas. Filter peptider som follOWS:
- Tilføje rekonstitueret peptider til en mikro-centrifugerør indeholdende et 0,65 um filter (se Materialer tabel).
- Centrifuge peptider ved 12.000 xg i 1 min. Fjerne filter, kasseres, og tilføj filtrerede peptider i en autosampler hætteglas.
- Fremstille de mobile buffere fase som følger: 3% (vol / vol) ACN med 0,1% FA (A) og 100% ACN med 0,1% FA (B).
- Injicer 6 pi hver SCX prøve fraktion på en fælde søjle pakket til 2 cm med C18 materiale (5 um, 200 Å porestørrelse).
BEMÆRK: Prøve rengøring på fælden er som følger: 3 min, 0% B; 3 uL / minut under anvendelse af en 2D væskechromatografisystem (se Materialer tabel). - Kør den analytiske adskillelsesmetode. Brug en 75 pm diameter x 13,2 cm laser trukket-tip kvartsglas kapillarkolonne pakket med C18 materiale (5 um, 100 Å). Gradienten er: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% B; 40-90 min, 15-25% B; 90-115 min, 25-30% B; 115-130 min, 30-60% B; 130-135 min, 60-80% B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% B; 150-180 min, 10% B; 300 nL / min, 180 min.
- Kør datafangst for massespektrometret mens den analytiske separationsmetode kører.
BEMÆRK: Parametrene for MS-undersøgelsen scanning er som følger: 400-1,600 m / z, 60.000 opløsning, automatisk forstærkningsregulering (AGC) målrette 1 x 10 6 ioner, maksimal injektion tid 500 ms. Parametre for CID-MS / MS er som følger: Top 1-7 eller Top 8-14 dataafhængig anskaffelse (DDA), 3 m / z isolation bredde, 500 mindste signal, 35% normaliseret kollisionsenergi (NCE), 0,25 aktivering q , 10 ms aktiveringstid, 3 x 10 4 AGC, 50 ms maksimale injektionstid. Parametre for HCD-MS 3 er som følger: 200 mindste signal, 4 m / z isolation bredde, 60% NCE, 0,1 aktiveringstid, 3 x 10 5 AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z MS / MS områdevalg udelukke un-fragmenteret moderion.
8. Dataanalyse 16
- Søg RAW filer ved hjælp af protein analyse software mod en passende database, såsom mus Uniprot.
BEMÆRK: Det er vigtigt at skabe to arbejdsgange for hver RAW-fil for at søge efter lette og tunge dimethylerede peptider. - Søge i RAW-filer under anvendelse af følgende parametre: trypsin med to ubesvarede spaltninger, peptid masseområde 300-6,000 Da, 15 ppm modermassen tolerance, 1 Da fragmentering tolerance. Statiske modifikationer: lys dimethylering (28,031, peptid N-terminus) eller heavy dimethylering (36,076 Da, peptid N-terminal), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
BEMÆRK: Nogle gange den tunge dimethyleret top er ~ 7 Da (35,069 Da, peptid N-terminal) er fra lyset dimethylerede top og derfor bør indarbejdes i søgningen arbejdsgang for tunge dimethylerede peptider. Dynamiske modifikationer: oxidation (15,995 Da, M), 6-plex isobar tag (229,163 Da, K). Omfatter en attrap databasesøgning til opnåelse falske opdagelse satser (fx 1 og 5%) og en kvantificering knudepunkt at søge efter reporter ionintensiteterne af isobare tags. - Statistik
- Eksport af data i en elektronisk regnearksprogram med henblik på at normalisere protein reporter ion værdier. For hvert protein, opdele enten median reporter ion nøgletal eller rå reporter ionintensiteterne af medianen mellem den interne standard eller rå reporter ionintensiteterne for den interne standard, henholdsvis. Brug den relevante statistiske software som en elektronisk regnearksprogram, Perseus, eller R for at bestemme signifikante ændringer blandt prøvebetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
cPILOT anvender aminbaseret kemi til kemisk label peptider ved N-terminalen og lysinrester og forbedrer prøve multiplexing kapaciteter. Figur 2 viser repræsentative MS data, der er opnået fra en 12-plex cPILOT analyse af hjerne, hjerte, og levervæv fra et Alzheimers sygdom-musemodel og vildtypekontroller. Som vist i tabel 1, er to biologiske replikater for Alzheimers sygdom og vildtypemus inkluderet i denne 12-plex analyse. Figur 2A viser en dobbelt ladet top par der er adskilt af m / z afstand på 4 indikerer en enkelt dimethyl gruppe blev inkorporeret i peptidet. Både de lette og tunge dimethylerede toppe i dette par uafhængigt isolerede og fragmenteret med CID. MS / MS-data for hver af de dimethylerede peptider er vist i fig 2B og C. Søgeresultater angive dette pair af toppe hører til T (dimethyl) ELNYFAK (isobarisk-tag 6) peptid af proteinet phosphoglyceratkinase 1. Den mest intense fragment ion er y 3+ som er ens for både de lette og tunge dimethylerede toppe. Disse toppe isoleres yderligere for HCD-MS 3 og reporter-ioner (m / z 126-131) observeres som vist i figurerne 2D og 2E. Begge sæt af MS 3 spektre er nødvendige for at få oplysninger om de 12 prøver. I dette eksempel er reporter ionforholdene (AD / WT) (Alzheimers sygdom / Vildtype kontrol) i hjerne, lever, og hjertevæv er ens i de to biologiske replikater. Fold-change værdier for hver sammenligning tyder på, at phosphoglyceratkinase 1-niveauer i hjernen og hjertet er højere i AD-mus, mens niveauerne i leveren er lavere.
Figure 1: Proteomics arbejdsgang ved hjælp cPILOT. Som et eksempel, denne arbejdsgang skitserer analyse af 12 individuelle prøver. Proteiner fra væv, celler eller legemsvæsker ekstraheres og tilsættes en egnet proteinstandard (fx bovint alfa-casein). Proteiner fordøjes ved anvendelse af trypsin. Peptider er mærket i den N-terminale ende ved hjælp af let eller tung dimethylering (pH ~ 2,5) og ved lysinrester ved anvendelse TMT 6 -plex (pH ~ 8,5). Mærkede peptider samles i en enkelt blanding og underlagt SCX RP-LC-MS / MS og MS 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempel cPILOT data for peptider fra hjerne, hjerte, og levervæv fra et Alzheimers sygdom-musemodel og vildtypekontroller. (A) viser lette og tunge dimethylerede peptider, repræsenteret ved toppene ved m / z 643,854 og 647,875. Disse peptider blev udvalgt, isoleret og fragmenteret, hvorved der genereres CID-MS / MS-spektre (B og C), som billede peptididentifikation. En yderligere udvælgelse, isolation og fragmentering af den mest intense fragment ion af de lette og tunge dimethylerede peptider ved MS / MS stadium genereres HCD-MS 3 spektre (D og E), henholdsvis. Peptidsekvensen er T (dimethyl) ELNYFAK (isobarisk-tag 6) og hører phosphoglyceratkinase 1. klik her for at se en større version af denne figur.
| isobarisk Reagens0; | ||||||
| 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | |
| Lys dimethylering | WT en | AD b | WT | AD | WT | AD |
| hjerne | hjerte | lever | ||||
| Heavy dimethylering | WT | AD | WT | AD | WT | AD |
| hjerte | lever | hjerne | ||||
| Vævet er enten fra en vildtype-kontrol (WT) en eller Alzheimers sygdom mus (AD) b. | ||||||
Tabel 1: cPILOT gruppering af AD og WT hjerne, hjerte, og levervæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cPILOT giver mulighed for samtidig måling af mere end 12 unikke prøver. For at sikre en vellykket tagging på både N-terminalen og lysinrester af peptider, er det bydende nødvendigt at have den korrekte pH-værdi for hvert sæt af reaktioner og udføre dimethylering reaktionen først for peptid mærkning. Selektiv dimethylering i N-terminus udføres ved at have en pH på ~ 2,5 (± 0,2). Dette opnås ved at udnytte forskellene i pKa s af aminogrupperne på lysin og N-terminus. Ved pH 2,5, lysin er inaktiv (pKA ~ 10,5); men hvis pH er mildt sur (dvs. pH 5-7) eller basisk, både N-terminalerne og lysinrester vil blive dimethyleret. Desuden, hvis isobar tagging udføres først ved en lav pH, vil N-terminalerne har de isobare label og lysinrester vil blive dimethyleret. Dette kan resultere i mindre fragmenter, vælges til MS 3 som b-ioner vil skulle vælges. De relative omkostninger ved den dimethylation reaktioner er billig i forhold til de kommercielle isobare reagenser. Mens man kan bruge en hel isobar reagenshætteglas pr 100 ug, har vi også haft succes med halvdelen af reagenset hætteglas pr 100 ug med sammenlignelig effektivitet mærkning. Dette medvirker til at reducere omkostningerne for individuelle cPILOT eksperimenter og giver flere prøver, der skal analyseres. Det er også vigtigt at bemærke, at andre isobare tagging reagenser kan anvendes i stedet for den isobare reagens anvendt i denne protokol som vi tidligere har vist 14. For at sikre en høj mærkning og tagging effektivitet, er det vigtigt at tilføje reagenser til prøverne hurtigt. Dette vil muliggøre prøver at have omtrent samme reaktionstid. Til kvantitative formål, bør hver prøve behandles ens især før samle prøver ved dimethylering og isobare trin mærkning. Endelig skal det bemærkes, at arbejde med mange prøver samtidigt i de indledende trin requires omhyggelig bruger dygtighed og opmærksomhed til at prøve håndtering.
Det mest ideelle er at opnå reporter ioner for hver protein i blandingen i de 12 prøver. Dette er imidlertid ikke tilfældet for et stort antal proteiner. Det antal peptider påvist med kvantificering om cPILOT og andre forbedrede multiplexing nærmer afhænger af flere faktorer, herunder prøvetype, prøve fraktionering og procestrin, MS datafangst metoder, og instrumenttype. Selvom både dimethylering og isobare tagging trin har en høj peptid mærkningseffekt på ~ 95-99%, er der stadig ~ 20% af MS 3 data, som ikke vil indeholde reporter ion information. Dette skyldes til dels, at anvendelse af trypsin som genererer arginin-terminerede peptider, der resulterer i ingen inkorporering af isobar reagens. Dette kan løses ved hjælp af andre enzymer, såsom LysC, med en potentiel tradeoff i protein-identifikationer 25. Også for tungdimethylerede peptider kan vælges til fragmentering peak være M eller M-1 top, som har forskellige intensiteter og vil påvirke reporter ionintensiteterne observeret i MS 3 trin. Således kan der være nogle lave intensitet reporter ioner, der ikke påvises for nogle prøver. Sådanne situationer er ofte almindeligvis observeret for lav intensitet MS / MS-fragmenter, som er isoleret til MS 3 trin. En stor løsning på dette problem er blevet inkorporeret i tribrid massespektrometre, som i stedet for anvendelse af single-notch udvælgelse for MS 3, anvender flere hak eller flere MS / MS-fragmenter 26.
Der er masser af alsidighed i cPILOT tilgang især med hensyn til antallet af prøver, som kan sammenlignes i en enkelt analyse (dvs. op til 20 med kommercielle isobare reagenser) og de typer af anvendte væv. Vi viste, at det er let at opnå præcise kvantitative oplysninger fra hjerne, hjerte, oglevervæv i den samme analyse i forbindelse med en sygdom. Denne metode, på samme måde som andre multiplexing fremgangsmåder, tillader analyse af multiple prøver på én gang, og anvendes på prøver, der stammer fra celler, væv legemsvæsker eller hele organismer. Desuden cPILOT mærkede peptider er i stand til at blive analyseret under anvendelse af enten en lav 24 eller høj opløsning (60.000) instrument. Til sammenligning opnå vellykket måling med andre multiplexing metoder kan være begrænset til en specifik type prøve (dvs. celler) 18, kan kræve et instrument med meget høj opløsning 20 eller adgang til stabile isotopmærker. cPILOT er fantastisk til brugere med interesse for sygdom forståelse, biomarkør opdagelse, reaktion på et lægemiddel eller terapeutisk indgriben, eller langsgående ændringer på tværs af mange tidspunkter. Desuden er der for store shotgun proteomics analyser af kliniske prøver (hvor N er stor, hundredvis til tusindvis), cPILOT kan også være egnet til at hjælpe med at reducere eksperimentelle omkostninger og tid. I fremtiden vil cPILOT blive udvidet til at multiplekse et større antal prøver ved anvendelse af eksisterende og hidtil ukendt isotopisk og isobare etiketter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne erkender University of Pittsburgh startfonde og NIH, NIGMS R01 tilskud (GM 117.191-01) til RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | - | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | - | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
References
- Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
