Summary
تقدم هذه الورقة سير العمل المجهري عالية المحتوى لتحديد الكمي في وقت واحد من مستويات روس داخل الخلايا، فضلا عن إمكانات الغشاء الميتوكوندريا والمورفولوجيا - يشار إليها مجتمعة باسم مورفوفونكتيون الميتوكوندريا - في الخلايا الملتصقة الحية باستخدام الخلايا الخلوية جزيئات مراسل الفلورسنت 5- 6) -كلوروميثيل -2 '، 7'- ثنائي كلورودي هيدروفلورسئين دياسيتات، استر أستيل (سم-H 2 دسفدا) وتيتراميثيلرودامين ميثيلستر (تمرم).
Abstract
أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) تنظم العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك التعبير الجيني، والهجرة، والتمايز والانتشار. ومع ذلك، فإن مستويات روس الزائدة تحفز حالة من الإجهاد التأكسدي، الذي يرافقه الأكسدة لا رجعة فيه الضرر إلى الحمض النووي، والدهون والبروتينات. وبالتالي، الكمي من روس يوفر بديلا مباشرا للحالة الصحية الخلوية. منذ الميتوكوندريا هي من بين المصادر الخلوية الرئيسية وأهداف روس، التحليل المشترك لوظيفة الميتوكوندريا وإنتاج روس في نفس الخلايا أمر بالغ الأهمية لفهم أفضل للربط في الظروف الفيزيولوجية المرضية. لذلك، تم تطوير استراتيجية عالية المستندة إلى المجهري على أساس الكمي في وقت واحد من مستويات روس الخلايا، والغشاء الميتوكوندريا المحتملة (ΔΨ م ) والتشكل الميتوكوندريا. لأنه يقوم على الآلي ويبيدفيلد المجهر مضان وتحليل الصور من الخلايا الملتصقة الحية، نمت في لوحات متعددة جيدا، وستيند مع جزيئات مراسل الفلورسنت خلية نفاذية سم-H 2 دكفدا (روس) و تمرم (ΔΨ م والتشكل الميتوكوندريا). على النقيض من قياس الفلور أو التدفق الخلوي، وهذه الاستراتيجية تسمح الكمي من المعلمات تحت الخلية على مستوى الخلية الفردية مع ارتفاع القرار الزماني الزماني، قبل وبعد التحفيز التجريبي. الأهم من ذلك، فإن الطبيعة القائمة على الصورة من طريقة يسمح استخراج المعلمات المورفولوجية بالإضافة إلى شدة الإشارة. وتستخدم مجموعة الخصائص المجمعة للتحليل الاستكشافي والإحصائي للبيانات المتعددة المتغيرات لكشف الاختلافات بين المجموعات السكانية الفرعية وأنواع الخلايا و / أو العلاجات. هنا، يتم تقديم وصف مفصل للمقايسة، جنبا إلى جنب مع مثال التجربة التي تثبت قدرتها على التمييز لا لبس فيه بين الحالات الخلوية بعد الاضطراب الكيميائي.
Introduction
وينظم تركيز روس داخل الخلايا بدقة من خلال التفاعل الديناميكي بين روس إنتاج ونظم روس إزالة الغبار. الخلل بين اثنين يثير حالة من الاكسدة. من بين المصادر الرئيسية لل روس هي الميتوكوندريا 1 . نظرا لدورها في التنفس الخلوي، فهي المسؤولة عن الجزء الأكبر من الفوق الخلايا داخل الخلايا (O 2 • - ) جزيئات 2 . وهذا ينتج في معظمه من تسرب الإلكترون إلى O 2 في مجمع 1 من سلسلة النقل الإلكترون في ظل ظروف قوية سلبية سلبية الغشاء الميتوكوندريا الداخلي (Δψ م )، أي فرط الاستقطاب الميتوكوندريا. من ناحية أخرى، كان الاستقطاب الميتوكوندريا يرتبط أيضا مع زيادة إنتاج روس مشيرا إلى وسائط متعددة من العمل 3 ، 4 ، 5 ،> 6 ، 7 ، 8 . وعلاوة على ذلك، من خلال التعديلات الأكسدة في البروتينات من الانصهار الانشطار الآلات، روس تشارك في تنظيم التشكل الميتوكوندريا 9. على سبيل المثال، يرتبط تجزئة مع زيادة إنتاج روس والموت الخلايا المبرمج 10 ، 11 ، في حين تم ربط الميتوكوندريا الخيطية إلى المجاعة المغذية والحماية ضد ميتوفاغي 12 . ونظرا للعلاقة المعقدة بين روس الخلوية والميتوكوندريا مورفوفونكتيون، كلاهما ينبغي أن يكون مثاليا في وقت واحد في الخلايا الحية. للقيام بذلك بالضبط، وقد وضعت مقايسة التصوير عالية المحتوى على أساس المجهري ويديفيلد الآلي وتحليل الصور من الثقافات خلية ملتصقة ملطخة تحقيقات الفلورسنت سم-H 2 دكفدا (روس) و تمرم (الميتوكوندريا Δψ م و مورفولوجيا). التصوير عالي المحتوى يشير إلى استخراج سب( أي عدد كبير من السمات الوصفية) معلومات عن المظاهر الخلوية باستخدام علامات تكميلية متعددة وتحليلات الصور الآلية. عندما يقترن المجهري الآلي يمكن فحص العديد من العينات في موازاة ( أي عالية الإنتاجية)، وبالتالي زيادة القوة الإحصائية للمقايسة. في الواقع، أحد الأصول الرئيسية للبروتوكول هو أنه يسمح للكمي في وقت واحد من المعلمات متعددة في نفس الخلية، وهذا لعدد كبير من الخلايا والظروف.
وينقسم البروتوكول إلى 8 أجزاء (وصفها بالتفصيل في البروتوكول أدناه): 1) خلايا البذر في لوحة 96 جيدا. 2) إعداد حلول الأسهم، حلول العمل والتصوير العازلة؛ 3) إعداد المجهر. 4) تحميل الخلايا مع سم-H 2 دكفدا و تمرم. 5) الأولى الحية التصوير جولة لقياس مستويات روس القاعدية و مورفوفونكتيون الميتوكوندريا. 6) الثانية الحية التصوير جولة بعد إضافة -تيل البوتيلبيروكسيد (تبهب) لقياس مستويات روس المستحثة؛ 7) الآلي تحليل الصور؛ 8) تحليل البيانات، ومراقبة الجودة والتصور.
وقد وضعت في الأصل أصلا لالألياف الليفية البشرية البشرية الطبيعية (ندف). وبما أن هذه الخلايا كبيرة ومسطحة، فهي مناسبة تماما لتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا في 2D ويديفيلد الصور 13 ، 14 . ومع ذلك، مع تعديلات طفيفة، هذه الطريقة تنطبق على أنواع الخلايا الملتصقة الأخرى. وعلاوة على ذلك، بجانب مزيج من سم-H 2 دكفدا و تمرم، سير العمل يتوافق مع مجموعة متنوعة من أزواج صبغ الفلورسنت مع الخصائص الجزيئية المختلفة 1 ، 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يوصف البروتوكول أدناه على أنها نفذت للخلايا ندف ومع استخدام لوحات مولتيويل المحددة في ملف المواد. انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة حول سير العمل.
1. إعداد الكواشف
- إعداد المتوسطة كاملة عن طريق استكمال دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) مع 10٪ V / V مصل البقري الجنين (فبس) و 100 إيو / مل البنسلين و 100 إيو / مل الستربتومايسين (بس). ل 500 مل المتوسطة كاملة، إضافة 50 مل من فبس و 5 مل من بس إلى 445 مل من دمم.
- إعداد هبس (ه) العازلة التصوير عن طريق استكمال حل الملح المتوازن هانك (مع المغنيسيوم والكالسيوم، ولكن من دون الفينول الأحمر) مع 20 ملي هيبيس. ل 500 ملل ساعة، إضافة 10 مل من محلول الأسهم هيبيس 1M إلى 490 مل هبس. تحقق من الرقم الهيدروجيني، وإذا لزم الأمر، والضبط لدرجة الحموضة 7.2.
- إعداد 1 ملم سم-H 2 حل الأسهم دكفدا عن طريق إذابة 50 ميكروغرام من سم-H 2 دكفدا مسحوق مجفف بالتجميد في 86.5 &# 181؛ L اللامائية دمسو. مزيج من قبل فورتيكسينغ أو بيبتينغ صعودا وهبوطا وجعل 20 أليكوتس ميكرولتر في أنابيب ميكروسنتريفوج البني. مخزن في الظلام في -20 درجة مئوية واستخدامها في غضون 1 أسبوع. إذا تخزينها تحت N- 2 الغلاف الجوي الجرف الحياة يمكن زيادة تصل إلى 1 شهر على الأقل.
- إعداد 1 ملي حل المخزون تمرم عن طريق إذابة 25 ملغ مسحوق تمرم في 50 مل دمسو اللامائية. مزيج بواسطة فورتيكسينغ أو بيبتينغ صعودا وهبوطا وجعل 10 قسامة ميكرولتر في أنابيب ميكروسنتريفوج البني. تخزين في الظلام في -20 درجة مئوية. هذا الحل مستقر لمدة سنة على الأقل.
- إعداد قسامة جديدة من تيرت -butyl بيروكسيد (تبهب) الأسهم (~ 7 M) لكل تجربة من قبل بيبتينغ مباشرة حجم من الحل الأسهم 70٪ (10 ميكرولتر / 96 جيدا لوحة). إبقاء هذه قسامة في 4 درجات مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
- إعداد الأجسام المضادة حل العمل (أب) عن طريق تمييع اثنين من الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا فلور 488 حمار المضادة للأرنب و CY3 حمار المضادة للأرنب) 1،000 مرة في 1X ه-بوffer.
2. إعداد المجهر والبروتوكول اكتساب (± 15 دقيقة)
ملاحظة: يتم تنفيذ اكتساب الصورة مع المجهر حقل واسع مجهزة مرحلة الآلي والمصاريع، ونظام ضبط تلقائي للصورة الأجهزة القائمة باستخدام 20X الهواء خطة تصحيح الهدف (نا = 0.75) وكاميرا إم-كسد. عند إعداد الفحص لأول مرة، يتم استخدام لوحة اختبار تحتوي على خلايا التحكم، ملطخة وفقا لتعليمات البروتوكول لمعايرة المرحلة زي وتحسين إعدادات الاستحواذ. إذا تم بالفعل تحديد إعدادات الاستحواذ، يمكن أن يتم المعايرة باستخدام لوحة فارغة.
- خفض الهدف إلى مستوى القاعدة المطلقة ومعايرة XY- مرحلة التالية تعليمات البرمجيات.
- تأكد من تثبيت مكعبات التصفية الصحيحة. لتصور سم-H 2 دكفدا، استخدم معيار فلتر غفب مكعب مع 472/30 نانومتر مرشح ممر الموجة، 495 نانومتر قطع ديكروومرآة إيك وفلتر انبعاث الموجة العمودية 520/35 نانومتر. ل تمرم، استخدام مكعب فلتر ل تريتك مع 540/25 نانومتر باندباس الإثارة مرشح، 565 نانومتر قطع مزدوج اللون ومرآة و 605/55 نانومتر مرشح انبوب الموجة.
- إنشاء بروتوكول التصوير باستخدام برنامج الاستحواذ.
- حدد النوع الصحيح من لوحة مولتيويل (الشركة المصنعة ورمز) من قائمة لوحات المتاحة المقدمة داخل البرنامج. بدلا من ذلك تحديد شكل لوحة مولتيويل الخاصة باستخدام لوحة وأبعاد جيدا.
- محاذاة لوحة جيدا وفقا لتعليمات البرنامج، على سبيل المثال عن طريق تحديد زوايا اثنين من آبار الزاوية الخارجية الأربعة. تغطي هذه الخطوة لتغيير اتجاه الكاميرا.
- حدد الآبار التي تحتاج إلى الحصول عليها. إذا كان هذا الخيار غير متوفر في البرنامج، استخدم مجموعة من المواقع زي المحددة يدويا التي تتوافق مع الآبار المحددة.
- تحسين إعدادات الاستحواذ (وقت التعرض، وكثافة مصباح، إم الربح) له قناتين بشكل منفصل باستخدام لوحة الاختبار. تقليل التعرض وكثافة كما ضوء الإثارة مضان نفسه يدفع روس. ولكن، تأكد من أن نسبة الإشارة إلى الخلفية هي على الأقل 2 لالقاعدية سم-H 2 دسفدا و 3 ل تمرم قبل العلاج تبهب، وأنه لا يوجد تشبع بعد العلاج تبهب. إعدادات الاكتساب تعتمد إلى حد كبير على الإعداد المجهري ونوع الخلية المستخدمة، ولكن كمرجع، وإعدادات الإرشادية عند استخدام لمبة هاليد معدنية من 130 W كمصدر للضوء وخلايا ندف الملطخة وفقا لتعليمات البروتوكول هي التالية: لكل من CM- H 2 دكفدا و تمرم يستخدم وقت التعرض 200 مللي ثانية و ند مرشح 8، جنبا إلى جنب مع كسب إم من 15 (13 ميغاهرتز؛ 14 بت) و 4 (27 ميغاهرتز؛ 14 بت) على التوالي. مرة واحدة الأمثل لنوع معين من الإعداد ونوع الخلية، يمكن تخطي هذه الخطوة.
ملاحظة: من الضروري أن يتم الاحتفاظ إعدادات الاكتساب نفسه خلال عملية التصوير بأكملها. لتجارب واسعة النطاق، لعدة أيام، مصباح ستابيليتي ينبغي أن تكون مبررة من قبل مراقبة الجودة العادية. - تحديد بروتوكول الاستحواذ، ويتألف من لامدا متتابعة (الطول الموجي) الاستحواذ. حدد قناة سم-H 2 دسفدا التي سيتم الحصول عليها أولا، لتقليل التعرض للضوء قبل القياس.
- تحديد حلقة جيدا لوحة، للحصول على 4 متباعدة بشكل منتظم الصور غير متداخلة المتمركزة حول مركز كل بئر من اختيار جيدا باستخدام بروتوكول الاستحواذ المعرفة في 2.3.4. اختيار الحصول على صورة متعرجة، أي، أولا من اليسار إلى اليمين، من B02 جيدا إلى B11، ثم مرة أخرى، من اليمين إلى اليسار، من جيدا C11 إلى C02 وهلم جرا ( الشكل 2A ). هذا يوفر الوقت مقارنة اليسار إلى اليمين الحصول على الصور. إذا كان هذا الخيار غير متوفر في البرنامج، وضبط مجموعة مخصصة من X- المواقع التي تم إنشاؤها في 2.3.3 لاتخاذ على هذا النمط التصوير.
- حفظ الإحداثيات زي من مواقع التصوير (على سبيل المثال في ملف شمل منفصلة)، للسماح سهلة المراجعةنانوغرام في حالة المجهر إعادة معايرة. هذا مهم بشكل خاص إذا كان يجب أن تكون مرتبطة قراءات من هذا الفحص مع المناعي بعد تلطيخ (إف) تلطيخ لنفس الخلايا.
3 - خلايا البذر في لوحة 96 جيدا (45 - 90 دقيقة، اعتمادا على عدد من خطوط الخلايا المختلفة)
- العمل في بيئة معقمة مثل فئة 2 السلامة الأحيائية مجلس الوزراء وارتداء قفازات.
- تطهير جميع الأسطح والمواد باستخدام 70٪ v / v الايثانول في الماء المقطر.
- اتخاذ قارورة ثقافة الخلية مع ثقافة الخلايا متموجة 90٪ من الحاضنة ووضعه في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
- غسل الخلايا مرتين مع بس 1X.
- إضافة كمية مناسبة من 0.05٪ التربسين-إدتا الحل على الخلايا، والتأكد من أن يتم تغطية سطح الخلية كاملة (على سبيل المثال ، 1 مل لقارورة T25)، واحتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .
- إذا كانت جميع الخلايا منفصلة (تحقق مع المجهر )، إضافة ثقافة المتوسطة (دمم + 10٪ فبس + 1٪ البنسلين ستربتومايسين؛ ± 4 مل في قارورة T25) لتعطيل الحل التربسين إدتا.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في وسط الاستزراع. تحديد كمية المتوسطة لكل نوع من الخلايا للحصول على تركيز الخلية التي تتوافق مع عد الخلايا. عادة، يحتوي على قارورة T25 متموجة T25 من ندف ما يقرب من 1-1.5 مليون الخلايا، التي معلق في 3-4 مل من وسط الثقافة.
- عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا أو عداد كولتر.
- البذور 8،000-10،000 الخلايا في كل من 60 بئرا الداخلية لوحة سوداء 96 جيدا مع رقيقة رقيقة البوليسترين أو أسفل الزجاج (أسود لتجنب تشتت والتقاطع بين الآبار المجاورة أثناء التصوير). عند استخدام ظروف مختلفة / العلاجات / خطوط الخلايا، وتوزيع مواقع البذر الخاصة بهم متجانسة على لوحة وذلك للحد من الآثار لوحة (التين "> الشكل 2 أ)، ولا تستخدم الآبار الخارجية، باستثناء البئر B01 و A01، لأنها أكثر عرضة لآثار الحافة.
- البذور 8،000-10،000 الخلايا في B01. وسيتم استخدام هذا جيدا لتعديل التركيز، فقط قبل الحصول على الصور.
- ملء الآبار الخارجية الفارغة مع المتوسطة لتقليل التدرجات (درجة الحرارة والرطوبة، وما إلى ذلك ) بين الآبار والبيئة.
- اضغط برفق على لوحة ثلاث مرات قبل وضعها مرة أخرى في الحاضنة لتجنب الخلايا من النمو في بقع.
- ثقافة الخلايا لمدة 24 ساعة، أو ما يصل إلى درجة التقاء تقريبا. 70٪.
- احفظ معلومات المعالجة للتجربة في جدول بيانات يسمى "Setup.xlsx". يجب أن يحتوي الملف على أربعة أعمدة وسيتم استخدامها لربط العلاجات مع الآبار ومعلومات الصورة أثناء تحليل البيانات. الأعمدة الأربعة هي: 'حسنا'، 'تراتمنتنمبر'، 'العلاج' و 'السيطرة' (صف واحد لكل بئر). يقترن كل علاجمع عدد معالجة فريدة من نوعها، والذي يستخدم أثناء التصور البيانات لتحديد ترتيب العلاجات على محور X من المؤامرات. يحدد عمود التحكم العلاج الذي يعمل كعلاج للتحكم في الصف الحالي. يتم توضيح الرسوم التوضيحية للتخطيط التجريبي نموذجي وملف الإعداد المقابلة في الشكل 2 .
4. تحميل الخلايا مع سم-H 2 دكفدا و تمرم (± 45 دقيقة)
ملاحظة: يمكن أن يتم التعامل مع الخلايا في يوم التجربة في بيئة معقمة (مجلس الوزراء السلامة الأحيائية)، ولكن هذا ليس إلزاميا لأن الخلايا سيتم تجاهلها أو إصلاحها مباشرة بعد الفحص.
- تسخين ه-العازلة إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد 20 ميكرومتر حل تمرم العمل عن طريق تمييع الحل الأسهم ملم 1 مرات في ه-العازلة (إضافة 490 ميكرولتر من ه-العازلة إلى قسامة 1 من 10 ميكرولتر حل الأسهم تمرم).
- إعداد الحملإنغ مع 2 ميكرومتر سم-H 2 دكفدا و 100 نم تمرم. تحقيقا لهذه الغاية، تمييع 1 ملم سم-H 2 دكسفدا حل الأسهم 500X و 20 ميكرومتر تمرم حل العمل 200X في ه-العازلة.
- عادة، لمدة 60 بئرا، وإعداد 7.5 مل من محلول التحميل عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من سم-H 2 دسفدا و 37.5 ميكرولتر من حل تمرم إلى 7447.5 ميكرولتر من سمو.
- تجاهل الوسط الثقافي من الخلايا عن طريق تحويل لوحة رأسا على عقب في حركة السائل واحد.
- غسل بلطف الخلايا مرتين مع ه-العازلة باستخدام ماصة الأقنية (100 ميكرولتر / جيدا). تجاهل ه-العازلة في بين خطوات الغسيل عن طريق تحويل لوحة رأسا على عقب في حركة السائل واحد.
- تحميل الخلايا مع سم-H 2 دكفدا و تمرم عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من حل التحميل إلى كل بئر، مرة أخرى باستخدام ماصة الأقنية. احتضان لمدة 25 دقيقة في الظلام، في درجة حرارة الغرفة. لا ننسى جيدا B01.
- خلال هذه 25 دقيقة، وإعداد حلول العمل من تبهب أكسدة وتأكد من تشغيل المجهر والأجهزة التبعي على.
- إعداد حل العمل الأول: تمييع الحل 7M الأسهم 70X إلى 100 ملم (10 الأسهم ميكرولتر في 690 ميكرولتر ه-العازلة).
- إعداد حل العمل الثاني: تمييع وس أنا 100X إلى 1 ملم (10 ميكرولتر وس I في 990 ميكرولتر ه-العازلة).
- إعداد حل العمل الثالث: تمييع وس إي 25X إلى 40 ميكرومتر (لمدة 60 بئرا إضافة 300 ميكرولتر وس الثاني في 7200 ميكرولتر العازلة س).
- بعد 25 دقيقة، وغسل الخلايا مرة أخرى مرتين مع 100 ميكرولتر ه-العازلة كما هو موضح من قبل.
- إضافة 100 ميكرولتر من ه-العازلة إلى جميع الآبار الداخلية 60.
5. أول لايف التصوير جولة لقياس مستويات بروس روس والميتوكوندريا مورفوفونكتيون (± 15 دقيقة)
- تأكد من أن برنامج الاستحواذ قيد التشغيل ويتم تحميل بروتوكول التصوير.
- تثبيت لوحة على المجهر، بدوره على الأجهزة باسيد ضبط تلقائي للصورة واستخدام B01 جيدا لضبط ضبط تلقائي للصورة تعويض باستخدام قناة تمرم. كما يؤدي هذا الإجراء زيادة في كثافة إشارة سم-H 2 دكفدا، يتم استبعاد هذا جيدا من تحليل الصورة المصب.
- تشغيل بروتوكول التصوير.
6. الثانية لايف التصوير جولة بعد إضافة تبهب لقياس مستحث روس مستويات (± 20 دقيقة)
- إزالة بعناية لوحة 96 جيدا من المجهر.
- إضافة 100 ميكرولتر من تبهب وس الثالث (40 ميكرومتر) إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية (وهذا يؤدي إلى تركيز 20 ميكرومتر تبهب في الآبار). يستخدم هذا المركب كسيطرة إيجابية داخلية لتلطيخ سم-H 2 دكفدا (يجب أن ترتفع الإشارة)، فضلا عن وسيلة لقياس مستويات روس المستحثة.
ملاحظة: H2 O 2 يمكن أن تستخدم أيضا بدلا من تبهب، ولكن هذا المركب هو أقل استقرارا وبالتالي أقل موثوقية. - انتظر 3 دقائق على الأقل للسماح رد فعل كامل من تبهب wإيث سم-H 2 دكفدا.
- خلال هذا الوقت، إضافة 100 ميكرولتر الأضداد حل العمل (1/1000) إلى A01 جيدا.
- جبل لوحة مرة أخرى على المجهر والتحقق من التركيز مرة أخرى باستخدام B01 جيدا.
- الحصول على نفس المواقف كما في الجولة التصوير الأولى باستخدام نفس بروتوكول التصوير.
- تصدير مجموعات البيانات المكتسبة في مجلد واحد كملفات تيف الفردية باستخدام تسميات موحدة تتضمن إشارة إلى لوحة، قبل أو بعد تبهب العلاج، حسنا، الحقل والقناة، مفصولة سفلية، على سبيل المثال . 'P01_Pre_B02_0001_C1' للوحة 1، والعلاج قبل تبهب، حسنا B02، الحقل 1 والقناة 1. سيتم استخدام هذه المعلومات أثناء تحليل الصور (على سبيل المثال لتحديد إعدادات تجزئة المناسبة)، وكذلك أثناء تحليل البيانات (لربط بيانات التحليل مع العلاجات الصحيحة).
- الحصول على صور حقل شقة لكلا القنوات على جميع المراكز الأربعة في جميع أنحاء مركز A01 جيدا باستخدام بروتوكول الاستحواذ. حفظ ثإم كملفات تيف الفردية في نفس المجلد مثل الصور الأخرى باستخدام التسميات الموحدة التالية: 'P01_FF_A01_0001_C1' للوحة 1، الحقل 1 والقناة 1. تأكد من أن الإشارات هي داخل النطاق الديناميكي. في حالة التشبع، استخدام تركيز أقل من حل العمل الأجسام المضادة.
- تجاهل لوحة أو حفظ لمزيد من المعالجة.
ملاحظة: بدلا من إزالة لوحة من المجهر واستخدام ماصة الأقنية لإضافة حل تبهب، ماصة الآلي يمكن تركيبها على مرحلة المجهر ومتصلة مع برنامج الاستحواذ وذلك للعمل عند تلقي الزناد. وهذا يسمح لإضافة تبهب إلى كل بئر مباشرة بعد عملية الاستحواذ الأولى، قبل الانتقال إلى بئر المقبل. بهذه الطريقة، عند الانتهاء من الجولة التصوير الأولى، والثانية يمكن أن تبدأ على الفور، وسوف يكون جميع الآبار وقتا حضانة متساوية مع تبهب.
7. معالجة الصور وتحليلها (± 30 دقيقة لكل96-جيدا لوحة)
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع معالجة الصور في فيجي (http://fiji.sc)، نسخة معبأة من إيماجيج مجانية. كتب مكتوب مخصص للتحليل الآلي للإشارات ROS- الميتوكوندريا داخل الخلايا، وكذلك المعلمات المورفولوجية (RedoxMetrics.ijm، وهي متاحة عند الطلب). يتم وصف الخوارزميات الكامنة في سيبراث إت آل. 1 -
- تأكد من تثبيت فيجي وتشغيلها.
- بدء فيجي وتثبيت مجموعة الماكرو (الإضافات -> وحدات الماكرو -> تثبيت ...). وهذا سوف استدعاء عدد من الأوامر الماكرو الجديدة فضلا عن مجموعة من أدوات العمل لتحسين إعدادات التحليل، كما هو مبين في الشكل 3A .
- فتح واجهة الإعداد لضبط إعدادات التحليل عن طريق النقر على زر 'S' ( الشكل 3B ).
- حدد نوع الصورة، وعدد القنوات والبئر الذي تم استخدامهللحصول على صور مسطحة.
- تشير إلى القناة التي تحتوي على خلايا (سم-H 2 قناة دكفدا) أو الميتوكوندريا (تمرم قناة) وضبط معلمات ما قبل المعالجة والتجزئة لكل قناة اعتمادا على جودة الصورة ( الشكل 3B ). ضع علامة على خانات "الخلفية" و "التباين" لأداء الطرح الخلفية أو النقيض محدود التكيف الرسم البياني المعادلة 16 ، على التوالي. تحديد سيغما لخلط غاوس من الخلايا وتعزيز لابلاسيان الميتوكوندريا. حدد خوارزمية عتبة تلقائية وتملأ حدود استبعاد الحجم (بالبكسل). إذا تم اختيار عتبة ثابتة بدلا من خوارزمية العتبة التلقائية، املأ العتبة العليا.
- اختبار إعدادات تجزئة على عدد قليل من الصور المحددة لمجموعات البيانات المكتسبة عن طريق فتحها والنقر على أزرار 'C' أو 'M' في القائمة لخلية أو الميتوكوندريا تجزئة على التوالي،وضبط الإعدادات إذا لزم الأمر. ويرد مثال النتيجة في الشكل 3C .
- تشغيل تحليل دفعة على مجلد (ق) من الفائدة عن طريق النقر على زر '#' واختيار المجلد مع الصور. لكل مجلد، وهذا سوف ينتج الدليل 'الإخراج' الجديد، التي تحتوي على مجموعات روي الفردية (ملفات زيب) وملفات النتيجة (.txt) لكل صورة. لكل من القنوات ملف النتائج يحتوي على الكثافة والوصف المورفولوجية. يحتوي ملف النتائج (الخلايا) سم-H 2 دكفدا (الخلايا) على كل واصف متوسط القيمة لعائدات الاستثمار المجمعة ضمن صورة واحدة. بالنسبة لقناة تمرم، يحتوي ملف النتائج على كل واصف القيمة لكل عائد استثمار ميتوكوندريا فردي مجزأ.
- بعد تحليل دفعة، والتحقق بصريا أداء تجزئة على "كومة التحقق"، فرط ضغط من جميع الصور مع تراكب روي منها عن طريق النقر على زر 'V'. وبهذه الطريقة، فإن التحف،/ التفكك السفلي، من الصور البؤرية أو جزيئات الغبار / الألياف في الصور يمكن رصدها بسرعة. ويمكن إجراء المزيد من التنظيم أثناء مراقبة جودة البيانات (الفقرة 8).
8. تحليل البيانات، مراقبة الجودة (ق) والتصور
يتم معالجة وتحليل البيانات الخام باستخدام R مجانية إحصائية (http://www.rproject.org - الإصدار 3.3.2) و رستوديو (http://www.rstudio.com/ - الإصدار 1.0.44). للحصول بسرعة و تصور النتائج، وقد تم تصميم تصور بديهية لامعة 17 (المتاحة عند الطلب) أن يدمج ويصور البيانات في هيتمابس و بوكسلوتس، ويؤدي أيضا التحليلات الإحصائية. بشكل عام، يتكون سير العمل من خطوتين متتاليتين. أولا، تتم معالجة البيانات وتفتيشها في لوحة 96-جيدا للكشف عن نقاط البيانات الشاذة. ثانيا، يتم تجميع البيانات المنسقة من جميع لوحات تجربة معينة وتحليلها باستخدام غير المعلمة متعددةاختبارات الاختلاف 18 وتحليل المكون الرئيسي.
- تأكد من تثبيت R و رستوديو وتشغيلها.
- بدء رستوديو.
- فتح تطبيق لامعة ريدوكسمتريكس وتشغيل التطبيق (اختيار لتشغيله في متصفح خارجي).
- في الصفحة "إدخال"، حدد الدليل حيث توجد ملفات النتائج من RedoxMetrics.ijm.
- تأكد من وجود "Setup.xlsx" (تم إنشاؤه في الخطوة 3.15) أيضا داخل هذا الدليل.
- يتم استيراد ملفات النتائج ومعلومات الإعداد تلقائيا، وإعادة ترتيب وتصور.
- تعرض صفحة "الإعداد التجريبي" تخطيط التجربة. استخدم هذه الصفحة للتحقق منها.
- الصفحة التالية، 'النتائج لكل لوحة' يظهر البيانات لكل لوحة على حدة في تخطيط لوحة متعددة بلون مرمزة وكذلك في بوكسلوتس مع القيم المتطرفة المسمى مع اسم جيدا ورقم الصورة. هذا الأخير يسمح التفتيش وهوية(القيم العالية أو المنخفضة للغاية مقارنة بالمتوسط القيم المقاسة لتلك المعاملة المحددة - انظر الشكل 4 للحصول على مثال).
باستخدام هذه المعلومات، تحقق من الصور المقابلة للنقاط الشاذة. إذا تم الكشف عن تشوهات، يجب إزالتها من التحليل. وتحدث معظم الشذوذ عن تجزئة غير لائق عندما (جزء) من الصورة هو خارج التركيز، أو عندما جزيئات الغبار الفلورسنت عالية تخل التقسيم الصحيح. يمكن بالفعل رصد الحالات المتطرفة بسرعة باستخدام أداة المكدس التحقق (الخطوة 7.5)، ولكن يتم اكتشاف المزيد من الحوادث الدقيقة في هذه الخطوة. عندما لا يمكن العثور على سبب واضح أو تقني للقيمة الشاذة، لا ينبغي إزالة الصورة من التحليل. - اختياري: إنشاء جدول بيانات جديد يسمى 'Drop.xlsx' مع عمود واحد فقط يسمى 'قطرة'. في هذا العمود، قم بإدراج أسماء الملفات (بما في ذلك ".tif" ملحق) من جميع الصورالتي يجب إزالتها من التحليل (المحدد في الخطوة 7.5 أو الخطوة 8.6.2). حمل هذا الملف باستخدام صفحة "الإدخال".
- تعرض صفحة "نتائج التجربة بأكملها" النتائج من جميع اللوحات مجتمعة. إذا تم تحميل ملف إسقاط، يتم استخدام هذا الملف لإزالة نقاط البيانات المحددة من التحليل.
لكل معلمة على حدة، يتم تطبيع البيانات لكل لوحة وفقا لضوابط كل منها. ثم يتم تجميع البيانات من جميع لوحات، تليها اختبارات متعددة المتغيرات غير المعلمية من حزمة نباربكوم 18 . إذا تمت مقارنة اثنين فقط من العلاجين يتم إجراء اختبارين عينة للمشكلة ببارنز فيشر غير بارامتري. لأكثر من 2 العلاجات، يتم استخدام اختبار مقارنة متعددة على أساس التباين غير البارامترية. يتم تصور النتائج باستخدام بوكسبلوتس. - صفحة "تحليل العنقودية" تظهر نتائج تحليل المكون الرئيسي (يكا - R الأساسية "حزمة" احصائيات). البيانات من 5 معلمات (باسال و التي يسببها روس، والغشاء الميتوكوندريا المحتملة، وحجم ودورية) جنبا إلى جنب لتمييز العلاجات المختلفة على أساس الشخصية الأكسدة الحساسة. وتحقيقا لهذه الغاية، يتم تنفيذ تحليل المكون الرئيسي (يكا) (R الأساسية 'احصائيات' حزمة). وتصور النتائج باستخدام بيبلوت (حزمة غبيبلوت - http://github.com/vqv/ggbiplot).
- استخدم صفحة "تنزيل البيانات" لتنزيل أطر بيانات الواجهة الخلفية التي تحتوي على البيانات التي تمت معالجتها وإعادة ترتيبها بحيث يمكن إعادة استخدامها للحصول على تصور بيانات أكثر تقدما أو تحليلات إحصائية.
ملاحظة: المزالق النموذجية والحلول المحتملة مدرجة في الجدول 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم قياس مقايسة باستخدام العديد من التجارب السيطرة، ونتائجها وصفها في سيبراث وآخرون. 1 - وباختصار، فإن استجابة مضان سم-H 2 دكفدا و تمرم إلى التغيرات التي يسببها خارجيا في روس الخلايا و Δψ م، على التوالي تم تحديدها لتحديد النطاق الديناميكي. ل سم-H 2 دكفدا، أظهرت ندف زيادة خطية في إشارة مضان عند التعامل مع زيادة تركيزات تبهب بين مجموعة من 10 ميكرومتر إلى 160 ميكرومتر. وبالمثل، ل تمرم، أظهرت خلايا ندف زيادة خطية في مضان الميتوكوندريا عندما تعامل مع زيادة تركيزات أوليغوميسين (الذي يدفع Δψ م فرط الاستقطاب) ضمن نطاق 1 إلى 10 ميكروغرام / ميكرولتر. على العكس من ذلك، في الوقت الحقيقي إضافة فالينوميسين، وهو مضاد حيوي الذي يدفع Δψ م الاستقطاب، أسفرت عن تدريجي،انخفاض إنفيابل من تمرم مضان .
كما تم استخدام مقايسة في مجموعة متنوعة من التجارب للكشف عن الاختلافات في حالة الأكسدة بين أنواع الخلايا أو العلاجات 1 ، 15 . ولتوضيح ذلك، تظهر النتائج للتجربة التي تمت معالجتها بواسطة ندف مع مثبط بروتياز الڤيروس هيف ساكينافير (سكف) ( الشكل 5 ). باستخدام بروتوكول وصفها، تم الكشف عن زيادة كبيرة لكل من مستويات روس ومستحثة بالمقارنة مع خلايا السيطرة تعامل مع دمسو ( الشكل 5B ). العلاج سكف أثرت أيضا بشكل كبير مورفوفونكتيون الميتوكوندريا. من الناحية الشكلية، اكتسبت الميتوكوندريا نمطا مجزأ للغاية، وهو ما أكده أيضا ارتفاع التعميم ومتوسط حجم أصغر للميتوكوندريا الفردية. وظيفيا، Δψ م ، يقاس كمتوسط إشارة تمرم لكل ميتوشأوندريال بكسل أيضا زيادة كبيرة ( الشكل 5A ). عند الجمع بين البيانات من المعلمات 5 المذكورة أعلاه، يمكن فصل الشرطين (السيطرة و سكف) بشكل واضح عن بعضها البعض من خلال تحليل المكون الرئيسي. وتظهر البيانات من ثلاثة مكررات البيولوجية المستقلة في 2D-بيبلوت عرض أول اثنين من المكونات الرئيسية، والتي تفسر 81.4٪ من التباين الكلي ( الشكل 5C ). وهذا يثبت متانة الفحص ويشير إلى أن قراءات مجتمعة قد تكون بمثابة مؤشر حساس للحالة الصحية الخلوية.
الشكل 1 : نظرة عامة عامة لفحص التصوير عالية المحتوى لقياس في وقت واحد من الخلايا القاعدية ومستويات روس المستحثة والميتوكوندريا مورفوفونكتيون. ( A ) Sالتمثيل الكيميائي للكتل التشغيلية الرئيسية. ( ب ) مثال مصور: الخلايا المصنفة في لوحات متطابقة 96-جيدا. يظهر تخطيط لوحة جيدا القياسية في مزيد من التفاصيل في الشكل 2A . بعد تلطيخ، يتم الحصول على 4 صور لكل قناة حول مركز كل بئر، سواء قبل وبعد العلاج تبهب، وهو ما يتضح من المونتاج كبيرة مع أقحم. بعد تحليل الصورة، يتم تصور نتائج كثافة باستخدام بديهية الحرارة خريطة المسقطة على تخطيط لوحة جيدا. وهذا يسمح الكشف السريع للآثار لوحة أو الآبار الشاذة. بعد تنظيم مجموعات البيانات التجريبية الكاملة، يتم تنفيذ تحليل البيانات النهائي مما يؤدي إلى إخراج واحد وكذلك متعدد المعلمة. (تم تعديل هذا الرقم من المرجع 1 ، مع إذن من سبرينجر) الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيسيوn من هذا الرقم.
الشكل 2 : نموذجية التجريبية 96-جيدا تخطيط ومطابقة "إعداد" الملف. ( A ) يتم توزيع 4 ظروف مختلفة متجانسة عبر 60 بئر الداخلية من لوحة. يحتوي حسنا B01 أيضا الخلايا، ولكن يستخدم فقط لضبط تعويض بس الأولي قبل التصوير. يتم تعبئة الآبار الخارجية الأخرى فقط مع وسط الاستزراع لتقليل التدرجات (درجة الحرارة، الرطوبة، الخ ) أثناء زراعة الخلايا. يتم الحصول على صورة بطريقة متعرجة، أي، أولا من اليسار إلى اليمين، من بئر B02 إلى B11، ثم مرة أخرى، من اليمين إلى اليسار، من جيدا C11 إلى C02 وهلم جرا. بعد الحصول على الصور يتم الحصول على صور حقل شقة في A01 جيدا، والذي يستخدم لتصحيح التجانس الإضاءة المكانية أثناء الصورة alysis. ( B ) ملف الإعداد المقابل (Setup.xlsx) هو جدول بيانات يحتوي على معلومات حول تخطيط التجربة. وهو يحدد مواقع كل معاملة في لوحة مولتيويل وضوابط كل منها. يمثل كل صف بئر. كل معاملة لها رقم العلاج الفريد الخاص بها، والذي يستخدم لتحديد ترتيب العلاجات على محور X من المؤامرات ولدت أثناء تحليل البيانات. يحتوي عمود "التحكم" على العلاج الذي يجب استخدامه كعنصر تحكم لتطبيع بيانات المعالجة المحددة في الصف نفسه. في المثال، والعلاج 1 هو العلاج الذي يستخدم كسيطرة لتطبيع البيانات من جميع العلاجات الأخرى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
9 / 55449fig3.jpg "/>
الشكل 3 : ريدوسمتريكس ماكرو مجموعة، تخطيط واجهة الإعداد. ( A ) عند تثبيت مجموعة الماكرو ريدوكسمتريكس ل فيجي، يتم إنشاء عدد من أوامر الماكرو الجديدة بالإضافة إلى مجموعة من أدوات الإجراءات لاختبار وتحسين إعدادات التحليل في شريط القوائم. 'S' استدعاء واجهة الإعداد. 'F' يقوم بتصحيح مسطح على صورة مفتوحة. 'C' و 'M' تجزئة اختبار للمناطق الخلوية ("خلية"، سم-H2DCFDA قناة) والمناطق الميتوكوندريا ("ميتو"، قنوات تمرم)، على التوالي على صورة واحدة مفتوحة باستخدام إعدادات التحليل المحدد في الإعداد واجهة، والعودة تراكب من المناطق مجزأة من الفائدة (روي). '#' ينفذ تحليل دفعة على مجلد من الصور باستخدام الإعدادات المحددة في واجهة الإعداد (عادة بعد التحقق على واحد أو عدد قليل من الصور). 'V' يخلق التحقق هيبرستاك وسينز بيانات الإخراج من تحليل الدفعة. هذه هيبرستاك هي صورة مركبة من جميع الصور الخام الموجودة في المجلد والمناطق التي تهمها (رسمها في قناة ثانية). 'O' يمكن النقر عليها لإظهار أو إخفاء تراكب المنطقة مجزأة. ( B ) واجهة الإعداد. هنا يتم تحديد كافة إعدادات التحليل، بما في ذلك معلومات عامة مثل نوع الصورة (امتداد)، وعدد القنوات (الأطوال الموجية)، والبئر الذي تم استخدامه لتصحيح فلاتفيلد. بعد ذلك هناك إعدادات محددة لنوع محتوى الصورة (خلية أو ميتو). في كلتا الحالتين، هناك خيارات (مربعات) لتضمين تصحيح الخلفية ("الخلفية") وتعزيز التباين المحلي ("التباين"). لتجزئة الخلية، وهناك خيار لتحديد دائرة نصف قطرها طمس غوس (سيغما) للحد من الضوضاء. بالنسبة لتجزئة ميتو هناك خيار لتحديد نصف قطر مشغل لابلاسيان لتعزيز انتقائي للميتوكوندريا. التجزئة اللاحقة هي pإرفورمد باستخدام طريقة دريشولدينغ التلقائي (أو الثابتة) التي يمكن تعريفها لكل نوع المحتوى. وعند اختيار عتبة ثابتة، يمكن توفير قيمة العتبة العليا يدويا. وأخيرا، يمكن أن يقتصر التحليل على مجموعة من الأشياء التي تقع ضمن الحد الأدنى والحد الأقصى لحجم. ( C ) مثال على نتيجة تجزئة كما يتم تشغيلها مع الأمر "C" (أعلى) أو "M" (أسفل)، يتم عرضها كصورة خام باللون الرمادي مضافين مع المناطق ذات الاهتمام باللون الأصفر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : مثال مصور لمرئيات البيانات الوسيطة. ( A ) مولتيويل لوحة التصور حيث تظهر الآبار B02 و D07مشبوه. ( ب ) بوكيبلوت يمثل نفس البيانات، مع القيم المتطرفة المسمى مع اسم جيدا واسم الصورة. جنبا إلى جنب مع F03_0003، الصور من B02 و D07 الظهور كخارج. ( C ) الفحص البصري لهذه الصور يدل على أنه يجب إزالة B02_0000 و D07_0001 من مزيد من التحليل لأن هناك أخطاء تجزئة (يتضح من الأحمر 'X'). يجب الاحتفاظ F03_0003 لأنه لا يوجد تجزئة واضحة أو خطأ فني. (إذا لم يتم العثور على سبب تقني للانحراف، لا ينبغي إزالة البيانات). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 : تأثير ساكينافير (سكف؛ 20 ميكرومتر) على فبر الإنسان الأولية(السيطرة هي دمسو). ( A ) إمكانات الغشاء الميتوكوندريا (ΔΨ م ) والتشكل الميتوكوندريا (دائرية ومتوسط حجم الميتوكوندريا الفردية) كما تم قياسه من قبل تمرم ( B ) زيادة مستويات القاعدية من روس داخل الخلايا التي يقاسها سم-H 2 دكفدا والاستجابة نحو روس يسببها، كما المكاسب النسبية في كثافة بعد إضافة 20μM تبهب بالإضافة إلى ذلك. ( C ) 2D سكاتيربلوت من أول 2 المكونات الرئيسية (أجهزة الكمبيوتر) من تحليل يكا على المتغيرات 5 المذكورة أعلاه (القاعدية والمستحثة روس مستويات، متوسط حجم الميتوكوندريا، دائرية، و ΔΨ م ). تمثل الأسهم السوداء اتجاهات المتغيرات الأصلية 5 فيما يتعلق بالمكونات الرئيسية. (يتم رسم النسخ المتماثلة المستقلة بلون مختلف؛ يتم تطبيع جميع البيانات فيما يتعلق بالسيطرة دمسو؛ * = p قيمة <0.05؛ ** = p قيمة <0.01؛ *** = p قيمة <0.001؛ نطاق Y -تم تعديل المحاور لعرض الاختلافات على النحو الأمثل؛ تم تعديل هذا الرقم من مرجع 1 ، مع إذن من سبرينجر) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مشكلة | السبب المحتمل | حل ممكن |
| عدد قليل جدا من الخلايا في الآبار أثناء التصوير | عدد قليل جدا من الخلايا المصنفة | البذور المزيد من الخلايا 24 ساعة قبل التصوير |
| ضعف نمو الخلايا | تحقق ظروف الثقافة (متوسطة، استقرار درجة الحرارة، كو 2 السيطرة) | |
| خطوات غسل عنيفة جدا | تجنب غسل الخلايا بعيدا، ماصة بلطف | |
| خلايا كثيرة جدا في الآبار أثناء التصوير | جداالعديد من الخلايا المصنفة | البذور أقل الخلايا 24 ساعة قبل التصوير |
| إشارات ضعيفة أو استجابة غير الخطية من مضان سم-H 2 دكفدا إلى التحفيز | تستخدم منخفضة جدا / عالية تركيز الصبغة | في حالة استخدام خلايا أخرى بخلاف ندف، يجب تحديد تركيزات التحميل المثلى تجريبيا |
| صبغ التحميل غير كافية | إضافة 0.02٪ ث / الخامس من السطحي بلورونيك -12 إلى حل التحميل لزيادة امتصاص. | |
| سم-H 2 دسفدا إشارة يزيد بصريا خلال وقت التعرض | تركيز صبغة عالية جدا | تقليل تركيز الصبغة |
| كثافة الإثارة عالية جدا | تقليل كثافة الإثارة باستخدام مرشحات ند و / أو تقليل وقت التعرض | |
| سم-H 2 كثافة دكفدا تنخفض خلال الاستحواذ على لوحة جيدا | سم-H 2 يتسرب دكفدا منالخلية. | استخدام 2 ملي بروبينيسيد (أنيون مضخة المانع). إضافة إلى حل التحميل، فضلا عن المخزن المؤقت التصوير للحد من التسرب |
| لا توجد زيادة في كثافة إشارة سم-H 2 دكفدا بعد إضافة تبهب | تبهب غير نشط | استخدام تبهب الطازجة |
| سم-H 2 يتسرب دكفدا من الخلية. | استخدام بروبينيسيد كما هو موضح أعلاه. | |
| (بعض من) الصور المكتسبة تظهر خارج التركيز، في حين يبدو التركيز موافق عند التحقق. | يتم تركيب اللوحة مائلة مما أدى إلى التركيز على تمديد أبس أوف | تحقق من تركيب لوحة ومستوى المرحلة، إعادة وضع لوحة |
| الجزء السفلي من لوحة يحتوي على الغبار أو المخالفات | تنظيف الجزء السفلي من لوحة مع ورقة عدسة المبللة الايثانول | |
| تموت الخلايا أثناء التصوير | تقليل كثافة الإثارة أو الحصول على عدد أقل من الصور لكل بئر. | |
| تكوين التصوير العازلة خاطئة | إعادة طبع التصوير العازلة | |
| هناك من البقع التركيز الفلورسنت في الصور | الخلايا المنفصلة تطفو خارج التركيز | غسل أكثر بلطف خلال بروتوكول التحميل |
| واحد أو أكثر من الأعمدة لديها جميع انخفاض كثافة من الآبار الأخرى من لوحة | لم يتم ربط واحد أو أكثر من النصائح من ماصة الأقنية بقوة، وبالتالي تم إضافة أقل مراسل إلى هذه الآبار | تحقق بدقة إذا تم ملء جميع النصائح تماما كلما كنت تستخدم ماصة الأقنية. |
| التركيز الانجرافات بشكل كبير خلال الحصول على الصور | القاع البوليسترين من لوحة يمكن أن تتفاعل مع زيت الغمر عند استخدام عدسة النفط | استخدام عدسة جافة، أو استخدام لوحة مولتيويل مع غلاسس أسفل |
| تزداد كثافة إشارة تمرم بين التصوير الأول والأخير جيدا | مراسل وقت التحميل لم يكن طويلا بما فيه الكفاية، تمرم لا يزال موازنا | زيادة وقت تحميل المراسل |
| سم-H 2 إشارة دكفدا بعد زيادة العلاج تبهب خلال الاستحواذ على لوحة جيدا | الوقت بين العلاج مع تبهب وبدء الجولة التصوير الثاني لم يكن طويلا بما فيه الكفاية، تبهب لا يزال مؤكسد سم-H 2 دكفدا. | زيادة فترة الحضانة بين العلاج مع تبهب وجولة التصوير الثانية. (تبدأ مع 3 دقائق على الأقل) |
| يتم تشبع الصور الحقل المسطح | حل العمل المضاد هو تتركز | استخدام تركيز أقل من حل العمل الأجسام المضادة |
| لم يتم تحسين إعدادات الاكتساب (وقت التعرض إلى ارتفاع، ند مرشح إلى منخفضة، ...) | تحسين إعدادات الاستحواذ،إشارة يجب أن يكون في مجموعة ديناميكية من أجهزة الاستشعار | |
| صور الحقل المسطح هي مظلمة | حل العمل المضاد هو المخفف | استخدام تركيز أعلى من الأجسام المضادة حل العمل |
| لم يتم تحسين إعدادات الاكتساب (وقت التعرض إلى ارتفاع، ند مرشح إلى منخفضة، ...) | تحسين إعدادات الاستحواذ، إشارة يجب أن يكون في مجموعة ديناميكية من أجهزة الاستشعار | |
| أكثر / أقل من القطع الأثرية | لم يتم تعيين عتبة بشكل صحيح | اضبط إعداد العتبة |
| فلاتر الحجم غير معدلة بشكل صحيح | ضبط معايير الحد الأدنى والحد الأقصى لتحليل الصور | |
| خلية كونفلنسي عالية جدا | المستوى الصحيح من كونفلنسي مهم جدا لتحليل الصور يمكن الاعتماد عليها. بالنسبة لأنواع الخلايا الأخرى من ندف، يجب تحديد كثافة البذر المثلى تجريبيا | |
| لا يعمل التطبيق لامعة | تم تحديد دليل خاطئ | اختر الدليل الصحيح في صفحة الإدخال. |
| الملفات المفقودة في الدليل | تأكد من وجود كافة الملفات الضرورية (الإخراج من ماكرو إيماجيج وملف الإعداد) في الدليل المحدد | |
| الحزم المفقودة | عادة يتحقق التطبيق لتركيب جميع الحزم الضرورية، ولكن عند فشل ذلك، تحقق يدويا للحزم التالية: ديفتولز، غبيبلوت، باسمان، ggplot2، بلير، نباركومب، data.table، ريادكسل، غبلوتس، غبيبلوت، لامعة، شينيفيلز، بابابلي و شينيجز بما في ذلك جميع التبعيات. |
الجدول 1: المزالق النموذجية والحلول المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه الورقة طريقة عالية المجهر المحتوى للكمية في وقت واحد من مستويات روس داخل الخلايا و مورفوفونكتيون الميتوكوندريا في ندف. وأظهرت أدائها مع دراسة حالة عن ندف الصندوق العالمي للمصايد. النتائج تدعم الأدلة السابقة من الأدب التي زادت مستويات روس أو ضعف الميتوكوندريا لوحظت بعد العلاج مع مثبطات الأنزيم البروتيني من نوع 1 فيروس نقص المناعة البشرية، وإن كان في تجارب منفصلة 19 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24 ، 25 . والفرق المهم هو أن الفحص الموصوف قادر على قياس هذه المعلمات في وقت واحد، في نفس الخلايا الحية، جنبا إلى جنب مع البيانات المورفولوجية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا النهج في تصميمه الذي لا لبس فيه لكلا العاملين معا في الفضاء و tإيم، والذي يسمح بتحديد العلاقات السببية. يتم إجراء تحليل المكون الرئيسي الذي يسمح لتوليد الشخصية الأكسدة الحساسة من الاضطرابات محددة. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام تقنيات استخراج البيانات الأكثر تقدما وخوارزميات التجميع (الخاضعة للإشراف) على البيانات المستخرجة لتمكين التنميط التنموي للأكسدة. قد يكون هذا ميزة قيمة لأدوات التصنيف التشخيصي أو النذير في علم الأمراض الرقمي، وكذلك في فحص للأهداف العلاجية، على سبيل المثال مرة واحدة يتم إنشاء نماذج تصنيف قوية، ويمكن فحص المكتبات جزيء صغير للعثور على المرشحين العلاجية لمواجهة الإجهاد التأكسدي، مماثلة ل شاشة حديثة للقيادات واعدة في تطوير العلاج للاضطرابات الميتوكوندريا البشرية 26 .
تم تصور الفحص ل ندف، ولكن يمكن أن تتكيف مع أنواع الخلايا الملتصقة الأخرى. وهذا يتطلب تحسين بروتوكول تلطيخ وتركيزات صبغ المراسل. كمية r صبغ إيبورتر يجب أن يكون الحد الأدنى منذ الزائد يمكن أن يسبب آثار غير الخطية بسبب التبريد أو حتى تصبح السامة للخلايا 27 . تمديد الفحص إلى خلايا تعليق هو أقل وضوحا بسبب الصعوبات مع تصاعد ومراقبة هذه الخلايا بطريقة فسيولوجية. ويمكن أن تكون سايتوسبون على ساترة أو مثقف في وسائل الإعلام خالية من المصل للحث على الالتصاق، ولكن كل من هذه العمليات تتداخل مع الظروف الفسيولوجية 28 ، 29 . ومع ذلك، يمكن التغلب على هذه القيود باستخدام ميكروباترنيد دعم الخلايا الخلية التي تحافظ على الخلايا الفردية (ملتصقة أو غير ملتصقة) المحاصرين في الآبار الصغيرة الصغيرة مع الحفاظ على بقاءها 30 ، أو عن طريق استخدام هيدروجيل الحرارية عكسها إلى فخ الخلايا أثناء التصوير 31 . وقد استخدمت هذه الأساليب بالفعل للفحص عالية المحتوى من إمكانات غشاء البلازما، أو الأكسجين الخلوي في خلايا التعليق الفردية= "كريف"> 32 ، 33 أو التصوير من علامات داخل الخلايا في المعيشة، والطفيليات عالية التحرك 31 . كما يجب أن يتم التكيف مع طريقة التصوير، حيث أن التحليل المورفولوجي لشبكة الميتوكوندريا في هذه الخلايا يتطلب قدرات 3D الاستحواذ السريعة مثل الغزل القرص متحد البؤر أو بيسل شعاع ضوء ورقة المجهري 34 ، 35 ، فضلا عن التحليل خط أنابيب، لتشمل Z- البعد في حين حساب المعلمات المورفولوجية.
وقد تم تحسين مقايسة لوحات 96-جيدا، ولكن من الواضح أن قابلة لزيادة رفع مستوى، على سبيل المثال إلى لوحات 384 جيدا. عامل الحد الرئيسي هو الوقت اقتناء لوحة، أي الوقت الذي يستغرقه للحصول على الصور من جميع الآبار. يجب أن تبقى إشارات الفلورسنت مستقرة خلال هذا الإطار الزمني حتى تكون قادرة على مقارنة بين القياسات بثقة بينالآبار الفردية. ولكن، لأن تلطيخ عابرة وعملية قيد التحقيق ديناميكية، وهذا يشكل تحديا. لذلك، تم قياس إشارات الفلورسنت في مجموعة من التجارب المكررة وأظهر هذا أن كلا من سم-H 2 دسفدا و تمرم إشارات تبقى مستقرة من 7 إلى 50 دقيقة على الأقل بعد تلطيخ (معامل الاختلاف <2٪). هذا يعطي نافذة من حوالي 40 دقيقة. A 96-لوحة جيدا عادة ما يستغرق حوالي 10 دقيقة. وبالتالي، فإن الاستقراء إلى لوحات 384-بئر من شأنه أن يحافظ على مدة الاستحواذ في غضون فترة زمنية مستقرة. مع متوسط 50 خلية لكل صورة (على أساس استخدام هدف 20X وخلايا ندف)، وهذا من شأنه أن يؤدي إلى بيانات عن ما يقرب من 30،000 خلية في الساعة من الفرز، إضافة إلى القوة الإحصائية للمقايسة إلى حد كبير. عامل آخر يؤثر على استقرار إشارة الفلورسنت هو درجة الحرارة. لتجنب فاكوليزاتيون سم-H 2 دكفدا (أي تراكم الصبغة في الحويصلات داخل الخلايا)، والتي من شأنها أن تؤدي إلى مغايرتلطيخ جيني والآثار غير الخطية، والحضانة تجري في درجة حرارة الغرفة بدلا من 37 درجة مئوية. وبصرف النظر عن الاستقرار، فمن المهم أن نلاحظ أن التعرض للخلايا الحية لمضان الإثارة ضوء نفسه يدفع إنتاج روس. وهذا يعني أن ظروف التعرض (وقت التعرض وشدة ضوء الإثارة) ينبغي أن تبقى في الحد الأدنى المطلق. وهذا يعني أيضا أن جميع الآبار يجب أن يتعرض فقط عندما يتم الحصول على الصور الفعلية. هذا يستبعد استخدام أساليب التركيز التلقائي تمكين البرمجيات ويضمن استخدام نظام ضبط تلقائي للصورة القائم على الأجهزة.
ومن مزايا الطريقة الموصوفة طابعها العام. تقريبا أي مزيج من المطورين الفلورسنت متوافق طيفيا يمكن استخدامها. وقد تجلى ذلك باستخدام الجمع بين كالسين / ميتوسوس لقياس الميتوكوندريا روس في الخلية الحية 1 ، 15 . وعلاوة على ذلك، لا تقتصر التطبيقات على إنت قياس روس / الميتوكوندريا. ويمكن أيضا أن تمتد الفحص مع إمونوستينينغ آخر بعد (بعد الجولة التصوير الثانية). منذ يتم حفظ مواقع التصوير الدقيق، والتحليلات الأكسدة يمكن أن ترتبط مباشرة مع بروتيوميكس الموقع في نفس الخلايا. هذا يزيد كثيرا من قراءات الجزيئية، وهو في تناقض صارخ مع أساليب أخرى غالبا ما تستخدم لتقييم البيولوجيا الأكسدة، أو شدة مضان بشكل عام. على سبيل المثال، فلوريمتري (قارئ الصفيحة الدقيقة) يستخدم على نطاق واسع بسبب التكلفة المنخفضة نسبيا (الإعداد الأساسي متاح لانخفاض 4000 €) ومنحنى التعلم الضحلة، ولكن كونه الصندوق الأسود، هو أكثر عرضة لعوامل مربكة مثل الاختلافات في كثافة الخلية أو الخلفية (لصناعة السيارات) مضان، على سبيل المثال من تلوث جزيئات الغبار. وعلاوة على ذلك، القراء لوحة لا تسمح لاستخراج المعلمات المورفولوجية، فإنها لا يمكن قياس خلايا واحدة، وأنها أقل حساسية وموثوق بها لقياس إشارات ديناميكية أو عابرةلاس = "كريف"> 36 ، 37 . التدفق الخلوي لديه القدرة على قياس خلايا واحدة ولها ميزة السرعة. في الواقع، لوحة 384 جيدا يمكن فحصها في اقل من 12 دقيقة مع حساسية عالية للعلامات متعددة 38 . هذا هو أسرع بكثير مما هو ممكن مع المجهر ويديفيلد. ولكن، لا يزال يتم توفير أي معلومات المكانية الزمانية ( أي التوطين تحت الخلوية، والبيانات المورفولوجية و / أو الحركية تعتمد على الوقت)، كما أنها لا تسمح إعادة النظر في الخلايا نفسها أثناء أو بعد العلاج (أي، في فلوكسو) . وعلاوة على ذلك، يجب أن تكون الخلايا في تعليق، مما يجعل التدفق الخلوي أقل ملاءمة لدراسة علم وظائف الأعضاء من الخلايا الملتصقة. العيوب الرئيسية للمجهر عالية المحتوى بالمقارنة مع الطرق الأخرى هي الحاجة لتخزين البيانات صورة كبيرة، قوة معالجة مكثفة وتحليلات الصور المعقدة. مقايسة عرض توحد عملية الحصول على الصور وتبسيط أناليسيثانية وذلك لتقليل وقت المعالجة هذا، وزيادة سهولة الاستخدام، وبالتالي جعل الفحص أكثر سهولة.
في الختام، ومحددة لاستخدام سم-H 2 دكفدا و تمرم، وصفت طريقة التنميط الأكسدة هي قوية وحساسة وموثوق بها. نظرا لطبيعتها متعددة الحجوم والكمية، فهي متفوقة على الأساليب الأخرى القائمة على مضان. وبهذه الطريقة، يمكن أن تساعد على توضيح العلاقة بين وظيفة الميتوكوندريا وروس الخلايا الإشارات، وهو أمر حاسم لفهم أفضل مجموعة واسعة من الأمراض التي يتم اختلال التوازن الأكسدة. وعلاوة على ذلك، نظرا لطابعه العام، وفحص يسمح تطبيقات تتجاوز بكثير نطاقها الأصلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويقول المؤلفون إنه لا توجد مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر. ويكفل المؤلف المناظر أيضا أن يطلب من جميع المؤلفين الكشف عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology? Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , https://CRAN.R-project.org/package=shiny (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
