Summary
Cet article présente un flux de travail de microscopie à contenu élevé pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires, ainsi que le potentiel de la membrane mitochondriale et la morphologie - communément appelée morphofonction mitochondriale - dans les cellules adhérentes vivantes en utilisant les molécules rapporteurs fluorescentes perméables aux cellules 5- (et- 6) -chlorométhyl-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescéine diacétate, ester acétylique (CM-H2RFDA) et tétraméthylrhodamine méthylester (TMRM).
Abstract
Les espèces réactives d'oxygène (ROS) régulent les processus cellulaires essentiels, y compris l'expression des gènes, la migration, la différenciation et la prolifération. Cependant, les niveaux excessifs de ROS induisent un état de stress oxydatif, qui s'accompagne de dommages oxydatifs irréversibles à l'ADN, aux lipides et aux protéines. Ainsi, la quantification de ROS fournit une procuration directe pour l'état de santé cellulaire. Étant donné que les mitochondries sont parmi les principales sources et cibles cellulaires des ROS, l'analyse conjointe de la fonction mitochondriale et de la production de ROS dans les mêmes cellules est cruciale pour mieux comprendre l'interconnexion dans les pathologies physiopathologiques. Par conséquent, une stratégie basée sur la microscopie à haut contenu a été développée pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires, du potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨ m ) et de la morphologie mitochondriale. Il est basé sur la microscopie de fluorescence automatisée à large champ et l'analyse d'image de cellules adhérentes vivantes, cultivées dans des plaques multi-puits, et StaineD avec les molécules rapporteurs fluorescentes perméables aux cellules CM-H 2 DCFDA (ROS) et TMRM (ΔΨ m et la morphologie mitochondriale). Contrairement à la fluorimétrie ou à la cytométrie en flux, cette stratégie permet de quantifier les paramètres subcellulaires au niveau de la cellule individuelle avec une résolution spatiotemporelle élevée, avant et après la stimulation expérimentale. Fait important, la nature basée sur l'image de la méthode permet d'extraire des paramètres morphologiques en plus des intensités de signal. Le jeu de caractéristiques combinées est utilisé pour l'analyse de données multivariées exploratoire et statistique pour détecter les différences entre les sous-populations, les types de cellules et / ou les traitements. Ici, une description détaillée de l'analyse est fournie, ainsi qu'un exemple d'expérience qui prouve son potentiel de discrimination sans équivoque entre les états cellulaires après une perturbation chimique.
Introduction
La concentration de ROS intracellulaire est méticuleusement régulée par un jeu dynamique entre les systèmes ROS produisant et ROS désactivant. Le déséquilibre entre les deux provoque un état de stress oxydatif. Parmi les principales sources de ROS sont les mitochondries 1 . Compte tenu de leur rôle dans la respiration cellulaire, ils sont responsables de la majeure partie des molécules intracellulaires de superoxyde (O 2 • - ) 2 . Cela résulte principalement de la fuite d'électrons vers O 2 au complexe 1 de la chaîne de transport d'électrons dans des conditions de potentiel de membrane mitochondrial interne négatif fort (Δψ m ), c'est-à-dire l' hyperpolarisation mitochondriale. D'autre part, la dépolarisation mitochondriale a également été corrélée avec une augmentation de la production de ROS indiquant de multiples modes d'action 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . En outre, grâce à des modifications rédox dans les protéines de la machine de fusion de fission, les ROS co-régulent la morphologie mitochondriale 9. Par exemple, la fragmentation est corrélée avec l'augmentation de la production de ROS et l'apoptose 10 , 11 , alors que les mitochondries filamenteuses ont été liées à la famine et la protection des nutriments contre Mitophagie 12 . Compte tenu de la relation complexe entre les ROS cellulaires et la morphofonction mitochondriale, les deux devraient idéalement être quantifiés simultanément dans les cellules vivantes. Pour ce faire, un test d'imagerie à contenu élevé a été développé sur la base d'une microscopie à large champ automatisée et d'une analyse d'image de cultures de cellules adhérentes colorées avec les sondes fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) et TMRM (mitochondrial Δψ m et morphologie). L'imagerie à contenu élevé se réfère à l'extraction de spDes informations sur les phénotypes cellulaires à l'aide de multiples marqueurs complémentaires et des analyses d'images automatisées (notamment un grand nombre d'éléments descriptifs). Lorsqu'ils sont combinés avec un microscope automatisé, de nombreux échantillons peuvent être criblés en parallèle ( c.- à-d. Débit élevé), ce qui augmente la puissance statistique du dosage. En effet, un atout principal du protocole est qu'il permet une quantification simultanée de plusieurs paramètres dans la même cellule, et ceci pour un grand nombre de cellules et de conditions.
Le protocole est divisé en 8 parties (décrites en détail dans le protocole ci-dessous): 1) ensemencement de cellules dans une plaque à 96 puits; 2) Préparation de solutions stock, solutions de travail et tampon d'imagerie; 3) Mise en place du microscope; 4) Chargement des cellules avec CM-H 2 DCFDA et TMRM; 5) Première image en direct pour mesurer les niveaux de ROS basaux et la morphofonction mitochondriale; 6) Deuxième cycle d'imagerie en direct après addition de tert -butylePeroxyde (TBHP) pour mesurer les niveaux de ROS induits; 7) Analyse d'image automatisée; 8) Analyse des données, contrôle de la qualité et visualisation.
Le test a été développé à l'origine pour les fibroblastes cutanés humains normaux (NHDF). Étant donné que ces cellules sont grandes et plates, elles sont bien adaptées pour évaluer la morphologie mitochondriale dans les images 2D widefield 13 , 14 . Cependant, avec des modifications mineures, cette méthode s'applique à d'autres types de cellules adhérentes. De plus, à côté de la combinaison de CM-H 2 DCFDA et TMRM, le flux de travail est conforme à une variété de paires de colorants fluorescents avec différentes spécificités moléculaires 1 , 15 .
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Protocol
Le protocole ci-dessous est décrit comme étant effectué pour les cellules NHDF et avec l'utilisation des plaques multi-puits spécifiées dans le fichier de matériaux. Voir la figure 1 pour une vue d'ensemble du flux de travail.
1. Préparation des réactifs
- Préparez le moyen complet en complétant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10% v / v de sérum bovin fœtal (FBS) et 100 UI / mL de pénicilline et 100 UI / ml de streptomycine (PS). Pour 500 ml de milieu complet, ajouter 50 mL de FBS et 5 mL de PS à 445 mL de DMEM.
- Préparer le tampon d'imagerie HBSS-HEPES (HH) en complétant la solution salée équilibrée de Hank (avec du magnésium et du calcium, mais sans rouge phénol) avec HEPES 20 mM. Pour 500 ml de HH, ajouter 10 mL de solution mère HEPES 1M à 490 mL de HBSS. Vérifier le pH et, le cas échéant, ajuster à pH 7,2.
- Préparer une solution stock de DCFDA CM-H 2 1 en dissolvant 50 pg de poudre lyophilisée CM-H 2 DCFDA en 86,5 &# 181; L DMSO anhydre. Mélanger en vortexant ou en pipetant vers le haut et vers le bas et faire des aliquotes de 20 μL dans des tubes de microcentrifugation marron. Conserver dans l'obscurité à -20 ° C et utiliser dans 1 semaine. Si stocké sous N 2, la durée de conservation de l'antenne peut être augmentée jusqu'à au moins 1 mois.
- Préparer une solution mère de TMRM 1 mM en dissolvant 25 mg de poudre de TMRM dans 50 ml de DMSO anhydre. Mélanger en vortexant ou en pipetant vers le haut et vers le bas et faire des aliquotes de 10 μL dans des tubes de microcentrifugation marron. Conserver dans l'obscurité à -20 ° C. Cette solution est stable depuis au moins un an.
- Préparez une fraction aliquote de stock de peroxyde de tert -butyle (TBHP) (~ 7 M) pour chaque expérience en pipettant directement un volume de la solution mère à 70% (plaque de 10 μL / 96 puits). Gardez cette aliquote à 4 ° C jusqu'à l'utilisation ultérieure.
- Préparez la solution de traitement des anticorps (AB) en diluant deux anticorps secondaires (Alexa Fluor 488 doigt anti-lapin et CY3 anse anti-lapin) 1000 fois dans 1x HH-buFfer.
2. Mise en place du microscope et du protocole d'acquisition (± 15 min)
REMARQUE: L'acquisition d'image est réalisée avec un microscope à champ large équipé d'un système automatisé et d'un volet, et d'un système autofocus basé sur le matériel utilisant un objectif corrigé par plan aérien 20X (NA = 0.75) et une caméra EM-CCD. Lors de la mise en place de l'analyse pour la première fois, une plaque d'essai contenant des cellules témoins, colorées selon les instructions du protocole, sert à étalonner le stade XY et à optimiser les paramètres d'acquisition. Si les paramètres d'acquisition ont déjà été déterminés, l'étalonnage peut être effectué à l'aide d'une plaque vide.
- Abaissez l'objectif au niveau de base absolue et étalonne le XY-stage en suivant les instructions du logiciel.
- Assurez-vous que les cubes de filtre corrects sont installés. Pour visualiser CM-H 2 DCFDA, utilisez un cube de filtre GFP standard avec un filtre passe-bande d'excitation 472/30 nm, un dichro de coupure de 495 nmIc mirror et un filtre à émission de bande passe 520/35 nm. Pour TMRM, utilisez un cube de filtre pour TRITC avec un filtre d'excitation bande passante de 540/25 nm, un miroir dichroïque de coupure de 565 nm et un filtre à émission de bande passante de 605/55 nm.
- Créez un protocole d'imagerie en utilisant le logiciel d'acquisition.
- Sélectionnez le type correct de plaque multi-puits (fabricant et code) à partir de la liste des plaques disponibles fournies dans le logiciel. Vous pouvez également définir votre propre format de plaque à plusieurs trous à l'aide de la plaque et des dimensions des puits.
- Alignez la plaque de puits en fonction des instructions du logiciel, par exemple en définissant deux coins des quatre puits d'angle extérieurs. Cette étape couvre les variations d'orientation de l'appareil photo.
- Sélectionnez les puits qui doivent être acquis. Si cette option n'est pas disponible dans le logiciel, utilisez un ensemble de sites XY définis manuellement qui correspondent aux puits sélectionnés.
- Optimisez les paramètres d'acquisition (temps d'exposition, intensité de la lampe, gain EM) pourE deux canaux séparément en utilisant la plaque d'essai. Minimiser l'exposition et l'intensité, car la lumière d'excitation de la fluorescence induit des ROS. Mais, assurez-vous que le rapport du signal au fond est d'au moins 2 pour le DCFDA basal CM-H 2 et 3 pour le TMRM avant le traitement TBHP et qu'il n'y a pas de saturation après le traitement TBHP. Les paramètres d'acquisition dépendent grandement de la configuration de microscopie et du type de cellule utilisé, mais comme référence, les paramètres indicatifs lors de l'utilisation d'une ampoule à halogénures métalliques de 130 W en tant que source de lumière et les cellules NHDF colorées selon les instructions du protocole sont les suivantes: pour CM- H 2 DCFDA et TMRM, un temps d'exposition de 200 ms et un filtre ND 8 sont utilisés, combinés à un gain EM de 15 (13 MHz, 14 bits) et 4 (27 MHz, 14 bits) respectivement. Une fois optimisé pour une certaine configuration et un type de cellule, cette étape peut être ignorée.
REMARQUE: il est essentiel que les paramètres d'acquisition restent identiques tout au long du processus d'imagerie. Pour les expériences à grande échelle, multi-jours, lamp staUne garantie régulière de qualité devrait être justifiée. - Définir un protocole d'acquisition, consistant en une acquisition séquentielle lambda (longueur d'onde). Sélectionnez le canal DCFDA CM-H 2 à acquérir d'abord, afin de minimiser l'exposition à la lumière avant la mesure.
- Définissez une boucle bien formée pour acquérir 4 images non chevauchées régulièrement espacées positionnées autour du centre de chaque puits de la sélection du puits en utilisant le protocole d'acquisition défini au 2.3.4. Choisissez l'acquisition de l'image méandre, c'est-à-dire d' abord de gauche à droite, du puits B02 à B11, puis de l'arrière, de droite à gauche, du puits C11 à C02 et ainsi de suite ( Figure 2A ). Cela permet d'économiser du temps par rapport à l'acquisition de l'image de gauche à droite. Si cette option n'est pas disponible dans le logiciel, ajustez l'ensemble personnalisé des emplacements XY créés en 2.3.3 pour prendre ce modèle d'image.
- Enregistrez les coordonnées XY des positions d'imagerie ( p. Ex. Dans un fichier xml séparé), afin de faciliter la révisionNg en cas de recalibrage du microscope. Ceci est particulièrement important si la lecture de ce dosage doit être corrélée avec une coloration post-hoc d'immunofluorescence (IF) pour les mêmes cellules.
3 . Cellules de semis dans une plaque à 96 puits (45 à 90 min, en fonction du nombre de lignes cellulaires différentes)
- Travailler dans un environnement stérile tel qu'un coffre de biosécurité de classe 2 et porter des gants.
- Décontaminer toutes les surfaces et tous les matériaux en utilisant de l'éthanol à 70% v / v dans de l'eau distillée.
- Prenez un flacon de culture cellulaire avec une culture cellulaire confluente à 90% de l'incubateur et placez-le dans l'armoire de sécurité biologique.
- Lavez les cellules deux fois avec PBS 1x.
- Ajouter la quantité appropriée de solution de trypsine-EDTA à 0,05% sur les cellules, en vous assurant que la surface cellulaire complète est couverte ( p. Ex. , 1 mL pour un flacon T25) et incuber pendant 2 min à 37 ° C et 5% de CO 2 .
- Si toutes les cellules sont détachées (vérifier au microscope ), Ajouter un milieu de culture (DMEM + 10% FBS + 1% de pénicilline-streptomycine, ± 4 mL dans un flacon T25) pour inactiver la solution trypsine-EDTA.
- Centrifuger pendant 5 min à 300 xg à température ambiante.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu de culture. Déterminez la quantité de support pour chaque type de cellule pour obtenir une concentration cellulaire compatible avec le comptage cellulaire. Typiquement, un flacon T25 confluent à 90% de NHDF contient environ 1-1,5 millions de cellules, qui sont remises en suspension dans 3-4 ml de milieu de culture.
- Comptez les cellules en utilisant une chambre de comptage cellulaire ou un compteur Coulter.
- Graine de 8 000 à 10 000 cellules dans chacun des 60 puits intérieurs d'une plaque noire de 96 puits avec un mince polystyrène continu ou un fond de verre (noir pour éviter la diffusion et le passage croisé entre les puits adjacents pendant l'imagerie). Lorsque vous utilisez différentes conditions / traitements / lignées cellulaires, répartissez leurs emplacements d'ensemencement de manière homogène sur la plaque de manière à minimiser les effets de la plaque (Fig "> Figure 2A). Les puits extérieurs, à l'exception des puits B01 et A01, ne sont pas utilisés car ils sont plus propices aux effets de bord.
- Graine de 8 000 à 10 000 cellules dans B01. Ce puits sera utilisé pour le réglage de la mise au point, juste avant l'acquisition de l'image.
- Remplissez les puits extérieurs vides avec un milieu pour minimiser les gradients (température, humidité, etc. ) entre les puits et l'environnement.
- Tapez doucement la plaque trois fois avant de la remettre dans l'incubateur pour éviter que les cellules ne poussent dans des taches.
- Culturez les cellules pendant 24 h, ou jusqu'à un degré de confluence d'env. 70%.
- Enregistrez les informations de traitement pour l'expérience dans une feuille de calcul appelée "Setup.xlsx". Le fichier doit contenir quatre colonnes et sera utilisé pour lier les traitements avec les puits et les informations d'image lors de l'analyse des données. Les quatre colonnes sont: «Bien», «Numéro de traitement», «Traitement» et «Contrôle» (une rangée par puits). Chaque traitement est coupléAvec un numéro de traitement unique, qui est utilisé lors de la visualisation des données pour déterminer l'ordre des traitements sur l'axe X des parcelles. La colonne de contrôle spécifie le traitement qui fonctionne comme contrôle pour le traitement sur la ligne en cours. Les illustrations d'une disposition expérimentale typique et du fichier d'installation correspondant sont représentées sur la figure 2 .
4. Chargement des cellules avec CM-H 2 DCFDA et TMRM (± 45 min)
REMARQUE: La manipulation des cellules au jour de l'expérience peut être effectuée dans un environnement stérile (armoire à biosécurité), mais ceci n'est pas obligatoire car les cellules seront rejetées ou fixées directement après l'essai.
- Chauffer le tampon HH à 37 ° C.
- Préparer une solution de travail TMRM 20 μM en diluant la solution mère 1 mM 50 fois dans du tampon HH (ajouter 490 μl de tampon HH à 1 aliquote de 10 μL de solution mère TMRM).
- Préparer une chargeAvec 2 μM CM-H 2 DCFDA et 100 nM TMRM. À cette fin, diluer la solution mère CM-H2 2 mM DCFDA 1 mM 500x et la solution de travail TMRM 20 μM 200x dans du tampon HH.
- Généralement, pour 60 puits, préparer 7,5 ml de solution de chargement en ajoutant 15 μL de DCFDA CM-H 2 et 37,5 μL de solution TMRM à 7447,5 μL de HH.
- Jeter le milieu de culture des cellules en tournant la plaque à l'envers dans un seul mouvement de fluide.
- Laver doucement les cellules deux fois avec du tampon HH à l'aide d'une pipette multicanal (100 μL / puits). Jeter le tampon HH entre les étapes de lavage en tournant la plaque à l'envers dans un seul mouvement de fluide.
- Chargez les cellules avec CM-H 2 DCFDA et TMRM en ajoutant 100 μL de la solution de chargement à chaque puits, à nouveau en utilisant une pipette multicanaux. Incuber pendant 25 min dans l'obscurité, à température ambiante. N'oubliez pas bien B01.
- Au cours de ces 25 min, préparez les solutions de travail de l'oxydant TBHP et assurez-vous que le microscope et le matériel d'accessoires sont allumés.
- Préparer la solution de travail I: Diluer la solution mère 7M de 70x à 100 mM (10 μL de stock dans 690 μL de tampon HH).
- Préparer la solution de travail II: Diluer WS I 100x à 1 mM (10 μL WS I dans 990 μL de tampon HH).
- Préparez la solution de travail III: Diluez WS III 25x à 40 μM (pour 60 puits ajoutez 300 μL de WS II dans 7200 μL de tampon HH).
- Au bout de 25 min, laver encore deux fois les cellules avec 100 uL de tampon HH comme décrit précédemment.
- Ajouter 100 μL de HH-tampon aux 60 puits intérieurs.
5. Première imagerie en direct Round to Measure Basal ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction (± 15 min)
- Assurez-vous que le logiciel d'acquisition est opérationnel et que le protocole d'imagerie est chargé.
- Installez la plaque sur le microscope, allumez le matériel baSed autofocus system et utilisez bien B01 pour ajuster le décalage autofocus à l'aide du canal TMRM. Comme cette procédure induit une augmentation de l'intensité du signal CM-H 2 DCFDA, ce puits est exclu de l'analyse de l'image en aval.
- Exécutez le protocole d'imagerie.
6. Deuxième cycle d'imagerie en direct après l'ajout de TBHP pour mesurer les niveaux de ROS induits (± 20 min)
- Retirez soigneusement la plaque à 96 puits du microscope.
- Ajouter 100 μL de TBHP WS III (40 μM) à chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal (cela se traduit par une concentration de TBHP de 20 μM dans les puits). Ce composé est utilisé comme témoin interne positif pour la coloration CM-H 2 DCFDA (le signal devrait augmenter) ainsi qu'un moyen de mesurer les niveaux de ROS induits.
REMARQUE: H 2 O 2 peut également être utilisé à la place de TBHP, mais ce composé est moins stable et donc moins fiable. - Attendez au moins 3 minutes pour permettre une réaction complète de TBHP wAvec CM-H 2 DCFDA.
- Pendant ce temps, ajouter 100 μL de solution de traitement d'anticorps (1/1000) au puits A01.
- Monter la plaque sur le microscope et vérifier la mise au point à nouveau avec le bon B01.
- Acquérir les mêmes positions que dans le premier cycle d'imagerie en utilisant le même protocole d'imagerie.
- Exportez les ensembles de données acquis dans un seul dossier sous forme de fichiers tiff individuels en utilisant une nomenclature normalisée qui inclut une référence à la plaque, au traitement pré ou post-TBHP, bien, au champ et au canal, séparés par des caractères de soulignement, p.ex. 'P01_Pre_B02_0001_C1' pour la plaque 1, traitement pré-TBHP, bien B02, champ 1 et canal 1. Cette information sera utilisée lors de l'analyse d'image ( p. Ex. Pour sélectionner les paramètres de segmentation appropriés), ainsi que lors de l'analyse des données (pour connecter les données d'analyse Avec les traitements corrects).
- Acquérir des images de terrain plates pour les deux canaux sur les quatre positions autour du centre du puits A01 en utilisant le protocole d'acquisition. Save thEn tant que fichiers tiff individuels dans le même dossier que les autres images en utilisant la nomenclature standardisée suivante: 'P01_FF_A01_0001_C1' pour la plaque 1, le champ 1 et le canal 1. Assurez-vous que les signaux se situent bien dans la plage dynamique; En cas de saturation, utiliser une concentration plus faible de solution de traitement d'anticorps.
- Jeter la plaque ou économiser pour un traitement ultérieur.
REMARQUE: Au lieu d'enlever la plaque du microscope et d'utiliser une pipette multicanaux pour ajouter la solution TBHP, une pipette automatisée peut être installée sur le microscope et reliée au logiciel d'acquisition afin de fonctionner lors de la réception d'un déclencheur. Cela permet d'ajouter TBHP à chaque puits directement après la première acquisition, avant de passer au prochain puits. De cette façon, lorsque le premier cycle d'imagerie est terminé, le second peut commencer tout de suite et tous les puits auront un temps d'incubation égal avec le TBHP.
7. Traitement et analyse d'images (± 30 min parPlaque à 96 puits)
REMARQUE: Tout le traitement d'image est effectué dans FIJI (http://fiji.sc), une version packagée du logiciel gratuit ImageJ. Un script dédié a été écrit pour une analyse automatisée des signaux intracellulaires ROS et mitochondriaux, ainsi que des paramètres morphologiques (RedoxMetrics.ijm, disponible sur demande). Les algorithmes sous-jacents sont décrits dans Sieprath et al. 1 .
- Assurez-vous que FIJI est installé et opérationnel.
- Démarrez FIJI et installez le macro-set (Plugins -> Macros -> Installer ...). Cela impliquera un certain nombre de nouvelles commandes de macro ainsi qu'un ensemble d'outils d'action pour optimiser les paramètres d'analyse, comme le montre la Figure 3A .
- Ouvrez l'interface de configuration pour définir les paramètres d'analyse en cliquant sur le bouton 'S' ( Figure 3B ).
- Sélectionnez le type d'image, le nombre de canaux et le puits utiliséPour l'acquisition d'images plates.
- Indiquez quel canal contient des cellules (canal DCFDA CM-H 2 ) ou une mitochondrie (canal TMRM) et ajustez les paramètres de prétraitement et de segmentation pour chaque canal en fonction de la qualité de l'image ( Figure 3B ). Cochez les cases '' Arrière-plan '' et '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' ' Définir un sigma pour le flou gaussien des cellules et l'amélioration des mitochondries Laplacienne. Sélectionnez un algorithme de seuillage automatique et remplissez les limites d'exclusion de taille (en pixels). Si un seuil fixe est choisi au lieu d'un algorithme de seuillage automatique, remplissez le seuil supérieur.
- Testez les paramètres de segmentation sur quelques images sélectionnées des ensembles de données acquises en les ouvrant et en cliquant sur les boutons 'C' ou 'M' dans le menu pour la segmentation cellulaire ou mitochondrie respectivement,Et ajustez les paramètres si nécessaire. Un exemple de résultat est illustré à la Figure 3C .
- Exécutez l'analyse par lots sur le (s) dossier (s) d'intérêt en cliquant sur le bouton '#' et en sélectionnant le dossier avec les images. Par dossier, cela produira un nouveau répertoire "Sortie", contenant des ensembles ROI individuels (fichiers zip) et des fichiers de résultat (.txt) par image. Pour les deux canaux, le fichier de résultats contient des descripteurs morphologiques et d'intensité. Le fichier de résultats de la chaîne DCFDA CM-H 2 (cellules) contient par descripteur la valeur moyenne pour les ROI combinés à une seule image. Pour le canal TMRM, le fichier de résultats contient par descripteur la valeur de chaque ROI mitochondrial individuellement segmenté.
- Après l'analyse par lot, vérifiez visuellement la performance de segmentation sur une «pile de vérification», une hyperstack de toutes les images avec leur recouvrement ROI respectif en cliquant sur le bouton «V». De cette façon, des artefacts tels que des sur-/ Undersegmentation, les images hors sujet ou les particules de poussière / fibres dans les images peuvent déjà être repérées rapidement. Une restauration supplémentaire peut être effectuée pendant le contrôle de la qualité des données (cfr. §8).
8. Analyse des données, contrôle qualité (QC) et visualisation
Le traitement et l'analyse des données brutes sont effectués en utilisant le logiciel R freeware statistique (http://www.rproject.org - version 3.3.2) et RStudio (http://www.rstudio.com/ - version 1.0.44). Pour obtenir et visualiser rapidement les résultats, une application Shiny intuitive 17 (disponible sur demande) a été conçue qui intègre et visualise les données dans les plans de chaleur et les calques, et effectue également des analyses statistiques. En général, le flux de travail se compose de deux étapes consécutives. Tout d'abord, les données sont traitées et inspectées par plaque de 96 puits pour détecter les points de données aberrantes. Deuxièmement, les données organisées de toutes les plaques d'une expérience donnée sont combinées et analysées à l'aide de multi-paramètres non paramétriquesTests variables 18 et une analyse de composante principale.
- Assurez-vous que R et RStudio sont installés et opérationnels.
- Démarrez RStudio.
- Ouvrez l'application brillante RedoxMetrics et exécutez l'application (choisissez de l'exécuter dans un navigateur externe).
- Dans la page 'entrée', sélectionnez le répertoire où se trouvent les fichiers de résultats de RedoxMetrics.ijm.
- Assurez-vous que 'Setup.xlsx' (créé à l'étape 3.15) est également présent dans ce répertoire.
- Les fichiers de résultats et les informations de configuration sont automatiquement importés, réarrangés et visualisés.
- La page 'configuration expérimentale' montre la mise en page de l'expérience. Utilisez cette page pour vérification.
- La page suivante, «résultats par plaque», montre les données pour chaque plaque séparément dans une disposition de plaques multi-puits codées par couleur ainsi que dans des boîtiers avec des valeurs aberrantes marquées avec le nom de nom et le numéro d'image. Ce dernier permet une inspection et une identification faciles des points de données aberrantes (valeurs extrêmement élevées ou faibles par rapport aux valeurs moyennes mesurées pour ce traitement spécifique - voir la figure 4 pour un exemple).
En utilisant cette information, vérifiez les images correspondant aux points aberrants. Si des anomalies sont détectées, elles doivent être retirées de l'analyse. La plupart des anomalies sont causées par une segmentation incorrecte lorsque (partie) de l'image est hors de portée, ou lorsque des particules de poussière fortement fluorescentes perturbent la segmentation adéquate. Les cas extrêmes peuvent déjà être repérés rapidement à l'aide de l'outil de vérification de pile (étape 7.5), mais des occurrences plus subtiles sont découvertes à cette étape. Lorsqu'aucune raison apparente ou technique ne peut être trouvée pour la valeur aberrante, l'image ne doit pas être retirée de l'analyse. - Facultatif: créez une nouvelle feuille de calcul intitulée 'Drop.xlsx' avec une seule colonne appelée 'Drop'. Dans cette colonne, listez les noms de fichier (y compris l'extension ".tif") de toutes les imagesQui doit être supprimé de l'analyse (identifiée à l'étape 7.5 ou à l'étape 8.6.2). Téléchargez ce fichier en utilisant la page 'entrée'.
- La page «résultats complet de l'expérience» montre les résultats de toutes les plaques combinées. Si un fichier déroulant a été téléchargé, ce fichier permet de supprimer les points de données spécifiés de l'analyse.
Pour chaque paramètre individuellement, les données sont normalisées par plaque selon leurs contrôles respectifs. Les données de toutes les plaques sont ensuite combinées, suivies de tests multivariés non paramétriques du paquet nparcomp 18 . Si seulement 2 traitements sont comparés, deux tests d'échantillons pour le problème non paramétrique de Behrens-Fisher sont effectués. Pour plus de 2 traitements, un test de comparaison multiple non paramétrique basé sur le contraste est utilisé. Les résultats sont visualisés à l'aide de boxplots. - La page «analyse par grappes» montre les résultats d'une analyse de composants principaux (paquetage «stats» de base de PCA-R). Données de 5 paramètres (baLes ROS salifiés et le potentiel de la membrane mitochondriale, la taille et la circularité) sont combinés pour discriminer les différents traitements basés sur un profil rédox sensible. À cette fin, une analyse de composante principale (PCA) est effectuée (paquet Rats 'stats'). Les résultats sont visualisés à l'aide d'un biplot (ggbiplot package - http://github.com/vqv/ggbiplot).
- Utilisez la page "télécharger des données" pour télécharger les images de données de backend contenant les données traitées et réarrangées afin qu'elles puissent être réutilisées pour une visualisation plus avancée des données ou des analyses statistiques.
REMARQUE: les pièges typiques et les solutions potentielles sont listés dans le tableau 1 .
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Representative Results
L'analyse a été comparée en utilisant plusieurs expériences de contrôle, dont les résultats sont décrits dans Sieprath et al. 1 . En bref, la réponse de fluorescence de CM-H 2 DCFDA et TMRM à des changements induits extraterrestre dans ROS intracellulaire et Δψ m, ont été quantifiés pour déterminer la gamme dynamique. Pour CM-H 2 DCFDA, le NHDF a montré une augmentation linéaire du signal de fluorescence lorsqu'il était traité avec des concentrations croissantes de TBHP entre une plage de 10 μM à 160 μM. De même, pour le TMRM, les cellules NHDF ont démontré une augmentation linéaire de la fluorescence mitochondriale lorsqu'elles sont traitées avec des concentrations croissantes d'oligomycine (qui induit une hyperpolarisation Δψ m ) dans une gamme de 1 à 10 μg / μL. À l'inverse, l'addition en temps réel de la valinomycine, un antibiotique qui induit la dépolarisation Δψ m , a entraîné une augmentation graduelleDiminution possible de la fluorescence TMRM .
Le test a également été utilisé dans une variété d'expériences pour révéler des différences dans l'état redox entre les types de cellules ou les traitements 1 , 15 . Pour illustrer cela, on montre les résultats d'une expérience dans laquelle le NHDF a été traité avec l'inhibiteur de la protéase du VIH Saquinavir (SQV) ( Figure 5 ). En utilisant le protocole décrit, une augmentation significative a été détectée pour les niveaux de ROS basaux et induits par rapport aux cellules de contrôle traitées par DMSO ( Figure 5B ). Le traitement SQV a également affecté de manière significative la morphofonction mitochondriale. Morphologiquement, les mitochondries ont acquis un schéma très fragmenté, ce qui a également été confirmé par une circularité plus élevée et une taille moyenne plus petite des mitochondries individuelles. Fonctionnellement, Δψ m , mesuré en tant que signal TMRM moyen par mitochLe pixel ondrial a également été considérablement augmenté ( figure 5A ). Lors de la combinaison des données des 5 paramètres décrits ci-dessus, les deux conditions (contrôle et SQV) pourraient être clairement séparées les unes des autres par analyse de composant principal. Les données de trois réplications biologiques indépendantes sont affichées dans un biplot 2D présentant les deux premières composantes principales, ce qui explique 81,4% de la variance totale ( figure 5C ). Cela prouve la robustesse de l'analyse et suggère que la lecture combinée peut servir d'indicateur sensible de l'état de santé cellulaire.
Figure 1 : Aperçu général de l'analyse de haute teneur en imagerie pour la mesure simultanée des niveaux intracellulaires intracellulaires et ROS induits et Morphofunction mitochondrial. ( A ) SReprésentation chimique des principaux blocs opérationnels. ( B ) Exemple illustré: les cellules sont ensemencées dans plusieurs plaques identiques à 96 puits. Une disposition standard de la plaque de puits est illustrée plus en détail à la figure 2A . Après la coloration, 4 images sont acquises par canal autour du centre de chaque puits, à la fois avant et après le traitement TBHP , illustré par les grands montages avec insertion. Après l'analyse de l'image, les résultats d'intensité sont visualisés à l'aide d'une carte de chaleur intuitive projetée sur la disposition des puits. Cela permet une détection rapide des effets de la plaque ou des puits aberrants. Après la cuisson des ensembles de données expérimentaux complets, l'analyse finale des données est effectuée, ce qui entraîne une sortie unique et multi-paramètres. (Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 1 , avec la permission de Springer) Cliquez ici pour voir un plus grand versioN de cette figure.
Figure 2 : Une mise en page expérimentale typique de 96 puits et un «fichier de configuration» correspondant. ( A ) 4 conditions différentes sont réparties de manière homogène sur les 60 puits intérieurs de la plaque. Bien B01 contient également des cellules, mais n'est utilisé que pour ajuster le décalage PFS initial juste avant l'imagerie. Les autres puits extérieurs ne sont remplis que de milieu de culture pour minimiser les gradients (température, humidité, etc. ) pendant la culture cellulaire. L'acquisition de l'image se fait de manière méandre, c'est-à-dire d' abord de gauche à droite, du puits B02 à B11, puis de l'arrière, de droite à gauche, du puits C11 à C02 et ainsi de suite. Après l'acquisition de l'image, les images à champ plat sont acquises dans le puits A01, qui est utilisé pour corriger l'hétérogénéité de l'éclairage spatial pendant l'image et Analysez. ( B ) Le fichier d'installation correspondant (Setup.xlsx) est une feuille de calcul contenant des informations sur la mise en page de l'expérience. Il spécifie les emplacements de chaque traitement dans la plaque multi-puits et leurs contrôles respectifs. Chaque rangée représente un puits. Chaque traitement a son propre numéro de traitement unique, qui sert à spécifier l'ordre des traitements sur l'axe X des parcelles générées lors de l'analyse des données. La colonne «Contrôle» contient le traitement qui doit être utilisé comme contrôle pour normaliser les données du traitement spécifié dans la même rangée. Dans l'exemple, le traitement 1 est le traitement utilisé comme témoin pour normaliser les données de tous les autres traitements. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 3 : Macro-set RedoxMetrics, interface de mise en page et de configuration. ( A ) Lorsque la macro-set RedoxMetrics pour FIJI est installée, un certain nombre de nouvelles commandes de macro ainsi qu'un ensemble d'outils d'action pour tester et optimiser les paramètres d'analyse sont créés dans la barre de menus. 'S' invoque l'interface de configuration. 'F' effectue une correction de plage plate sur une image ouverte. 'C' et 'M' effectuent une segmentation de test pour les régions cellulaires ("Cell", CM-H2DCFDA channel) et les régions mitochondriales ("Mito", chaînes TMRM), respectivement sur une seule image ouverte en utilisant les paramètres d'analyse sélectionnés dans la configuration Interface, renvoyant une superposition des régions segmentées d'intérêt (ROI). '#' Effectue une analyse par lots sur un dossier d'images en utilisant les paramètres spécifiés dans l'interface de configuration (généralement après vérification sur une ou quelques images). 'V' crée une vérification hyperstack usinG les données de sortie de l'analyse par lots. Cette hyperstack est une image composite de toutes les images brutes présentes dans le dossier et leurs régions respectives d'intérêt (dessinées dans une seconde chaîne). 'O' peut être cliqué pour afficher ou masquer la superposition de la région segmentée. ( B ) Interface de configuration. Ici, tous les paramètres d'analyse sont sélectionnés, y compris les informations générales telles que le type d'image (extension), le nombre de canaux (longueurs d'onde) et le puits qui a été utilisé pour la correction de terrain plat. Ensuite, il existe des paramètres spécifiques au type de contenu d'image (Cell ou Mito). Dans les deux cas, il existe des options (cases à cocher) pour inclure une correction de fond («arrière-plan») et une amélioration de contraste locale («contraste»). Pour la segmentation cellulaire, il est possible de définir un rayon de flou gaussien (sigma) pour réduire le bruit. Pour la segmentation mito, il est possible de définir le rayon d'un opérateur laplacien pour l'amélioration sélective des mitochondries. La segmentation subséquente est pErformé en utilisant une méthode de seuillage automatique (ou fixe) qui peut être définie par type de contenu. Lorsqu'un seuil fixe est choisi, la valeur de seuil supérieure peut être fournie manuellement. Enfin, l'analyse peut être limitée à une sélection d'objets qui se situent dans une taille minimale et maximale. ( C ) Un exemple de résultat de segmentation exécuté avec la commande "C" (supérieure) ou "M" (inférieure), affichée sous forme d'image brute en gris superposée aux régions d'intérêt en jaune. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Exemple illustré de visualisations de données intermédiaires. ( A ) Visualisation de la plaque Multiwell où les puits B02 et D07 apparaissentméfiant. ( B ) Boxplot représentant les mêmes données, avec les valeurs aberrantes marquées avec le nom du nom et le nom de l'image. Avec F03_0003, les images de B02 et D07 réapparaissent comme des valeurs aberrantes. ( C ) L'inspection visuelle de ces images montre que B02_0000 et D07_0001 devraient être supprimés d'une analyse plus approfondie car il existe des erreurs de segmentation (illustrées par le «X rouge»). F03_0003 doit être conservé car il n'y a pas de segmentation apparente ou d'erreur technique. (Si aucune raison technique n'est trouvée pour l'aberration, les données ne doivent pas être supprimées). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Effet du Saquinavir (SQV; 20 μM) sur le Fibr Humain PrimaireOblasts (le contrôle est DMSO). ( A ) Le potentiel de la membrane mitochondriale (ΔΨ m ) et la morphologie mitochondriale (circularité et taille moyenne des mitochondries individuelles) mesurées par le TMRM ( B ) Augmentation des niveaux basaux de ROS intracellulaires mesurés par CM-H 2 DCFDA et réponse à ROS induite, mesurée En tant que gain relatif d'intensité après addition de 20 μM d'addition de TBHP. ( C ) diagramme de dispersion 2D des 2 premiers composants principaux (PC) d'une analyse PCA sur les 5 variables décrites ci-dessus (niveaux de ROS basaux et induits, taille moyenne mitochondriale, circularité et ΔΨ m ). Les flèches noires représentent les directions des 5 variables originales par rapport aux composants principaux. (Les répétitions indépendantes sont tracées avec une couleur différente; Toutes les données sont normalisées par rapport à la commande DMSO; * = valeur p <0,05; ** = valeur p <0,01; *** = valeur p <0,001; la portée de la Y -Les axes ont été ajustés pour afficher de manière optimale les différences; Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 1 , avec la permission de Springer) Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Problème | Raison potentielle | Solution possible |
| Trop de cellules dans les puits pendant l'imagerie | Trop peu de cellules ensemencées | Graine plus de cellules 24 h avant l'imagerie |
| Faible croissance cellulaire | Vérifier les conditions de culture (moyenne, stabilité à la température, contrôle du CO 2 ) | |
| Étapes de lavage trop violentes | Évitez de nettoyer les cellules, faites pipette doucement | |
| Trop de cellules dans les puits pendant l'imagerie | AussiDe nombreuses cellules ensemencées | Graine moins de cellules 24 h avant l'imagerie |
| Signaux faibles ou réponse non linéaire de la fluorescence CM-H 2 DCFDA au stimulus | Utilisé une concentration de colorant trop faible / élevée | Si vous utilisez des cellules autres que NHDF, les concentrations de chargement optimales doivent être déterminées empiriquement |
| Le chargement des teintures est insuffisant | Ajouter 0,02% p / v de l'agent tensio-actif Pluronic-127 à la solution de chargement pour augmenter l'absorption. | |
| Le signal DCFDA CM-H 2 augmente visuellement pendant le temps d'exposition | Concentration de colorant trop élevée | Réduire la concentration de colorant |
| L'intensité de l'excitation est trop élevée | Réduire l'intensité d'excitation en utilisant des filtres ND et / ou réduire le temps d'exposition | |
| CM-H 2 DCFDA intensité diminue lors de l'acquisition de la plaque de puits | CM-H 2 DCFDA sort dela cellule. | Utiliser un Probenicid 2 mM (inhibiteur de la pompe anionique). Ajoutez à la solution de chargement, ainsi que le tampon d'imagerie pour réduire les fuites |
| Il n'y a pas d'augmentation de l'intensité du signal DCFDA CM-H 2 après l'ajout de TBHP | TBHP n'est pas actif | Utiliser du TBHP frais |
| CM-H 2 DCFDA sort de la cellule. | Utiliser Probenicid comme décrit ci-dessus. | |
| (Certaines des) images acquises apparaissent en dehors de la mise au point, alors que l'accent semble être correct lors de la vérification. | La plaque est montée inclinée, ce qui fait que le foyer s'étend au-delà du décalage PFS | Vérifier le montage de la plaque et du niveau de scène, Repositionner la plaque |
| Le fond de la plaque contient de la poussière ou des irrégularités | Nettoyez le fond de la plaque avec un papier à lentilles humides à l'éthanol | |
| Les cellules meurent pendant l'imagerie | Réduire l'intensité d'excitation ou acquérir moins d'images par puits. | |
| Composition d'image-tampon erronée | Remake image-buffer | |
| Il y a des points fluorescents hors d'usage dans les images | Les cellules détachées flottent hors de portée | Laver plus doucement pendant le protocole de chargement |
| Une ou plusieurs colonnes ont une intensité inférieure à celle des autres puits de la plaque | Un ou plusieurs conseils de la pipette multicanaux n'étaient pas fermement attachés et donc moins de journaliste a été ajouté à ces puits | Vérifiez soigneusement si toutes les astuces sont remplies parfaitement lorsque vous utilisez une pipette multicanaux. |
| L'accent se déploie de façon spectaculaire lors de l'acquisition de l'image | Le fond en polystyrène de la plaque peut réagir avec de l'huile d'immersion lors de l'utilisation d'une lentille d'huile | Utilisez une lentille sèche, ou utilisez une plaque multi-puits avec une glaSs bottom |
| L'intensité du signal TMRM augmente entre l'imagerie du premier et du dernier puits | Le temps de chargement des rapporteurs n'était pas assez long, le TMRM est toujours en équilibre | Augmenter le temps de chargement du journaliste |
| Le signal DCFDA CM-H 2 après traitement TBHP augmente pendant l'acquisition de la plaque de puits | Le temps entre le traitement avec TBHP et le début du deuxième cycle d'imagerie n'était pas assez long, TBHP continue d'oxyder le DCFDA CM-H 2 . | Augmenter le temps d'incubation entre le traitement avec TBHP et le deuxième cycle d'imagerie. (Commencer par au moins 3 min) |
| Les images plates du terrain sont saturées | La solution de travail des anticorps est concentrée | Utiliser une concentration plus faible de solution de traitement d'anticorps |
| Les paramètres d'acquisition ne sont pas optimisés (temps d'exposition à élevé, filtre ND à bas, ...) | Optimiser les paramètres d'acquisition,Le signal doit être dans la gamme dynamique du capteur | |
| Les images plates sur le terrain sont obscures | La solution de travail des anticorps est à diluer | Utilisez une concentration plus élevée de solution de travail d'anticorps |
| Les paramètres d'acquisition ne sont pas optimisés (temps d'exposition à élevé, filtre ND à bas, ...) | Optimiser les paramètres d'acquisition, le signal doit être dans la gamme dynamique du capteur | |
| Artéfacts sur / sous-segmentation | Seuil non réglé correctement | Ajuster le seuil |
| Filtres de taille non ajustés correctement | Ajuster les critères de taille min et max pour l'analyse d'image | |
| La confluence cellulaire est trop élevée | Le niveau de confluence correct est très important pour une analyse d'image fiable. Pour d'autres types de cellules que le NHDF, la densité de semis optimale doit être déterminée empiriquement | |
| L'application brillante ne fonctionne pas | Répertoire incorrect sélectionné | Choisissez le répertoire correct sur la page d'entrée. |
| Fichiers manquants dans le répertoire | Assurez-vous que tous les fichiers nécessaires (sortie de macro imagej et fichier d'installation) sont présents dans le répertoire sélectionné | |
| Paquets manquants | Normalement, l'application vérifie et installe tous les paquets nécessaires, mais lorsque cela échoue, vérifiez manuellement les paquets suivants: devtools, ggbiplot, pacman, ggplot2, plyr, nparcomp, data.table, readxl, gplots, ggbiplot, brillant, brillantFiles, pbapply Et shinyjs incluant toutes les dépendances. |
Tableau 1: pièges typiques et solutions potentielles.
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Discussion
Cet article décrit une méthode de microscopie à contenu élevé pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires et de la morphofonction mitochondriale dans le NHDF. Sa performance a été démontrée avec une étude de cas sur le NHDF traité par SQV. Les résultats confirment des preuves antérieures de la littérature dans lesquelles des niveaux accrus de ROS ou un dysfonctionnement mitochondrial ont été observés après le traitement avec des inhibiteurs de la protéase du VIH de type 1, bien que dans des expériences séparées 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . La différence importante est que l'analyse décrite est capable de mesurer ces paramètres simultanément, dans les mêmes cellules vivantes, ainsi que des données morphologiques. L'avantage majeur de cette approche est la détermination sans ambiguïté des deux facteurs ensemble dans l'espace et tIme, ce qui permet de repérer les relations de causalité. Une analyse de composante principale est réalisée qui permet de générer un profil redox sensible de perturbations spécifiques. Cependant, des techniques d'exploration de données plus avancées et des algorithmes de codage (supervisés) peuvent également être utilisés sur les données extraites pour permettre le profil prédictif redox. Cela peut être une caractéristique précieuse pour les outils de classification diagnostique ou pronostique en pathologie numérique, ainsi que dans le dépistage de cibles thérapeutiques, par exemple , une fois que des modèles de classification robustes sont créés, des bibliothèques de petites molécules peuvent être examinées pour trouver des candidats thérapeutiques pour contrer le stress oxydatif, analogue à Un écran récent pour les pistes prometteuses dans le développement thérapeutique des troubles mitochondriaux humains 26 .
Le dosage a été conçu pour NHDF, mais peut être adapté à d'autres types de cellules adhérentes. Cela nécessite une optimisation du protocole de coloration et des concentrations de colorants rapporteurs. Le montant de r Le colorant de l'eporter doit être minimisé car la surcharge peut provoquer des effets non linéaires dus à la trempe ou même devenir cytotoxiques 27 . L'extension du dosage aux cellules en suspension est moins évidente en raison de difficultés liées au montage et à l'observation de ces cellules de manière physiologique. Ils peuvent être cytospun sur une lamelle ou cultivés dans des milieux exempts de sérum pour induire une adhésion, mais ces deux processus interfèrent avec les conditions physiologiques 28 , 29 . Cependant, ces limitations pourraient être surmontées en utilisant des supports de culture cellulaire micropatternés qui maintiennent les cellules individuelles (adhérentes ou non adhérentes) piégées dans de petits micro-puits tout en maintenant leur viabilité 30 ou par l'utilisation d'un hydrogel thermo-réversible pour piéger des cellules pendant l'imagerie 31 . Ces méthodes ont déjà été utilisées pour le dépistage à haute teneur du potentiel de la membrane plasmique ou l'oxygène cellulaire dans les cellules individuelles en suspension= "Xref"> 32 , 33 ou l'imagerie des marqueurs intracellulaires dans les parasites vivants et hautement mobiles 31 . Des adaptations devraient également être apportées à la modalité d'imagerie, étant donné que l'analyse morphologique du réseau mitochondrial dans ces cellules nécessiterait des capacités rapides d'acquisition en 3D, telles que la microscopie de la feuille lumineuse à faisceau confocal ou Bessel 34 , 35 , ainsi que l'analyse Pipeline, pour inclure la dimension Z tout en calculant les paramètres morphologiques.
Le dosage a été optimisé pour les plaques à 96 puits, mais il est évidemment possible de faire évoluer davantage, par exemple sur des plaques de 384 puits. Le facteur limitant majeur est le temps d'acquisition de la plaque, c'est-à-dire le temps nécessaire pour acquérir des images de tous les puits. Les signaux fluorescents doivent rester stables pendant ce délai afin de pouvoir comparer en toute confiance les mesures entrePuits individuels. Mais, parce que la coloration est transitoire et que le processus à l'étude est dynamique, cela pose un défi. Par conséquent, les signaux fluorescents ont été mesurés dans un ensemble d'expériences répliquées et cela a montré que les signaux CMF-H2 DCFDA et TMRM restent stables de 7 à au moins 50 minutes après coloration (coefficient de variation <2%). Cela donne une fenêtre d'environ 40 minutes. Une plaque à 96 puits prend généralement environ 10 minutes. Ainsi, une extrapolation sur des plaques de 384 puits maintiendrait la durée d'acquisition dans le temps stable. Avec une moyenne de 50 cellules par image (en fonction de l'utilisation d'un objectif 20X et des cellules NHDF), cela donnerait des données pour environ 30 000 cellules par heure de dépistage, ce qui augmenterait grandement le pouvoir statistique de l'analyse. Un autre facteur influençant la stabilité du signal fluorescent est la température. Pour éviter la vacuolisation de CM-H 2 DCFDA (c.-à-d. L'accumulation de colorant dans les vésicules intracellulaires), ce qui donnerait naissance à un hétéroColoration généreuse et effets non linéaires, l'incubation a lieu à température ambiante au lieu de 37 ° C. En dehors de la stabilité, il est important de noter que l'exposition des cellules vivantes à la lumière d'excitation de la fluorescence induit la production de ROS. Cela implique que les conditions d'exposition (temps d'exposition et intensité de l'excitation lumineuse) doivent être maintenues au minimum. Cela signifie également que tous les puits ne devraient être exposés que lorsque les images réelles sont acquises. Cela exclut l'utilisation de méthodes de mise au point automatique activées par logiciel et justifie l'utilisation d'un système autofocus basé sur le matériel.
Un avantage de la méthode décrite est son caractère générique. Pratiquement toute combinaison de journalistes fluorescents compatibles spectralement peut être utilisée. Ceci a été démontré en utilisant la combinaison Calcein / MitoSOX pour mesurer les ROS mitochondriaux par cellule vivante 1 , 15 . En outre, les applications ne sont pas limitées à l'int Mesure ROS / mitochondrial egravée. Le dosage peut également être étendu avec une immunocoloration post hoc (après le deuxième cycle d'imagerie). Étant donné que les emplacements d'imagerie exacts sont enregistrés, les analyses redox peuvent être directement liées à la protéomique de localisation dans les mêmes cellules. Cela augmente considérablement la lecture moléculaire, ce qui contraste avec d'autres méthodes souvent utilisées pour évaluer la biologie redox, ou les intensités de fluorescence en général. Par exemple, la fluorimétrie (lecteur de microplaque) est largement utilisée en raison de son coût relativement faible (configuration de base disponible pour aussi peu que € 4000) et de la courbe d'apprentissage peu profonde, mais étant une boîte noire, elle est plus enclin à des facteurs de confusion tels que les variations Densité cellulaire ou fluorescence d'arrière-plan (auto-), p.ex. contaminant les particules de poussière. De plus, les lecteurs de plaques ne permettent pas l'extraction de paramètres morphologiques, ils ne peuvent pas mesurer des cellules individuelles et sont moins sensibles et fiables pour mesurer des signaux dynamiques ou transitoiresLass = "xref"> 36 , 37 . La cytométrie de flux a la capacité de mesurer des cellules individuelles et a l'avantage de la vitesse. En effet, une plaque de 384 puits peut être filtrée en moins de 12 min avec une sensibilité élevée pour les marqueurs multiples 38 . C'est beaucoup plus rapide que ce qui est possible avec la microscopie à large champ. Mais, toujours aucune information spatiotemporelle n'est fournie ( c.-à-d. La localisation subcellulaire, les données morphologiques et / ou la cinétique dépendante du temps), ni permet de revisiter les mêmes cellules pendant ou après un traitement (c.-à-d., En flux) . En outre, les cellules doivent être en suspension, ce qui rend la cytométrie en flux moins adaptée à l'étude de la physiologie des cellules adhérentes. Les inconvénients majeurs du microscopie à contenu élevé par rapport aux autres méthodes sont la nécessité d'un stockage de données d'image de grande taille, d'une puissance de traitement intensive et d'analyses d'images complexes. L'analyse présentée standardise le processus d'acquisition d'image et rationalise l'analyseS afin de minimiser ce temps de traitement, d'augmenter la facilité d'utilisation et donc de rendre l'analyse plus accessible.
En conclusion, et spécifique à l'utilisation de CM-H 2 DCFDA et TMRM, la méthode de profilage redox décrite est robuste, sensible et fiable. En raison de son caractère multiparamétrique et quantitatif, il est supérieur à d'autres méthodes basées sur la fluorescence. De cette façon, cela peut aider à élucider la relation entre la fonction mitochondriale et la signalisation ROS intracellulaire, ce qui est essentiel pour mieux comprendre une grande variété de pathologies dans lesquelles l'homéostasie redox est perturbée. En outre, en raison de son caractère générique, le test permet des applications bien au-delà de leur portée d'origine.
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Disclosures
Les auteurs affirment qu'il n'y a pas d'intérêts financiers concurrents ou d'autres conflits d'intérêts. L'auteur correspondant veille également à ce que tous les auteurs aient été invités à divulguer tous les conflits d'intérêts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
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