Summary
Dieses Papier präsentiert einen hochauflösenden Mikroskopie-Workflow zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus sowie mitochondrialem Membranpotential und Morphologie - gemeinsam als mitochondriale Morphofunktion bezeichnet - in lebenden adhärenten Zellen unter Verwendung der zellpermeablen fluoreszierenden Reportermoleküle 5- (und- 6) -chlormethyl-2 ', 7'-dichlordihydrofluoresceindiacetat, Acetylester (CM-H 2 DCFDA) und Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM).
Abstract
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) regulieren essentielle zelluläre Prozesse einschließlich Genexpression, Migration, Differenzierung und Proliferation. Allerdings induzieren übermäßige ROS-Spiegel einen Zustand von oxidativem Stress, der von irreversiblen oxidativen Schäden an DNA, Lipiden und Proteinen begleitet wird. Somit liefert die Quantifizierung von ROS einen direkten Proxy für den zellulären Gesundheitszustand. Da Mitochondrien zu den wichtigsten zellulären Quellen und Zielen von ROS gehören, ist die gemeinsame Analyse der mitochondrialen Funktion und der ROS-Produktion in denselben Zellen entscheidend für ein besseres Verständnis der Zusammenschaltung in pathophysiologischen Bedingungen. Daher wurde für die gleichzeitige Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus, mitochondrialem Membranpotential (ΔΨ m ) und mitochondrialer Morphologie eine hochgradige mikroskopiebasierte Strategie entwickelt. Es basiert auf automatisierte Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse von lebenden adhärenten Zellen, die in Multi-Well-Platten gewachsen sind, und staineD mit den zellpermeablen fluoreszierenden Reportermolekülen CM-H 2 DCFDA (ROS) und TMRM (ΔΨ m und mitochondrialer Morphologie). Im Gegensatz zur Fluorimetrie oder Durchflusszytometrie erlaubt diese Strategie die Quantifizierung von subzellulären Parametern auf der Ebene der einzelnen Zelle mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung, sowohl vor als auch nach der experimentellen Stimulation. Wichtig ist, dass die bildbasierte Natur des Verfahrens die Extraktion von morphologischen Parametern zusätzlich zu den Signalintensitäten ermöglicht. Der kombinierte Feature-Set wird für die explorative und statistische multivariate Datenanalyse verwendet, um Unterschiede zwischen Subpopulationen, Zelltypen und / oder Behandlungen zu erkennen. Hier wird eine detaillierte Beschreibung des Assays gegeben, zusammen mit einem Beispielversuch, das sein Potenzial für eine eindeutige Diskriminierung zwischen zellulären Zuständen nach chemischer Störung beweist.
Introduction
Die Konzentration des intrazellulären ROS wird durch ein dynamisches Zusammenspiel zwischen ROS-produzierenden und ROS-Entschärfungssystemen akribisch reguliert. Ungleichgewicht zwischen den beiden provoziert einen Zustand des oxidativen Stresses. Unter den Hauptquellen der ROS sind Mitochondrien 1 . Angesichts ihrer Rolle bei der Zellatmung sind sie verantwortlich für den Großteil der intrazellulären Superoxid (O 2 • - ) - Moleküle 2 . Dies ergibt sich meist aus Elektronenleckage zu O 2 am Komplex 1 der Elektronentransportkette unter Bedingungen eines starken negativen inneren mitochondrialen Membranpotentials (Δψ m ), dh mitochondrialer Hyperpolarisation. Auf der anderen Seite wurde auch die mitochondriale Depolarisation mit einer erhöhten ROS-Produktion korreliert, die auf mehrere Wirkmechanismen 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 Darüber hinaus wird durch Redox-Modifikationen in Proteinen der Spalt-Fusions-Maschinerie ROS die mitochondriale Morphologie 9 regulieren. Beispielsweise ist die Fragmentierung mit einer erhöhten ROS-Produktion und Apoptose 10 , 11 korreliert, während filamentöse Mitochondrien mit Nährstoffverhungern und Schutz verbunden sind Mitophagie 12 Angesichts der komplizierten Beziehung zwischen zellulärem ROS und mitochondrialer Morphofunktion sollten beide idealerweise gleichzeitig in lebenden Zellen quantifiziert werden. Um dies genau zu tun, wurde ein hochauflösender Bildgebungsassay auf der Grundlage einer automatisierten Breitfeldmikroskopie und einer Bildanalyse von adhärenten Zellkulturen entwickelt, die mit den Fluoreszenzsonden CM-H 2 DCFDA (ROS) und TMRM (mitochondrialem Δψ m und Morphologie) gefärbt wurden. High-Content-Imaging bezieht sich auf die Extraktion von spAtiotemporell reiche ( dh große Anzahl von beschreibenden Merkmalen) Informationen über zelluläre Phänotypen mit mehreren komplementären Markern und automatisierten Bildanalysen. In Kombination mit automatisierter Mikroskopie können viele Proben parallel ( dh Hochdurchsatz) abgeschirmt werden, wodurch die statistische Kraft des Assays erhöht wird. In der Tat ist ein Hauptbestandteil des Protokolls, dass es die gleichzeitige Quantifizierung von mehreren Parametern in der gleichen Zelle ermöglicht, und dies für eine große Anzahl von Zellen und Bedingungen.
Das Protokoll wird in 8 Teile aufgeteilt (im Detail beschrieben im Protokoll): 1) Seeding-Zellen in einer 96-Well-Platte; 2) Vorbereitung von Stammlösungen, Arbeitslösungen und Bildgebungspuffer; 3) Aufstellung des Mikroskops; 4) Beladen der Zellen mit CM-H 2 DCFDA und TMRM; 5) Erste Live-Imaging-Runde zur Messung der basalen ROS-Werte und der mitochondrialen Morphofunktion; 6) Zweite Live-Bildgebung nach Zugabe von tert. -ButylPeroxid (TBHP) zur Messung induzierter ROS-Werte; 7) Automatisierte Bildanalyse; 8) Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Visualisierung.
Der Assay wurde ursprünglich für normale menschliche dermale Fibroblasten (NHDF) entwickelt. Da diese Zellen groß und flach sind, eignen sie sich gut zur Beurteilung der mitochondrialen Morphologie in 2D-Weitfeldbildern 13 , 14 . Bei kleineren Modifikationen ist diese Methode jedoch auf andere adhärente Zelltypen anwendbar. Darüber hinaus entspricht neben der Kombination von CM-H 2 DCFDA und TMRM der Workflow einer Vielzahl von fluoreszierenden Farbstoffpaaren mit unterschiedlichen molekularen Spezifitäten 1 , 15 .
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Protocol
Das nachstehende Protokoll wird für NHDF-Zellen und unter Verwendung der in der Materialdatei angegebenen Multiwell-Platten beschrieben. Siehe Abbildung 1 für einen allgemeinen Überblick über den Workflow.
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten Sie das vollständige Medium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% v / v Fetal Bovine Serum (FBS) und 100 IE / ml Penicillin und 100 IE / ml Streptomycin (PS) ergänzen. Für 500 ml vollständiges Medium werden 50 ml FBS und 5 ml PS auf 445 ml DMEM gegeben.
- Bereiten Sie HBSS-HEPES (HH) Imaging-Puffer vor, indem Sie Hank's Balanced Salt Solution (mit Magnesium und Calcium, aber ohne Phenolrot) mit 20 mM HEPES ergänzen. Für 500 ml HH werden 10 ml 1M HEPES-Stammlösung auf 490 ml HBSS gegeben. Den pH-Wert überprüfen und ggf. auf pH 7.2 einstellen.
- 1 mM CM-H 2 DCFDA-Stammlösung durch Auflösen von 50 μg CM-H 2 DCFDA lyophilisiertem Pulver in 86,5 &# 181; L wasserfreies DMSO. Mischen durch Vortexen oder Pipettieren auf und ab und machen 20 μl Aliquote in braunen Mikrozentrifugenröhrchen. Im Dunkeln bei -20 ° C aufbewahren und innerhalb von 1 Woche verwenden. Bei Lagerung unter N 2 -Status-Haltbarkeit kann bis zu mindestens 1 Monat erhöht werden.
- 1 mM TMRM-Stammlösung durch Auflösen von 25 mg TMRM-Pulver in 50 ml wasserfreiem DMSO vorbereiten. Mischen durch Vortexen oder Pipettieren auf und ab und machen 10 μl Aliquote in braunen Mikrozentrifugenröhrchen. Im Dunkeln bei -20 ° C aufbewahren. Diese Lösung ist für mindestens ein Jahr stabil.
- Bereiten Sie für jedes Experiment ein frisches Aliquot von Tert -Butylperoxid (TBHP) -Stand (~ 7 M) vor, indem Sie direkt ein Volumen aus der 70% igen Stammlösung (10 μl / 96-Well-Platte) pipettieren. Halten Sie dieses Aliquot bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Vorbereiten der Antikörper-Arbeitslösung (AB) durch Verdünnen von zwei sekundären Antikörpern (Alexa Fluor 488 Esel-Anti-Kaninchen und CY3-Esel-Anti-Kaninchen) 1.000 Mal in 1x HH-buFfer.
2. Einrichten des Mikroskops und des Erfassungsprotokolls (± 15 min)
HINWEIS: Die Bildaufnahme erfolgt mit einem Weitfeldmikroskop, das mit einer automatisierten Bühne und Rollläden ausgestattet ist, und ein hardwarebasiertes Autofokus-System mit einem 20fachen Flugplan-korrigierten Objektiv (NA = 0,75) und einer EM-CCD-Kamera. Bei der erstmaligen Einrichtung des Assays wird eine Testplatte mit Kontrollzellen, die gemäß den Anweisungen des Protokolls gefärbt ist, zur Kalibrierung der XY-Stufe und zur Optimierung der Erfassungseinstellungen verwendet. Wenn die Erfassungseinstellungen bereits festgestellt wurden, kann die Kalibrierung mit einer leeren Platte erfolgen.
- Senken Sie das Ziel auf die absolute Basisebene und kalibrieren Sie die XY-Bühne nach Software-Anweisungen.
- Stellen Sie sicher, dass die richtigen Filterwürfel installiert sind. Zur Visualisierung von CM-H 2 DCFDA verwenden Sie einen Standard-GFP-Filterwürfel mit einem 472/30 nm Anregungsbandpassfilter, einem 495 nm Cutoff DichroIc-Spiegel und ein 520/35 nm Bandpass-Emissionsfilter. Für TMRM verwenden Sie einen Filterwürfel für TRITC mit einem 540/25 nm Bandpass-Anregungsfilter, einem 225 nm Cutoff-dichroitischen Spiegel und einem 605/55 nm Bandpass-Emissionsfilter.
- Erstellen Sie ein Imaging-Protokoll mit der Erfassungssoftware.
- Wählen Sie die richtige Art von Multiwell-Platte (Hersteller und Code) aus der Liste der verfügbaren Platten in der Software zur Verfügung gestellt. Alternativ definieren Sie Ihr eigenes Multiwell-Plattenformat mit Teller und Well-Dimensionen.
- Richten Sie die Well-Platte entsprechend den Anweisungen der Software aus, z. B. indem Sie zwei Ecken der vier äußeren Eckbrunnen definieren. Dieser Schritt umfasst für die Kameraorientierung.
- Wählen Sie die Brunnen aus, die erworben werden sollen. Wenn diese Option in der Software nicht verfügbar ist, verwenden Sie einen Satz von manuell definierten XY-Standorten, die den ausgewählten Vertiefungen entsprechen.
- Optimieren Sie die Erfassungseinstellungen (Belichtungszeit, Lampenintensität, EM-Verstärkung) für thE zwei Kanäle separat mit der Testplatte. Minimieren Sie Belichtung und Intensität, da Fluoreszenzanregungslicht selbst ROS induziert. Aber stellen Sie sicher, dass das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis mindestens 2 für basale CM-H 2 DCFDA und 3 für TMRM vor TBHP-Behandlung ist und dass es keine Sättigung nach TBHP-Behandlung gibt. Die Akquisitionseinstellungen hängen stark von der verwendeten Mikroskopie-Setup- und Zellentypen ab, aber als Referenz sind indikative Einstellungen bei Verwendung einer Metallhalogenid-Glühbirne von 130 W als Lichtquelle und NHDF-Zellen, die gemäß den Anweisungen des Protokolls gefärbt sind, wie folgt: für beide CM- H 2 DCFDA und TMRM werden eine Belichtungszeit von 200 ms und ND-Filter 8 verwendet, kombiniert mit einer EM-Verstärkung von 15 (13 MHz, 14 Bit) bzw. 4 (27 MHz; 14-Bit). Einmal optimiert für einen bestimmten Setup- und Zelltyp, kann dieser Schritt übersprungen werden.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Erfassungseinstellungen während des gesamten Bildgebungsprozesses gleich bleiben. Für großräumige, mehrtägige Experimente, Lampe staDurch regelmäßige Qualitätskontrolle gerechtfertigt werden. - Definieren Sie ein Erfassungsprotokoll, das aus einer sequentiellen Lambda (Wellenlänge) Erfassung besteht. Wählen Sie zuerst den CM-H 2 DCFDA-Kanal aus, um die Lichtbelichtung vor der Messung zu minimieren.
- Definieren Sie eine Well-Teller-Schleife, um 4 regelmäßig beabstandete, nicht überlappende Bilder zu erfassen, die um das Zentrum jeder Vertiefung der Wannenauswahl unter Verwendung des in 2.3.4 definierten Erfassungsprotokolls positioniert sind. Wählen Sie die mäandernde Bildaufnahme, dh zuerst von links nach rechts, von gut B02 nach B11, dann zurück von rechts nach links von gut C11 nach C02 und so weiter ( Abbildung 2A ). Das spart Zeit im Vergleich zur Links-zu-Rechts-Bildaufnahme. Wenn diese Option nicht in der Software verfügbar ist, passen Sie den benutzerdefinierten Satz von XY-Standorten an, die in 2.3.3 erstellt wurden, um dieses Bildgebungsmuster zu übernehmen.
- Speichern Sie die XY-Koordinaten der Imaging-Positionen ( zB in einer separaten XML-Datei), um ein einfaches Revisiti zu ermöglichenNg im Falle einer Mikroskop-Rekalibrierung. Dies ist besonders wichtig, wenn das Auslesen aus diesem Assay mit einer post-hoc-Immunfluoreszenz (IF) -Färbung für dieselben Zellen korreliert werden muss.
3 Seeding Cells in einer 96-Well-Platte (45 - 90 min, abhängig von der Anzahl der verschiedenen Zelllinien)
- Arbeiten in sterilen Umgebungen wie einem Biosicherheitsschrank der Klasse 2 und tragen Handschuhe.
- Dekontaminieren Sie alle Oberflächen und Materialien mit 70% V / V Ethanol in destilliertem Wasser.
- Nehmen Sie einen Zellkulturkolben mit einer 90% konfluenten Zellkultur aus dem Inkubator und legen Sie ihn in den Biosicherheitsschrank.
- Die Zellen zweimal mit PBS 1x waschen.
- Fügen Sie die geeignete Menge an 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung auf die Zellen hinzu, wobei darauf zu achten ist, dass die gesamte Zelloberfläche bedeckt ist ( z. B. 1 ml für einen T25-Kolben) und inkubieren für 2 min bei 37 ° C und 5% CO 2 .
- Wenn alle Zellen abgelöst sind (mit einem Mikroskop überprüfen) ), Addieren Kulturmedium (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin, ± 4 ml in einem T25-Kolben), um die Trypsin-EDTA-Lösung zu inaktivieren.
- 5 min bei 300 xg bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in Kulturmedium resuspendieren. Bestimmen Sie die Menge an Medium für jeden Zelltyp, um eine Zellkonzentration zu erhalten, die mit der Zellzählung kompatibel ist. Typischerweise enthält ein 90% konfluenter T25-Kolben aus NHDF etwa 1-1,5 Millionen Zellen, die in 3-4 ml Kulturmedium resuspendiert werden.
- Zählen Sie die Zellen mit einer Zellzählkammer oder Coulter Zähler.
- Seed 8.000-10.000 Zellen in jedem der inneren 60 Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte mit einem dünnen kontinuierlichen Polystyrol oder Glasboden (schwarz, um Streuung und Übersprechen zwischen benachbarten Brunnen während der Bildgebung zu vermeiden). Bei Verwendung unterschiedlicher Bedingungen / Behandlungen / Zelllinien verteilen Sie ihre Saatplätze homogen auf die Platte, um Platteneffekte zu minimieren (Abb. "Abb. 2A) Die äußeren Brunnen, mit Ausnahme der Brunnen B01 und A01, werden nicht verwendet, weil sie anfälliger für Randeffekte sind.
- Samen 8.000-10.000 Zellen in B01. Diese gut wird für die Fokuseinstellung verwendet, kurz vor der Bilderfassung.
- Füllen Sie die leeren äußeren Brunnen mit Medium, um die Steigungen (Temperatur, Feuchtigkeit, etc. ) zwischen den Brunnen und der Umgebung zu minimieren.
- Schütteln Sie den Teller dreimal vorsichtig, bevor Sie ihn wieder in den Inkubator legen, um zu vermeiden, dass Zellen in Patches wachsen.
- Kultur die Zellen für 24 h oder bis zu einem Konfluenzgrad von ca. 70%
- Speichern Sie die Behandlungsinformationen für das Experiment in eine Kalkulationstabelle mit dem Namen "Setup.xlsx". Die Datei sollte vier Spalten enthalten und wird verwendet, um Behandlungen mit Brunnen und Bildinformationen während der Datenanalyse zu verknüpfen. Die vier Spalten sind: "Nun", "Behandlungsnummer", "Behandlung" und "Kontrolle" (eine Zeile pro Brunnen). Jede Behandlung ist gekoppeltMit einer einzigartigen Behandlungsnummer, die bei der Datenvisualisierung verwendet wird, um die Reihenfolge der Behandlungen auf der X-Achse der Plots zu bestimmen. Die Kontrollspalte spezifiziert die Behandlung, die als Kontrolle für die Behandlung in der aktuellen Zeile fungiert. Abbildungen von einem typischen experimentellen Layout und einer entsprechenden Setup-Datei sind in Abbildung 2 dargestellt.
4. Beladen der Zellen mit CM-H 2 DCFDA und TMRM (± 45 min)
HINWEIS: Die Handhabung der Zellen am Tag des Experiments kann in einer sterilen Umgebung (Biosicherheitskabinett) durchgeführt werden, aber dies ist nicht zwingend erforderlich, da die Zellen direkt nach dem Assay entsorgt oder fixiert werden.
- Den HH-Puffer auf 37 ° C erhitzen.
- Vorbereitung einer 20 μM TMRM-Arbeitslösung durch Verdünnen der 1 mM Stammlösung 50 mal in HH-Puffer (Zugabe von 490 μl HH-Puffer zu 1 Aliquot von 10 μl TMRM Stammlösung).
- Vorbereitung einer LastLösung mit 2 μM CM-H 2 DCFDA und 100 nM TMRM. Zu diesem Zweck die 1 mM CM-H 2 DCFDA-Stammlösung 500x und die 20 μM TMRM-Arbeitslösung 200x in HH-Puffer verdünnen.
- Typischerweise werden für 60 Vertiefungen 7,5 ml Beladungslösung durch Zugabe von 15 & mgr; l CM-H 2 DCFDA und 37,5 & mgr; l TMRM-Lösung auf 7447,5 & mgr; l HH hergestellt.
- Verwerfe das Kulturmedium aus den Zellen, indem du die Platte in einer einzigen Flüssigkeitsbewegung umgedreht hast.
- Die Zellen zweimal mit HH-Puffer mit einer Mehrkanalpipette (100 μl / Vertiefung) zweimal abwaschen. Verwerfen Sie den HH-Puffer zwischen den Waschschritten, indem Sie die Platte in einer einzigen Flüssigkeitsbewegung umgedreht drehen.
- Laden Sie die Zellen mit CM-H 2 DCFDA und TMRM durch Zugabe von 100 μl der Beladungslösung zu jeder Vertiefung, wiederum unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. Inkubieren für 25 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Vergiss nicht gut B01.
- Während dieser 25 min, bereiten Sie Arbeitslösungen des Oxidationsmittels TBHP vor und stellen Sie sicher, dass das Mikroskop und die Zusatzhardware eingeschaltet sind.
- Arbeitslösung I vorbereiten: 7M Stammlösung 70x bis 100 mM verdünnen (10 μl Lager in 690 μl HH-Puffer).
- Arbeitslösung vorbereiten II: WS I 100x bis 1 mM verdünnen (10 μl WS I in 990 μl HH-Puffer).
- Arbeitslösung vorbereiten III: WS III 25x bis 40 μM verdünnen (für 60 Vertiefungen 300 μl WS II in 7200 μL HH Puffer hinzufügen).
- Nach 25 min die Zellen zweimal mit 100 μl HH-Puffer wie zuvor beschrieben waschen.
- Füge 100 μl HH-Puffer zu allen 60 inneren Vertiefungen hinzu.
5. Erste Live-Imaging-Runde zur Messung der Basal-ROS-Stufen und der mitochondrialen Morphofunktion (± 15 min)
- Stellen Sie sicher, dass die Erfassungssoftware betriebsbereit ist und das Imaging-Protokoll geladen ist.
- Installiere die Platte auf dem Mikroskop, schalte die Hardware einSed Autofokus-System und verwenden Sie gut B01, um den Autofokus-Offset mit dem TMRM-Kanal anzupassen. Da dieses Verfahren eine Erhöhung der CM-H & sub2 ; DCFDA-Signalintensität induziert, wird diese Vertiefung von der nachgeschalteten Bildanalyse ausgeschlossen.
- Führen Sie das Imaging-Protokoll aus.
6. Zweite Live-Imaging-Runde nach der Addition von TBHP zur Messung induzierter ROS-Werte (± 20 min)
- Entfernen Sie vorsichtig die 96-Well-Platte aus dem Mikroskop.
- Füge 100 μl TBHP WS III (40 μM) zu jeder Vertiefung unter Verwendung einer Mehrkanalpipette hinzu (dies führt zu einer 20 μM TBHP-Konzentration in den Vertiefungen). Diese Verbindung wird als interne Positivkontrolle für die CM-H 2 DCFDA-Färbung (das Signal sollte steigen) sowie ein Mittel zur Messung induzierter ROS-Werte verwendet.
HINWEIS: H 2 O 2 kann auch anstelle von TBHP verwendet werden, aber diese Verbindung ist weniger stabil und daher weniger zuverlässig. - Warten Sie mindestens 3 min, um eine vollständige Reaktion von TBHP zu ermöglichenIth CM-H 2 DCFDA.
- Während dieser Zeit 100 μl Antikörper-Arbeitslösung (1 / 1.000) zu gut A01 zugeben.
- Befestigen Sie die Platte wieder auf dem Mikroskop und überprüfen Sie den Fokus wieder mit gut B01.
- Erwerben Sie die gleichen Positionen wie in der ersten Abbildungsrunde mit demselben Abbildungsprotokoll.
- Exportieren Sie die erfassten Datensätze in einem einzelnen Ordner als einzelne TIFF-Dateien mit standardisierter Nomenklatur, die den Verweis auf die Platte, die Vor- oder Nach-TBHP-Behandlung, das Feld, den Kanal und den Kanal enthält, getrennt durch Unterstriche, z . 'P01_Pre_B02_0001_C1' für Platte 1, Vor-TBHP-Behandlung, Brunnen B02, Feld 1 und Kanal 1. Diese Information wird bei der Bildanalyse verwendet ( zB zur Auswahl der entsprechenden Segmentierungseinstellungen) sowie bei der Datenanalyse (zur Analyse von Analysedaten Mit den richtigen Behandlungen).
- Erfassen Sie flache Feldbilder für beide Kanäle an allen vier Positionen um die Mitte des Brunnens A01 mit dem Erfassungsprotokoll. Sparen Sie thEm als einzelne TIFF-Dateien im selben Ordner wie die anderen Bilder unter Verwendung der folgenden standardisierten Nomenklatur: 'P01_FF_A01_0001_C1' für Platte 1, Feld 1 und Kanal 1. Vergewissern Sie sich, dass sich die Signale im Dynamikbereich befinden. Im Falle der Sättigung eine geringere Konzentration an Antikörper-Arbeitslösung verwenden.
- Verwerfen Sie die Platte oder speichern Sie für die weitere Verarbeitung.
HINWEIS: Anstatt die Platte aus dem Mikroskop zu entfernen und eine Mehrkanalpipette zu verwenden, um die TBHP-Lösung hinzuzufügen, kann eine automatisierte Pipette auf der Mikroskopstufe installiert und mit der Erfassungssoftware verbunden werden, um so bei einem Trigger zu funktionieren. Dies ermöglicht das Hinzufügen von TBHP zu jedem Brunnen direkt nach der ersten Akquisition, bevor er zum nächsten Brunnen geht. Auf diese Weise, wenn die erste bildgebende Runde beendet ist, kann die zweite sofort beginnen und alle Brunnen haben eine gleiche Inkubationszeit mit dem TBHP gehabt.
7. Bildverarbeitung und -analyse (± 30 min pro96-Well-Platte)
HINWEIS: Die gesamte Bildverarbeitung erfolgt in FIJI (http://fiji.sc), einer verpackten Version von ImageJ Freeware. Ein dediziertes Skript wurde für die automatisierte Analyse von intrazellulären ROS- und mitochondrialen Signalen sowie morphologischen Parametern (RedoxMetrics.ijm, auf Anfrage erhältlich) geschrieben. Die zugrunde liegenden Algorithmen sind in Sieprath et al. 1
- Stellen Sie sicher, dass FIJI installiert und betriebsbereit ist.
- Starten Sie FIJI und installieren Sie das Makro-Set (Plugins -> Makros -> Installieren ...). Dies ruft eine Reihe neuer Makrobefehle sowie eine Reihe von Aktionswerkzeugen auf, um die Analyseeinstellungen zu optimieren, wie in Abbildung 3A gezeigt .
- Öffnen Sie die Setup-Schnittstelle, um die Analyseeinstellungen einzustellen, indem Sie auf die Schaltfläche 'S' klicken (Abbildung 3B ).
- Wählen Sie den Bildtyp, die Anzahl der Kanäle und den verwendeten Brunnen ausZum Erwerb von Flatfield-Bildern.
- Geben Sie an, welcher Kanal Zellen enthält (CM-H 2 DCFDA-Kanal) oder Mitochondrien (TMRM-Kanal) und stellen Sie die Vorverarbeitungs- und Segmentierungsparameter für jeden Kanal in Abhängigkeit von der Bildqualität ein (Abbildung 3B ). Markieren Sie die Kontrollkästchen 'Hintergrund' und 'Kontrast', um eine Hintergrund-Subtraktion oder eine kontrastbegrenzte adaptive Histogramm-Entzerrung 16 durchzuführen. Definiere ein Sigma für die Gaußsche Verschwommenheit der Zellen und die Laplace-Verstärkung der Mitochondrien. Wählen Sie einen automatischen Schwellenwert-Algorithmus aus und füllen Sie die Größenausschlussgrenzen (in Pixeln) aus. Wenn anstelle eines automatischen Schwellenwertalgorithmus eine feste Schwelle gewählt wird, füllen Sie den oberen Schwellenwert aus.
- Testen Sie die Segmentierungseinstellungen auf ein paar ausgewählten Bildern der erfassten Datensätze, indem Sie sie öffnen und auf die Schaltflächen "C" oder "M" im Menü für die Zell- oder Mitochondriensegmentierung klicken,Und ggf. die Einstellungen anpassen. Ein Beispielergebnis ist in Fig. 3C gezeigt .
- Führen Sie die Batch-Analyse auf dem / den Ordner aus, indem Sie auf die Schaltfläche '#' klicken und den Ordner mit den Bildern auswählen. Pro Ordner wird ein neues 'Output'-Verzeichnis erstellt, das einzelne ROI-Sets (Zip-Dateien) und Ergebnisdateien (.txt) pro Bild enthält. Für beide Kanäle enthält die Ergebnisdatei Intensität und morphologische Deskriptoren. Die CM-H 2 DCFDA-Kanal (Zellen) Ergebnisdatei enthält pro Deskriptor den Mittelwert für die kombinierten ROIs innerhalb eines Bildes. Für den TMRM-Kanal enthält die Ergebnisdatei pro Deskriptor den Wert für jeden einzeln segmentierten mitochondrialen ROI.
- Nach der Chargenanalyse überprüft man die Segmentierungsleistung auf einem "Verifizierungsstapel" visuell, ein Hyperstapel aller Bilder mit dem jeweiligen ROI-Overlay, indem du auf die Schaltfläche 'V' klickst. Auf diese Weise sind Artefakte wie Over-/ Untersegmentierung, unscharfe Bilder oder Staubpartikel / Fasern in Bildern können schon schnell erkannt werden. Eine weitere Kuration kann während der Datenqualitätskontrolle durchgeführt werden (siehe § 8).
8. Datenanalyse, Qualitätskontrolle (QC) und Visualisierung
Die Verarbeitung und Auswertung der Rohdaten erfolgt über R statistische Freeware (http://www.rproject.org - Version 3.3.2) und RStudio (http://www.rstudio.com/ - Version 1.0.44). Um die Ergebnisse schnell zu erhalten und zu visualisieren, wurde eine intuitive Shiny-Applikation 17 (auf Anfrage) konzipiert, die die Daten in Wärmeabbildungen und Boxplots integriert und visualisiert und statistische Analysen durchführt. Im Allgemeinen besteht der Arbeitsablauf aus zwei aufeinanderfolgenden Schritten. Zuerst werden die Daten pro 96-Well-Platte verarbeitet und überprüft, um fehlerhafte Datenpunkte zu detektieren. Zweitens werden kuratierte Daten aus allen Platten eines gegebenen Experiments kombiniert und mit nichtparametrischem Multi analysiertVariationstests 18 und eine Hauptkomponentenanalyse.
- Stellen Sie sicher, dass R und RStudio installiert und betriebsbereit sind.
- Starten Sie RStudio.
- Öffnen Sie die redoxMetrics glänzende Anwendung und führen Sie die App aus (wählen Sie, um sie in einem externen Browser auszuführen).
- Wählen Sie auf der Seite 'Eingabe' das Verzeichnis aus, in dem sich die Ergebnisdateien von RedoxMetrics.ijm befinden.
- Stellen Sie sicher, dass "Setup.xlsx" (erstellt in Schritt 3.15) auch in diesem Verzeichnis vorhanden ist.
- Die Ergebnisdateien und Setup-Informationen werden automatisch importiert, neu arrangiert und visualisiert.
- Die Seite "experimentelle Einrichtung" zeigt das Layout des Experiments. Verwenden Sie diese Seite zur Bestätigung.
- Die nächste Seite, 'Ergebnisse pro Platte' zeigt die Daten für jede Platte separat in einem farbcodierten Multi-Well-Plattenlayout sowie in Boxplots mit Ausreißern mit Namens- und Bildnummer. Letzteres erlaubt eine einfache Inspektion und identIfizierung von fehlerhaften Datenpunkten (extrem hohe oder niedrige Werte im Vergleich zu den für diese spezifische Behandlung gemessenen Durchschnittswerten - siehe Abbildung 4 für ein Beispiel).
Mit diesen Informationen überprüfen Sie die Bilder, die den aberranten Punkten entsprechen. Wenn Anomalien erkannt werden, müssen sie aus der Analyse entfernt werden. Die meisten Anomalien werden durch falsche Segmentierung verursacht, wenn (Teil) des Bildes unscharf ist oder wenn hoch fluoreszierende Staubpartikel die richtige Segmentierung stören. Extreme Fälle können bereits schnell mit dem Bestätigungsstapelwerkzeug entdeckt werden (Schritt 7.5), aber bei diesem Schritt werden noch subtilere Vorkommnisse entdeckt. Wenn kein offensichtlicher oder technischer Grund für den fehlerhaften Wert gefunden werden kann, sollte das Bild nicht aus der Analyse entfernt werden. - Optional: Erstellen Sie eine neue Tabellenkalkulation mit dem Namen 'Drop.xlsx' mit nur einer Spalte mit dem Namen 'Drop'. In dieser Spalte können Sie die Dateinamen (einschließlich ".tif" -Erweiterung) aller Bilder auflistenDie aus der Analyse entfernt werden müssen (identifiziert in Schritt 7.5 oder Schritt 8.6.2). Laden Sie diese Datei mit der 'input' -Seite hoch.
- Die 'Gesamtexperiment' Seite zeigt die Ergebnisse aller Platten zusammen. Wenn eine Drop-Datei hochgeladen wurde, wird diese Datei verwendet, um die angegebenen Datenpunkte aus der Analyse zu entfernen.
Für jeden Parameter einzeln werden die Daten pro Platte entsprechend ihrer jeweiligen Steuerung normiert. Daten von allen Platten werden dann kombiniert, gefolgt von nichtparametrischen multivariaten Tests aus dem nparcomp-Paket 18 . Wenn nur 2 Behandlungen verglichen werden, werden zwei Probentests für das nichtparametrische Behrens-Fisher-Problem durchgeführt. Für mehr als 2 Behandlungen wird ein nicht parametrischer kontrastbasierter Mehrfachvergleichstest verwendet. Die Ergebnisse werden mit Boxplots visualisiert. - Die Seite "Clusteranalyse" zeigt die Ergebnisse einer Hauptkomponentenanalyse (PCA - R Kern 'Stats' Paket). Daten aus 5 Parametern (baSal & induziertes ROS und mitochondriales Membranpotential, Größe & Zirkularität) kombiniert werden, um die verschiedenen Behandlungen auf der Grundlage eines empfindlichen Redoxprofils zu unterscheiden. Zu diesem Zweck wird eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt (R core 'stats' package). Die Ergebnisse werden mit einem Biplot (ggbiplot Paket - http://github.com/vqv/ggbiplot) visualisiert.
- Verwenden Sie die Seite "Downloaddaten", um die Backend-Datenrahmen herunterzuladen, die die verarbeiteten und umgeordneten Daten enthalten, so dass sie für fortgeschrittenere Datenvisualisierung oder statistische Analysen wiederverwendet werden können.
HINWEIS: Typische Fallstricke und mögliche Lösungen sind in Tabelle 1 aufgelistet.
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Representative Results
Der Assay wurde mit mehreren Kontrollversuchen benchmarkiert, deren Ergebnisse in Sieprath et al. 1 In kurzer Zeit wurde die Fluoreszenzantwort von CM-H 2 DCFDA und TMRM auf fremd induzierte Veränderungen in intrazellulärem ROS und Δψ m quantifiziert, um den dynamischen Bereich zu bestimmen. Für CM-H 2 DCFDA zeigte NHDF eine lineare Erhöhung des Fluoreszenzsignals bei der Behandlung mit steigenden Konzentrationen von TBHP zwischen einem Bereich von 10 μM bis 160 μM. Ebenso zeigten NHDF-Zellen für TMRM eine lineare Erhöhung der mitochondrialen Fluoreszenz bei der Behandlung mit zunehmenden Konzentrationen von Oligomycin (die Δψ m Hyperpolarisation induziert) im Bereich von 1 bis 10 μg / μL. Umgekehrt führte die Echtzeit-Zugabe von Valinomycin, einem Antibiotikum, das Δψ m- Depolarisation induziert, zu einem allmählichen, quantIfiable Abnahme der TMRM-Fluoreszenz .
Der Assay wurde auch in einer Vielzahl von Experimenten verwendet, um Unterschiede im Redoxstatus zwischen Zelltypen oder Behandlungen 1 , 15 zu zeigen . Um dies zu veranschaulichen, sind die Ergebnisse eines Experiments gezeigt, bei dem NHDF mit dem HIV-Protease-Inhibitor Saquinavir (SQV) behandelt wurde (Abbildung 5 ). Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls wurde eine signifikante Zunahme sowohl für basale als auch für induzierte ROS-Spiegel im Vergleich zu mit DMSO behandelten Kontrollzellen nachgewiesen ( 5B ). SQV Behandlung auch erheblich beeinflusst mitochondrialen Morphofunktion. Morphologisch erwarb die Mitochondrien ein stark fragmentiertes Muster, das auch durch eine höhere Kreisförmigkeit und eine kleinere mittlere Größe der einzelnen Mitochondrien bestätigt wurde. Funktionell Δψ m , gemessen als mittleres TMRM-Signal pro HämogOndrial-Pixel wurde ebenfalls signifikant erhöht (Abbildung 5A ). Bei der Kombination der Daten der oben beschriebenen 5 Parameter konnten die beiden Bedingungen (Kontrolle und SQV) durch eine Hauptkomponentenanalyse eindeutig voneinander getrennt werden. Daten aus drei unabhängigen biologischen Replikaten werden in einem 2D-Biplot gezeigt, der die ersten beiden Hauptkomponenten zeigt, die 81,4% der Gesamtvarianz erklären (Abbildung 5C ). Dies beweist die Robustheit des Assays und deutet darauf hin, dass die kombinierte Auslesung als sensibler Indikator für den zellulären Gesundheitszustand dienen kann.
Abbildung 1 : Allgemeiner Überblick über den hochauflösenden Bildgebungsassay zur gleichzeitigen Messung von intrazellulären basalen und induzierten ROS-Stufen und mitochondrialen Morphofunktion. ( A ) SChemische Darstellung der wichtigsten operativen Blöcke. ( B ) Beispiel: Zellen werden in mehreren identischen Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Ein Standard-Well-Platten-Layout ist in 2A detaillierter gezeigt . Nach der Färbung werden 4 Bilder pro Kanal um die Mitte jedes Brunnens erworben, sowohl vor als auch nach der TBHP- Behandlung, die durch die großen Montagen mit Insert illustriert wird. Nach der Bildanalyse werden die Intensitätsergebnisse anhand einer intuitiven Hitzekarte visualisiert, die auf das Well-Tafel-Layout projiziert wird. Dies ermöglicht eine schnelle Erkennung von Platteneffekte oder aberranten Brunnen. Nach der Kuration der kompletten experimentellen Datensätze wird die endgültige Datenanalyse durchgeführt, die sowohl Einzel- als auch Multiparameter-Ausgangssignale zur Folge hat. (Diese Zahl wurde von Referenz 1 mit Genehmigung von Springer geändert) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehenN dieser Figur.
Abbildung 2 : Ein typisches experimentelles 96-well-Layout und entsprechende 'Setup'-Datei. ( A ) 4 verschiedene Bedingungen werden homogen über die inneren 60 Vertiefungen der Platte verteilt. Nun B01 enthält auch Zellen, wird aber nur verwendet, um den anfänglichen PFS-Offset kurz vor der Bildgebung anzupassen. Die anderen äußeren Vertiefungen werden nur mit Kulturmedium gefüllt, um die Gradienten (Temperatur, Feuchtigkeit usw. ) während der Zellkultur zu minimieren. Die Bildaufnahme erfolgt mäanderförmig, dh zuerst von links nach rechts, von gut B02 nach B11, dann von rechts nach links von gut C11 nach C02 und so weiter. Nach der Bilderfassung werden Flachbildbilder im Brunnen A01 erfasst, der zur Korrektur der räumlichen Beleuchtungsheterogenität während des Bildes verwendet wird Alyse ( B ) Die entsprechende Setup-Datei (Setup.xlsx) ist eine Tabellenkalkulation, die Informationen über das Layout des Experiments enthält. Es spezifiziert die Orte jeder Behandlung in der Multiwell-Platte und ihre jeweiligen Kontrollen. Jede Zeile repräsentiert einen Brunnen. Jede Behandlung hat ihre eigene einzigartige Behandlungsnummer, die verwendet wird, um die Reihenfolge der Behandlungen auf der X-Achse der erzeugten Plots während der Datenanalyse anzugeben. Die Spalte "Kontrolle" enthält die Behandlung, die als Kontrolle zur Normalisierung der in der gleichen Zeile angegebenen Daten der Behandlung verwendet werden soll. In dem Beispiel ist Behandlung 1 die Behandlung, die als Kontrolle für die Normalisierung der Daten aus allen anderen Behandlungen verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
9 / 55449fig3.jpg "/>
Abbildung 3 : RedoxMetrics Makro-Set, Layout und Setup-Schnittstelle. ( A ) Bei der Installation des RedoxMetrics-Makros für FIJI wird in der Menüleiste eine Reihe neuer Makrobefehle sowie eine Reihe von Aktionstools zum Testen und Optimieren der Analyseeinstellungen angelegt. 'S' ruft die Setup-Schnittstelle auf. 'F' führt eine Flatfield-Korrektur auf einem offenen Bild durch. "C" und "M" führen eine Testsegmentierung für zelluläre Regionen ("Cell", CM-H2DCFDA-Kanal) und mitochondrialen Regionen ("Mito", TMRM-Kanäle) jeweils auf einem einzigen geöffneten Bild unter Verwendung der im Setup ausgewählten Analyseeinstellungen durch Schnittstelle, die eine Überlagerung der segmentierten Regionen von Interesse (ROIs) zurückgibt. '#' Führt die Batch-Analyse auf einem Ordner mit den in der Setup-Schnittstelle angegebenen Einstellungen durch (meist nach der Überprüfung auf ein oder wenigen Bildern). 'V' schafft einen Bestätigungs-Hyperstapel usinG die Ausgabedaten aus der Batch-Analyse. Dieser Hyperstack ist ein zusammengesetztes Bild aller in dem Ordner vorhandenen Rohbilder und deren jeweilige interessante Bereiche (in einem zweiten Kanal gezeichnet). 'O' kann angeklickt werden, um die Überlagerung der segmentierten Region anzuzeigen oder zu verbergen. ( B ) Setup-Schnittstelle Hier werden alle Analyseneinstellungen ausgewählt, einschließlich allgemeiner Informationen wie der Bildtyp (Erweiterung), die Anzahl der Kanäle (Wellenlängen) und der Brunnen, der für die Flatfield-Korrektur verwendet wurde. Als nächstes gibt es Einstellungen, die für den Bildinhaltstyp (Cell oder Mito) spezifisch sind. In beiden Fällen gibt es Optionen (Checkboxen), um eine Hintergrundkorrektur ("Hintergrund") und eine lokale Kontrastverstärkung ("Kontrast") einzuschließen. Für die Zellsegmentierung gibt es die Möglichkeit, einen Gaußschen Unschärferadius (Sigma) zur Reduzierung von Rauschen zu definieren. Für die Mito-Segmentierung gibt es die Möglichkeit, den Radius eines Laplace-Operators zur selektiven Verstärkung der Mitochondrien zu definieren. Nachfolgende Segmentierung ist pErformiert mit einer automatischen (oder festen) Schwellenwertmethode, die je Inhaltstyp definiert werden kann. Wenn eine feste Schwelle gewählt wird, kann der obere Schwellenwert manuell bereitgestellt werden. Schließlich kann die Analyse auf eine Auswahl von Objekten beschränkt werden, die innerhalb einer minimalen und maximalen Größe liegen. ( C ) Ein Beispiel für ein Segmentierungsergebnis, das mit dem Befehl "C" (oben) oder "M" (unten) ausgeführt wird, wird als Rohbild in grau überlagert mit den interessierenden Bereichen in gelb dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 : Illustriertes Beispiel für Zwischendatenvisualisierungen. ( A ) Multiwell-Plattenvisualisierung, wo die Wells B02 und D07 erscheinenverdächtig. ( B ) Boxplot, die dieselben Daten repräsentiert, wobei die Ausreißer mit Namens- und Bildnamen gekennzeichnet sind. Zusammen mit F03_0003 erscheinen Bilder aus B02 und D07 als Ausreißer. ( C ) Die visuelle Inspektion dieser Bilder zeigt, dass B02_0000 und D07_0001 aus der weiteren Analyse entfernt werden sollten, da es sich um Segmentierungsfehler handelt (dargestellt durch das rote 'X'). F03_0003 sollte beibehalten werden, da es keine offensichtliche Segmentierung oder technischen Fehler gibt. (Wenn kein technischer Grund für die Aberration gefunden wird, sollten die Daten nicht entfernt werden). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5 : Wirkung von Saquinavir (SQV; 20 μM) auf die primäre menschliche FaserOblips (Kontrolle ist DMSO). ( A ) Mitochondriales Membranpotential (ΔΨ m ) und mitochondriale Morphologie (Kreisförmigkeit und durchschnittliche Größe der einzelnen Mitochondrien), gemessen durch TMRM ( B ) Erhöhte Basalwerte von intrazellulärem ROS, gemessen durch CM-H 2 DCFDA und Reaktion auf induzierte ROS, gemessen Als relativer Verstärkungsfaktor nach Zugabe von 20 μM TBHP-Addition. ( C ) 2D-Scatterplot der ersten 2 Hauptkomponenten (PCs) aus einer PCA-Analyse an den oben beschriebenen 5 Variablen (basale und induzierte ROS-Werte, mittlere mitochondriale Größe, Kreisförmigkeit und ΔΨ m ). Die schwarzen Pfeile repräsentieren die Richtungen der ursprünglichen 5 Variablen in Bezug auf die Hauptkomponenten. (Unabhängige Replikate sind mit einer anderen Farbe aufgetragen, alle Daten werden in Bezug auf die DMSO-Kontrolle normiert: * = p-Wert <0,05; ** = p-Wert <0,01; *** = p-Wert <0,001; Y -Achsen wurde angepasst, um die Unterschiede optimal darzustellen; Diese Zahl wurde aus Referenz 1 mit Genehmigung von Springer geändert) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Problem | Mögliche Ursache | Mögliche Lösung |
| Zu wenige Zellen in den Brunnen während der Bildgebung | Zu wenige Zellen ausgesät | Samen mehr Zellen 24 h vor der Bildgebung |
| Schlechtes Zellwachstum | Überprüfen Sie die Kulturbedingungen (Medium, Temperaturstabilität, CO 2 -Regelung) | |
| Zu heftigen Waschschritten | Vermeiden Sie das Waschen von Zellen weg, pipettieren Sie sanft | |
| Zu viele Zellen in den Brunnen während der Bildgebung | AuchViele Zellen ausgesät | Saatgut weniger Zellen 24 h vor der Bildgebung |
| Schwache Signale oder nichtlineare Reaktion von CM-H 2 DCFDA Fluoreszenz auf Stimulus | Zu wenig / hohe Farbstoffkonzentration verwendet | Bei Verwendung von anderen NHDF-Zellen müssen optimale Beladungskonzentrationen empirisch bestimmt werden |
| Die Färbebelastung ist unzureichend | Füge 0,02% G / V des Tensids Pluronic-127 zur Beladungslösung hinzu, um die Aufnahme zu erhöhen. | |
| CM-H 2 DCFDA-Signal erhöht sich bei der Belichtungszeit visuell | Zu hohe Farbstoffkonzentration | Reduzieren Sie die Farbstoffkonzentration |
| Die Anregungsintensität ist zu hoch | Verringerung der Anregungsintensität durch Verwendung von ND-Filtern und / oder Verringerung der Belichtungszeit | |
| CM-H 2 DCFDA-Intensität nimmt beim Erwerb der Well-Platte ab | CM-H 2 DCFDA leckt ausdie Zelle. | Verwenden Sie 2 mM Probenicid (Anionenpumpenhemmer). Fügen Sie der Lade-Lösung, sowie die Imaging-Puffer, um Leckage zu verringern |
| Es gibt keine Erhöhung der CM-H 2 DCFDA-Signalintensität nach Zugabe von TBHP | TBHP ist nicht aktiv | Verwenden Sie frische TBHP |
| CM-H 2 DCFDA leckt aus der Zelle. | Verwenden Sie Probenicid wie oben beschrieben. | |
| (Einige der) erworbenen Bilder erscheinen out-of-focus, während Fokus scheint ok, wenn überprüft. | Die Platte ist geneigt, wodurch der Fokus über den PFS-Offset hinausgeht | Überprüfen Sie die Montage der Platte und der Bühnenebene, positionieren Sie die Platte |
| Der Boden der Platte enthält Staub oder Unregelmäßigkeiten | Reinigen Sie den Boden der Platte mit einem Ethanol-befeuchteten Linsenpapier | |
| Zellen sterben während der Bildgebung | Reduzieren Sie die Anregungsintensität oder erwerben Sie weniger Bilder pro Brunnen. | |
| Falsche Imaging-Puffer-Komposition | Remake Imaging-Puffer | |
| Es gibt unscharfe fluoreszierende Flecken in den Bildern | Freistehende Zellen schweben unscharf | Waschen Sie sich vorsichtig während des Ladeprotokolls |
| Eine oder mehrere Säulen haben eine geringere Intensität als die anderen Brunnen der Platte | Eine oder mehrere Spitzen aus der Mehrkanalpipette waren nicht fest verbunden und daher wurde weniger Reporter zu diesen Brunnen hinzugefügt | Überprüfen Sie gründlich, ob alle Tipps perfekt gefüllt sind, wenn Sie eine Mehrkanalpipette verwenden. |
| Fokus driftet dramatisch während der Bildaufnahme | Der Polystyrolboden der Platte kann bei der Verwendung einer Öllinse mit Tauchöl reagieren | Verwenden Sie eine trockene Linse, oder verwenden Sie eine Multiwell-Platte mit einem GlaSs unten |
| Die TMRM-Signalintensität steigt zwischen der Abbildung der ersten und der letzten Wanne | Reporter Ladezeit war nicht lang genug, TMRM ist immer noch Gleichgewicht | Erhöhung Reporter Ladezeit |
| CM-H 2 DCFDA-Signal nach TBHP-Behandlung erhöht sich beim Erwerb der Well-Platte | Die Zeit zwischen der Behandlung mit TBHP und dem Beginn der zweiten Bildrunde war nicht lang genug, TBHP oxidiert immer noch CM-H 2 DCFDA. | Erhöhung der Inkubationszeit zwischen der Behandlung mit TBHP und der zweiten Bildrunde. (Beginnend mit mindestens 3 min) |
| Flache Feldbilder sind gesättigt | Antikörper-Arbeitslösung konzentriert sich | Verwenden Sie eine geringere Konzentration an Antikörper-Arbeitslösung |
| Akquisitionseinstellungen sind nicht optimiert (Belichtungszeit zu hoch, ND-Filter zu niedrig, ...) | Optimieren Sie die Erfassungseinstellungen,Signal muss im Dynamikbereich des Sensors sein | |
| Flache Feldbilder sind dunkel | Antikörper-Arbeitslösung ist zu verdünnen | Verwenden Sie eine höhere Konzentration an Antikörper-Arbeitslösung |
| Akquisitionseinstellungen sind nicht optimiert (Belichtungszeit zu hoch, ND-Filter zu niedrig, ...) | Optimieren Sie die Erfassungseinstellungen, das Signal muss sich im Dynamikbereich des Sensors befinden | |
| Over- / Undersegmentations-Artefakte | Schwelle nicht richtig eingestellt | Stellen Sie die Schwelleneinstellung ein |
| Größenfilter nicht richtig eingestellt | Passen Sie die minimalen und maximalen Größenkriterien für die Bildanalyse an | |
| Zellkonfluenz ist zu hoch | Für eine zuverlässige Bildanalyse ist das richtige Konfliktniveau sehr wichtig. Bei anderen Zelltypen als NHDF muss die optimale Saatdichte empirisch ermittelt werden | |
| Die glänzende Anwendung funktioniert nicht | Falsches Verzeichnis ausgewählt | Wählen Sie auf der Eingabeseite das richtige Verzeichnis aus. |
| Fehlende Dateien im Verzeichnis | Vergewissern Sie sich, dass alle notwendigen Dateien (Ausgabe aus Imagej-Makro und Setup-Datei) im ausgewählten Verzeichnis vorhanden sind | |
| Fehlende Pakete | Normalerweise prüft die App und installiert alle notwendigen Pakete, aber wenn dies fehlschlägt, manche manuell für die folgenden Pakete: devtools, ggbiplot, pacman, ggplot2, plyr, nparcomp, data.table, readxl, gplots, ggbiplot, glänzend, shinyFiles, pbapply Und shinyjs einschließlich aller Abhängigkeiten. |
Tabelle 1: Typische Fallstricke und mögliche Lösungen.
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Discussion
Dieses Papier beschreibt eine hochauflösende Mikroskopie-Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus und mitochondrialer Morphofunktion in NHDF. Seine Leistung wurde mit einer Fallstudie über SQV-behandelten NHDF nachgewiesen. Die Ergebnisse unterstützen frühere Hinweise aus der Literatur, bei denen nach der Behandlung mit HIV-Protease-Inhibitoren des Typs 1 erhöhte ROS-Spiegel oder mitochondriale Dysfunktion beobachtet wurden, wenn auch in separaten Experimenten 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Der wesentliche Unterschied besteht darin, dass der beschriebene Assay diese Parameter gleichzeitig in den gleichen lebenden Zellen zusammen mit morphologischen Daten messen kann. Der wesentliche Vorteil dieses Ansatzes ist seine eindeutige Bestimmung der beiden Faktoren zusammen im Raum und tIme, was die Ermittlung von Kausalbeziehungen ermöglicht. Es wird eine prinzipielle Komponentenanalyse durchgeführt, die es ermöglicht, ein empfindliches Redoxprofil bestimmter Störungen zu erzeugen. Allerdings können auch fortgeschrittenere Data-Mining-Techniken und (überwachte) Clustering-Algorithmen auf den extrahierten Daten verwendet werden, um eine prädiktive Redox-Profilierung zu ermöglichen. Dies kann ein wertvolles Merkmal für diagnostische oder prognostische Klassifikationswerkzeuge in der digitalen Pathologie sowie beim Screening auf therapeutische Ziele sein, zB wenn einmal robuste Klassifikationsmodelle erstellt werden, kleine Molekülbibliotheken können abgeschirmt werden, um therapeutische Kandidaten zu finden, um dem oxidativen Stress entgegenzuwirken Ein neuer Bildschirm für vielversprechende Leads in der Therapieentwicklung für menschliche mitochondriale Störungen 26 .
Der Assay wurde für NHDF konzipiert, kann aber an andere adhärente Zelltypen angepasst werden. Dies erfordert eine Optimierung des Färbeprotokolls und der Reporterfarbstoffkonzentrationen. Die Menge an r Eporterfarbstoff muss minimiert werden, da Überlastung nichtlineare Effekte durch Abschrecken verursachen oder sogar zytotoxisch werden kann 27 . Die Erweiterung des Assays auf Suspensionszellen ist aufgrund von Schwierigkeiten bei der Montage und Beobachtung solcher Zellen in physiologischer Weise weniger offensichtlich. Sie können Cytospun auf einem Deckglas sein oder in serumfreien Medien kultiviert werden, um Adhäsion zu induzieren, aber beide dieser Prozesse stören physiologische Zustände 28 , 29 . Diese Einschränkungen könnten jedoch unter Verwendung von mikrostrukturierten Zellkulturträgern überwunden werden, die einzelne Zellen (adhärent oder nicht adhärent), die in kleinen Mikrovertiefungen eingeschlossen sind, unter Beibehaltung ihrer Lebensfähigkeit 30 oder durch die Verwendung eines thermoreversiblen Hydrogels, um Zellen während der Bildgebung zu fangen, . Diese Verfahren wurden bereits für das hochauflösende Screening von Plasmamembranpotential oder zellulärem Sauerstoff in einzelnen Suspensionszellen verwendet= "Xref"> 32 , 33 oder die Abbildung von intrazellulären Markern in den lebenden, hochbewegten Parasiten 31 . Anpassungen müssten auch an die Bildgebungsmodalität vorgenommen werden, da die morphologische Analyse des mitochondrialen Netzwerks in diesen Zellen schnelle 3D-Erfassungsfähigkeiten wie die Spinnplatten-Konfokal- oder Bessel-Strahl-Lichtbogenmikroskopie 34 , 35 sowie die Analyse erfordern würde Pipeline, um die Z-Dimension bei der Berechnung morphologischer Parameter einzuschließen.
Der Assay wurde für 96-Well-Platten optimiert, aber es ist offensichtlich für weitere Upscaling, zB auf 384-Well-Platten, zugänglich. Der Hauptbegrenzungsfaktor ist die Plattenerfassungszeit, dh die Zeit , die es braucht, um Bilder aller Brunnen zu erfassen. Die Fluoreszenzsignale müssen während dieses Zeitrahmens stabil bleiben, um die Messungen sicher zu vergleichenIndividuelle Brunnen. Aber weil die Färbung vorübergehend ist und der Untersuchungsprozess dynamisch ist, stellt dies eine Herausforderung dar. Daher wurden die Fluoreszenzsignale in einem Satz von replizierten Experimenten gemessen, und dies zeigte, dass sowohl CM-H 2 DCFDA- als auch TMRM-Signale von 7 bis mindestens 50 min nach der Färbung (Variationskoeffizient <2%) stabil bleiben. Hier ergibt sich ein Fenster von ca. 40 min. Eine Platte mit 96 Vertiefungen dauert typischerweise etwa 10 min. Somit würde eine Extrapolation auf 384-Well-Platten die Erfassungsdauer innerhalb des stabilen Zeitschlitzes beibehalten. Mit durchschnittlich 50 Zellen pro Bild (basierend auf der Verwendung eines 20X-Objektivs und NHDF-Zellen) würde dies zu Daten für etwa 30.000 Zellen pro Stunde Screening führen, was die statistische Kraft des Assays stark erhöht. Ein weiterer Faktor, der die Fluoreszenzsignalstabilität beeinflusst, ist die Temperatur. Um eine Vakuolisierung von CM-H 2 DCFDA (dh Farbstoffansammlung in intrazellulären Vesikeln) zu vermeiden, was zu Hetero führen würdeGlatte Färbung und nichtlineare Effekte erfolgt die Inkubation bei Raumtemperatur anstelle von 37 ° C. Abgesehen von der Stabilität ist es wichtig zu beachten, dass die Exposition von lebenden Zellen zu Fluoreszenz Anregungslicht selbst induziert ROS-Produktion. Dies bedeutet, dass die Belichtungsbedingungen (Belichtungszeit und Anregungslichtintensität) auf einem absoluten Minimum gehalten werden sollten. Es bedeutet auch, dass alle Brunnen nur ausgesetzt werden sollten, wenn die tatsächlichen Bilder erworben werden. Dies schließt die Verwendung von Software-fähigen Autofokussierungsmethoden aus und garantiert die Verwendung eines hardwarebasierten Autofokus-Systems.
Ein Vorteil des beschriebenen Verfahrens ist sein generischer Charakter. Es kann praktisch jede Kombination von spektral kompatiblen fluoreszierenden Reportern verwendet werden. Dies wurde durch die Verwendung der Calcein / MitoSOX-Kombination zur Messung der mitochondrialen ROS pro lebenden Zelle 1 , 15 gezeigt . Darüber hinaus sind die Anwendungen nicht auf die int Egrated ROS / mitochondriale Messung. Der Assay kann auch mit einer post-hoc- Immunfärbung (nach der zweiten Bildrunde) erweitert werden. Da die genauen Abbildungsstandorte gespeichert sind, können Redoxanalysen direkt mit der Standortproteomik in denselben Zellen korreliert werden. Dies erhöht die molekulare Auslesung stark, was im Gegensatz zu anderen Methoden steht, die häufig zur Beurteilung der Redoxbiologie oder Fluoreszenzintensitäten im Allgemeinen verwendet werden. Zum Beispiel ist die Fluorimetrie (Mikroplattenleser) wegen ihrer relativ geringen Kosten (Grundausstattung für bis zu 4000 €) und der flachen Lernkurve weit verbreitet, aber als Blackbox ist es anfälliger für verwechslungsreiche Faktoren wie Variationen in Zelldichte oder Hintergrund (Auto-) Fluoreszenz, zB von kontaminierenden Staubpartikeln. Darüber hinaus erlauben Plattenleser nicht die Extraktion von morphologischen Parametern, sie können einzelne Zellen nicht messen und sind weniger empfindlich und zuverlässig, um dynamische oder transiente Signale zu messenLass = "xref"> 36 , 37 . Durchflusszytometrie hat die Fähigkeit, einzelne Zellen zu messen und hat den Vorteil der Geschwindigkeit. Tatsächlich kann eine 384-Well-Platte bis zu 12 min mit hoher Empfindlichkeit für mehrere Marker 38 abgeschirmt werden. Das ist viel schneller als das, was mit der Weitfeldmikroskopie möglich ist. Es werden aber noch keine räumlich-zeitlichen Informationen bereitgestellt ( dh subzelluläre Lokalisierung, morphologische Daten und / oder zeitabhängige Kinetik), noch erlaubt es, die gleichen Zellen während oder nach einer Behandlung (dh in fluxo) zu besichtigen . Darüber hinaus müssen die Zellen in Suspension sein, was die Durchflusszytometrie weniger geeignet macht, die Physiologie der adhärenten Zellen zu untersuchen. Wesentliche Nachteile der hochauflösenden Mikroskopie im Vergleich zu den anderen Methoden sind die Notwendigkeit einer großen Bilddatenspeicherung, einer intensiven Rechenleistung und komplexen Bildanalysen. Der dargestellte Assay vereinheitlicht den Bildakquisitionsprozess und optimiert die AnalysenS, um diese Verarbeitungszeit zu minimieren, die Benutzerfreundlichkeit zu erhöhen und damit den Assay zugänglicher zu machen.
Abschließend und speziell für die Verwendung von CM-H 2 DCFDA und TMRM ist das beschriebene Redox-Profiling-Verfahren robust, empfindlich und zuverlässig. Aufgrund seiner multiparametrischen und quantitativen Natur ist sie anderen fluoreszenzbasierten Methoden überlegen. Auf diese Weise kann es helfen, die Beziehung zwischen der mitochondrialen Funktion und der intrazellulären ROS-Signalisierung aufzuklären, was für ein besseres Verständnis einer Vielzahl von Pathologien entscheidend ist, in denen die Redox-Homöostase gestört wird. Darüber hinaus erlaubt der Assay aufgrund seines generischen Charakters weit über seinen ursprünglichen Umfang hinaus.
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Disclosures
Die Autoren geben an, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte gibt. Der entsprechende Autor sorgt auch dafür, dass alle Autoren aufgefordert wurden, alle Interessenkonflikte zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
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