Summary
מאמר זה מציג עבודה תוכן גבוהה מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, כמו גם פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריה ומורפולוגיה - המכונים במשותף כמו morphofunction המיטוכונדריה - בתאים חסיד חיים באמצעות מולקולרית פלואורסצנטי חוברת מולקולות כתב 5- (ו - 6) -כלורומיליל -2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, אסתר אצטיל (CM-H 2 DCFDA) ו tetramethylrhodamine methylester (TMRM).
Abstract
מינים חמצן תגובתי (ROS) מווסתים תהליכים תאיים חיוניים, כולל ביטוי גנטי, הגירה, הבחנה והתפשטות. עם זאת, רמות ROS מוגזמות לגרום למצב של מתח חמצוני, אשר מלווה בנזק חמצוני בלתי הפיך ל- DNA, שומנים וחלבונים. לפיכך, כימות של ROS מספק פרוקסי ישיר למצב הבריאות הסלולרית. מאז המיטוכונדריה הם בין המקורות הסלולר העיקריים ומטרות של ROS, ניתוח משותף של תפקוד המיטוכונדריה ו ROS הייצור באותם תאים הוא חיוני להבנה טובה יותר של הקישוריות בתנאים פתופיזיולוגיים. לכן, אסטרטגיה גבוהה מבוסס מיקרוסקופ אסטרטגיה שפותחה עבור כימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה (ΔΨ מ ' ) ומורפולוגיה המיטוכונדריה. הוא מבוסס על מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומאטי widefield וניתוח תמונה של תאים חסיד חיים, גדל צלחות רב, וכן staineD עם חדיר תאים חדיר מולקולות פלורסנט CM-H 2 DCFDA (ROS) ו TMRM (ΔΨ מ ו מורפולוגיה המיטוכונדריה). בניגוד fluorimetry או זרימת cytometry, אסטרטגיה זו מאפשרת כימות הפרמטרים subcellular ברמה של תא בודד עם רזולוציה גבוהה spatiotemporal, הן לפני ואחרי גירוי ניסיוני. חשוב לציין, את האופי מבוסס התמונה של השיטה מאפשרת לחלץ פרמטרים מורפולוגיים בנוסף עוצמת האות. מערך התכונות המשולב משמש לניתוח נתונים רב-משתני וניתוח סטטיסטי כדי לזהות הבדלים בין תת-אוכלוסיות, סוגי תאים ו / או טיפולים. הנה, תיאור מפורט של assay מסופק, יחד עם ניסוי לדוגמה זה מוכיח את הפוטנציאל שלה לאפליה חד משמעית בין מדינות הסלולר לאחר הפרעה כימית.
Introduction
ריכוז של ROS תאיים הוא מוסדר בקפידה באמצעות אינטראקציה דינמית בין ROS לייצר ROS מערכות defusing. חוסר איזון בין שני מעורר מצב של מתח חמצוני. בין המקורות העיקריים של ROS הם המיטוכונדריה 1 . בהינתן תפקידם בנשימה התאית, הם אחראים על חלק הארי של מולקולות הסופר-חמצן הבין-תאיות (O 2 - - ). זה נובע בעיקר דליפת אלקטרונים O 2 ב 1 מורכבים של שרשרת התחבורה האלקטרון בתנאים של פוטנציאל פנימי שלילי מיטוכונדריאלי שלילי (Δψ מ ' ), כלומר hyperpolarization המיטוכונדריה. מצד שני, dololarization המיטוכונדריה יש גם מתואמים עם ייצור ROS מוגברת הצבעה על מצבים מרובים של פעולה 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . יתר על כן, באמצעות שינויים חזיון חלבונים של מנגנון היתוך ביקוע, ROS שיתוף להסדיר מורפולוגיה המיטוכונדריה 9. לדוגמה, פיצול הוא בקורלציה עם ייצור ROS גדל אפופטוזיס 10 , 11 , בעוד המיטוכונדריה נימי נקשרו הרעב התזונתי והגנה מפני מיטופגי 12 . לאור היחסים המורכבים בין ROS הסלולר morphofunction המיטוכונדרי, שניהם באופן אידיאלי צריך לכמת בו זמנית בתאים חיים. כדי לעשות בדיוק את זה, assay הדמיה תוכן גבוהה פותחה על בסיס מיקרוסקופ widefield אוטומטיות וניתוח תמונה של תרבויות תא חסיד מוכתם בדיקות פלורסנט CM-H 2 DCFDA (ROS) ו TMRM (מיטוכונדריאלי Δψ מ ומורפולוגיה). הדמיה בתוכן גבוה מתייחסת להפקת spAtiotemporally עשיר ( כלומר , מספר גדול של תכונות תיאוריות) מידע על פנוטיפים הסלולר באמצעות מספר סמנים משלימים וניתוחי תמונה אוטומטיים. בשילוב עם מיקרוסקופיה אוטומטית דגימות רבות ניתן לוקרן במקביל ( כלומר , תפוקה גבוהה), ובכך להגדיל את הכוח הסטטיסטי של assay. ואכן, הנכס העיקרי של הפרוטוקול הוא שהוא מאפשר כימות בו זמנית של פרמטרים מרובים בתא זהה, וזאת עבור מספר רב של תאים ותנאים.
פרוטוקול מחולק 8 חלקים (המתואר בפירוט בפרוטוקול להלן): 1) תאים זורעים בצלחת 96-היטב; 2) הכנת פתרונות מלאי, פתרונות עבודה ומאגר הדמיה; 3) הגדרת המיקרוסקופ; 4) טוען של תאים עם CM-H 2 DCFDA ו TMRM; 5) הראשון הדמיה חיה כדי למדוד את רמות הבסיס ROS ו morphofunction המיטוכונדריה; 6) סיבוב הדמיה חיה שנייה לאחר תוספת של tert -butyl(TBHP) כדי למדוד רמות ROS המושרה; 7) ניתוח תמונה אוטומטי; 8) ניתוח נתונים, בקרת איכות ויזואליזציה.
Assay פותחה במקור עבור fibroblasts נורמלי אנושי (NHDF). מאז תאים אלה גדולים ושטוחים, הם מתאימים גם להערכת מורפולוגיה המיטוכונדריאלי בתמונות widefield 2D 13 , 14 . עם זאת, עם שינויים קלים, שיטה זו חלה על סוגי תאים אחרים חסיד. יתר על כן, ליד השילוב של CM-H 2 DCFDA ו TMRM, זרימת העבודה תואם מגוון רחב של זוגות צבע פלורסנט עם תכונות מולקולריות שונות 1 , 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול להלן מתואר כפי שבוצעה עבור תאים NHDF ועם השימוש של לוחות multiwell המפורטים בקובץ חומרים. ראה איור 1 לקבלת סקירה כללית על זרימת העבודה.
1. הכנה של ריאגנטים
- הכן בינוני שלם על ידי הוספת Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) עם 10% V / V בסרום שור העובר (FBS) ו 100 IU / מ"ל פניצילין ו 100 IU / מ"ל סטרפטומיצין (PS). במשך בינוני 500 מ"ל מלא, להוסיף 50 מ"ל של FBS ו 5 מ"ל של PS ל 445 מ"ל של DMEM.
- הכן HBSS-HEPES (HH) חיץ הדמיה על ידי השלמת תמיסת מלח מאוזן של האנק (עם מגנזיום וסידן, אבל ללא פנול אדום) עם 20 מ"מ HEPES. במשך 500 מ"ל HH, להוסיף 10 מ"ל של פתרון מלאי HEPES 1M ל 490 מ"ל HBSS. אמת את ה- pH, ואם יש צורך, כוונן את ה- pH 7.2.
- הכן 1 מ"מ CM-H 2 DCFDA פתרון המניות על ידי המסת 50 מיקרוגרם של אבקת CM-H 2 DCFDA lyophilized ב 86.5 &# 181; L L DMSO נטול מים. מערבבים על ידי vortexing או pipetting למעלה ולמטה ולעשות 20 aliquots μL צינורות microcentrifuge חום. חנות בחושך ב -20 מעלות צלזיוס להשתמש תוך שבוע. אם מאוחסנים תחת N 2- האווירה מדף יכול להיות מוגברת עד חודש לפחות 1.
- הכן 1 מ"מ TMRM פתרון המניות על ידי המסת אבקה 25 מ"ג TMRM ב 50 מ"ל DMSO נטול מים. מערבבים על ידי vortexing או pipetting למעלה ולמטה ולעשות 10 aliquots μL צינורות microcentrifuge חום. חנות בחושך ב -20 מעלות צלזיוס. פתרון זה יציב במשך שנה לפחות.
- הכן aliquot טרי של Tert -Butyl חמצן (TBHP) המניה (~ 7 M) עבור כל ניסוי על ידי pipetting ישירות נפח מפתרון מלאי 70% (10 צלחת μL / 96-well). שמור על זה aliquot ב 4 ° C עד לשימוש נוסף.
- הכן נוגדנים פתרון עבודה (AB) על ידי דילול שני נוגדנים משני (Alexa פלואור 488 חמור נגד ארנבת CY3 חמור נגד ארנב) 1,000 פעמים 1x HH-bu.
2. הגדרת הפרוטוקול מיקרוסקופ ורכישה (± 15 דקות)
הערה: רכישת התמונה מתבצעת עם מיקרוסקופ שדה רחב מצויד שלב אוטומטיים תריסים, וכן מערכת מבוססת פוקוס אוטומטי מבוסס חומרה באמצעות 20X תוכנית האוויר מתקן (NA = 0.75) ו מצלמה EM-CCD. בעת הגדרת assay בפעם הראשונה, צלחת בדיקה המכילה תאים בקרה, מוכתמים על פי ההוראות של הפרוטוקול משמש לכייל את השלב XY כדי לייעל את הגדרות הרכישה. אם הגדרות הרכישה כבר נקבעו, כיול יכול להיעשות באמצעות צלחת ריקה.
- הורידו את המטרה לרמת הבסיס המוחלטת וכיול את הוראות התוכנה של XY-stage.
- ודא את קוביות המסנן הנכון מותקנים. כדי לדמיין CM-H 2 DCFDA, להשתמש תקן קוביית GFP מסנן עם 472/30 ננומטר עירור המסנן bandpass, 495 ננומטר חיתוך דיכרומראה IC ו 520/35 ננומטר bandpass פליטת מסנן. עבור TMRM, השתמש קוביית מסנן עבור TRITC עם 540/25 ננומטר bandpass עירור מסנן, 565 ננומטר מלוטש dichroic המראה ו 605/55 ננומטר bandpass פליטה מסנן.
- יצירת פרוטוקול הדמיה באמצעות תוכנת הרכישה.
- בחר את הסוג הנכון של צלחת multiwell (יצרן וקוד) מרשימת הצלחות הזמינות המסופקות בתוכנה. לחלופין להגדיר את תבנית הצלחת multiwell שלך באמצעות צלחת גם ממדים.
- ישר את צלחת היטב בהתאם להוראות התוכנה, למשל על ידי הגדרת שתי פינות של ארבע בארות בפינה החיצונית. שלב זה מכסה עבור וריאציה אוריינטציה המצלמה.
- בחר את הבארות כי יש לרכוש. אם אפשרות זו אינה זמינה בתוכנה, השתמש בערכה של מיקומי XY המוגדרים באופן ידני התואמים את הבארות שנבחרו.
- לייעל את הגדרות הרכישה (זמן חשיפה, עוצמת המנורה, EM-gain) עבור thE שני ערוצים בנפרד באמצעות צלחת הבדיקה. מזעור החשיפה ואת העוצמה כמו אור עירור פלואורסצנטי עצמו גורם ROS. אבל, ודא את יחס האות לרקע הוא לפחות 2 עבור BM-H 2 DCFDA הבסיסי ו -3 עבור TMRM לפני טיפול TBHP, וכי אין רוויה לאחר טיפול TBHP. רכישת הגדרות מאוד תלוי בהגדרת מיקרוסקופיה סוג התא בשימוש, אבל כהפניה, הגדרות אינדיקציה בעת שימוש בנורת הלד מתכת של 130 W כמקור אור ותאי NHDF מוכתמים על פי הוראות הפרוטוקול הן הבאות: עבור שניהם CM- H 2 DCFDA ו- TMRM, זמן חשיפה של 200 ms ו- ND מסנן 8, בשילוב עם EM-gain של 15 (13 MHz; 14 סיביות) ו -4 (27 MHz; 14 סיביות) בהתאמה. לאחר אופטימיזציה עבור התקנה מסוימת סוג התא, צעד זה יכול להיות דילג.
הערה: חיוני כי הגדרות הרכישה יישמרו באותו תהליך הדמיה כולו. עבור בקנה מידה גדול, ניסויים רב ימים, sta המנורהBility צריך להיות מוצדק על ידי בקרת איכות רגילה. - הגדרת פרוטוקול הרכישה, בהיקף של רכש למבדה רציף (אורך גל). בחרו בערוץ DCFDA CM-H 2 שיש לרכוש תחילה, כדי למזער את החשיפה לאור לפני המדידה.
- הגדרת לולאה צלחת היטב, כדי לרכוש 4 באופן קבוע במרווחים שאינם חופפים תמונות הממוקמות סביב מרכז של כל טוב של הבחירה גם באמצעות פרוטוקול הרכישה המוגדרים 2.3.4. בחר meandering רכישת התמונה, כלומר, הראשון משמאל לימין, גם B02 ל B11, ואז חזרה, מימין לשמאל, גם C11 כדי C02 וכן הלאה ( איור 2 א ). זה חוסך זמן לעומת רכישת התמונה משמאל לימין. אם אפשרות זו אינה זמינה בתוכנה, התאם את הסדרה המותאמת אישית של XY - מיקומים שנוצרו ב - 2.3.3 כדי לקבל דפוס הדמיה זה.
- שמור את XY קואורדינטות של עמדות הדמיה ( למשל בקובץ XML נפרד), כדי לאפשר revisiti קלNg במקרה של כיול מיקרוסקופ. זה חשוב במיוחד אם readout מן assay זה חייב להיות בקורלציה עם מכתים פוסט-הוק immunofluorescence (IF) עבור אותם תאים.
3 . תאים זרע בצלחת 96 גם (45 - 90 דקות, בהתאם למספר שורות תאים שונים)
- עבודה בסביבה סטרילית כגון ארון 2 biosafety בכיתה וללבוש כפפות.
- לטהר את כל המשטחים והחומרים באמצעות 70% V / V אתנול במים מזוקקים.
- קח בקבוק תרבות התא עם 90% תרבות תאים confluent מן החממה ומניחים אותו בארון biosafety.
- לשטוף את התאים פעמיים עם PBS 1x.
- הוסף את הכמות המתאימה של 0.05% פתרון טריפסין-EDTA על התאים, ולוודא כי פני השטח התא המלא מכוסה ( למשל , 1 מ"ל עבור בקבוק T25), ו דגירה של 2 דקות ב 37 ° C ו 5% CO 2 .
- אם כל התאים מנותקים (לבדוק עם מיקרוסקופ ), להוסיף בינוני תרבות (DMEM + 10% FBS + 1% פניצילין סטרפטומיצין, ± 4 מ"ל בבקבוק T25) לנטרל את הפתרון טריפסין-EDTA.
- צנטריפוגה 5 דקות ב XG 300 בטמפרטורת החדר.
- מחק supernatant ו resuspend תא גלולה במדיום התרבות. לקבוע את כמות המדיום עבור כל סוג התא כדי להשיג ריכוז התא התואם לספור תאים. בדרך כלל, 90% בקבוק T25 מלוכדות של NHDF מכיל כ 1-1.5 מיליון תאים, אשר resuspended ב 3-4 מ"ל של המדיום תרבות.
- ספירת התאים באמצעות תא ספירה תא או מונה Coulter.
- זרעים 8,000-10,000 תאים בכל אחד 60 בארות פנימי של צלחת 96-שחור שחור עם פוליסטירן רציפה או זכוכית התחתונה (שחור, כדי למנוע פיזור ו חוצה לדבר בין בארות סמוך במהלך ההדמיה). בעת שימוש בתנאים שונים / טיפולים / שורות תאים, להפיץ את זריעת מיקומים הומוגנית על צלחת כדי למזער את ההשפעות צלחת (איור 2 א) .ארות חיצוניות, למעט גם B01 ו A01, אינם משמשים כי הם נוטים יותר תופעות קצה.
- זרע 8,000-10,000 תאים ב B01. זה גם ישמש עבור התאמת המיקוד, רק לפני רכישת התמונה.
- ממלאים את הבארות החיצוניות הריקות עם המדיום כדי למזער מעברים (טמפרטורה, לחות וכו ' ) בין הבארות לסביבה.
- בעדינות להקיש על הצלחת שלוש פעמים לפני הצבת אותו בחזרה לתוך החממה, כדי למנוע תאים גדלים טלאים.
- תרבות התאים במשך 24 שעות, או עד מידת מפגש של כ. 70%.
- שמור את פרטי הטיפול עבור הניסוי לגיליון אלקטרוני בשם "Setup.xlsx". הקובץ צריך להכיל ארבע עמודות וישמש לקישור טיפולים עם בארות ומידע תמונות במהלך ניתוח נתונים. ארבע העמודות הן: 'טוב', 'טיפול', 'טיפול' ו'בקרה '(שורה אחת לכל באר). כל טיפול הוא מצמידיםעם מספר טיפול ייחודי, אשר משמש במהלך להדמיה נתונים כדי לקבוע את סדר הטיפולים על ציר ה- X של המגרשים. עמודת הבקרה מפרטת את הטיפול המתפקד כטיפול לטיפול בשורה הנוכחית. איורים של פריסה ניסיונית טיפוסית וקובץ ההתקנה המתאים מתוארים באיור 2 .
4. טעינה של תאים עם CM-H 2 DCFDA ו TMRM (± 45 דקות)
הערה: הטיפול של התאים ביום הניסוי יכול להתבצע בסביבה סטרילית (ארון biosafety), אבל זה לא חובה כי תאים יימחקו או קבועים ישירות לאחר assay.
- מחממים את חיץ HH ל 37 מעלות צלזיוס.
- הכן פתרון 20 מ"מ TMRM עבודה על ידי דילול תמיסת המניות 1 מ"מ 50 פעמים HH חיץ (להוסיף 490 μL של חיץ HH ל 1 aliquot של 10 פתרון המניות TMRM μL).
- הכן עומסIng עם 2 מיקרומטר CM-H 2 DCFDA ו 100 ננומטר TMRM. לשם כך, לדלל את 1 מ"מ CM-H 2 DCFDA מלאי פתרון 500x ו 20 מיקרומטר TMRM פתרון עבודה 200x ב HH- חיץ.
- בדרך כלל, עבור 60 בארות, להכין 7.5 מ"ל של פתרון הטעינה על ידי הוספת 15 μL של DC-D2-CM-H ו 37.5 μL של פתרון TMRM ל 7447.5 μL של HH.
- מחק את המדיום תרבות מן התאים על ידי הפיכת צלחת במהופך תנועה נוזלים אחת.
- בעדינות לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ HH באמצעות פיפטה רב (100 μL / טוב). מחק את HH חיץ בין שלבי כביסה על ידי הפיכת הצלחת במהופך בתנועה נוזלים אחת.
- טען את התאים עם CM-H 2 DCFDA ו TMRM על ידי הוספת 100 μL של פתרון הטעינה לכל טוב, שוב באמצעות פיפטה רב ערוצי. דגירה במשך 25 דקות בחושך, בטמפרטורת החדר. אל תשכח היטב B01.
- במהלך 25 דקות אלה, להכין פתרונות עבודה של TBHP חמצון ולוודא את המיקרוסקופ חומרה אביזר מופעלים.
- הכן פתרון עובד אני: לדלל את פתרון המניה 7M 70x 100 מ"מ (10 מניות μL ב 690 μL HH חיץ).
- הכן פתרון עובד II: לדלל WS אני 100x ל 1 מ"מ (10 μL WS אני 990 μL HH חיץ).
- הכן פתרון עובד III: לדלל WS III 25x ל 40 מיקרומטר (עבור 60 בארות להוסיף 300 μL WS II במאגר 7200 μL HH).
- לאחר 25 דקות, לשטוף את התאים שוב פעמיים עם 100 HH חיץ μL כמתואר לפני.
- הוסף 100 μL של חיץ HH לכל 60 בארות פנימיים.
5. ראשון Live הדמיה עגול למדידת רמות ROS Basal ו Morphofunction המיטוכונדריאלי (± 15 דקות)
- ודא את תוכנת הרכישה הוא מבצעית ואת פרוטוקול הדמיה נטען.
- התקן את הצלחת על המיקרוסקופ, להפעיל את החומרה BASed מערכת פוקוס אוטומטי ולהשתמש היטב B01 כדי להתאים את הפוקוס אוטומטי באמצעות ערוץ TMRM. כמו הליך זה גורם לעלייה CM-H 2 DCFDA עוצמת האות, גם זה אינו נכלל ניתוח התמונה במורד הזרם.
- הפעל את פרוטוקול ההדמיה.
6. Second Live הדמיה לאחר תוספת של TBHP למדוד רמות ROS Induced (± 20 דקות)
- בזהירות להסיר את צלחת 96-היטב מהמיקרוסקופ.
- הוסף 100 μL של TBHP WS III (40 מיקרומטר) לכל היטב באמצעות פיפטה רב ערוצי (זה גורם ריכוז 20 מיקרומטר TBHP בבארות). תרכובת זו משמשת כבקרה חיובית פנימית עבור מכתים DCFDA CM-H 2 (האות צריך לעלות), כמו גם אמצעי למדוד רמות המושרה ROS.
הערה: H 2 O 2 יכול לשמש גם במקום TBHP, אבל המתחם הזה הוא פחות יציב ולכן פחות אמין. - המתן לפחות 3 דקות כדי לאפשר תגובה מלאה של TBHP wIth CM-H 2 DCFDA.
- במהלך תקופה זו, להוסיף 100 פתרון נוגדן μL עובד (1 / 1,000) כדי A01.
- הר את הצלחת בחזרה על המיקרוסקופ ולבדוק להתמקד שוב באמצעות היטב B01.
- לרכוש את אותם מיקומים כמו בסיבוב ההדמיה הראשון באמצעות פרוטוקול הדמיה אותו.
- ייצא את מערכי הנתונים שנרכשו בתיקייה אחת כקובצי tiff בודדים באמצעות נומנקלטורה סטנדרטית הכוללת התייחסות לצלחת, לפני או לאחר טיפול TBHP, טוב, שדה וערוץ, מופרדים על ידי הקווים התחתונים, למשל . "P01_Pre_B02_0001_C1" עבור צלחת 1, טרום טיפול TBHP, גם B02, שדה 1 וערוץ 1. מידע זה ישמש במהלך ניתוח התמונה ( למשל כדי לבחור את הגדרות פילוח מתאים), כמו גם במהלך ניתוח נתונים (כדי לחבר נתונים ניתוח עם הטיפולים הנכונים).
- לרכוש תמונות שדה שטוח עבור שני ערוצים על כל ארבע עמדות סביב מרכז A01 היטב באמצעות פרוטוקול הרכישה. שמור את הEm כמו קבצים בודדים tiff באותה תיקייה כמו תמונות אחרות באמצעות נומנקלטורה סטנדרטית הבאה: 'P01_FF_A01_0001_C1' עבור צלחת 1, שדה 1 וערוץ 1. ודא האותות הם גם בתוך טווח דינמי; במקרה של רוויה, להשתמש בריכוז נמוך יותר של פתרון עבודה נוגדנים.
- מחק את הצלחת או שמור לעיבוד נוסף.
הערה: במקום להסיר את הצלחת מן המיקרוסקופ באמצעות פיפטה רב ערוצי להוסיף את הפתרון TBHP, פיפטה אוטומטית יכול להיות מותקן על הבמה מיקרוסקופ מחובר עם תוכנת הרכישה כדי לתפקד עם קבלת ההדק. זה מאפשר הוספת TBHP לכל טוב ישירות לאחר הרכישה הראשונה, לפני המעבר הבא הבא. בדרך זו, כאשר הסיבוב הדמיה הראשון הוא סיים, השני יכול להתחיל מיד את כל הבארות יהיה זמן הדגירה שווה עם TBHP.
7. עיבוד תמונה וניתוח (± 30 דקות לכלצלחת 96)
הערה: כל עיבוד התמונה מבוצעת ב - FIJI (http://fiji.sc), גרסה ארוזה של. התסריט ייעודי נכתב עבור ניתוח אוטומטי של אותות ROS ו מיטוכונדריה תאיים, כמו גם פרמטרים מורפולוגיים (RedoxMetrics.ijm, זמין על פי בקשה). האלגוריתמים הבסיסיים מתוארים ב- Sieprath et al. 1 .
- ודא FIJI מותקן מבצעית.
- הפעל את FIJI ולהתקין את מאקרו סט (תוספים -> פקודות מאקרו -> התקן ...). זה יהיה להפעיל מספר פקודות מאקרו חדשות, כמו גם קבוצה של כלי פעולה כדי לייעל את הגדרות הניתוח, כפי שמוצג באיור 3 א .
- פתח את ממשק ההתקנה כדי להגדיר את הגדרות ניתוח על ידי לחיצה על כפתור "S" ( איור 3 ב ).
- בחר את סוג התמונה, את מספר הערוצים ואת הבאר ששימשהעבור רכישת תמונות flatfield.
- ציין איזה ערוץ מכיל תאים (ערוץ CMF-H2 DCFDA) או המיטוכונדריה (ערוץ TMRM) ולהתאים את הפרמטרים טרום עיבוד ופילוח עבור כל ערוץ בהתאם לאיכות התמונה ( איור 3 ב ). סמן את תיבות הסימון 'רקע' ו'ניגוד 'כדי לבצע חיסור רקע או בניגוד להשוואה היסטוגרפית הסתגלותית מוגבלת 16 , בהתאמה. הגדרת סיגמה עבור טשטוש גאוס של תאים Laplacian שיפור של המיטוכונדריה. בחר אלגוריתם סף אוטומטי ומלא את מגבלות אי ההכללה (בפיקסלים). אם נבחר סף קבוע במקום אלגוריתם סף אוטומטי, מלא את הסף העליון.
- בדוק את הגדרות הפילוח על מספר תמונות נבחרות של ערכות הנתונים שנרכשו על ידי פתיחתן ולחיצה על הלחצנים 'C' או 'M' בתפריט עבור פילוח תאים או מיטוכונדריה בהתאמה,ולהתאים את ההגדרות אם יש צורך. תוצאה לדוגמה מוצג באיור 3 ג .
- הפעל את אצווה ניתוח על תיקיות (ים) של עניין על ידי לחיצה על כפתור '#' ובחירה בתיקייה עם התמונות. לכל תיקיה, זה יפיק ספרייה חדשה "פלט", המכיל ערכות ROI הפרט (קבצי zip) וקבצי תוצאות (.txt) לכל תמונה. עבור שני הערוצים קובץ התוצאות מכיל תיאורים אינטנסיביים ומורפולוגיים. ערוץ ה- DCFDA של CM-H 2 (תאים) מביא לקובץ מתאר לכל הערך הממוצע של החזר ה- ROI המשולב בתמונה אחת. עבור ערוץ TMRM, קובץ התוצאות מכיל לכל מתאר את הערך עבור כל החזר ההשקעה המיטוכונדריאלי בנפרד.
- לאחר ניתוח אצווה, אמת חזותית את ביצועי הפילוח על 'ערימת אימות', ערימת יתר של כל התמונות עם שכבת העל של החזר ה- ROI בהתאמה על ידי לחיצה על הלחצן 'V'. בדרך זו, חפצים כגון over-/ Undersegmentation, מתוך תמונות להתמקד או חלקיקי אבק / סיבים בתמונות כבר ניתן הבחין במהירות. איסוף נוסף יכול להיעשות במהלך בקרת איכות הנתונים (cfr §8).
8. ניתוח נתונים, בקרת איכות (QC) ויזואליזציה
עיבוד וניתוח של הנתונים הגולמיים נעשה באמצעות R סטטיסטי freeware (http://www.rproject.org - גרסה 3.3.2) ו RStudio (http://www.rstudio.com/ - גרסה 1.0.44). כדי לקבל במהירות ולהציג את התוצאות, יישום מבריק אינטואיטיבי 17 (זמין לפי בקשה) כבר יזום המשלבת ואת visualizes הנתונים heatmaps ו boxplots, וכן מבצעת ניתוחים סטטיסטיים. באופן כללי, זרימת העבודה מורכבת משני שלבים עוקבים. ראשית, הנתונים מעובד נבדק לכל צלחת 96 היטב כדי לזהות נקודות נתונים סוטה. שנית, נתונים שנאספו מכל הלוחות של ניסוי נתון משולבים ומנותחים באמצעות ריבוי לא פרמטרימבחני variate 18 וניתוח מרכיב עיקרי.
- ודא ש- R ו- RStudio מותקנים ומופעלים.
- הפעל את RStudio.
- פתח את היישום המבריק RedoxMetrics והפעל את היישום (בחר להפעיל אותו בדפדפן חיצוני).
- בדף 'קלט', בחר בספריה שבה נמצאים קובצי התוצאות מ- RedoxMetrics.ijm.
- ודא 'Setup.xlsx' (שנוצרו בשלב 3.15) קיים גם בספריה זו.
- קובצי התוצאות ומידע ההתקנה מיובאים באופן אוטומטי, מסודרים ומדמיינים.
- הדף 'הגדרה ניסיונית' מציג את הפריסה של הניסוי. השתמש בדף זה לאימות.
- העמוד הבא, 'תוצאות לכל צלחת' מציג את הנתונים עבור כל צלחת בנפרד בצבעים מרובת צבעים היטב פריסת צלחת כמו גם boxplots עם חריגים מסומן עם שם גם מספר התמונה. זה האחרון מאפשר בדיקה פסים זהותOf של נקודות נתונים חריגות (ערכים גבוהים מאוד או נמוכים בהשוואה לערכים הממוצעים שנמדדו עבור טיפול ספציפי זה - ראה איור 4 לדוגמה).
באמצעות מידע זה, אמת את התמונות התואמות את הנקודות הסותרות. אם מתגלים חריגות, יש להסיר אותם מהניתוח. רוב הפרעות נגרמות על ידי פילוח לא תקין כאשר (חלק) של התמונה הוא מחוץ להתמקד, או כאשר חלקיקי אבק פלואורסצנטי מאוד להפריע פילוח ראוי. במקרים קיצוניים כבר ניתן להבחין במהירות באמצעות כלי מחסנית האימות (שלב 7.5), אך בשלב זה מתגלות תופעות מתוחכמות יותר. כאשר שום סיבה נראית לעין או טכנית לא ניתן למצוא את הערך הסוטה, התמונה לא צריך להיות מוסר מניתוח. - אופציונלי: צור גיליון אלקטרוני חדש בשם 'Drop.xlsx' עם עמודה אחת בלבד בשם 'Drop'. בעמודה זו, רשום את שמות הקבצים (כולל סיומת .tif) של כל התמונותכי יש להסיר מן הניתוח (מזוהה בשלב 7.5 או שלב 8.6.2). העלה קובץ זה באמצעות הדף 'קלט'.
- הדף 'תוצאות הניסוי כולו' מציג את התוצאות מכל הלוחות המשולבים. אם קובץ טיפה הועלה, קובץ זה משמש להסרת נקודות הנתונים שצוינו מהניתוח.
עבור כל פרמטר בנפרד, הנתונים מנורמל לכל צלחת על פי פקדים בהתאמה שלהם. לאחר מכן משולבים נתונים מכל הלוחות, ולאחר מכן מבוצעים מבחנים רב-משתנים שאינם פרמטריים מחבילת nparcomp 18 . אם רק 2 טיפולים משווים שתי בדיקות מדגם עבור הבעיה Behrens-Fisher nonparametric מבוצעות. עבור יותר מ 2 טיפולים, נעשה שימוש במבחן השוואה רב-ערכי לא-פרמטרי. התוצאות דמיינו באמצעות boxplots. - הדף 'ניתוח אשכול' מציג את התוצאות של ניתוח רכיבים ראשי (חבילת הליבה של PCA-R core '). נתונים מ 5 פרמטרים (baSal & induced ROS, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, גודל & מעגל) משולבים להפלות את הטיפולים השונים על בסיס פרופיל שחזר רגיש. לשם כך, ניתוח רכיב עיקרי (PCA) מבוצע (R ליבה "חבילת נתונים סטטיסטיים). התוצאות דמיינו באמצעות biplot (ggbiplot החבילה - http://github.com/vqv/ggbiplot).
- השתמש בדף 'הורדת נתונים' כדי להוריד את מסגרות הנתונים של backend המכילות את הנתונים המעובדים והסודרים מחדש, כך שניתן יהיה לעשות בהם שימוש חוזר לצורך הדמיה מתקדמת יותר של נתונים או ניתוחים סטטיסטיים.
הערה: מכשולים אופייניים ופתרונות פוטנציאליים מפורטים בטבלה 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay כבר benchmarked באמצעות מספר ניסויים שליטה, את התוצאות אשר מתוארים Sieprath et al. 1 . בקצרה, התגובה הקרינה של CM-H 2 DCFDA ו TMRM לשינויים המושרה באופן חיצוני ROS תאיים Δψ מ ', בהתאמה כבר לכמת כדי לקבוע את טווח דינמי. עבור CM-H 2 DCFDA, הראה NHDF עלייה ליניארית האות הקרינה כאשר מטופלים עם ריכוזים הולכים וגדלים של TBHP בין טווח של 10 מיקרומטר עד 160 מיקרומטר. כמו כן, עבור TMRM, תאים NHDF הוכיח עלייה לינארית של הקרינה המיטוכונדריאלית כאשר מטופלים עם ריכוזים הולכים וגדלים של oligomycin (אשר גורם Δψ m hyperpolarization) בטווח של 1 עד 10 מיקרוגרם / μL. לעומת זאת, תוספת בזמן אמת של valinomycin, אנטיביוטיקה שגורמת Δψ m depolarization, הביאה הדרגתית,ירידה אפשרית של הקרינה TMRM .
Assay שימש גם במגוון של ניסויים כדי לגלות הבדלים במצב החמצה בין סוגי תאים או טיפולים 1 , 15 . כדי להמחיש זאת, התוצאות מוצגות ניסוי שבו NHDF טופלו עם מעכב פרוטאז HIV סקינוויר (SQV) ( איור 5 ). באמצעות פרוטוקול המתואר, עלייה משמעותית זוהה הן רמות הבסיסיות המושרה ROS לעומת תאים בקרה שטופלו DMSO ( איור 5 ב ). טיפול SQV השפיע באופן משמעותי על תפקוד המיטוכונדריה. מבחינה מורפולוגית, המיטוכונדריה רכשה דפוס מקוטע מאוד, אשר אושר גם על ידי מעגל גבוה יותר וגודל ממוצע קטן יותר של המיטוכונדריה הפרטנית. פונקציונלית, Δψ מ ' , נמדד כמו אות TMRM הממוצע לכל מיטוךפיקסל ondrial היה גם גדל באופן משמעותי ( איור 5 א ). כאשר משלבים את הנתונים של 5 הפרמטרים שתוארו לעיל, שני התנאים (שליטה SQV) יכול להיות מופרד בבירור אחד מהשני על ידי ניתוח רכיבים עיקריים. נתונים משלושה משכפלים ביולוגיים עצמאיים מוצגים ביפלום דו-ממדי המציג את שני המרכיבים העיקריים הראשונים, המסבירים 81.4% מהשונות הכוללת ( איור 5 ג ' ). זה מוכיח את החוסן של assay ומציע כי readout המשולב עשוי לשמש אינדיקטור רגיש של מצב הבריאות הסלולרית.
איור 1 : סקירה כללית של Assay הדמיה תוכן גבוהה למדידת סימולטני של בזל תאיים רמות ROS Induced ו Morphofunction מיטוכונדריאלי. ( א ) Sייצוג כימטי של אבני התפעול הגדולות. ( ב ) דוגמה מאוירת: תאים הם seeded במספר רב 96 צלחות זהים. פריסת צלחת סטנדרטי גם מוצג בפירוט רב יותר בתרשים 2 א . לאחר מכתים, 4 תמונות נרכשים לכל ערוץ סביב מרכז של כל טוב, גם לפני ואחרי טיפול TBHP, אשר מאויר על ידי montages גדול עם הבלעה. לאחר ניתוח התמונה, עוצמת התוצאות הם דמיינו באמצעות מפת חום אינטואיטיבי מוקרן על פריסת צלחת היטב. זה מאפשר זיהוי מהיר של השפעות צלחת או בארות סוטה. לאחר אוגר של ערכות נתונים ניסיוני מלאה, ניתוח הנתונים הסופי מבוצע וכתוצאה מכך יחיד כמו גם פלט רב פרמטר. (נתון זה שונה מ הפניה 1 , עם אישור של ספרינגר) אנא לחץ כאן כדי להציג גדול versioN של נתון זה.
איור 2 : טיפוסית ניסיוני 96-היטב פריסה מקבילים "תוכנית ההתקנה" קובץ. ( א ) 4 תנאים שונים מופצים הומוגנית על פני 60 בארות הפנימי של הצלחת. ובכן B01 מכיל גם תאים, אבל הוא משמש רק כדי להתאים את PFS הראשונית לקזז רק לפני ההדמיה. הבארות החיצוניות האחרות מתמלאות רק במדיום תרבותי כדי למזער מעברי צבע (טמפרטורה, לחות וכו ' ) במהלך תרבות התאים. רכישת התמונה מתבצע באופן מתפתל, כלומר, הראשון משמאל לימין, גם B02 B11, ולאחר מכן חזרה, מימין לשמאל, גם C11 ל C02 וכן הלאה. לאחר רכישת התמונה תמונות שדה שטוח נרכשים גם A01, אשר משמש לתיקון הטרוגניות התאורה המרחבית במהלך התמונה אליזה. ( B ) קובץ ההתקנה המתאים (Setup.xlsx) הוא גיליון אלקטרוני המכיל מידע על הפריסה של הניסוי. זה מציין את מיקומם של כל טיפול בצלחת multiwell ובקרות בהתאמה שלהם. כל שורה מייצגת באר. לכל טיפול יש מספר טיפול ייחודי משלו, אשר משמש כדי לציין את סדר הטיפולים על ציר ה- X של המגרשים שנוצרו במהלך ניתוח הנתונים. העמודה 'בקרה' מכילה את הטיפול שיש להשתמש בו כבקרה לנרמול נתוני הטיפול שצוין באותה שורה. בדוגמה, טיפול 1 הוא הטיפול המשמש כבקרה לנרמול הנתונים מכל שאר הטיפולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
9 / 55449fig3.jpg "/>
איור 3 : RedoxMetrics מאקרו, פריסה והגדרת ממשק. ( א ) כאשר מאקרו RedoxMetrics להגדיר עבור FIJI מותקן, מספר פקודות מאקרו חדשות, כמו גם קבוצה של כלי פעולה כדי לבדוק ולמטב את הגדרות ניתוח נוצר בשורת התפריטים. 'S' משתמש בממשק ההתקנה. 'F' מבצע תיקון flatfield על תמונה פתוחה. "C" ו- "M" מבצעים פילוח בדיקה עבור אזורים סלולריים ("Cell", ערוץ CM-H2DCFDA) ואזורי המיטוכונדריה ("Mito", ערוצי TMRM), בהתאמה, על תמונה אחת נפתחת תוך שימוש בהגדרות הניתוח שנבחרו בהתקנה ממשק, החזרת כיסוי של אזורים מפולח של עניין (החזרים על ההשקעה). '#' מבצע ניתוח אצווה על תיקיית תמונות באמצעות ההגדרות שצוינו בממשק ההתקנה (בדרך כלל לאחר אימות על תמונה אחת או מספר תמונות). 'V' יוצרת אימות יתרG נתוני הפלט מניתוח אצווה. זה hyperstack היא תמונה מורכבת של כל תמונות גלם נוכח בתיקייה ואת האזורים המתאימים שלהם של עניין (מצויר בערוץ השני). 'O' ניתן ללחוץ כדי להציג או להסתיר את שכבת העל של האזור מפולח. ( ב ) ממשק ההתקנה. כאן נבחרו כל הגדרות הניתוח, כולל מידע כללי כגון סוג התמונה (הרחבה), מספר הערוצים (אורכי גל), וכן את הבאר ששימש לתיקון flatfield. לאחר מכן יש הגדרות ספציפיות לסוג תוכן התמונה (Cell או Mito). בשני המקרים, קיימות אפשרויות (תיבות סימון) כדי לכלול תיקון רקע ("רקע") ושיפור ניגודיות מקומי ("ניגודיות"). עבור פילוח התא, יש אפשרות להגדיר רדיוס לטשטש גאוס (sigma) להפחתת הרעש. עבור פילוח מיטו יש אפשרות להגדיר את הרדיוס של מפעיל Laplacian עבור שיפור סלקטיבי של המיטוכונדריה. פילוח לאחר מכן הוא pאומתה בשיטת סף אוטומטית (או קבועה) שניתן להגדיר לפי סוג תוכן. כאשר נבחר סף קבוע, ניתן לספק את ערך הסף העליון באופן ידני. לבסוף, הניתוח יכול להיות מוגבל מבחר של אובייקטים שנופל בתוך מינימום ומקסימום גודל. ( ג ) דוגמה לתוצאה פילוח כמו לרוץ עם "C" (למעלה) או "M" (תחתית) הפקודה, כפי שמוצג התמונה גלם אפור עם אזור עניין של צהוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : דוגמה מאוירת של נתונים חזותיים ביניים. ( א ) הדמיה צלחת multiwell שבו בארות B02 ו D07 מופיעיםחָשׁוּד. ( ב ) Boxplot המייצג את אותם נתונים, עם outliers שכותרתו עם שם שם ותמונה. יחד עם F03_0003, תמונות מ- B02 ו- D07 מופיעות שוב כשורות חריגות. ( ג ) בדיקה חזותית של תמונות אלה מראה כי B02_0000 ו D07_0001 יש להסיר מניתוח נוסף כי יש שגיאות פילוח (מאויר על ידי אדום 'X'). F03_0003 יש לשמור כי אין פילוח לכאורה או שגיאה טכנית. (אם לא נמצאה סיבה טכנית עבור aberration, הנתונים לא צריך להיות מוסר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 : ההשפעה של סאקינוויר (SQV, 20 מיקרומטר) על פיבר האדם העיקריאובלסטים (שליטה היא DMSO). ( A ) פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (ΔΨ m ) והמורפולוגיה המיטוכונדריאלית (מעגל וגודל ממוצע של המיטוכונדריה הפרטית) כפי שנמדד על ידי רמות ה- BASR (TMRM) המוגברות של ה- ROS בין תאי, כפי שנמדד על-ידי DCFDA CM-H 2 ותגובה כלפי ROS המושרה, כמו עלייה יחסית בעוצמה לאחר תוספת של 20μM בנוסף TBHP. ( C ) של שני המרכיבים העיקריים הראשונים (PC) מניתוח PCA על 5 משתנים שתוארו לעיל (רמות BOS ו המושרה ROS, גודל המיטוכונדריה הממוצע, מעגל, ו ΔΨ מ ' ). החצים השחורים מייצגים את הכיוונים של 5 המשתנים המקוריים ביחס לרכיבים העיקריים. (משכפלים עצמאיים הם זממו עם צבע שונה, כל הנתונים הוא מנורמל ביחס DMSO- שליטה; * = p ערך <0.05, ** = ערך p <0.01; *** = p = 0.001, טווח של Y -הצירים הותאמו כדי להציג את ההבדלים בצורה אופטימלית; נתון זה שונה מ התייחסות 1 , עם אישור של שפרינגר) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| בְּעָיָה | סיבה אפשרית | פתרון אפשרי |
| תאים מעטים מדי בארות במהלך ההדמיה | תאים מעטים מדי מזרזים | זרע תאים נוספים 24 שעות לפני הדמיה |
| צמיחת תאים גרועה | בדוק תנאי התרבות (בינוני, יציבות טמפרטורה, CO 2 שליטה) | |
| צעדי כביסה אלימים מדי | הימנע כביסה תאים משם, פיפטה בעדינות | |
| יותר מדי תאים בבארות במהלך ההדמיה | גַםתאים רבים זרעו | זרע פחות תאים 24 שעות לפני הדמיה |
| אותות חלשים או תגובה לא ליניארית של CM-H 2 DCFDA הקרינה לגירוי | משמש נמוך מדי / ריכוז גבוהה צבע | אם משתמשים בתאי NHDF אחרים, הריכוז הטעינה האופטימלי צריך להיקבע באופן אמפירי |
| טעינת צבע אינו מספיק | הוסף 0.02% w / v של פעילי שטח pluronic-127 כדי לטעון את הפתרון כדי להגדיל את ספיגה. | |
| אות CMF-H 2 DCFDA עולה באופן חזותי בזמן החשיפה | ריכוז צבע גבוה מדי | הפחת את ריכוז הצבע |
| עוצמת עירור גבוהה מדי | הפחת את עוצמת העירור באמצעות מסנני ND ו / או צמצום זמן החשיפה | |
| CM-H 2 עוצמת DCFDA יורדת במהלך רכישת צלחת היטב | CM-H 2 DCFDA הוא דולף מתוךהתא. | השתמש 2 מ"מ Probenicid (מעכב משאבת אניון). הוסף את פתרון הטעינה, כמו גם את מאגר ההדמיה כדי להפחית את הדליפה |
| אין עלייה בעוצמת האות DCFDA CM-H 2 לאחר הוספת TBHP | TBHP אינו פעיל | השתמש TBHP טרי |
| CM-H 2 DCFDA דולף מתוך התא. | השתמש Probenicid כמתואר לעיל. | |
| (חלק) תמונות שנרכשו מופיעות מחוץ להתמקד, תוך התמקדות נראה בסדר כאשר בדק. | צלחת מותקן מוטה גורמת להתמקד להתרחב מעבר PFS לקזז | בדוק את הרכבה של הצלחת ואת רמת הבמה, למקם מחדש את הצלחת |
| החלק התחתון של הצלחת מכיל אבק או חריגות | נקה את החלק התחתון של הצלחת עם נייר עדשה הרט אתנול | |
| תאים מתים במהלך ההדמיה | הפחת את עוצמת עירור או לרכוש פחות תמונות לכל טוב. | |
| הרכב לא נכון של הדמיה | צור מחדש את מאגר ההדמיה | |
| יש מחוץ להתמקד נקודות פלורסנט בתמונות | תאים מנותקים צפים מתוך המיקוד | לשטוף בעדינות יותר במהלך פרוטוקול הטעינה |
| עמודה אחת או יותר יש עוצמה נמוכה יותר allover מאשר בארות אחרות של הצלחת | אחד או יותר טיפים מן פיפטה רב ערוצי לא היו מחוברים היטב ולכן פחות כתב נוספה בארות אלה | בדוק ביסודיות אם כל הטיפים מלאים באופן מושלם בכל פעם שאתה משתמש פיפטה רב. |
| פוקוס נסחף באופן דרמטי במהלך רכישת התמונה | הקלקר התחתון של הצלחת יכול להגיב עם שמן טבילה בעת שימוש בעדשת שמן | השתמש עדשה יבשה, או להשתמש צלחת multiwell עם גלהבתחתית |
| עוצמת האות TMRM מגדילה בין הדמיה הראשונה והבריאה | זמן הטעינה של העיתון לא היה ארוך מספיק, TMRM עדיין equilibrating | הגדל את זמן הטעינה של הכתב |
| CM-H 2 DCFDA האות לאחר טיפול TBHP מגביר במהלך רכישת צלחת היטב | הזמן בין טיפול ב- TBHP לבין תחילת סיבוב ההדמיה השני לא היה ארוך מספיק, TBHP עדיין מחמצן את CM-H 2 DCFDA. | הגדל את זמן הדגירה בין הטיפול ב- TBHP לבין סבב ההדמיה השני. (להתחיל עם לפחות 3 דקות) |
| תמונות שדה שטוח רוויות | פתרון נוגדן עובד הוא מרוכז | השתמש בריכוז נמוך יותר של פתרון נוגדן עובד |
| הגדרות הרכישה אינם מותאמים (זמן חשיפה גבוהה, ND- מסנן נמוך, ...) | בצע אופטימיזציה של הגדרות הרכישה,האות חייב להיות בטווח דינמי של החיישן | |
| תמונות שדה שטוח הן כהות | פתרון נוגדן עובד הוא מדולל | השתמש בריכוז גבוה יותר של פתרון נוגדן עובד |
| הגדרות הרכישה אינם מותאמים (זמן חשיפה גבוהה, ND- מסנן נמוך, ...) | מטב את הגדרות הרכישה, האות צריך להיות בטווח דינמי של החיישן | |
| מעל / undersegmentation חפצים | סף לא הוגדר כהלכה | התאם את הגדרת הסף |
| מסננים גודל לא מותאם כראוי | התאם את הקריטריונים של הגודל המינימלי והמקסימלי לניתוח תמונות | |
| תא confluency גבוה מדי | הרמה הנכונה של confluency הוא מאוד חשוב עבור ניתוח תמונה אמין. עבור סוגי תאים אחרים מאשר NHDF, צפיפות זריעת אופטימלי יש לקבוע באופן אמפירי | |
| היישום המבריק אינו פועל | נבחרה ספריה שגויה | בחר את הספרייה הנכונה בדף הקלט. |
| קבצים חסרים בספרייה | ודא שכל הקבצים הדרושים (פלט מקובץ Imagej ומאקרו) נמצאים בספרייה שנבחרה | |
| חבילות חסרות | בדרך כלל היישום בודק ומתקין את כל החבילות הדרושות, אך כאשר זה נכשל, בדוק באופן ידני את החבילות הבאות: devtools, ggbiplot, pgman, ggplot2, plyr, nparcomp, data.table, readxl, gplots, ggbiplot, מבריק, מבריק, pbapply ואת shinyjs כולל כל תלות. |
טבלה 1: מכשולים אופייניים ופתרונות אפשריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה גבוהה תוכן מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים ו morphofunction המיטוכונדרי ב NHDF. הביצועים שלה הודגם עם מקרה מבחן על SQV שטופלו NHDF. התוצאות תומכות בראיות מוקדמות יותר מהספרות שבהן רמות ROS גבוהות או תפקוד מיטוכונדריאלי נצפו לאחר טיפול במעכבי פרוטאז מסוג 1, אם כי בניסויים נפרדים 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . ההבדל החשוב הוא assay המתואר הוא מסוגל למדוד את הפרמטרים האלה בו זמנית, בתאים חיים אותו, יחד עם נתונים מורפולוגיים. היתרון העיקרי של גישה זו הוא הקביעה החד משמעית של שני הגורמים יחד בחלל ובטIme, אשר מאפשר איתור סיבתי יחסים. ניתוח מרכיב עיקרי מתבצע המאפשר יצירת פרופיל שחזר רגיש של הפרעות ספציפיות. עם זאת, טכניקות כריית נתונים מתקדמות יותר ואלגוריתמים לאשכולות (בפיקוח) ניתנים לשימוש גם בנתונים שחולצו כדי לאפשר אפיון פרופילי חיזוי חזוי. זה עשוי להיות תכונה חשובה עבור כלים סיווג אבחון או פרוגנוסטי פתולוגיה דיגיטלית, כמו גם הקרנה של מטרות טיפוליות, למשל לאחר מודלים סיווג חזקים נוצרות, ספריות מולקולה קטנה ניתן לבדוק כדי למצוא מועמדים טיפוליים כדי לנטרל מתח חמצוני, מקביל ל מסך לאחרונה עבור מוביל מבטיח בפיתוח טיפול עבור הפרעות המיטוכונדריה האנושית 26 .
Assay היה יזום עבור NHDF, אבל יכול להיות מותאם סוגים אחרים של תאים חסיד. זה דורש אופטימיזציה של פרוטוקול מכתים וריכוז צבע ריבוע. כמות r צבע eporter צריך להיות ממוזער מאז עומס יתר יכול לגרום השפעות ליניאריות עקב מרווה או אפילו להפוך ציטוטוקסי 27 . הרחבה של assay לתאי ההשעיה הוא פחות ברור בשל קשיים עם הרכבה ותצפית תאים כאלה בצורה פיזיולוגית. הם יכולים להיות cytospun על coverslip או מתורבת בסרום ללא מדיה כדי לגרום הידבקות, אבל שני תהליכים אלה להפריע לתנאים הפיזיולוגיים 28 , 29 . עם זאת, מגבלות אלה ניתן להתגבר באמצעות micropatterned תא התרבות תומכת לשמור תאים בודדים (חסיד או חסיד) לכודים בתוך בארות מיקרו קטנות תוך שמירה על יכולתם 30 , או על ידי שימוש hydroel תרמו הפיך ללכידת תאים במהלך הדמיה 31 . שיטות אלה כבר כבר בשימוש עבור תוכן תוכן גבוהה של פוטנציאל קרום פלסמה, או חמצן תאים תאים ההשעיה הפרט= "Xref"> 32 , 33 או הדמיה של סמנים תאיים של טפילים חיים, מאוד מוטיבציה 31 . הסתגלות גם צריך להיעשות על מודול הדמיה, שכן ניתוח מורפולוגי של הרשת המיטוכונדריאלי בתאים אלה ידרוש מהיר רכישת יכולות 3D כגון ספינינג דיסק confocal או בסל קרן קרן אור מיקרוסקופ 34 , 35 , כמו גם לניתוח צינור, כדי לכלול את Z- מימד תוך חישוב פרמטרים מורפולוגיים.
Assay היה מותאם במיוחד עבור צלחות 96-היטב, אבל זה כמובן amenable כדי upscaling נוספת, למשל 384 טוב צלחות. הגורם המגביל העיקרי הוא הזמן רכישת צלחת, כלומר, הזמן שנדרש כדי לרכוש תמונות של כל הבארות. אותות ניאון צריך להישאר יציב במהלך פרק זמן זה, כדי להיות מסוגל להשוות בביטחון מדידות ביןבארות בודדות. אבל, בגלל מכתים הוא חולף ואת התהליך הנחקר הוא דינמי, זה מציב אתגר. לכן, אותות ניאון נמדדו קבוצה של ניסויים משוכפלים וזה הראה כי הן CM-H 2 DCFDA ו TMRM אותות להישאר יציב מ 7 עד לפחות 50 דקות לאחר מכתים (מקדם וריאציה <2%). זה נותן חלון של כ 40 דקות. צלחת 96-היטב בדרך כלל לוקח בערך 10 דקות. לפיכך, אקסטרפולציה על צלחות 384 טוב ישמור על משך הרכישה בתוך חריץ זמן יציב. עם ממוצע של 50 תאים לכל תמונה (מבוסס על שימוש של מטרה 20X ותאי NHDF), זה יגרום לנתונים של כ 30,000 תאים לשעה של הקרנה, להוסיף מאוד את הכוח הסטטיסטי של assay. גורם נוסף המשפיע על יציבות אותות ניאון הוא הטמפרטורה. כדי למנוע vacuolization של CM-H 2 DCFDA (כלומר הצטברות צבע בתוך שלפוחית תאיים), אשר יביא להטרומכתים גנטיים ולא ליניארי אפקטים, הדגירה מתרחשת בטמפרטורת החדר במקום 37 ° C. מלבד יציבות, חשוב לציין כי החשיפה של תאים חיים אור עירור פלואורסצנטי עצמו גורם ייצור ROS. זה מרמז כי תנאי החשיפה (זמן חשיפה ועוצמת אור עירור) צריך להישמר מינימום מוחלט. זה גם אומר שכל בארות צריך רק להיות חשוף כאשר התמונות בפועל נרכשים. זה פוסל את השימוש בשיטות מיקוד אוטומטי של התוכנה ומאפשר שימוש במערכת פוקוס אוטומטית מבוססת חומרה.
היתרון של השיטה המתוארת הוא אופיו הגנרי. כמעט כל שילוב של כתבים פלואורסצנטי תואם ספקטרום ניתן להשתמש. זה הוכח באמצעות שילוב Calcein / MitoSOX למדוד ROS המיטוכונדריה לכל תא חי 1 , 15 . יתר על כן, היישומים אינם מוגבלים int ROS מיגרדת / מיטוכונדריה. Assay ניתן גם להרחיב עם immunostaining פוסט הוק (לאחר ההדמיה השנייה). מאז המיקום המדויק הדמיה נשמרים, ניתוחים redox יכול להיות מתואמים ישירות עם proteomics מיקום בתאים אותו. זה מגדיל מאוד את readout מולקולרי, אשר בניגוד מוחלט לשיטות אחרות המשמשות לעתים קרובות כדי להעריך ביולוגיה החמצה, או פלואורסצנטי עוצמות בכלל. לדוגמה, Fluorimetry (קורא microplate) נעשה שימוש נרחב בגלל העלות הנמוכה יחסית שלה (ההתקנה הבסיסית זמין עבור נמוך כמו 4000 €) ועקומת למידה רדודה, אבל להיות קופסה שחורה, הוא נוטה יותר גורמים confounding כגון וריאציות ב צפיפות תאים או רקע (אוטומטי) פלואורסצנציה, למשל של חלקיקי אבק מזוהמים. יתר על כן, קוראי צלחת אינם מאפשרים החילוץ של פרמטרים מורפולוגיים, הם לא יכולים למדוד תאים בודדים, והם רגישים פחות ואמין למדידת אותות דינמיים או חולפיםLass = "xref"> 36 , 37 . זרימת cytometry יש את היכולת למדוד תאים בודדים יש את היתרון של מהירות. ואכן, צלחת 384 גם יכול להיות מוקרן קטנה כמו 12 דקות עם רגישות גבוהה עבור סמנים מרובים 38 . זה הרבה יותר מהר ממה אפשרי עם מיקרוסקופ widefield. עם זאת, עדיין אין מידע spatiotemporal מסופק ( כלומר לוקליזציה subcellular, נתונים מורפולוגיים ו / או קינטיקה תלוי זמן), וגם זה לא מאפשר revisiting אותם תאים במהלך או אחרי הטיפול (כלומר, fluxo) . יתר על כן, התאים צריכים להיות בהשעיה, מה שהופך את cytometry זרימה מתאים פחות ללמוד את הפיזיולוגיה של תאים חסיד. החסרונות העיקריים של מיקרוסקופיה בתוכן גבוה בהשוואה לשיטות האחרות הן הצורך לאחסון נתונים גדול התמונה, כוח עיבוד אינטנסיבי ניתוחי תמונה מורכבים. Assay המוצגת standardizes את תהליך רכישת התמונה מייעלת את analysiS כדי למזער את זמן העיבוד, להגדיל את קלות השימוש ולכן להפוך את assay נגיש יותר.
לסיכום, ספציפית לשימוש CMD-H 2 DCFDA ו TMRM, שיטת ההתאמה האישית המתואר redox הוא חזק, רגיש ואמין. בשל אופיו multiparametetric וכמותי, הוא עדיף על שיטות מבוססות פלואורסצנטי אחרים. בדרך זו, זה יכול לעזור להבהיר את הקשר בין תפקוד המיטוכונדריה לבין איתות ROS תאיים, אשר חיוני להבנה טובה יותר מגוון רחב של פתולוגיות שבו הומאוסטזיס שחזר מוטרד. יתר על כן, בשל אופיו הגנרלי, assay מאפשר יישומים הרבה מעבר להיקף המקורי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים קובעים כי אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים. המחבר המקביל גם מבטיח שכל המחברים התבקשו לחשוף כל ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת אנטוורפן (TTBOF / 29267, TTBOF / 30112), קרן המחקר המיוחד של אוניברסיטת גנט (פרויקט BOF / 11267/09), NB-Photonics (קוד פרוייקט 01-MR0110) ו- CSBR עבור ביולוגיה של מערכות מחקר) יוזמה של הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO: לא: CSBR09 / 013V). חלקים מכתבי יד אלה הותאמו מפרסום אחר, באישורו של שפרינגר. המחברים מודים לחירט מייסן על עזרתו במיקרוסקופ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology? Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , https://CRAN.R-project.org/package=shiny (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
