Summary
이 논문은 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 막 전위와 형태학을 동시에 정량화하기위한 고 - 내용 현미경 검사 워크 플로우를 제시한다. 세포 투과성 형광 리포터 분자 5- (and- 6) - 클로로 메틸 -2 ', 7'- 디클로로 디 히드로 플루 오렌 시스 디 아세테이트, 아세틸 에스테르 (CM-H 2 DCFDA) 및 테트라 메틸 로다 민 메틸 에스테르 (TMRM)
Abstract
활성 산소 종 (ROS)은 유전자 발현, 이동, 분화 및 증식을 포함한 필수 세포 과정을 조절합니다. 그러나 과도한 ROS 수준은 DNA, 지질 및 단백질에 대한 비가 역적 산화 손상을 수반하는 산화 스트레스 상태를 유도합니다. 따라서, ROS의 정량화는 세포 건강 상태에 대한 직접적인 프록시를 제공한다. 미토콘드리아가 ROS의 중요한 세포 원 및 표적이기 때문에 같은 세포에서 미토콘드리아 기능과 ROS 생산의 공동 분석은 병리 생리 학적 조건에서 상호 연결을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 따라서, 세포 내 ROS 수준, 미토콘드리아 막 잠재력 (ΔΨ m ) 및 미토콘드리아 형태학의 동시 정량화를위한 고 함량 현미경 기반 전략이 개발되었습니다. 그것은 다중 웰 플레이트에서 성장한 살아있는 부착 세포의 자동화 된 광역 형광 현미경 및 이미지 분석에 기반을두고 있습니다.세포 - 투과성 형광 리포터 분자 CM-H2 DCFDA (ROS) 및 TMRM (ΔΨm 및 미토콘드리아 형태학)을 사용하여 d를 측정 하였다. 형광 측정 또는 유동 세포 계측법과는 달리,이 전략은 실험 자극 전후 모두 높은 시공간 해상도를 갖는 개별 세포 수준에서 세포 매개 변수를 정량화 할 수 있습니다. 중요하게도,이 방법의 이미지 기반 성질은 신호 강도 이외에 형태 론적 파라미터를 추출 할 수있게한다. 결합 된 기능 세트는 하위 집단, 세포 유형 및 / 또는 치료법 간의 차이를 탐지하기위한 탐색 및 통계 다변량 데이터 분석에 사용됩니다. 여기에, 화학 섭동 후 세포 상태 사이의 모호하지 않은 차별을위한 잠재력을 증명하는 실험 예와 함께 분석에 대한 자세한 설명이 제공됩니다.
Introduction
세포 내 ROS의 농도는 ROS 생성 시스템과 ROS를 제거하는 시스템 사이의 동적 상호 작용을 통해 세 심하게 조절됩니다. 이 둘의 불균형은 산화 스트레스 상태를 일으킨다. ROS의 주요 원인 중 하나는 미토콘드리아이다. 세포 호흡에서의 역할을 감안할 때, 그들은 세포 내 superoxide (O 2 • - ) 분자의 대부분을 담당합니다 2 . 이것은 주로 강한 마이너스 내부 미토콘드리아 막 잠재력 (Δψ m ), 즉 미토콘드리아 과분극 조건 하에서 전자 전달 사슬의 복합체 1에서 O 2 로의 전자 누출에 기인한다. 반면에 mitochondrial depolarization은 ROS 생성 증가와 상호 작용하여 여러 형태의 작용 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . 또한 핵분열 - 핵융합 기계 단백질의 산화 환원 변형을 통해 ROS는 미토콘드리아 형태를 공동 조절한다. 예를 들어, 단편화는 ROS 생성 및 세포 사멸 증가와 관련이있다 10 , 11 , 섬유 성 미토콘드리아는 영양 기아와 보호 mitophagy 12 . 세포 ROS와 미토콘드리아 morphofunction 사이의 복잡한 관계를 감안할 때, 둘 다 살아있는 세포에서 동시에 정량화되어야합니다. 정확하게 이것을 수행하기 위해, 형광 프로브 CM-H 2 DCFDA (ROS) 및 TMRM (미토콘드리아 Δψm 및 형태학)으로 염색 된 부착 세포 배양 물의 자동화 된 와이드 필드 현미경 및 이미지 분석에 기초하여 고 - 컨텐츠 이미징 분석법을 개발 하였다. 고 - 컨텐츠 이미징은 sp다중 보완 마커 및 자동화 된 이미지 분석을 사용하여 세포 phenotypes에 대해 atiotemporally 풍부한 ( 즉 , 많은 설명 기능) 정보. 자동화 된 현미경 검사와 결합하면 많은 샘플을 병렬로 ( 즉 높은 처리량) 스크리닝 할 수 있으므로 분석의 통계 능력이 향상됩니다. 사실, 프로토콜의 주요 자산은 같은 세포에서 여러 매개 변수의 동시 부량을 허용하고, 이것은 많은 세포 및 조건에서 가능하다는 것입니다.
프로토콜은 8 부분으로 나누어 져 있습니다 (아래의 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다) : 1) 96- 웰 플레이트에서 세포를 시드; 2) 원액, 작업 용액 및 영상 버퍼의 준비; 3) 현미경 셋업; 4) CM-H 2 DCFDA 및 TMRM으로 세포를 로딩하는 단계; 5) 기본 ROS 수준과 미토콘드리아 morphofunction을 측정하는 최초의 라이브 영상 라운드; 6) tert- 부틸의 첨가 후 둥근 두번째 이미지 생성유도 된 ROS 수준을 측정하기위한 과산화수소 (TBHP); 7) 자동화 된 이미지 분석; 8) 데이터 분석, 품질 관리 및 시각화.
이 분석법은 원래 정상적인 사람 피부 섬유 아세포 (NHDF)를 위해 개발되었습니다. 이러한 세포는 크고 평평하기 때문에 2D 와이드 이미지 13 , 14 에서 미토콘드리아 형태학을 평가하는 데 적합합니다. 그러나 사소한 수정으로이 방법은 다른 접착 세포 유형에도 적용 할 수 있습니다. 또한, CM-H 2 DCFDA와 TMRM의 조합 옆에 워크 플로우는 다른 분자 특이성 1 , 15 의 다양한 형광 염료 쌍을 준수합니다.
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Protocol
아래의 프로토콜은 NHDF 세포와 재료 파일에 명시된 멀티 웰 플레이트를 사용하여 수행되는 것으로 설명됩니다. 워크 플로의 일반적인 개요는 그림 1 을 참조하십시오.
1. 시약의 준비
- 10 % v / v 태아 소 혈청 (FBS)과 100 IU / ML 페니실린과 100 IU / ML 스트렙토 마이신 (PS)와 Dulbecco의 수정 독수리 매체 (DMEM) 보충하여 완벽한 매체를 준비합니다. 500 mL의 완전한 배지에 44 mL의 DMEM에 50 mL의 FBS와 5 mL의 PS를 첨가한다.
- 20 MM HEPES와 행크의 균형 소금 솔루션 (마그네슘과 칼슘,하지만 페놀 레드없이) 보완하여 HBSS - HEPES (HH) 이미징 버퍼를 준비합니다. HH 500 mL에 1M HEPES 스톡 용액 10 mL를 HBSS 490 mL에 넣는다. pH를 확인하고, 필요하다면 pH 7.2로 맞추십시오.
- CM - H 2 DCFDA 동결 건조 분말 50 μg을 86.5 ℃에서 녹여 1 mM CM - H 2 DCFDA 저장 용액을 준비한다.# 181; L 무수 DMSO. vortexing 또는 위아래로 pipetting하여 혼합하고 갈색 microcentrifuge 튜브에 20 μL aliquots을 확인하십시오. -20 ° C의 어두운 곳에 보관하고 1 주 이내에 사용하십시오. N 2 - 분위기하에 보관하면 유효 기간은 최소 1 개월까지 연장 할 수 있습니다.
- 50 ML 무수 DMSO에 25 MG TMRM 분말을 해산하여 1 MM TMRM 주식 솔루션을 준비합니다. vortexing 또는 위아래로 pipetting하여 혼합하고 갈색 microcentrifuge 튜브에 10 μL aliquots을 확인하십시오. -20 ° C에서 보관하십시오. 이 솔루션은 최소 1 년 동안 안정적입니다.
- 70 % 원액 (10 μL / 96-well plate)의 부피를 직접 pipetting하여 모든 실험에 대해 Tert-butyl peroxide (TBHP) 스톡 (~ 7 M)의 신선한 분액을 준비하십시오. 추후 사용까지 4 ° C에서이 분취 량을 유지하십시오.
- 2 차 항체 (Alexa Fluor 488 당나귀 항 토끼 및 CY3 당나귀 항 토끼)를 1 배 HH-bu로 1000 배 희석하여 항체 작업 용액 (AB)을 준비하십시오ffer.
2. 현미경 및 수집 프로토콜 설정 (± 15 분)
참고 : 이미지 수집은 자동화 된 스테이지 및 셔터가 장착 된 와이드 필드 현미경 및 20X 공기 평면 보정 대물 렌즈 (NA = 0.75) 및 EM-CCD 카메라를 사용하는 하드웨어 기반 자동 초점 시스템으로 수행됩니다. 처음으로 분석을 설정하는 경우 프로토콜 지침에 따라 염색 된 대조군 세포가 들어있는 시험판을 사용하여 XY 스테이지를 보정하고 수집 설정을 최적화합니다. 획득 설정이 이미 결정된 경우 빈 플레이트를 사용하여 보정을 수행 할 수 있습니다.
- 대물 렌즈를 절대베이스 레벨로 낮추고 소프트웨어 지침에 따라 XY 스테이지를 보정하십시오.
- 올바른 필터 큐브가 설치되어 있는지 확인하십시오. CM-H 2 DCFDA를 가시화하려면 472/30 nm 여기 밴드 패스 필터, 495 nm cutoff dichro와 함께 표준 GFP 필터 큐브를 사용하십시오ic 미러 및 520/35 nm 밴드 패스 방출 필터가 있습니다. TMRM의 경우, 540/25 nm 밴드 패스 여기 필터, 565 nm 컷오프 다이크로 익 미러 및 605/55 nm 밴드 패스 방출 필터가있는 TRITC 용 필터 큐브를 사용하십시오.
- 수집 소프트웨어를 사용하여 이미징 프로토콜을 만듭니다.
- 소프트웨어 내에 제공된 사용 가능한 플레이트 목록에서 올바른 종류의 멀티 웰 플레이트 (제조업체 및 코드)를 선택하십시오. 또는 플레이트와 웰 치수를 사용하여 자신의 멀티 웰 플레이트 형식을 정의하십시오.
- 소프트웨어의 지시에 따라, 예 를 들어 4 개의 외부 코너 웰의 두 모서리를 정의하여 웰 플레이트를 정렬합니다. 이 단계는 카메라 방향 변화에 적용됩니다.
- 획득해야 할 우물을 선택하십시오. 이 옵션을 소프트웨어에서 사용할 수없는 경우 선택한 웰에 해당하는 수동으로 정의 된 XY 위치 집합을 사용하십시오.
- th에 대한 획득 설정 (노출 시간, 램프 강도, EM- 게인) 최적화2 개의 채널을 테스트 플레이트를 사용하여 따로 따로 설치하십시오. 형광 여기 광 자체가 ROS를 유도하므로 노출과 강도를 최소화하십시오. 그러나 TBHP 치료 전에 신호 대비 배경 신호 비율이 기저 CM-H 2 DCFDA가 2 이상, TMRM이 3 이상이어야하며 TBHP 치료 후 포화도가 없음을 확인하십시오. 취득 설정은 현미경 설정 및 사용 된 세포 유형에 크게 달려 있지만 참조 용으로 130W의 금속 할로겐 전구를 광원으로 사용하고 지시서에 따라 염색 된 NHDF 세포를 사용할 때의 표시 설정은 다음과 같습니다. CM- H 2 DCFDA 및 TMRM의 노출 시간은 200ms이고 ND 필터 8은 각각 15 (13MHz, 14 비트) 및 4 (27MHz, 14 비트)의 EM 게인과 함께 사용됩니다. 특정 설정 및 셀 유형에 맞게 최적화되면이 단계를 건너 뛸 수 있습니다.
참고 : 획득 설정을 전체 이미징 프로세스에서 동일하게 유지하는 것이 중요합니다. 대규모의 여러 날 실험의 경우, 램프 스태정기적 인 품질 관리로 신뢰성을 보장해야합니다. - 순차적 람다 (파장) 수집으로 구성된 수집 프로토콜을 정의하십시오. 측정 전에 빛의 노출을 최소화하기 위해 먼저 수집 할 CM-H 2 DCFDA 채널을 선택하십시오.
- 웰 플레이트 루프를 정의하여 2.3.4에 정의 된 획득 프로토콜을 사용하여 웰 선택의 각 웰 중앙에 배치 된 규칙적으로 간격을 둔 비 중첩 이미지 4 개를 획득합니다. 사방 팔방으로 이미지 수집을 선택하십시오 ( 예 : 왼쪽에서 오른쪽으로, 잘 B02에서 B11까지, 다시 오른쪽에서 왼쪽으로, 웰 C11에서 C02까지) ( 그림 2A ). 이렇게하면 왼쪽에서 오른쪽으로 이미지를 가져 오는 것보다 시간이 절약됩니다. 이 옵션을 소프트웨어에서 사용할 수없는 경우 2.3.3에서 생성 된 XY 위치의 사용자 정의 세트를 조정하여이 이미징 패턴을 적용하십시오.
- 이미징 위치 ( 예 : 별도의 XML 파일)의 XY 좌표를 저장하여 쉽게 재구성 가능현미경 재 보정의 경우. 이 분석의 판독 값이 동일한 세포에 대한 post-hoc immunofluorescence (IF) 염색과 관련이 있어야하는 경우 특히 중요합니다.
3 . 96- 웰 플레이트에서 세포를 시드 (45 ~ 90 분, 상이한 세포주의 수에 따라)
- 2 등급 바이오 안전성 캐비닛과 같은 무균 환경에서 작업하고 장갑을 착용하십시오.
- 증류수에서 70 % v / v 에탄올을 사용하여 모든 표면과 물질을 오염 제거하십시오.
- 배양기에서 90 % 컨 플루 언트 세포 배양액으로 세포 배양 플라스크를 가져 와서 바이오 안전성 캐비닛에 넣으십시오.
- PBS 1x로 세포를 두 번 씻으십시오.
- 완전한 세포 표면 ( 예 : T25 flasks 1 ML) 덮여 있는지 확인하고, 세포에 0.05 % 트립신 - EDTA 솔루션의 적절한 금액을 추가하고 37 ° C와 5 % CO 2 2 분 품어.
- 모든 세포가 분리되면 (현미경으로 확인하십시오 ), 배양 배지 (DMEM + 10 % FBS + 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신; T25 플라스크에서 ± 4 mL)를 첨가하여 트립신 -EDTA 용액을 불 활성화시킨다.
- 상온에서 300 X에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 뜨는을 버리고 문화 매체에 세포 펠렛을 resuspend. 세포 계수와 호환되는 세포 농도를 얻기 위해 모든 세포 유형에 대한 매체의 양을 결정하십시오. 일반적으로, NHDF의 90 % 합류 T25 플라스크는 약 1-1,500,000 개의 세포를 함유하며, 이는 3-4 mL의 배양 배지에 재현 탁된다.
- 셀 계수 챔버 또는 Coulter 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다.
- 얇은 연속 폴리스티렌이나 유리 바닥이있는 흑색 96- 웰 플레이트의 안쪽 60 개 웰 각각에 8,000-10,000 개의 세포를 시드하십시오 (블랙은 이미징 중에 인접 웰 사이의 산란 및 크로스 토크를 피하기 위해). 다른 조건 / 치료법 / 세포주를 사용할 때는 플레이트 효과를 최소화하기 위해 플레이트에 균질하게 시드 위치를 분배하십시오 (그림 "> 그림 2A). 우물 B01과 A01을 제외한 외측 우물은 가장자리 효과가 더 잘 발생하기 때문에 사용되지 않습니다.
- B01에 8,000-10,000 개의 세포가 뿌려진다. 이 우물은 이미지 획득 직전의 초점 조정에 사용됩니다.
- 우물과 환경 사이의 기울기 (온도, 습도 등 )를 최소화하기 위해 빈 외부 우물을 매질로 채 웁니다.
- 천천히 판을 세 번 두드려 인큐베이터에 다시 넣고 세포가 번식하지 않도록하십시오.
- 세포를 24 시간 동안 배양하거나, 합류 정도까지 배양한다. 70 %.
- 실험을위한 치료 정보를 "Setup.xlsx"라는 스프레드 시트에 저장하십시오. 파일에는 4 개의 열이 있어야하며 데이터 분석 중에 우물 및 이미지 정보와 함께 처리를 연결하는 데 사용됩니다. 네 개의 열은 'Well', 'Treatmentnumber', 'Treatment'및 'Control'(우물당 한 행)입니다. 모든 치료가 결합 됨데이터 처리 중에 플롯의 X 축에서 처리 순서를 결정하는 데 사용되는 고유 한 처리 번호가 있습니다. control-column은 현재 행에 대한 처리를위한 제어로서 기능하는 처리를 지정합니다. 일반적인 실험 레이아웃 및 해당 설정 파일의 그림은 그림 2 에 나와 있습니다.
4. CM - H 2 DCFDA 및 TMRM (± 45 분)과 세포의 로딩
참고 : 실험 당일 세포의 취급은 멸균 환경 (biosafety cabinet)에서 수행 할 수 있지만 분석 후 세포를 폐기하거나 직접 고정하기 때문에 의무 사항은 아닙니다.
- HH 완충액을 37 ° C로 가열한다.
- 1 MM 주식 용액을 HH 버퍼 50 회 희석하여 20 μM TMRM 작업 솔루션을 준비하십시오 (10 μL TMRM 스톡 솔루션의 1 나누기에 490 μL의 HH 버퍼를 추가하십시오).
- 부하 준비2 μM CM-H 2 DCFDA 및 100 nM TMRM을 함유 한 용액으로 처리 하였다. 이를 위해 1mM CM - H 2 DCFDA 주식 솔루션 500x와 HH - 버퍼의 20 μm의 TMRM 작업 솔루션 200 배 희석.
- 일반적으로, 60 개의 웰을 위해, HH 7447.5 μL에 CM-H 2 DCFDA 15 μL와 TMRM 용액 37.5 μL를 첨가하여 7.5 mL의 로딩 용액을 준비한다.
- 접시를 거꾸로 한 번 유체 운동으로 세포에서 배양 매체를 폐기하십시오.
- 부드럽게 다중 채널 피펫 (100 μL / 잘)을 사용하여 HH 버퍼로 세포를 두 번 씻으십시오. 한 번의 유체 움직임으로 플레이트를 뒤집어서 세척 단계 사이에 HH 완충액을 버립니다.
- 다시 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 잘로드 솔루션의 100 μL를 추가하여 CM - H 2 DCFDA와 TMRM로 세포를로드합니다. 실온에서 어둠 속에서 25 분 동안 품어 낸다. B01을 잘 잊지 마십시오.
- 이 25 분 동안 산화제 TBHP의 작업 용액을 준비하고 현미경 및 부속품 하드웨어가 켜져 있는지 확인하십시오.
- 작업 솔루션 I 준비 : 7M 스톡 용액을 70 x 100 mM 희석하십시오 (690 μL HH 완충액 10 μL).
- 작업 솔루션 II 준비 : WS 1을 100x로 희석하십시오 (10 μL WS I, 990 μL HH 완충액).
- 작업 솔루션 III 준비 : WS III 25x를 40 μM으로 희석하십시오 (60 웰에는 7200 μL HH 버퍼에 300 μL WS II가 추가됨).
- 25 분 후, 전에 설명한대로 100 μL HH 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 모든 60 내부 웰에 HH 버퍼 100 μL를 추가합니다.
5. 기본 ROS 수준과 미토콘드리아 몰포 기능 (± 15 분)을 측정하기위한 최초의 라이브 영상
- 수집 소프트웨어가 작동하고 이미징 프로토콜이로드되었는지 확인하십시오.
- 현미경에 플레이트를 설치하고, 하드웨어 ba를 켜십시오.sed 자동 초점 시스템을 사용하고 B01을 사용하여 TMRM 채널을 사용하여 자동 초점 오프셋을 조정합니다. 이 절차는 CM - H 2 DCFDA 신호 강도의 증가를 유도하므로,이 우물은 하류 이미지 분석에서 제외됩니다.
- 이미징 프로토콜을 실행하십시오.
6. 유도 된 ROS 수준을 측정하기 위해 TBHP를 추가 한 후 2 번째 라이브 영상 (± 20 분)
- 조심스럽게 현미경에서 96 - 웰 플레이트를 제거합니다.
- 다중 채널 피펫을 사용하여 각 우물에 TBHP WS III (40 μM) 100 μL를 추가합니다 (우물에서 20 μM TBHP 농도 결과). 이 화합물은 유도 된 ROS 수준을 측정하는 수단뿐만 아니라 CM-H 2 DCFDA 염색 (신호가 상승해야 함)에 대한 내부 양성 대조군으로 사용됩니다.
참고 : H 2 O 2 는 TBHP 대신 사용할 수도 있지만이 화합물은 안정성이 낮아 안정성이 낮습니다. - TBHP w의 완전한 반응을 허용하기 위해 적어도 3 분을 기다린다.i CM-H 2 DCFDA.
- 이 시간 동안 잘 A01에 100 μL 항체 작동 용액 (1 / 1,000)을 첨가하십시오.
- 현미경에 플레이트를 다시 마운트하고 잘 B01을 사용하여 다시 초점을 확인하십시오.
- 동일한 이미징 프로토콜을 사용하여 첫 번째 이미징 라운드에서와 같은 위치를 획득하십시오.
- 수집 된 데이터 세트를 단일 폴더에서 개별 tiff 파일로 내보내고 플레이트 참조, TBH 이전 또는 이후 처리, 우물, 필드 및 채널을 밑줄로 구분하여 표준화 된 명명법을 사용하십시오. 이 정보는 이미지 분석 ( 예 : 적절한 세분화 설정 선택)과 데이터 분석 (분석 데이터 연결)에 사용됩니다.이 정보는 플레이트 1, 예비 TBHP 처리, 웰 B02, 필드 1 및 채널 1에 대한 'P01_Pre_B02_0001_C1' 올바른 치료법과 함께).
- 수집 프로토콜을 사용하여 웰 A01의 중심 주위의 4 개 위치 모두에서 두 채널에 대한 플랫 필드 이미지를 수집합니다. th를 저장하십시오.다음과 같은 표준화 된 명명법을 사용하여 다른 이미지와 동일한 폴더에서 개별 TIFF 파일로 저장하십시오 : 플레이트 1, 필드 1 및 채널 1에 대해 'P01_FF_A01_0001_C1': 신호가 동적 범위 내에 있는지 확인하십시오. 포화의 경우,보다 낮은 농도의 항체 작동 용액을 사용하십시오.
- 접시를 버리거나 추가 가공을 위해 저장하십시오.
참고 : 현미경에서 플레이트를 제거하고 멀티 채널 피펫을 사용하여 TBHP 솔루션을 추가하는 대신 자동 피펫을 현미경 스테이지에 설치하고 트리거를 수신 할 때 작동하도록 획득 소프트웨어에 연결할 수 있습니다. 이렇게하면 첫 번째 획득 직후에 모든 우물에 TBHP를 추가 한 다음 다음 우물로 이동하기 전에 TBHP를 추가 할 수 있습니다. 이 방법으로, 첫 번째 이미징 라운드가 끝나면 두 번째 이미징을 시작할 수 있으며 모든 우물은 TBHP와 동일한 잠복 시간을 갖게됩니다.
7. 이미지 처리 및 분석 (± 30 분당96- 웰 플레이트)
참고 : 모든 이미지 처리는 ImageJ 프리웨어의 패키지 버전 인 FIJI (http://fiji.sc)에서 수행됩니다. 전용 스크립트는 세포 내 ROS 및 미토콘드리아 신호의 자동화 된 분석 및 형태 학적 파라미터 (RedoxMetrics.ijm, 요청시 이용 가능)를 위해 작성되었습니다. 기본적인 알고리즘은 Sieprath et al. 1 .
- FIJI가 설치되어 작동하는지 확인하십시오.
- FIJI를 시작하고 매크로 세트 (플러그인 -> 매크로 -> 설치 ...)를 설치하십시오. 그러면 그림 3A 와 같이 분석 설정을 최적화하기위한 일련의 작업 도구뿐만 아니라 여러 가지 새로운 매크로 명령이 호출됩니다.
- 설정 인터페이스를 열어 'S'버튼 ( 그림 3B )을 클릭하여 분석 설정을 설정하십시오.
- 이미지 유형, 채널 수 및 사용 된 웰을 선택하십시오.flatfield 이미지를 얻기위한 것입니다.
- 어떤 채널에 세포 (CM-H 2 DCFDA 채널) 또는 미토콘드리아 (TMRM 채널)가 있는지 표시하고 이미지 품질에 따라 각 채널의 전처리 및 세분화 매개 변수를 조정하십시오 ( 그림 3B ). 'Background'및 'Contrast'확인란을 선택하면 배경 빼기 또는 대비가 제한된 적응 형 히스토그램 평준화 16 을 각각 수행 할 수 있습니다. 세포의 가우시안 블러 링 및 미토콘드리아의 라플라시안 강화를위한 시그마를 정의하십시오. 자동 임계 알고리즘을 선택하고 크기 제외 한도 (픽셀 단위)를 입력하십시오. 자동 임계 알고리즘 대신 고정 된 임계 값을 선택한 경우 상위 임계 값을 채 웁니다.
- 획득 한 데이터 세트의 몇 가지 선택된 이미지에 대한 세그먼테이션 설정을 열고 셀 또는 미토콘드리아 세분화를위한 메뉴에서 'C'또는 'M'버튼을 클릭하여 각각을 열고,필요한 경우 설정을 조정하십시오. 예시적인 결과가 도 3c 에 도시된다.
- '#'버튼을 클릭하고 이미지가있는 폴더를 선택하여 관심있는 폴더에서 배치 분석을 실행하십시오. 폴더 당 하나의 이미지 당 개별 ROI 세트 (zip 파일)와 결과 파일 (.txt)을 포함하는 새로운 '출력'디렉토리가 생성됩니다. 두 채널 모두 결과 파일에는 강도 및 형태 학적 설명자가 들어 있습니다. CM-H 2 DCFDA 채널 (셀) 결과 파일에는 디스크립터마다 하나의 이미지 내에서 결합 된 ROI의 평균값이 들어 있습니다. TMRM 채널의 경우, 결과 파일에는 개별적으로 분류 된 모든 미토콘드리아 ROI 값이 디스크립터별로 포함됩니다.
- 배치 분석 후 'V'버튼을 클릭하여 ROI 오버레이가있는 모든 이미지의 하이퍼 스택 인 '검증 스택'에서 세분화 성능을 시각적으로 확인하십시오. 이 방법으로,이미지에서 초점이 맞지 않는 이미지, 초점이 흐린 이미지 또는 먼지 입자 / 섬유가 이미 빠르게 발견 될 수 있습니다. 데이터 품질 관리 중에 더 많은 큐 레이션을 수행 할 수 있습니다 (§8).
8. 데이터 분석, 품질 관리 (QC) 및 시각화
원시 데이터의 처리 및 분석은 R 통계 프리웨어 (http://www.rproject.org - 버전 3.3.2) 및 RStudio (http://www.rstudio.com/ - 버전 1.0.44)를 사용하여 수행됩니다. 결과를 신속하게 얻고 시각화하기 위해 Heatmaps 및 boxplots에서 데이터를 통합하고 시각화하고 통계 분석을 수행하는 직관적 인 Shiny 응용 프로그램 17 (요청시 사용 가능)이 구상되었습니다. 일반적으로 워크 플로우는 두 개의 연속 단계로 구성됩니다. 첫째, 96- 웰 플레이트 당 데이터를 처리하고 검사하여 이상 데이터 포인트를 검출합니다. 둘째, 주어진 실험의 모든 플레이트에서 큐 레이션 된 데이터를 결합하고 비 - 파라 메트릭 멀티variate tests 18 및 주성분 분석.
- R 및 RStudio가 설치되어 작동하는지 확인하십시오.
- RStudio를 시작하십시오.
- RedoxMetrics 반짝이 응용 프로그램을 열고 응용 프로그램을 실행하십시오 (외부 브라우저에서 실행되도록 선택).
- '입력'페이지에서 RedoxMetrics.ijm의 결과 파일이있는 디렉토리를 선택하십시오.
- 단계 3.15에서 만든 'Setup.xlsx'도이 디렉토리 내에 있는지 확인하십시오.
- 결과 파일 및 설정 정보가 자동으로 가져와지고 재배치되고 시각화됩니다.
- '실험 설정'페이지는 실험 레이아웃을 보여줍니다. 확인을 위해이 페이지를 사용하십시오.
- 다음 페이지 '결과 당 플레이트'는 우물 이름과 이미지 번호로 라벨링 된 이상치가있는 상자 그림뿐만 아니라 색으로 구분 된 다중 우물 판 레이아웃에서 각 판의 데이터를 개별적으로 보여줍니다. 후자는 쉽게 검사하고 ident를 허용합니다.비정상적인 데이터 포인트 (해당 특정 치료법에 대해 측정 된 평균값과 비교하여 매우 높거나 낮은 값 - 예를 들어 그림 4 참조)의 발생.
이 정보를 사용하여 이상한 지점에 해당하는 이미지를 확인하십시오. 이상이 발견되면 분석에서 제거해야합니다. 대부분의 이상은 이미지의 일부가 초점을 벗어나거나 형광 분진 입자가 적절한 분할을 방해 할 때 부적절한 분할로 인해 발생합니다. 극단적 인 사례는 이미 검증 스택 도구 (7.5 단계)를 사용하여 신속하게 발견 할 수 있지만이 단계에서는 더 미묘한 사건이 발견됩니다. 이상 값에 대해 명백하거나 기술적 인 이유가 발견되지 않으면 이미지를 분석에서 제거하면 안됩니다. - 선택 사항 : 'Drop'이라는 하나의 열만있는 'Drop.xlsx'라는 스프레드 시트를 새로 만듭니다. 이 열에는 모든 이미지의 파일 이름 ( ".tif"확장자 포함)을 나열하십시오분석 (단계 7.5 또는 단계 8.6.2에서 식별)에서 제거해야합니다. '입력'페이지를 사용하여이 파일을 업로드하십시오.
- '결과 전체 실험'페이지는 모든 플레이트 조합 결과를 보여줍니다. 드롭 파일이 업로드되면이 파일을 사용하여 분석에서 지정된 데이터 요소를 제거합니다.
각 매개 변수에 대해 개별적으로 데이터는 해당 컨트롤에 따라 플레이트 당 표준화됩니다. 그런 다음 모든 플레이트의 데이터를 결합한 다음 nparcomp 패키지 18 의 비 매개 변수 다 변수 테스트를 수행합니다. 2 개의 치료법 만 비교하면 비모수적인 Behrens-Fisher 문제에 대한 두 가지 샘플 테스트가 수행됩니다. 2 회 이상의 치료의 경우, 비 파라 메트릭 콘트라스트 기반 다중 비교 검사가 사용됩니다. 결과는 상자 그림을 사용하여 시각화됩니다. - '클러스터 분석'페이지는 주성분 분석 (PCA-R 코어 '통계'패키지)의 결과를 보여줍니다. 5 개의 매개 변수 (ba염 및 유도 된 ROS, 미토콘드리아 막 잠재력, 크기 및 원형도)을 결합하여 민감한 산화 환원 프로파일에 따라 다른 처리법을 구별합니다. 이를 위해 PCA (Principal Component Analysis)가 수행됩니다 (R core 'stats'패키지). 결과는 biplot (ggbiplot 패키지 - http://github.com/vqv/ggbiplot)을 사용하여 시각화됩니다.
- '데이터 다운로드'페이지를 사용하여 처리 및 재 배열 된 데이터가 포함 된 백엔드 데이터 프레임을 다운로드하여 고급 데이터 시각화 또는 통계 분석에 다시 사용할 수 있습니다.
참고 : 일반적인 함정과 잠재적 인 해결책은 표 1 에 나열되어 있습니다.
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Representative Results
분석은 여러 대조 실험을 사용하여 벤치마킹되었으며, 그 결과는 Sieprath et al. 1 . 간단히 말하면, CM-H 2 DCFDA 및 TMRM의 세포 내 ROS 및 Δψ m의 외적으로 유도 된 변화에 대한 형광 응답을 각각 동적 범위를 결정하기 위해 정량화 하였다. CM-H 2 DCFDA의 경우, NHDF는 10 μM에서 160 μM 범위의 TBHP 농도로 처리했을 때 형광 신호의 선형 증가를 보였다. 마찬가지로, TMRM의 경우 NHDF 세포는 1에서 10 μg / μL 범위 내에서 증가하는 oligomycin 농도 (ΔΨ m 과민성을 유도 함)로 처리했을 때 미토콘드리아 형광의 선형 증가를 나타냈다. 반대로 ΔΨ m 탈분극을 유도하는 항생제 인 발리 노마 이신 (valinomycin)의 실시간 첨가는 점차적으로 정량화되었다TMRM 형광의 가능한 감소 .
이 분석법은 세포 유형이나 치료법 1 , 15 사이의 산화 환원 상태 차이를 밝혀 내기 위해 다양한 실험에도 사용되었습니다. 이것을 설명하기 위해 NHDF를 HIV 프로테아제 억제제 인 Saquinavir (SQV)로 치료 한 결과가 표시됩니다 ( 그림 5 ). 서술 된 프로토콜을 사용하여, DMSO로 처리 된 대조군 세포와 비교하여 기저 및 유도 된 ROS 수준 모두에서 유의 한 증가가 검출되었다 ( 도 5B ). SQV 치료는 또한 미토콘드리아 형태 기능에 상당한 영향을 미쳤다. 형태 론적으로, 미토콘드리아는 고도로 단편화 된 패턴을 얻었으며, 이것은 또한보다 높은 원형도 및 개별 미토콘드리아의보다 작은 평균 크기에 의해 확인되었다. 기능적으로 Δψ m 은 미토크 당 평균 TMRM 신호로 측정됩니다.ondrial 픽셀도 크게 증가했다 ( 그림 5A ). 위에서 설명한 5 가지 매개 변수의 데이터를 결합 할 때 주성분 분석을 통해 두 가지 조건 (대조 및 SQV)을 명확하게 구분할 수 있습니다. 3 개의 독립적 인 생물학적 복제물의 데이터는 전체 2 차 분산의 81.4 %를 설명하는 처음 두 가지 주요 구성 요소를 표시하는 2D biplot으로 표시됩니다 ( 그림 5C ). 이것은 분석의 견고성을 증명하고 결합 된 판독 값이 세포 건강 상태의 민감한 지표로 작용할 수 있음을 시사합니다.
그림 1 : 세포 내 기저 및 유도 된 ROS 수준과 미토콘드리아 몰포 기능의 동시 측정을위한 하이 컨텐트 이미징 분석의 일반 개요. ( A ) S주요 운영 블록의 화학적 표현. ( B ) 일러스트 예제 : 세포는 여러 개의 동일한 96 - 웰 플레이트에 심어 져 있습니다. 표준 웰 플레이트 레이아웃은 도 2a에보다 상세히 도시되어있다. 염색 후, 각 우물의 중심 주위에 채널 당 4 개의 이미지가 획득되며, TBHP 전후의 처리가 삽입물이있는 큰 몽타주로 설명됩니다. 이미지 분석 후 웰 플레이트 레이아웃에 투사 된 직관적 인 히트 맵을 사용하여 강도 결과를 시각화합니다. 이를 통해 플레이트 효과 또는 이상한 우물을 신속하게 검출 할 수 있습니다. 완전한 실험 데이터 세트의 큐 레이션 (curation) 후에, 최종 데이터 분석이 수행되어 단일 및 다중 매개 변수 출력을 얻습니다. (이 수치는 Springer의 허락하에 참조 1 에서 수정되었습니다.) 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의 n.
그림 2 : 전형적인 실험적인 96-well 레이아웃과 상응하는 'Setup'파일. ( A ) 4 가지 조건이 플레이트의 내부 60 개 웰에 균일하게 분포되어 있습니다. 잘 B01은 또한 셀을 포함하지만 이미징 이전에 초기 PFS 오프셋을 조정하는 데만 사용됩니다. 다른 외부 우물은 세포 배양 동안 기울기 (온도, 습도 등 )를 최소화하기 위해 배지로만 채워집니다. 이미지 수집은 우물 B02에서 B11로, 다시 오른쪽에서 왼쪽으로, 우물 C11에서 C02로, 그리고 왼쪽에서 오른쪽으로 미로 방식으로 수행됩니다. 이미지 획득 플랫 필드 이미지가 웰 A01에서 수집 된 후 이미지 A 및 B에서 공간 조명 이질성을 보정하는 데 사용됩니다. 분석. ( B ) 해당 설치 파일 (Setup.xlsx)은 실험 레이아웃에 대한 정보가 들어있는 스프레드 시트입니다. 그것은 멀티 웰 플레이트의 각 처리 위치와 각 컨트롤을 지정합니다. 각 행은 우물을 나타냅니다. 각 처리에는 데이터 분석 중 생성 된 플롯의 X 축에서 처리 순서를 지정하는 데 사용되는 고유 한 처리 번호가 있습니다. 'Control'열에는 동일한 행에 지정된 치료 데이터를 표준화하기위한 컨트롤로 사용해야하는 치료가 포함됩니다. 이 예에서 치료 1은 다른 모든 치료에서 나온 데이터를 표준화하기위한 제어로 사용되는 치료입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3 : RedoxMetrics 매크로 집합, 레이아웃 및 설치 인터페이스 ( A ) FIJI 용 RedoxMetrics 매크로 세트가 설치되면 분석 설정을 테스트하고 최적화하기위한 일련의 조치 도구뿐만 아니라 많은 새 매크로 명령이 메뉴 표시 줄에 작성됩니다. 'S'는 설치 인터페이스를 호출합니다. 'F'는 열려있는 이미지에 대해 근거리 교정을 수행합니다. 'C'와 'M'은 설정에서 선택한 분석 설정을 사용하여 하나의 열린 이미지에서 세포 영역 (Cell, CM-H2DCFDA 채널)과 미토콘드리아 영역 ( "Mito", TMRM 채널)에 대한 테스트 세분화를 각각 수행합니다 인터페이스를 사용하여 분할 된 관심 영역 (ROI)의 오버레이를 반환합니다. '#'은 설치 인터페이스에 지정된 설정을 사용하여 이미지 폴더에서 일괄 처리 분석을 수행합니다 (대개 하나 또는 몇 개의 이미지를 확인한 후). 'V'는 검증 하이퍼 스택을 생성합니다.g 배치 분석의 출력 데이터. 이 하이퍼 스택은 폴더에있는 모든 원본 이미지와 해당 관심 영역 (두 번째 채널에서 그려 짐)의 합성 이미지입니다. 'O'를 클릭하면 분할 된 영역의 오버레이를 표시하거나 숨길 수 있습니다. ( B ) 설치 인터페이스. 여기에는 이미지 유형 (확장), 채널 수 (파장) 및 평지 교정에 사용 된 웰과 같은 일반 정보를 포함하여 모든 분석 설정이 선택됩니다. 다음으로 이미지 내용 유형 (셀 또는 Mito)에 특정한 설정이 있습니다. 두 경우 모두 백그라운드 보정 ( "배경") 및 로컬 대비 향상 ( "대비")을 포함하는 옵션 (확인란)이 있습니다. 셀 세분화를 위해 노이즈를 줄이기 위해 Gaussian blur radius (σ)를 정의하는 옵션이 있습니다. 미토 세분화를 위해 미토콘드리아의 선택적 증진을위한 라플라시안 연산자의 반경을 정의하는 옵션이 있습니다. 후속 세그먼트 화는 p입니다.콘텐츠 유형별로 정의 할 수있는 자동 또는 고정 임계 값 방법을 사용합니다. 고정 된 임계 값을 선택하면 상위 임계 값을 수동으로 제공 할 수 있습니다. 마지막으로, 분석은 최소 및 최대 크기 내에 속하는 객체의 선택으로 제한 될 수 있습니다. ( C ) "C"(위) 또는 "M"(아래) 명령으로 실행되는 세분화 결과의 예제. 회색으로 표시된 원시 이미지가 노란색 관심 영역과 겹쳐서 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 중급 데이터 시각화의 예. ( A ) 웰 B02 및 D07이 나타나는 멀티 웰 플레이트 시각화의심 많은. ( B ) 동일한 데이터를 나타내는 Boxplot. 이상치 및 이미지 이름으로 라벨링 된 특이점. F03_0003과 함께 B02 및 D07의 이미지가 이상치로 다시 나타납니다. ( C ) 이러한 이미지를 육안으로 검사하면 세분화 오류 (빨간색 'X'로 표시)가 있기 때문에 B02_0000 및 D07_0001을 이후 분석에서 제거해야 함을 알 수 있습니다. F03_0003은 명백한 분할 또는 기술적 오류가 없기 때문에 보관해야합니다. (기술적 이유가 수차에 대해 발견되지 않으면 데이터를 제거해서는 안됨). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 일차 인간 섬유에 대한 Saquinavir (SQV; 20 μM)의 효과oblasts (대조구는 DMSO 임). ( A ) TMRM ( B )에 의해 측정 된 미토콘드리아 막 전위 (ΔΨ m ) 및 미토콘드리아 형태 (개별 미토콘드리아의 원형도 및 평균 크기) CMR 2 DCFDA에 의해 측정 된 세포 내 ROS의 기초 수준 증가 및 유도 된 ROS에 대한 반응 20μM TBHP 첨가 후 강도의 상대 이득으로 나타냈다. (기본 및 유도 된 ROS 수준, 평균 미토콘드리아 크기, 원형도 및 ΔΨ m )에 대한 PCA 분석으로부터의 ( C ) 2D 산점도. 검은 색 화살표는 주요 구성 요소에 대한 원래의 5 가지 변수의 방향을 나타냅니다. (독립적 인 복제물은 다른 색상으로 그려져 있으며, 모든 데이터는 DMSO- 대조군에 대해 표준화되었다; * = p 값 <0.05; ** = p 값 <0.01; *** = p 값 <0.001; Y -차이가 최적으로 표시되도록 축을 조정했습니다. 이 수치는 Springer의 허가하에 참고 문헌 1 에서 수정되었습니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 문제 | 잠재적 인 이유 | 가능한 해결책 |
| 이미징하는 동안 우물에 너무 적은 세포 | 시드 된 세포가 너무 적습니다. | 이미징 24 시간 전에 세포를 더 시드하십시오. |
| 불쌍한 세포 성장 | 확인 문화 조건 (매체, 온도 안정성, 이산화탄소 제어) | |
| 너무 폭력적인 세척 단계 | 피하 세포를 멀리 피펫 부드럽게 | |
| 이미징하는 동안 우물에 너무 많은 세포가 있음 | 너무많은 세포가 뿌려졌다. | 이미징 24 시간 전에 씨앗이 적은 세포 |
| 자극에 대한 CM-H 2 DCFDA 형광의 약한 신호 또는 비선형 응답 | 너무 낮거나 높은 염료 농도를 사용함 | NHDF 세포 이외의 것을 사용하는 경우 최적의 부하 농도는 경험적으로 결정되어야합니다 |
| 염료 적재가 불충분하다. | 0.02 % w / v의 계면 활성제 Pluronic-127을 로딩 용액에 첨가하여 흡수를 증가시킵니다. | |
| CM-H 2 DCFDA 신호는 노출 시간 동안 시각적으로 증가합니다. | 너무 높은 염료 농도 | 염료 농도 감소 |
| 여기 강도가 너무 높음 | ND 필터를 사용하거나 노출 시간을 줄여서 여기 강도를 줄입니다. | |
| 웰 플레이트 획득 동안 CM-H 2 DCFDA 강도가 감소 함. | CM-H 2 DCFDA가 새어 나온다.세포. | 2 mM Probenicid (음이온 펌프 억제제)를 사용하십시오. 로딩 솔루션뿐만 아니라 이미징 버퍼를 추가하여 누출을 줄입니다. |
| TBHP 첨가 후 CM-H 2 DCFDA 신호 강도의 증가는 없다 | TBHP가 활성화되지 않았습니다. | 신선한 TBHP를 사용하십시오 |
| CM-H 2 DCFDA가 셀에서 새어 나옵니다. | 위에서 설명한대로 Probenicid를 사용하십시오. | |
| (일부) 획득 된 이미지는 초점이 맞지 않는 것처럼 보인 반면, 초점이 선택된 경우 확인 된 것처럼 보입니다. | 플레이트가 기울어 져 장착되어 초점이 PFS 오프셋을 초과하여 확장됩니다. | 플레이트와 스테이지 레벨의 장착 상태를 확인하고, 플레이트의 위치를 변경하십시오 |
| 판의 바닥에 먼지 나 불규칙성이 있습니다. | 에탄올로 젖은 렌즈 종이로 판의 바닥을 청소하십시오 | |
| 이미징하는 동안 세포가 죽는다. | 자극 강도를 줄이거 나 우물 당 이미지 수를 줄입니다. | |
| 잘못된 이미징 버퍼 구성 | 리메이크 이미징 버퍼 | |
| 이미지에 초점이 흐린 형광 점이 있습니다. | 분리 된 셀의 초점이 흐려짐 | 로딩 프로토콜 동안 더 부드럽게 씻으십시오. |
| 하나 이상의 기둥은 플레이트의 다른 기둥보다 더 낮은 강도를 가지고있다. | 다 채널 피펫의 하나 이상의 팁이 단단히 부착되지 않았으므로 리포터가이 웰에 추가되지 않았습니다. | 다 채널 피펫을 사용할 때마다 모든 팁이 완벽하게 채워 졌는지 철저히 확인하십시오. |
| 이미지 획득 중에 포커스가 극적으로 바뀝니다. | 플레이트의 폴리스티렌 바닥은 오일 렌즈를 사용할 때 침지 오일과 반응 할 수 있습니다 | 마른 렌즈를 사용하거나 gla가있는 멀티 웰 플레이트를 사용하십시오.밑바닥 |
| TMRM 신호 강도는 첫 번째 웰과 마지막 웰의 이미징 사이에서 증가합니다 | 리포터 로딩 시간이 충분하지 않아 TMRM은 여전히 평형 상태입니다. | 리포터 로딩 시간 증가 |
| TBHP 처리 후의 CM-H 2 DCFDA 신호는 웰 판의 획득 중에 증가한다 | TBHP 처리와 두 번째 이미징 라운드의 시작 사이의 시간이 충분하지 않아서 TBHP는 여전히 CM-H 2 DCFDA를 산화시키고있다. | TBHP 치료와 두 번째 이미징 사이의 배양 시간을 늘립니다. (최소 3 분부터 시작) |
| 플랫 필드 이미지가 포화 상태입니다. | 항체 작동 해결책은 집중시키기위한 것이다 | 낮은 농도의 항체 작동 용액을 사용하십시오. |
| 획득 설정이 최적화되지 않았습니다 (노출 시간이 높음, ND 필터가 낮음, ...). | 수집 설정 최적화,신호는 센서의 동적 범위에 있어야합니다. | |
| 플랫 필드 이미지가 어둡다. | 항체 작동 해결책은 희석하기위한 것이다 | 더 높은 농도의 항체 작동 용액을 사용하십시오. |
| 획득 설정이 최적화되지 않았습니다 (노출 시간이 높음, ND 필터가 낮음, ...). | 수집 설정 최적화, 신호는 센서의 동적 범위에 있어야합니다. | |
| 오버 / 언더 세그멘테이션 인공물 | 임계 값이 올바르게 설정되지 않았습니다. | 임계 값 설정 조정 |
| 크기 필터가 제대로 조정되지 않았습니다. | 이미지 분석을위한 최소 및 최대 크기 기준 조정 | |
| 세포의 confluency가 너무 높다. | 올바른 수준의 confluency는 신뢰할 수있는 이미지 분석에 매우 중요합니다. NHDF보다 다른 세포 유형의 경우 최적의 접종 밀도는 경험적으로 결정되어야합니다 | |
| 반짝이는 응용 프로그램이 작동하지 않습니다. | 잘못된 디렉토리가 선택되었습니다. | 입력 페이지에서 올바른 디렉토리를 선택하십시오. |
| 디렉토리에 파일이 없습니다. | 필요한 모든 파일 (imagej 매크로 및 설정 파일의 출력)이 선택한 디렉토리에 있는지 확인하십시오. | |
| 누락 된 패키지 | 일반적으로 앱은 필요한 모든 패키지를 확인하고 설치하지만 실패 할 경우 devtools, ggbiplot, pacman, ggplot2, plyr, nparcomp, data.table, readxl, gplots, ggbiplot, shiny, shinyFiles, pbapply 패키지를 수동으로 확인합니다. 모든 의존성을 포함한 shinyjs. |
표 1 : 일반적인 함정과 잠재적 해결책.
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Discussion
이 논문은 NHDF에서 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 morphofunction의 동시 정량화를위한 고 함량 현미경 검사법을 설명합니다. 그 성능은 SQV가 처리 된 NHDF에 대한 사례 연구를 통해 입증되었습니다. 그 결과는 별도의 실험 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 에도 불구하고 1 형 HIV 프로테아제 억제제로 치료 한 후에 증가 된 ROS 수치 또는 미토콘드리아 기능 장애가 관찰 된 문헌의 초기 증거를 뒷받침한다. 중요한 차이점은 묘사 된 분석법이 형태 학적 데이터와 함께 동일한 살아있는 세포에서 이러한 매개 변수를 동시에 측정 할 수 있다는 것입니다. 이 접근법의 가장 큰 장점은 공간과 공간에서 두 요인을 모호하지 않게 결정한다는 것입니다인과 관계를 정확하게 지적 할 수있는 특정 섭동에 대한 민감한 산화 환원 프로파일을 생성 할 수있는 주성분 분석이 수행됩니다. 그러나 추출 된 데이터에 고급 데이터 마이닝 기술 및 (감독 된) 클러스터링 알고리즘을 사용하여 예측 산화 환원 프로파일 링을 사용할 수도 있습니다. 이것은 디지털 병리학의 진단 또는 예후 분류 도구뿐만 아니라 치료 표적에 대한 스크리닝에서 중요한 기능입니다. 예를 들어 강력한 분류 모델이 만들어지면 작은 분자 라이브러리를 스크리닝하여 산화 스트레스에 대응하는 치료 후보 물질을 찾을 수 있습니다. 인간 미토콘드리아 장애 치료법 개발에서 유망한 선도적 인 연구 26 .
이 분석법은 NHDF에 대해 고안되었지만 다른 접착 세포 유형에도 적용 할 수 있습니다. 이것은 염색 프로토콜과 리포터 염료 농도의 최적화가 필요합니다. r의 양 과부하가 급냉으로 인한 비선형 효과를 유발하거나 심지어 세포 독성을 나타낼 수 있기 때문에 eporter 염료를 최소화해야합니다 27 . 생체 학적 방법으로 그러한 세포를 장착하고 관찰하는 것이 어려워서 현탁 세포에 대한 분석의 확장이 덜 명백하다. 그들은 coverslip에 cytospun 수 있거나 유착을 유도하기 위해 무 혈청 배지에서 배양되었지만이 두 과정 모두 생리적 조건을 방해합니다 28 , 29 . 그러나 이러한 한계는 생존력을 유지하면서 작은 미세 웰에 개별 세포 (부착 성 또는 비 부착 성)를 갇히게하는 미세 패턴의 세포 배양기 지지체를 사용하거나 이미징 중 세포를 잡아 두는 열 가역성 하이드로 겔의 사용으로 극복 될 수 있습니다 31 . 이 방법은 이미 세포막 전위 또는 개별 현탁액 세포 산소의 고 함량 스크리닝에 사용되어왔다= "xref"> 32 , 33 또는 살아있는 운동성 기생충에서 세포 내 마커의 영상 31 . 이러한 세포에서 미토콘드리아 네트워크의 형태 학적 분석은 회전 공 촛점 또는 Bessel 빔 광 시트 현미경과 같은 신속한 3D 획득 기능을 필요로하기 때문에 이미징 양식에도 적용해야한다 34 , 35 형태소 파라미터를 계산하면서 Z- 차원을 포함하는 파이프 라인
분석은 96- 웰 플레이트에 대해 최적화되었지만, 예 를 들어 384- 웰 플레이트에 대한 추가 업 스케일링이 분명히 가능하다. 주요 제한 요인은 플레이트 획득 시간, 즉 모든 웰의 이미지를 획득하는 데 걸리는 시간입니다. 형광 신호는이 시간 동안 안정을 유지해야하기 때문에 측정 신호를 자신과 비교할 수 있습니다.개인 우물. 그러나 얼룩이 일시적이며 조사중인 과정이 역동적이기 때문에 이것은 도전 과제입니다. 따라서, 복제 된 실험 세트에서 형광 신호를 측정하였고, 이는 CM-H 2 DCFDA 및 TMRM 신호 모두가 염색 후 7 내지 50 분 동안 안정한 상태를 유지함을 나타냈다 (변동 계수 <2 %). 이것은 대략 40 분의 창을 준다. 96- 웰 플레이트는 전형적으로 약 10 분이 걸린다. 따라서, 384-well plate에 대한 외삽 법은 안정된 시간 슬롯 내에서 획득 기간을 유지할 것이다. 이미지 당 평균 50 개의 세포 (20X 목적 및 NHDF 세포의 사용을 기준으로 함)를 사용하면 시간당 약 30,000 개의 세포에 대한 데이터가 얻어지며 분석의 통계 능력이 크게 향상됩니다. 형광 신호 안정성에 영향을 미치는 또 다른 요소는 온도입니다. CM-H 2 DCFDA (즉, 세포 내 소포에서의 염료 축적)의 공극을 피하기 위해 헤테로유전자 염색 및 비선형 효과가있는 경우 37 ° C가 아닌 실온에서 항온 처리가 이루어집니다. 안정성 이외에도 살아있는 세포가 형광 여기 광에 노출되면 ROS 생성이 유도된다는 점에 유의해야합니다. 이는 노출 조건 (노출 시간 및 여기 광 세기)이 절대 최소로 유지되어야 함을 의미합니다. 또한 실제 이미지를 얻을 때만 모든 우물을 노출해야 함을 의미합니다. 이는 소프트웨어 사용 자동 초점 방법의 사용을 배제하고 하드웨어 기반 자동 초점 시스템의 사용을 보증합니다.
설명 된 방법의 장점은 일반적인 문자입니다. 사실상 스펙트럼 호환 가능한 형광 기자의 모든 조합을 사용할 수 있습니다. 이것은 살아있는 세포 당 미토콘드리아 ROS를 측정하기 위해 Calcein / MitoSOX 조합을 사용하여 입증되었습니다. 또한 응용 프로그램은 int egrated ROS / 미토콘드리아 측정. 이 분석법은 post hoc 면역 염색법 (두 번째 이미징 라운드 이후)으로 연장 할 수도 있습니다. 정확한 이미징 위치가 저장되기 때문에 산화 환원 분석은 동일한 세포 내에서 위치 proteomics와 직접적으로 연관 될 수 있습니다. 이것은 크게 산화 환원 생물학 또는 형광 강도를 평가하기 위해 자주 사용되는 다른 방법과는 완전히 다른 분자 판독 값을 증가시킵니다. 예를 들어, 형광 측정법 (microplate reader)은 상대적으로 저렴한 비용 (기본 설정은 4000 유로 정도)과 얕은 학습 곡선으로 인해 널리 사용되지만 블랙 박스이기 때문에 변형과 같은 교섭 요인이 더 많이 발생합니다 세포 밀도 또는 백그라운드 (자동) 형광, 예 : 오염 먼지 입자. 또한 플레이트 판독기는 형태 학적 매개 변수 추출을 허용하지 않으며 단일 셀을 측정 할 수 없으며 동적 또는 과도 신호를 측정하기 위해 덜 민감하고 신뢰할 수 있습니다lass = "xref"> 36 , 37 . 유동 세포 계측법은 단일 세포를 측정 할 수있는 능력을 가지고 있으며 속도의 이점을 가지고 있습니다. 실제로, 384-well plate는 다중 marker 38 에 대해 높은 감도로 최소 12 분 안에 screening 될 수있다. 이것은 와이드 필드 현미경으로 가능한 것보다 훨씬 빠릅니다. 그러나 여전히 시공간 정보가 제공되지 않고 ( 즉, 세포 내 지방화, 형태 학적 데이터 및 / 또는 시간 의존 동역학), 치료 도중 또는 후에 (즉, 플럭스) 동일한 세포를 다시 방문 할 수 없습니다. 또한, 세포가 정지 세포에 있어야 유동 세포 계측법은 접착 세포의 생리학을 연구하기에 적합하지 않습니다. 다른 방법과 비교하여 고 함량 현미경 검사법의 주요 단점은 대형 이미지 데이터 저장, 강력한 처리 능력 및 복잡한 이미지 분석이 필요하다는 것입니다. 제시된 분석법은 영상 획득 과정을 표준화하고 분석기를 합리화합니다따라서이 처리 시간을 최소화하고 사용 편의성을 높이며 분석 결과를보다 쉽게 이용할 수 있습니다.
결론적으로, CM-H 2 DCFDA 및 TMRM의 사용과 관련하여 설명 된 산화 환원 프로파일 링 방법은 견고하고 민감하며 신뢰할 수 있습니다. 다중 매개 변수 및 양적 특성으로 인해 다른 형광 기반 방법보다 우수합니다. 이 방법은 산화 환원 항상성이 교란되는 다양한 병리학을보다 잘 이해하는 데 중요한 미토콘드리아 기능과 세포 내 ROS 신호 전달 사이의 관계를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 그 일반적인 특성 때문에, 분석은 원래의 범위를 훨씬 벗어나는 적용을 허용합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 금전적 이해 관계 나 다른 이해 상충이 없다고 말합니다. 또한 저자는 모든 저자가 모든 이해 상충을 공개하도록 요청 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
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