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Biology

Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido

Published: May 14, 2017 doi: 10.3791/55449
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Laboratory of Cell Biology and Histology, Department of Veterinary Sciences, University of Antwerp, 2Cell Systems and Imaging Research Group (CSI), Department of Molecular Biotechnology, Ghent University, 3Department of Biochemistry , Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center

Summary

Este trabajo presenta un flujo de trabajo de microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles de ROS intracelular, así como el potencial de membrana mitocondrial y la morfología -conocidas conjuntamente como morfofonción mitocondrial- en células adherentes vivas utilizando las moléculas reportero fluorescentes permeantes a las células 5- 6) - clorometil - 2 ', 7' - diclorodihidrofluoresceína, éster acetilico (CM - H _ { 2 } DCFDA) y éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM).

Abstract

Las especies de oxígeno reactivo (ROS) regulan los procesos celulares esenciales incluyendo la expresión génica, la migración, la diferenciación y la proliferación. Sin embargo, los niveles excesivos de ROS inducen un estado de estrés oxidativo, que se acompaña de daño oxidativo irreversible al ADN, lípidos y proteínas. Por lo tanto, la cuantificación de ROS proporciona un proxy directo para la condición de salud celular. Dado que las mitocondrias están entre las principales fuentes celulares y objetivos de ROS, el análisis conjunto de la función mitocondrial y la producción de ROS en las mismas células es crucial para comprender mejor la interconexión en condiciones fisiopatológicas. Por lo tanto, se desarrolló una estrategia basada en la microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles intracelulares de ROS, el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ m ) y la morfología mitocondrial. Se basa en microscopía de fluorescencia de campo ancho automatizada y análisis de imágenes de células adherentes vivas, crecidas en placas de pocillos múltiples, y staineD con las moléculas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) y TMRM (ΔΨm y morfología mitocondrial) permeables a las células. En contraste con la fluorimetría o la citometría de flujo, esta estrategia permite cuantificar los parámetros subcelulares a nivel de la célula individual con alta resolución espacio-temporal, tanto antes como después de la estimulación experimental. Es importante destacar que la naturaleza basada en imágenes del método permite extraer parámetros morfológicos además de intensidades de señal. El conjunto combinado de características se utiliza para el análisis exploratorio y estadístico de datos multivariados para detectar diferencias entre subpoblaciones, tipos de células y / o tratamientos. Aquí, se proporciona una descripción detallada del ensayo, junto con un ejemplo de experimento que demuestra su potencial para la discriminación inequívoca entre los estados celulares después de la perturbación química.

Introduction

La concentración de ROS intracelular se regula meticulosamente a través de una interacción dinámica entre la producción de ROS y ROS sistemas de desactivación. El desequilibrio entre los dos provoca un estado de estrés oxidativo. Entre las principales fuentes de ROS están las mitocondrias 1 . Dado su papel en la respiración celular, son responsables de la mayor parte de las moléculas de superóxido intracelular (O 2 • - ) 2 . Esto se debe principalmente a la fuga de electrones a O 2 en el complejo 1 de la cadena de transporte de electrones bajo condiciones de fuerte potencial negativo interno de membrana mitocondrial (Δψ m ), es decir , hiperpolarización mitocondrial. Por otra parte, la despolarización mitocondrial también se ha correlacionado con una mayor producción de ROS apuntando a múltiples modos de acción 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Además, a través de modificaciones redox en las proteínas de la fisión-fusión maquinaria, ROS co-regular la morfología mitocondrial 9. Por ejemplo, la fragmentación se correlaciona con el aumento de la producción de ROS y apoptosis [ 10 , 11] , mientras que las mitocondrias filamentosas se han vinculado a la inanición de nutrientes y protección contra Mitófago 12 . Dada la intrincada relación entre el ROS celular y la morfofunción mitocondrial, ambos deberían idealmente ser cuantificados simultáneamente en células vivas. Para ello, se desarrolló un ensayo de imagen de alto contenido basado en microscopía automatizada de campo ancho y análisis de imágenes de cultivos celulares adherentes teñidos con las sondas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) y TMRM (mitocondrial Δψ m y morfología). Imágenes de alto contenido se refiere a la extracción de spAtiotemporally rico ( es decir , un gran número de características descriptivas) información sobre fenotipos celulares utilizando múltiples marcadores complementarios y análisis de imagen automatizada. Cuando se combinan con microscopía automatizada, muchas muestras pueden ser examinadas en paralelo ( es decir, de alto rendimiento), aumentando así el poder estadístico del ensayo. De hecho, un activo principal del protocolo es que permite la cuantificación simultánea de múltiples parámetros en la misma célula, y esto para un gran número de células y condiciones.

El protocolo se divide en 8 partes (descritas en detalle en el siguiente protocolo): 1) siembra de células en una placa de 96 pocillos; 2) Preparación de soluciones madre, soluciones de trabajo y tampón de formación de imágenes; 3) Montaje del microscopio; 4) Carga de las células con DCFDA CM-H 2 y TMRM; 5) Primer ciclo de imágenes en vivo para medir los niveles basales de ROS y la morfofunción mitocondrial; 6) Segunda ronda de imágenes en vivo después de la adición de terc -butilPeróxido (TBHP) para medir los niveles de ROS inducidos; 7) Análisis automatizado de imágenes; 8) Análisis de Datos, Control de Calidad y Visualización.

El ensayo se desarrolló originalmente para fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Dado que estas células son grandes y planos, que son muy adecuados para la evaluación de la morfología mitocondrial en 2D imágenes widefield [ 13 , 14] . Sin embargo, con modificaciones menores, este método es aplicable a otros tipos de células adherentes. Por otra parte, junto a la combinación de CM-H 2 DCFDA y TMRM, el flujo de trabajo cumple con una variedad de pares de tintes fluorescentes con diferentes especificidades moleculares [ 1 , 15] .

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Protocol

El protocolo siguiente se describe como realizado para células NHDF y con el uso de las placas de pocillos múltiples especificadas en el archivo de materiales. Consulte la Figura 1 para obtener una descripción general del flujo de trabajo.

1. Preparación de reactivos

  1. Preparar el medio completo suplementando el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% v / v de suero bovino fetal (FBS) y 100 UI / ml de penicilina y 100 UI / mL de estreptomicina (PS). Para 500 ml de medio completo, añadir 50 ml de FBS y 5 ml de PS a 445 ml de DMEM.
  2. Preparar HBSS-HEPES (HH) buffer de imagen mediante el complemento Hank's Balanced Salt Solution (con magnesio y calcio, pero sin rojo fenol) con 20 mM HEPES. Para 500 ml de HH, añadir 10 ml de solución madre de HEPES 1M a 490 ml de HBSS. Verificar el pH y, si es necesario, ajustar a pH 7,2.
  3. Preparar 1 mM CM-H 2 DCFDA solución madre mediante la disolución de 50 μ g de CM-H 2 DCFDA polvo liofilizado en 86,5 &# 181; L DMSO anhidro. Mezclar en vórtex o pipetear hacia arriba y hacia abajo y preparar alícuotas de 20 μL en tubos marrones de microcentrífuga. Almacenar en la oscuridad a -20 ° C y utilizar en 1 semana. Si se almacena bajo atmósfera de N 2, la vida útil se puede aumentar hasta al menos 1 mes.
    1. Preparar solución madre TMRM 1 mM disolviendo 25 mg de TMRM en polvo en 50 ml de DMSO anhidro. Mezclar vorticialmente o pipetear hacia arriba y hacia abajo y preparar alícuotas de 10 μL en tubos marrones de microcentrífuga. Almacenar en la oscuridad a -20 ° C. Esta solución es estable durante al menos un año.
  4. Preparar una alícuota fresca de stock de peróxido de tert-butilo (TBHP) (~ 7 M) para cada experimento pipeteando directamente un volumen a partir de la solución madre al 70% (placa de 10 μl / 96 pocillos). Mantenga esta alícuota a 4 ° C hasta su uso posterior.
  5. Preparar la solución de trabajo de anticuerpos (AB) diluyendo dos anticuerpos secundarios (Alexa Fluor 488 burro anti-conejo y CY3 burro anti-conejo) 1.000 veces en 1x HH-buFfer

2. Configuración del Microscopio y Protocolo de Adquisición (± 15 min)

NOTA: La adquisición de la imagen se realiza con un microscopio de campo amplio equipado con una etapa automática y obturadores, y un sistema de autofoco basado en hardware usando un objetivo 20X aire Plan-corrigido (NA = 0.75) y una cámara EM-CCD. Cuando se configura el ensayo por primera vez, se usa una placa de ensayo que contiene células de control, teñidas de acuerdo con las instrucciones del protocolo, para calibrar la etapa XY y optimizar los ajustes de adquisición. Si ya se han determinado los ajustes de adquisición, la calibración puede realizarse con una placa vacía.

  1. Baje el objetivo al nivel base absoluto y calibre la etapa XY siguiendo las instrucciones del software.
  2. Asegúrese de que los cubos de filtro correctos estén instalados. Para visualizar CM-H 2 DCFDA, utilice un cubo de filtro GFP estándar con un filtro de paso de excitación de 472/30 nm, un cutoff dichro de 495 nmIc y un filtro de emisión de paso de banda 520/35 nm. Para TMRM, utilice un cubo de filtro para TRITC con un filtro de excitación de paso de banda de 540/25 nm, un espejo dicroico de corte de 565 nm y un filtro de emisión de paso de banda de 605/55 nm.
  3. Cree un protocolo de imagen utilizando el software de adquisición.
    1. Seleccione el tipo correcto de placa de pozo múltiple (fabricante y código) de la lista de placas disponibles en el software. Alternativamente, defina su propio formato de placa multihaz usando las dimensiones de placa y pozo.
    2. Alinee la placa del pozo de acuerdo con las instrucciones del software, p . Ej. Definiendo dos esquinas de los cuatro pozos de las esquinas exteriores. Este paso cubre la variación de la orientación de la cámara.
    3. Seleccione los pozos que necesitan ser adquiridos. Si esta opción no está disponible en el software, utilice un conjunto de ubicaciones XY definidas manualmente que correspondan a los pozos seleccionados.
    4. Optimice los ajustes de adquisición (tiempo de exposición, intensidad de la lámpara, ganancia EM) paraDos canales por separado usando la placa de prueba. Minimizar la exposición y la intensidad ya que la propia luz de excitación de fluorescencia induce ROS. Pero, asegúrese de que la relación de señal a fondo es de al menos 2 para DCFDA CM-H 2 basal y 3 para TMRM antes del tratamiento TBHP, y que no hay saturación después del tratamiento con TBHP. Los ajustes de adquisición dependen en gran medida de la configuración de la microscopía y del tipo de célula utilizada, pero como referencia, los ajustes indicativos cuando se usa una bombilla de haluro metálico de 130 W como fuente de luz y células NHDF teñidas de acuerdo con las instrucciones del protocolo son los siguientes: H 2 DCFDA y TMRM se utilizan un tiempo de exposición de 200 ms y un filtro ND 8, combinados con una ganancia EM de 15 (13 MHz; 14 bits) y 4 (27 MHz; 14 bits), respectivamente. Una vez optimizado para una cierta configuración y tipo de célula, este paso se puede omitir.
      NOTA: es esencial que los ajustes de adquisición se mantengan igual durante todo el proceso de formación de imágenes. Para los experimentos a gran escala, de varios dControl de calidad regular.
    5. Definir un protocolo de adquisición, consistente en una adquisición secuencial lambda (longitud de onda). Seleccione primero el canal DCFDA CM-H 2 que se va a adquirir, para minimizar la exposición a la luz antes de la medición.
    6. Definir un bucle de placa de pozo, para adquirir 4 imágenes no superpuestas regularmente espaciadas, situadas alrededor del centro de cada pozo de la selección de pozos usando el protocolo de adquisición definido en 2.3.4. Elija la adquisición de la imagen en meandros, es decir, primero de izquierda a derecha, desde el pozo B02 a B11, luego hacia atrás, de derecha a izquierda, desde el pozo C11 hasta C02 y así sucesivamente ( Figura 2A ). Esto ahorra tiempo comparado con la adquisición de imágenes de izquierda a derecha. Si esta opción no está disponible en el software, ajuste el conjunto personalizado de ubicaciones XY creado en 2.3.3 para asumir este patrón de generación de imágenes.
    7. Guardar las coordenadas XY de las posiciones de imagen ( por ejemplo, en un archivo xml separado), para permitir una revisión fácilNg en caso de recalibración del microscopio. Esto es especialmente importante si la lectura de este ensayo tiene que estar correlacionada con una tinción de inmunofluorescencia (IF) post-hoc para las mismas células.

3 . Sembrado de células en una placa de 96 pocillos (45 - 90 min, dependiendo del número de diferentes líneas celulares)

  1. Trabajar en un entorno estéril, como un gabinete de bioseguridad clase 2 y usar guantes.
  2. Descontaminar todas las superficies y materiales usando etanol al 70% v / v en agua destilada.
  3. Tome un frasco de cultivo celular con un cultivo de células confluentes al 90% de la incubadora y colóquelo en el gabinete de bioseguridad.
  4. Lavar las células dos veces con PBS 1x.
  5. Añadir la cantidad apropiada de solución de tripsina-EDTA al 0,05% en las células, asegurándose de cubrir la superficie celular completa ( por ejemplo , 1 ml para un matraz T25) e incubar durante 2 min a 37 ° C y 5% de CO 2 .
  6. Si todas las células están separadas (verifique con un microscopio ), Añadir medio de cultivo (DMEM + FBS al 10% + penicilina-estreptomicina al 1% ± 4 mL en un matraz T25) para inactivar la solución de tripsina-EDTA.
  7. Centrifugar durante 5 min a 300 xg a temperatura ambiente.
  8. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en medio de cultivo. Determine la cantidad de medio para cada tipo de célula para obtener una concentración celular que sea compatible con el recuento celular. Típicamente, un matraz T25 confluente al 90% de NHDF contiene aproximadamente de 1 a 1,5 millones de células, las cuales se resuspenden en 3-4 ml de medio de cultivo.
  9. Contar las células utilizando una cámara de recuento de células o contador Coulter.
  10. Sembrar de 8.000 a 10.000 células en cada uno de los 60 pocillos interiores de una placa negra de 96 pocillos con un fino poliestireno o fondo de vidrio continuo (negro para evitar la dispersión y el cruce entre pozos adyacentes durante la formación de imágenes). Cuando se utilizan diferentes condiciones / tratamientos / líneas celulares, distribuir sus lugares de siembra de forma homogénea en la placa con el fin de minimizar los efectos de la placa (Los pozos exteriores, excepto los pozos B01 y A01, no se utilizan porque son más propensos a los efectos de borde.
  11. Semilla de 8.000 a 10.000 células en B01. Este pozo se utilizará para el ajuste del enfoque, justo antes de la adquisición de la imagen.
  12. Llene los pocillos exteriores vacíos con medio para minimizar gradientes (temperatura, humedad, etc. ) entre los pozos y el ambiente.
  13. Golpee suavemente la placa tres veces antes de colocarla de nuevo en la incubadora para evitar que las células crezcan en parches.
  14. Cultivo de las células durante 24 h, o hasta un grado de confluencia de aprox. 70%.
  15. Guarde la información de tratamiento para el experimento en una hoja de cálculo llamada "Setup.xlsx". El archivo debe contener cuatro columnas y se utilizará para vincular tratamientos con pozos e información de imagen durante el análisis de datos. Las cuatro columnas son: "Bueno", "Número de tratamiento", "Tratamiento" y "Control" (una fila por pocillo). Cada tratamiento está acopladoCon un número de tratamiento único, que se utiliza durante la visualización de datos para determinar el orden de los tratamientos en el eje X de parcelas. La columna de control especifica el tratamiento que funciona como control para el tratamiento en la fila actual. Las ilustraciones de un diseño experimental típico y el archivo de configuración correspondiente se representan en la Figura 2 .

4. Carga de las células con DCFDA CM-H 2 y TMRM (± 45 min)

NOTA: El manejo de las células el día del experimento puede llevarse a cabo en un ambiente estéril (gabinete de bioseguridad), pero esto no es obligatorio porque las células serán desechadas o fijadas directamente después del ensayo.

  1. Calentar el tampón HH a 37 ° C.
  2. Preparar una solución de trabajo de TMRM 20 μM diluyendo la solución madre 1 mM 50 veces en tampón HH (añadir 490 μl de tampón HH a 1 alícuota de 10 μl de solución madre TMRM).
  3. Preparar una cargaCon 2 μM CM-H 2 DCFDA y 100 nM TMRM. Para ello, diluir la disolución madre de CMF-H 2 CMF de 500 mM y la solución de trabajo de TMRM 20 μM 200x en tampón HH.
    1. Típicamente, para 60 pocillos, preparar 7,5 mL de solución de carga añadiendo 15 μL de DCFDA CM-H2 y 37,5 μL de solución TMRM a 7447,5 μL de HH.
  4. Deseche el medio de cultivo de las células girando la placa boca abajo en un solo movimiento de fluido.
  5. Lavar suavemente las células dos veces con tampón HH usando una pipeta multicanal (100 μL / pocillo). Deseche el buffer HH entre las etapas de lavado girando la placa boca abajo en un solo movimiento de fluido.
  6. Cargar las células con DCFDA CM-H 2 y TMRM añadiendo 100 μl de la solución de carga a cada pocillo, utilizando de nuevo una pipeta multicanal. Incubar durante 25 minutos en la oscuridad, a temperatura ambiente. No se olvide bien de B01.
  7. Durante estos 25 minutos, prepare soluciones de trabajo del oxidante TBHP y asegúrese de que el microscopio y el accesorio estén encendidos.
    1. Preparar solución de trabajo I: Diluir la solución madre 7M 70x a 100 mM (10 μL de stock en 690 μl de tampón HH).
    2. Preparar la solución de trabajo II: Diluir WS I 100x a 1 mM (10 μl de WS I en 990 μl de tampón HH).
    3. Preparar la solución de trabajo III: Diluir WS III 25x a 40 μM (para 60 pocillos agregar 300 μl de WS II en 7200 μl de tampón HH).
  8. Después de 25 min, lavar de nuevo las células dos veces con 100 mu l de tampón HH como se describió anteriormente.
  9. Añadir 100 μl de tampón HH a los 60 pocillos internos.

5. Primera Ronda de Imágenes en Vivo para Medir los Niveles Basales de ROS y la Morfofonción Mitocondrial (± 15 min)

  1. Asegúrese de que el software de adquisición esté operativo y de que se cargue el protocolo de imagen.
  2. Instale la placa en el microscopio, encienda el hardware baSed y utilice bien el B01 para ajustar el desplazamiento del autofoco utilizando el canal TMRM. Dado que este procedimiento induce un incremento en la intensidad de la señal de DCFDA de CM-H 2 , este pozo se excluye del análisis de la imagen aguas abajo.
  3. Ejecute el protocolo de generación de imágenes.

6. Segunda ronda de imágenes en vivo después de la adición de TBHP para medir los niveles de ROS inducidos (± 20 min)

  1. Retire con cuidado la placa de 96 pocillos del microscopio.
  2. Añadir 100 μl de TBHP WS III (40 μM) a cada pocillo usando una pipeta multicanal (Esto da como resultado una concentración de TBHP de 20 μM en los pocillos). Este compuesto se utiliza como un control positivo interno para la tinción CM-H 2 DCFDA (la señal debe aumentar), así como un medio para medir los niveles de ROS inducidos.
    NOTA: H 2 O 2 también se puede usar en lugar de TBHP, pero este compuesto es menos estable y por lo tanto menos confiable.
  3. Espere al menos 3 minutos para permitir la reacción completa de TBHP wCon CM-H $ ₂ $ DCFDA.
  4. Durante este tiempo, añada 100 μl de solución de trabajo de anticuerpos (1 / 1.000) al pocillo A01.
  5. Montar la placa de nuevo en el microscopio y comprobar el enfoque de nuevo con el pozo B01.
  6. Adquirir las mismas posiciones que en la primera ronda de imágenes utilizando el mismo protocolo de imagen.
  7. Exportar los conjuntos de datos adquiridos en una sola carpeta como archivos tiff individuales usando una nomenclatura estandarizada que incluye referencia a la placa, tratamiento previo o posterior al TBHP, pozo, campo y canal, separados por subrayados, por ejemplo . 'P01_Pre_B02_0001_C1' para la placa 1, tratamiento previo al TBHP, pozo B02, campo 1 y canal 1. Esta información se utilizará durante el análisis de imágenes ( por ejemplo, para seleccionar los ajustes de segmentación apropiados), así como durante el análisis de datos (para conectar datos de análisis Con los tratamientos correctos).
  8. Adquirir imágenes de campo plano para ambos canales en las cuatro posiciones alrededor del centro del pozo A01 usando el protocolo de adquisición. SalvaEm como archivos tiff individuales en la misma carpeta que las otras imágenes utilizando la siguiente nomenclatura estandarizada: 'P01_FF_A01_0001_C1' para la placa 1, campo 1 y canal 1. Asegúrese de que las señales están bien dentro del rango dinámico; En caso de saturación, utilizar una concentración más baja de la solución de trabajo del anticuerpo.
  9. Deseche la placa o guárdela para su posterior procesamiento.
    NOTA: En lugar de retirar la placa del microscopio y utilizar una pipeta multicanal para añadir la solución TBHP, se puede instalar una pipeta automática en la platina del microscopio y conectarse con el software de adquisición para funcionar al recibir un disparador. Esto permite agregar TBHP a cada pozo directamente después de la primera adquisición, antes de pasar al siguiente pozo. De esta manera, cuando se termina la primera ronda de imágenes, la segunda puede comenzar de inmediato y todos los pozos habrán tenido el mismo tiempo de incubación con el TBHP.

7. Procesamiento y análisis de imágenes (± 30 min porPlaca de 96 pocillos)

NOTA: Todo el procesamiento de imágenes se realiza en FIJI (http://fiji.sc), una versión empaquetada de Freeware de ImageJ. Un guión dedicado fue escrito para el análisis automatizado de ROS intracelular - y las señales mitocondriales, así como parámetros morfológicos (RedoxMetrics.ijm, disponible a petición). Los algoritmos subyacentes se describen en Sieprath et al. 1 .

  1. Asegúrese de que FIJI esté instalado y en funcionamiento.
  2. Inicie FIJI e instale el conjunto de macros (Plugins -> Macros -> Install ...). Esto invocará una serie de nuevos comandos de macro, así como un conjunto de herramientas de acción para optimizar los ajustes de análisis, como se muestra en la Figura 3A .
  3. Abra la interfaz de configuración para establecer la configuración del análisis haciendo clic en el botón 'S' ( Figura 3B ).
    1. Seleccione el tipo de imagen, el número de canales y el pozo que se utilizóPara la adquisición de imágenes de campo plano.
    2. Indica qué canal contiene las células (CM-H 2 DCFDA canal) o mitocondrias (TMRM-canal) y ajustar los parámetros de preprocesamiento y segmentación para cada canal en función de la calidad de imagen ( Figura 3B ). Marque las casillas de verificación 'Fondo' y 'Contraste' para realizar la sustracción de fondo o la ecualización adaptativa limitada del histograma de contraste 16 , respectivamente. Definir un sigma para Gaussian borrosidad de las células y laplaciana mejora de las mitocondrias. Seleccione un algoritmo de umbral automático y rellene los límites de exclusión de tamaño (en píxeles). Si se elige un umbral fijo en lugar de un algoritmo de umbral automático, rellene el umbral superior.
    3. Pruebe los ajustes de segmentación en algunas imágenes seleccionadas de los conjuntos de datos adquiridos abriéndolos y haciendo clic en los botones 'C' o 'M' en el menú para la segmentación de células o mitocondrias respectivamente,Y ajuste los ajustes si es necesario. Un ejemplo de resultado se muestra en la Figura 3C .
  4. Ejecute el análisis por lotes en la (s) carpeta (s) de interés haciendo clic en el botón '#' y seleccionando la carpeta con las imágenes. Por carpeta, esto producirá un nuevo directorio 'Salida', que contiene conjuntos de ROI individuales (archivos zip) y archivos de resultados (.txt) por imagen. Para ambos canales el archivo de resultados contiene intensidad y descriptores morfológicos. El archivo de resultados CM-H 2 DCFDA (células) contiene por descriptor el valor promedio de los ROI combinados dentro de una imagen. Para el canal TMRM, el archivo de resultados contiene por descriptor el valor de cada ROI mitocondrial segmentado individualmente.
  5. Después del análisis por lotes, verifique visualmente el rendimiento de la segmentación en una "pila de verificación", una hiperstack de todas las imágenes con su respectiva superposición de ROI haciendo clic en el botón 'V'. De esta manera, artefactos como el sobre-/ Undersegmentation, fuera de las imágenes de enfoque o partículas de polvo / fibras en las imágenes ya se pueden detectar rápidamente. Se puede realizar una curación adicional durante el control de calidad de datos (cfr. § 8).

8. Análisis de datos, control de calidad (QC) y visualización

El procesamiento y el análisis de los datos en bruto se realiza utilizando el software de estadística R (http://www.rproject.org - versión 3.3.2) y RStudio (http://www.rstudio.com/ - versión 1.0.44). Para obtener y visualizar rápidamente los resultados, se ha concebido una aplicación intuitiva Shiny 17 (disponible a petición) que integra y visualiza los datos en heatmaps y boxplots, y también realiza análisis estadísticos. En general, el flujo de trabajo consta de dos pasos consecutivos. En primer lugar, los datos se procesan e inspeccionan por placa de 96 pocillos para detectar puntos de datos aberrantes. En segundo lugar, los datos curados de todas las placas de un experimento dado se combinan y analizan utilizando no paramétrico multiPruebas variables 18 y un análisis de componentes principales.

  1. Asegúrese de que R y RStudio están instalados y operativos.
  2. Inicie RStudio.
  3. Abra la aplicación brillante RedoxMetrics y ejecute la aplicación (elija ejecutarla en un navegador externo).
  4. En la página "entrada", seleccione el directorio donde se encuentran los archivos de resultados de RedoxMetrics.ijm.
  5. Asegúrese de que 'Setup.xlsx' (creado en el paso 3.15) también está presente dentro de este directorio.
  6. Los archivos de resultados y la información de configuración se importan, reordenan y visualizan automáticamente.
    1. La página 'configuración experimental' muestra el diseño del experimento. Utilice esta página para verificación.
    2. En la página siguiente, 'results per plate' muestra los datos de cada placa por separado en un diseño de placa de múltiples pocillos con códigos de colores, así como en los boxplots con outliers marcados con el nombre del pozo y el número de imagen. Este último permite fácil inspección e ident(Valores extremadamente altos o bajos comparados con los valores medios medidos para ese tratamiento específico - ver Figura 4 para un ejemplo).
      Utilizando esta información, verifique las imágenes correspondientes a los puntos aberrantes. Si se detectan anormalidades, deben ser eliminadas del análisis. La mayoría de las anormalidades son causadas por una segmentación incorrecta cuando (parte) de la imagen está fuera de foco, o cuando partículas de polvo altamente fluorescentes alteran la segmentación adecuada. Los casos extremos ya se pueden detectar rápidamente utilizando la herramienta de pila de verificación (paso 7.5), pero se descubren más sutiles en este paso. Cuando no se encuentre ninguna razón aparente o técnica para el valor aberrante, la imagen no debe ser eliminada del análisis.
    3. Opcional: cree una nueva hoja de cálculo llamada 'Drop.xlsx' con una sola columna llamada 'Drop'. En esta columna, liste los nombres de archivo (incluyendo la extensión ".tif") de todas las imágenesQue deben eliminarse del análisis (identificadas en el paso 7.5 o el paso 8.6.2). Sube este archivo usando la página 'entrada'.
    4. La página 'resultados de todo el experimento' muestra los resultados de todas las placas combinadas. Si se ha cargado un archivo de eliminación, este archivo se utiliza para eliminar los puntos de datos especificados del análisis.
      Para cada parámetro individualmente, los datos se normalizan por placa según sus respectivos controles. A continuación, se combinan los datos de todas las placas, seguidas de las pruebas multivariadas no paramétricas del paquete nparcomp 18 . Si sólo se comparan dos tratamientos se realizan dos pruebas de muestra para el problema no paramétrico de Behrens-Fisher. Para más de 2 tratamientos, se utiliza una prueba de comparación múltiple no paramétrica basada en contraste. Los resultados se visualizan utilizando los boxplots.
    5. La página 'análisis de clúster' muestra los resultados de un análisis de componentes principales (paquetes de 'estadísticas' de PCA - R). Los datos de 5 parámetros (baSal y ROS inducido, y potencial de membrana mitocondrial, tamaño y circularidad) se combinan para discriminar los diferentes tratamientos basados ​​en un perfil redox sensible. Con este fin, se realiza un análisis de componentes principales (PCA) (paquete de stats de R core). Los resultados se visualizan usando un biplot (paquete ggbiplot - http://github.com/vqv/ggbiplot).
    6. Utilice la página "descargar datos" para descargar los marcos de datos de back-end que contienen los datos procesados ​​y reorganizados de tal manera que puedan ser reutilizados para una visualización de datos o análisis estadísticos más avanzados.
      NOTA: Los peligros típicos y las posibles soluciones se enumeran en la Tabla 1 .

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Representative Results

El ensayo se ha comparado utilizando varios experimentos de control, cuyos resultados se describen en Sieprath et al. 1 . En resumen, se ha cuantificado la respuesta de fluorescencia de CM-H 2 DCFDA y TMRM a cambios inducidos por extrano en ROS intracelular y Δψ m respectivamente para determinar el rango dinámico. Para CM-H 2 DCFDA, el NHDF mostró un incremento lineal en la señal de fluorescencia cuando se trató con concentraciones crecientes de TBHP entre un intervalo de 10 μM a 160 μM. Del mismo modo, para TMRM, las células NHDF demostraron un aumento lineal en la fluorescencia mitocondrial cuando se tratan con concentraciones crecientes de oligomicina (que induce la hiperpolarización Δψ m ) en un rango de 1 a 10 μg / μL. Por el contrario, la adición en tiempo real de valinomicina, un antibiótico que induce Δψ m despolarización, dio lugar a una cuantitativa paDisminución de la fluorescencia TMRM .

El ensayo también se ha utilizado en una variedad de experimentos para revelar diferencias en el estado redox entre tipos de células o tratamientos [ 1 , 15] . Para ilustrar esto, se muestran los resultados de un experimento en el que NHDF se trataron con el inhibidor de proteasa de HIV Saquinavir (SQV) ( Figura 5 ). Utilizando el protocolo descrito, se detectó un aumento significativo tanto para los niveles basales como para los ROS inducidos en comparación con las células control tratadas con DMSO ( Figura 5B ). El tratamiento con SQV también afectó significativamente a la morfofunción mitocondrial. Morfológicamente, las mitocondrias adquirieron un patrón altamente fragmentado, lo que también fue confirmado por una mayor circularidad y tamaño medio más pequeño de las mitocondrias individuales. Funcionalmente, Δψ m , medido como señal TMRM promedio por mitochOndrial también fue significativamente mayor ( Figura 5A ]. Al combinar los datos de los 5 parámetros descritos anteriormente, las dos condiciones (control y SQV) podrían estar claramente separadas entre sí por el análisis del componente principal. Los datos de tres repeticiones biológicas independientes se muestra en una biplot 2D-biplot mostrar los dos primeros componentes principales, que explican 81,4% de la varianza total ( Figura 5C ]. Esto demuestra la solidez del ensayo y sugiere que la lectura combinada puede servir como un indicador sensible del estado de salud celular.

Figura 1
Figura 1 : Visión general general del ensayo de formación de imágenes de alto contenido para la medición simultánea de niveles intracelulares basales e inducidos por ROS y morfofunción mitocondrial. ( A ) SRepresentación quimática de los principales bloques operacionales. ( B ) Ejemplo ilustrado: las células se siembran en múltiples placas idénticas de 96 pocillos. En la Figura 2A se muestra un diseño de placa de pozo estándar con más detalle. Después de la tinción, se adquieren 4 imágenes por canal alrededor del centro de cada pozo, tanto pre y post tratamiento TBHP, que se ilustra por los grandes montajes con inserción. Después del análisis de imágenes, los resultados de intensidad se visualizan usando un mapa de calor intuitivo proyectado sobre el diseño de la placa de pozo. Esto permite una detección rápida de los efectos de la placa o de los pocillos aberrantes. Después de la curación de los conjuntos completos de datos experimentales, el análisis final de los datos se realiza dando como resultado una salida simple o multiparamétrica. (Esta cifra fue modificada a partir de la referencia 1 , con permiso de Springer) Haga clic aquí para ver una versión más grandeN de esta cifra.

Figura 2
Figura 2 : Un experimento típico de 96 pozos de diseño y correspondiente 'Setup' archivo. ( A ) 4 condiciones diferentes se distribuyen de forma homogénea a través de los 60 pocillos interiores de la placa. El pocillo B01 también contiene células, pero sólo se utiliza para ajustar el desplazamiento PFS inicial justo antes de la obtención de imágenes. Los otros pocillos exteriores se llenan sólo con medio de cultivo para minimizar los gradientes (temperatura, humedad, etc. ) durante el cultivo celular. La adquisición de la imagen se realiza de forma sinuosa, es decir, primero de izquierda a derecha, desde el pocillo B02 hasta B11, luego hacia atrás, de derecha a izquierda, desde el pozo C11 hasta C02 y así sucesivamente. Después de la adquisición de imágenes, se obtienen imágenes de campo plano en el pozo A01, que se utiliza para corregir la heterogeneidad de iluminación espacial durante la imagen y Alisis. ( B ) El archivo de configuración correspondiente (Setup.xlsx) es una hoja de cálculo que contiene información sobre el diseño del experimento. Especifica las ubicaciones de cada tratamiento en la placa multipocillos y sus respectivos controles. Cada fila representa un pozo. Cada tratamiento tiene su propio número de tratamiento único, que se utiliza para especificar el orden de los tratamientos en el eje X de las parcelas generadas durante el análisis de datos. La columna 'Control' contiene el tratamiento que debe utilizarse como control para normalizar los datos del tratamiento especificado en la misma fila. En el ejemplo, el tratamiento 1 es el tratamiento que se utiliza como control para normalizar los datos de todos los otros tratamientos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

9 / 55449fig3.jpg "/>
Figura 3 : Conjunto de macros, configuración e interfaz de configuración de RedoxMetrics. ( A ) Cuando se instala el conjunto de macro RedoxMetrics para FIJI, en la barra de menús se crean una serie de nuevos comandos de macro, así como un conjunto de herramientas de acción para probar y optimizar los parámetros de análisis. 'S' invoca la interfaz de configuración. 'F' realiza una corrección de campo plano en una imagen abierta. 'C' y 'M' realizan una segmentación de prueba para regiones celulares ("Cell", canal CM-H2DCFDA) y regiones mitocondriales ("Mito", canales TMRM), respectivamente en una única imagen abierta usando los ajustes de análisis seleccionados en la configuración , Devolviendo una superposición de las regiones segmentadas de interés (ROIs). '#' Realiza el análisis por lotes en una carpeta de imágenes utilizando la configuración especificada en la interfaz de configuración (normalmente después de la verificación en una o varias imágenes). 'V' crea un hiperstack de verificación usinG los datos de salida del análisis por lotes. Este hiperstack es una imagen compuesta de todas las imágenes en bruto presentes en la carpeta y sus respectivas regiones de interés (dibujado en un segundo canal). Se puede hacer clic en 'O' para mostrar u ocultar la superposición de la región segmentada. ( B ) Interfaz de configuración. Aquí se seleccionan todos los ajustes de análisis, incluyendo información general como el tipo de imagen (extensión), el número de canales (longitudes de onda) y el pozo que se utilizó para la corrección de campo plano. A continuación hay ajustes específicos para el tipo de contenido de imagen (Cell o Mito). En ambos casos, hay opciones (casillas de verificación) para incluir una corrección de fondo ("fondo") y realce de contraste local ("contraste"). Para la segmentación celular, existe la opción de definir un radio gaussiano de desenfoque (sigma) para reducir el ruido. Para la segmentación mito existe la opción de definir el radio de un operador laplaciano para el realce selectivo de las mitocondrias. La segmentación subsiguiente es pErformed usando un método de umbral automático (o fijo) que se puede definir por tipo de contenido. Cuando se elige un umbral fijo, el valor de umbral superior puede proporcionarse manualmente. Finalmente, el análisis se puede restringir a una selección de objetos que caen dentro de un tamaño mínimo y máximo. ( C ) Un ejemplo de un resultado de segmentación que se ejecuta con el comando "C" (arriba) o "M" (inferior), que se muestra como la imagen cruda en gris superpuesta con las regiones de interés en amarillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4 : Ejemplo ilustrado de visualizaciones de datos intermedios. ( A ) Visualización de la placa Multiwell en la que aparecen los pocillos B02 y D07suspicaz. ( B ) Boxplot que representa los mismos datos, con los outliers etiquetados con el nombre del pozo y el nombre de la imagen. Junto con F03_0003, las imágenes de B02 y D07 reaparecen como valores atípicos. ( C ) La inspección visual de estas imágenes muestra que B02_0000 y D07_0001 deben eliminarse del análisis posterior porque hay errores de segmentación (ilustrados por el 'X' rojo). F03_0003 debe mantenerse porque no hay aparente segmentación o error técnico. (Si no se encuentra ninguna razón técnica para la aberración, los datos no deben ser eliminados). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5 : Efecto de Saquinavir (SQV, 20 μM) sobre Fibra Humana PrimariaOblasts (el control es DMSO). ( A ) Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ m ) y morfología mitocondrial (circularidad y tamaño medio de las mitocondrias individuales) según medida TMRM ( B ) Aumento de los niveles basales de ROS intracelular medido por DCFDA CM-H2 y respuesta a ROS inducida, medida Como ganancia relativa en intensidad después de la adición de 20 μM de adición de TBHP. ( C ) diagrama de dispersión 2D de los 2 primeros componentes principales (PCs) de un análisis de PCA sobre las 5 variables descritas anteriormente (niveles basales e inducidos de ROS, tamaño medio mitocondrial, circularidad y ΔΨ m ). Las flechas negras representan las direcciones de las 5 variables originales con respecto a los componentes principales. Todos los datos se normalizan con respecto al control de DMSO; * = valor de p <0,05; ** = valor de p <0,01; *** = valor de p <0,001; intervalo de valores de Y -Ejes se ha ajustado para mostrar óptimamente las diferencias; Esta cifra fue modificada a partir de la referencia 1 , con permiso de Springer) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Problema Razón potencial Solución posible
Demasiadas células en los pocillos durante la formación de imágenes Muy pocas células sembradas Sembrar más células 24 h antes de tomar imágenes
Pobre crecimiento celular Compruebe las condiciones de cultivo (medio, estabilidad a la temperatura, control de CO 2 )
Pasos de lavado demasiado violentos Evite lavar las celdas, pipetee suavemente
Demasiadas células en los pocillos durante la obtención de imágenes TambiénMuchas células sembradas Semilla menos células 24 h antes de la obtención de imágenes
Señales débiles o respuesta no lineal de la fluorescencia de CMF-DCFDA a los estímulos Utilizado concentración de colorante demasiado baja / alta Si se utilizan células distintas de NHDF, las concentraciones óptimas de carga deben determinarse empíricamente
La carga de colorante es insuficiente Añadir 0,02% p / v del surfactante Pluronic-127 a la solución de carga para aumentar la captación.
CM-H 2 La señal DCFDA aumenta visualmente durante el tiempo de exposición Concentración de colorante demasiado alta Reducir la concentración de colorante
La intensidad de excitación es demasiado alta Reduzca la intensidad de excitación usando filtros ND y / o reduciendo el tiempo de exposición
CM-H 2 La intensidad de DCFDA disminuye durante la adquisición de la placa de pozo CM-H 2 DCFDA se filtra fuera dela célula. Utilice 2 mg de probenicida (inhibidor de la bomba aniónica). Añadir a la solución de carga, así como el buffer de imagen para disminuir las fugas
No hay aumento en la intensidad de la señal de DCFDA CM-H 2 después de la adición de TBHP TBHP no está activo Utilice TBHP fresco
CM-H 2 DCFDA se filtra hacia fuera de la celda. Utilice Probenicid como se describió anteriormente.
(Algunas de las) imágenes adquiridas aparecen fuera de foco, mientras que el enfoque parece estar bien cuando está marcado. La placa está montada inclinada haciendo que el enfoque se extienda más allá del offset PFS Comprobar el montaje de la placa y el nivel de la etapa, Reposicionar la placa
El fondo de la placa contiene polvo o irregularidades Limpie la parte inferior de la placa con un papel de lente humedecido en etanol
Las células mueren durante la formación de imágenes Reduzca la intensidad de excitación o adquiera menos imágenes por pozo.
Composición de buffer de imagen incorrecta Remake imaging-buffer
Hay puntos fluorescentes fuera de foco en las imágenes Las células separadas están flotando fuera de foco Lave más suavemente durante el protocolo de carga
Una o más columnas tienen una intensidad inferior a la de los otros pocillos de la placa Una o más puntas de la pipeta multicanal no se unieron firmemente y, por lo tanto, se añadió menos reportero a estos pocillos Compruebe minuciosamente si todas las puntas se llenan perfectamente siempre que utilice una pipeta multicanal.
El enfoque se deriva dramáticamente durante la adquisición de imágenes El fondo de poliestireno de la placa puede reaccionar con aceite de inmersión cuando se usa una lente de aceite Utilice una lente seca, o utilice una placa multipozo con un glaAbajo
La intensidad de la señal TMRM aumenta entre la imagen del primer y último pozo El tiempo de carga del reportero no fue suficiente, TMRM sigue equilibrando Aumentar el tiempo de carga del reportero
CM-H 2 La señal DCFDA después del tratamiento con TBHP aumenta durante la adquisición de la placa de pozo El tiempo transcurrido entre el tratamiento con TBHP y el inicio de la segunda ronda de formación de imágenes no fue lo suficientemente largo, el TBHP todavía está oxidando el DCFDA CM-H 2 . Aumentar el tiempo de incubación entre el tratamiento con TBHP y la segunda ronda de imágenes. (Comience con al menos 3 min)
Las imágenes de campo plano están saturadas La solución de trabajo de anticuerpos es concentrada Utilizar una concentración más baja de la solución de trabajo del anticuerpo
Los ajustes de adquisición no están optimizados (tiempo de exposición a alta, filtro ND a bajo, ...) Optimice los ajustes de adquisición,La señal tiene que estar en el rango dinámico del sensor
Imágenes de campo plano son oscuras La solución de trabajo del anticuerpo es diluida Utilizar una mayor concentración de solución de trabajo de anticuerpos
Los ajustes de adquisición no están optimizados (tiempo de exposición a alta, filtro ND a bajo, ...) Optimizar ajustes de adquisición, la señal tiene que estar en el rango dinámico del sensor
Sobre / Undersegmentation artefacts Umbral no establecido correctamente Ajuste el umbral
Filtros de tamaño no ajustados correctamente Ajuste los criterios de tamaño mínimo y máximo para el análisis de imagen
La confluencia celular es demasiado alta El nivel correcto de confluencia es muy importante para el análisis fiable de la imagen. Para otros tipos de células que NHDF, la densidad de siembra óptima tiene que ser determinado empíricamente
La aplicación brillante no funciona Se ha seleccionado un directorio incorrecto Elija el directorio correcto en la página de entrada.
Faltan archivos en el directorio Asegúrese de que todos los archivos necesarios (salida de la macro imagej y el archivo de configuración) están presentes en el directorio seleccionado
Paquetes que faltan Normalmente, la aplicación comprueba e instala todos los paquetes necesarios, pero cuando esto falla, compruebe manualmente los siguientes paquetes: devtools, ggbiplot, pacman, ggplot2, plyr, nparcomp, data.table, readxl, gplots, ggbiplot, shiny, shinyFiles, pbapply Y shinyjs incluyendo todas las dependencias.

Tabla 1: Trampas típicas y soluciones potenciales.

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Discussion

Este artículo describe un método de microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles intracelulares de ROS y morfofonción mitocondrial en NHDF. Su desempeño se demostró con un estudio de caso sobre NHDF tratado con SQV. Los resultados apoyan la evidencia anterior de la literatura en la que se han observado niveles elevados de ROS o disfunción mitocondrial después del tratamiento con inhibidores de la proteasa del VIH de tipo 1, aunque en experimentos separados 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . La diferencia importante es que el ensayo descrito es capaz de medir estos parámetros simultáneamente, en las mismas células vivas, junto con datos morfológicos. La principal ventaja de este enfoque es su determinación inequívoca de ambos factores juntos en el espacio y tIme, lo que permite identificar las relaciones causales. Se realiza un análisis de componentes principales que permite generar un perfil redox sensible de perturbaciones específicas. Sin embargo, las técnicas más avanzadas de minería de datos y los algoritmos de agrupación (supervisados) también se pueden utilizar en los datos extraídos para permitir el perfilamiento redox predictivo. Esto puede ser una característica valiosa para las herramientas de clasificación diagnóstica o pronóstica en la patología digital, así como en el cribado de dianas terapéuticas, por ejemplo , una vez que se crean modelos robustos de clasificación, las bibliotecas de moléculas pequeñas pueden ser seleccionadas para encontrar candidatos terapéuticos para contrarrestar el estrés oxidativo, Una reciente pantalla de prometedor lleva en el desarrollo terapéutico de los trastornos mitocondriales humanos [ 26] .

El ensayo fue concebido para NHDF, pero puede adaptarse a otros tipos de células adherentes. Esto requiere la optimización del protocolo de tinción y las concentraciones de colorantes informadores. La cantidad de r Eporter dye tiene que ser minimizado ya que la sobrecarga puede causar efectos no lineales debido a la extinción o incluso llegar a ser citotóxicos [ 27] . La extensión del ensayo a las células en suspensión es menos evidente debido a dificultades con el montaje y la observación de dichas células de una manera fisiológica. Pueden ser citospun en un cubreobjetos o cultivados en medio libre de suero para inducir la adhesión, pero ambos procesos interfieren con las condiciones fisiológicas 28 , 29 . Sin embargo, estas limitaciones podrían ser superadas utilizando soportes de cultivo celular micropatternados que mantienen a las células individuales (adherentes o no adherentes) atrapadas en micro pocillos pequeños mientras que mantienen su viabilidad 30 , o mediante el uso de un hidrogel termo-reversible para atrapar células durante la formación de imágenes 31 . Estos métodos ya se han utilizado para el cribado de alto contenido de potencial de membrana plasmática, o oxígeno celular en células de suspensión individuales= "Xref"> 32 , 33 o la obtención de imágenes de marcadores intracelulares en los parásitos vivos y altamente móviles 31 . También habría que hacer adaptaciones a la modalidad de obtención de imágenes, ya que el análisis morfológico de la red mitocondrial en estas células requeriría capacidades rápidas de adquisición en 3D, como la confocal confocal del disco de hilado o la microscopía de luz de haz Bessel 34 , 35 , así como al análisis Pipeline, para incluir la dimensión Z mientras se calculan los parámetros morfológicos.

El ensayo se optimizó para placas de 96 pocillos, pero es evidentemente susceptible de una mayor escalonación, por ejemplo , a placas de 384 pocillos. El principal factor limitante es el tiempo de adquisición de placas, es decir, el tiempo que se tarda en adquirir imágenes de todos los pozos. Las señales fluorescentes tienen que permanecer estables durante este periodo de tiempo para poder comparar con confianza las mediciones entrePozos individuales. Pero, debido a que la tinción es transitoria y el proceso bajo investigación es dinámico, esto plantea un desafío. Por lo tanto, las señales fluorescentes se midieron en un conjunto de experimentos repetidos y esto demostró que ambas señales CM-H 2 DCFDA y TMRM permanecen estables desde 7 hasta al menos 50 minutos después de la tinción (coeficiente de variación <2%). Esto da una ventana de aproximadamente 40 min. Una placa de 96 pocillos típicamente toma alrededor de 10 minutos. Por lo tanto, una extrapolación a placas de 384 pozos mantendría la duración de adquisición dentro del intervalo de tiempo estable. Con un promedio de 50 células por imagen (basado en el uso de un objetivo 20X y las células NHDF), esto daría como resultado datos de aproximadamente 30.000 células por hora de cribado, lo que aumentaría considerablemente el poder estadístico del ensayo. Otro factor que influye en la estabilidad de la señal fluorescente es la temperatura. Para evitar la vacuolización de CM-H 2 DCFDA (es decir, acumulación de colorante en vesículas intracelulares), lo que daría lugar a heteroLa tinción genética y los efectos no lineales, la incubación tiene lugar a temperatura ambiente en lugar de 37 ° C. Aparte de la estabilidad, es importante señalar que la exposición de las células vivas a la luz de excitación de fluorescencia por sí misma induce la producción de ROS. Esto implica que las condiciones de exposición (tiempo de exposición e intensidad de la luz de excitación) deben mantenerse en un mínimo absoluto. También significa que todos los pozos sólo deben ser expuestos cuando se obtienen las imágenes reales. Esto descarta el uso de métodos de autofocus de software habilitado y garantiza el uso de un sistema de autofoco basado en hardware.

Una ventaja del procedimiento descrito es su carácter genérico. Prácticamente se puede utilizar cualquier combinación de reporteros fluorescentes espectralmente compatibles. Esto se demostró mediante el uso de la combinación Calcein / MitoSOX para medir ROS mitocondrial por célula viva 1 , 15 . Además, las aplicaciones no se limitan a la int Medición de ROS / mitocondrial egrated. El ensayo también puede extenderse con una inmunotinción post hoc (después de la segunda ronda de formación de imágenes). Dado que se guardan las localizaciones de imágenes exactas, los análisis redox pueden correlacionarse directamente con la proteómica de localización en las mismas células. Esto aumenta enormemente la lectura molecular, que está en marcado contraste con otros métodos utilizados con frecuencia para evaluar la biología redox, o intensidades de fluorescencia en general. Por ejemplo, la fluorimetría (lector de microplacas) se utiliza ampliamente debido a su coste relativamente bajo (configuración básica disponible por tan sólo 4000 €) y curva de aprendizaje superficial, pero al ser una caja negra, es más propensa a factores de confusión como variaciones en Densidad celular o fondo (auto-) fluorescencia, por ejemplo , de partículas de polvo contaminantes. Además, los lectores de placas no permiten la extracción de parámetros morfológicos, no pueden medir células individuales y son menos sensibles y fiables para medir señales dinámicas o transitoriasLass = "xref"> 36 , 37 . La citometría de flujo tiene la capacidad de medir células individuales y tiene la ventaja de velocidad. De hecho, una placa de 384 pocillos se puede cribar en tan sólo 12 minutos con alta sensibilidad para los marcadores múltiples [ 38] . Esto es mucho más rápido que lo que es posible con microscopía de campo ancho. Sin embargo, todavía no se proporciona información espaciotemporal ( es decir, localización subcelular, datos morfológicos y / o cinética dependiente del tiempo), ni permite volver a visitar las mismas células durante o después de un tratamiento (es decir, en flujo) . Además, las células necesitan estar en suspensión, lo que hace que la citometría de flujo sea menos adecuada para estudiar la fisiología de las células adherentes. Las principales desventajas de la microscopía de alto contenido en comparación con los otros métodos son la necesidad de grandes datos de imagen de almacenamiento, la potencia de procesamiento intensivo y análisis de imágenes complejas. El ensayo presentado normaliza el proceso de adquisición de imágenes yS para minimizar este tiempo de procesamiento, aumentar la facilidad de uso y por lo tanto hacer el ensayo más accesible.

En conclusión, y específico para el uso de CM-H 2 DCFDA y TMRM, el método de perfil redox descrito es robusto, sensible y fiable. Debido a su carácter multiparamétrico y cuantitativo, es superior a otros métodos basados ​​en la fluorescencia. De esta manera, puede ayudar a dilucidar la relación entre la función mitocondrial y la señalización ROS intracelular, que es crucial para comprender mejor una amplia variedad de patologías en las que la homeostasis redox está perturbada. Además, debido a su carácter genérico, el ensayo permite aplicaciones mucho más allá de su alcance original.

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Disclosures

Los autores afirman que no hay intereses financieros en competencia ni otros conflictos de intereses. El autor correspondiente también asegura que a todos los autores se les ha pedido que revelen todos y cada uno de los conflictos de interés.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) ThermoFisher Scientific T668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) ThermoFisher Scientific C6827
Dimethyl sulfoxide Sigma)Aldrich D8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded Brooks life science systems MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mL Lonza BE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamine Lonza BE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg Lonza BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL Lonza 17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) Solution Lonza BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson 711-166-152 Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson 711-546-152 Antibody used for acquiring flat-field image
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscope Nikon
Perfect Focus System (PFS) Nikon hardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objective Nikon
Name Company Catalog Number Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module Nikon This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44 Rstudio
R version 3.3.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Sieprath, T., Corne, T., Robijns, J., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55449, doi:10.3791/55449 (2017).

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