Summary
Bu makale, hücreye nüfuz eden floresan muhabir molekülleri olan canlı yapışık hücrelerde, mitokondriyal membran potansiyeli ve morfolojisinin yanı sıra mitokondriyal morfofonksiyon olarak da adlandırılan, hücre içi ROS seviyelerinin aynı anda ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi iş akışını sunuyor. 5- (ve- 6) -klorometil-2 ', 7'-diklorodihidrofloresan diasetat, asetil ester (CM-H2 DCFDA) ve tetrametilrhodamin metilester (TMRM).
Abstract
Reaktif oksijen türleri (ROS) gen ekspresyonu, göç, farklılaşma ve proliferasyon da dahil olmak üzere gerekli hücresel süreçleri düzenler. Bununla birlikte, aşırı ROS seviyeleri, DNA'ya, lipitlere ve proteinlere geri döndürülemez oksidatif hasar eşlik eden bir oksidatif stres oluşturur. Böylece, ROS'un nicelendirilmesi, hücresel sağlık durumu için doğrudan bir vekil sağlar. Mitokondri, ROS'un başlıca hücresel kaynakları ve hedefleri arasında yer aldığından, patofizyolojik koşullarda arabağlantıyı daha iyi anlamak için aynı hücrelerde mitokondriyal fonksiyon ve ROS üretiminin ortak analizi önemlidir. Bu nedenle, hücre içi ROS seviyelerinin, mitokondriyal membran potansiyelinin (ΔΨ m ) ve mitokondriyal morfolojinin eşzamanlı olarak nicelendirilmesi için yüksek içerikli mikroskopi tabanlı bir strateji geliştirildi. Çok yönlü plakalarda yetiştirilen, yaşayan adherent hücrelerin otomatik geniş alan floresan mikroskobu ve görüntü analizine dayanıyor ve staineD hücreye geçirgen flüoresan haberci molekülleri CM-H2 DCFDA (ROS) ve TMRM (ΔΨ m ve mitokondriyal morfoloji) ile karşılaştırıldı. Florimetri veya akış-sitometri aksine, bu strateji hem deneysel uyarı öncesi hem de sonrasında, yüksek spatiotemporal çözünürlük ile tek tek hücre seviyesinde subselüler parametrelerin miktarının belirlenmesine izin verir. Önemlisi, yöntemin görüntü temelli doğası, sinyal yoğunluğuna ek olarak morfolojik parametrelerin çıkarılmasına izin verir. Kombine özellik kümesi, alt popülasyonlar, hücre türleri ve / veya tedavileri arasındaki farkları saptamak için araştırma ve istatistiksel çok değişkenli veri analizi için kullanılır. Burada, kimyasal pertürbasyon sonrasında hücresel durumlar arasındaki belirgin ayrımcılık potansiyelini kanıtlayan bir deney deneyiyle birlikte, deneyin ayrıntılı bir tarifi verilmektedir.
Introduction
Hücre içi ROS konsantrasyonu, ROS üreten ve ROS sıyırma sistemleri arasındaki dinamik bir etkileşim vasıtasıyla titizlikle düzenlenir. İkisi arasındaki dengesizlik, oksidatif stres durumunu kışkırtır. ROS'un ana kaynakları arasında mitokondri 1 bulunur . Hücresel solunumda rolleri göz önüne alındığında, hücre içi süperoksit (O 2 • - ) moleküllerinden 2 sorumludurlar. Bu, çoğunlukla elektron nakil zincirinin 1 kompleksinde elektron kaçağından kuvvetli negatif iç mitokondriyal zar potansiyeli (Δψ m ) koşulları, yani mitokondriyal hiperpolarizasyon sonucu ortaya çıkar. Öte yandan, mitokondriyal depolarizasyon, artmış ROS üretimi ile birden fazla etki moduna işaret eden 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Ayrıca, fizyon-füzyon mekanizmalarının proteinlerindeki redoks değişiklikleri ile ROS, mitokondriyal morfolojiyi birlikte düzenlemektedir 9.Farklı mitokondriyum, artmış ROS üretimi ve apoptoz ile korelasyon gösterirken, ipliksi mitokondri, besin yetersizliği ve korunma ile bağlantılıdır Mitofaji 12 . Hücresel ROS ile mitokondriyal morfofonksiyon arasındaki karmaşık ilişki göz önüne alındığında, ikisi de ideal olarak canlı hücrelerde nicelenmesi gerekir. Tam olarak bunu yapmak için, CM-H2 DCFDA (ROS) ve TMRM (mitokondriyal Δψ m ve morfoloji) floresan probları ile lekelenmiş yapışık hücre kültürlerinin otomatik geniş alan mikroskopisi ve görüntü analizine dayanılarak yüksek içerikli bir görüntüleme testi geliştirildi. Yüksek içerikli görüntüleme, sp'ninÇoklu tamamlayıcı işaretleyiciler ve otomatikleştirilmiş görüntü analizi kullanan hücresel fenotipler hakkında atiotemporal bakımdan zengin ( yani çok sayıda açıklayıcı özellik) bilgi. Otomatik mikroskop ile kombine edildiğinde, birçok numune paralel olarak taranabilir ( yani yüksek verimlilik), böylece tahlilin istatistiksel gücünü artırabilir. Aslında, protokolün temel bir öğesi, aynı hücredeki birden çok parametrenin aynı anda sayısallaştırılmasına ve çok sayıdaki hücre ve koşullara göre ayarlanmasına olanak sağlamasıdır.
Protokol 8 bölüme ayrılmıştır (aşağıdaki protokolde ayrıntılı olarak açıklanmıştır): 1) 96 oyuklu plakada hücrelerin tohumlanması; 2) Stok solüsyonlarının, çalışma solüsyonlarının ve görüntü tamponunun hazırlanması; 3) Mikroskop kurulumu; 4) CM-H 2 DCFDA ve TMRM ile hücrelerin yüklenmesi; 5) Bazal ROS düzeylerini ve mitokondriyal morfofonksiyonu ölçmek için ilk canlı görüntüleme yuvarlaklığı; 6) tert -butil ilavesinden sonra ikinci canlı görüntüleme turuIndüklenen ROS düzeylerini ölçmek için peroksit (TBHP); 7) Otomatik görüntü analizi; 8) Veri Analizi, Kalite Kontrolü ve Görselleştirme.
Test orijinal olarak normal insan dermal fibroblastları (NHDF) için geliştirildi. Bu hücreler geniş ve düz olduğundan, 2B geniş alanlı görüntülerde 13 , 14 mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için çok uygundurlar. Bununla birlikte, küçük değişikliklerle bu yöntem, diğer yapışık hücre tipleri için de geçerlidir. Üstelik, CM-H2 DCFDA ve TMRM'nin kombinasyonunun yanında, iş akışı farklı moleküler özgüllükleri olan 1 , 15'e sahip çeşitli floresan boya çiftlerine uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol, NHDF hücreleri için ve materyal dosyasında belirtilen çoklu plakalar kullanılarak gerçekleştirildi. İş akışına genel bir bakış için Şekil 1'e bakın.
1. Reaktiflerin Hazırlanması
- Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 10 v / v Fetal Sığır Serumu (FBS) ve 100 IU / mL penisilin ve 100 IU / mL streptomisin (PS) ile takviye ederek komple ortam hazırlayın. 500 mL komple ortam için, 445 mL DMEM'ye 50 mL FBS ve 5 mL PS ilave edin.
- Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (magnezyum ve kalsiyum ile, fakat fenol kırmızısı olmadan) 20 mM HEPES ile takviye ederek HBSS-HEPES (HH) görüntüleme tamponunu hazırlayın. 500 mL HH için, 490 mL HBSS'ye 10 mL 1M HEPES stok solüsyonu ekleyin. PH değerini teyit edin ve gerektiğinde pH 7.2 değerine ayarlayın.
- CM0H2 DCFDA liyofilize edilmiş tozun 50 ug'sini 86.5 ° C'de çözündürerek 1 mM CM-H2 DCFDA stok solüsyonu hazırlayın.# 181; L susuz DMSO. Vorteksleme veya pipetleme ile karıştırın ve kahverengi mikrosantrifüj tüplerinde 20 μL alikotlar yapın. -20 ° C'de karanlıkta saklayın ve 1 hafta içinde kullanın. N2 ortamında depolanırsa raf ömrü en az 1 ay artabilir.
- 25 mM TMRM tozunu 50 mL susuz DMSO'ya eriterek 1 mM TMRM stok solüsyonu hazırlayın. Vorteksleme veya pipetleme ile karıĢtırın ve kahverengi mikrosantrifüj tüplerinde 10 μL alikotlar yapın. -20 ° C'de karanlıkta saklayın. Bu çözüm en az bir yıl istikrarlıdır.
- % 70 stok çözeltisinden (10 uL / 96 oyuklu plaka) doğrudan bir miktar pipetleyerek her deney için Tert -bütil peroksit stokunun (~ 7 M) taze bir bölüm hazırlayın. Daha sonra kullanana kadar bu alikuotu 4 ° C'de tutun.
- Antikor çalışma çözeltisini (AB), iki ikincil antikoru (Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşanı ve CY3 eşek tavşanı) 1 kez, 1x HH-Bu'da 1,000 kez seyrelterek hazırlayınffer.
2. Mikroskop ve Alıcı Protokolün Kurulumu (± 15 dakika)
NOT: Görüntü elde etme işlemi, otomatik bir sahne ve panjurlarla donatılmış geniş alanlı bir mikroskop ile ve 20X hava Planlı düzeltilmiş objektif (NA = 0.75) ve EM-CCD kamera kullanan, donanıma dayalı bir otofokus sistemi ile gerçekleştirilir. Deneyi ilk kez kurarken, protokolün talimatlarına göre lekelenmiş kontrol hücreleri içeren bir test plakası, XY aşamasını kalibre etmek ve edinme ayarlarını optimize etmek için kullanılır. Kazanç ayarları önceden belirlenmişse, kalibrasyon boş bir plaka kullanılarak yapılabilir.
- Amacı mutlak taban seviyesine indirin ve yazılım talimatlarını izleyen XY aşamasını kalibre edin.
- Doğru filtre küplerinin takıldığından emin olun. CM-H 2 DCFDA'yı görselleştirmek için, 472/30 nm uyarma bant geçiren filtre, 495 nm'lik kesme dikrolu standart bir GFP filtre küveti kullanınBuz aynası ve 520/35 nm bant geçiren emisyon filtresi. TMRM için, 540/25 nm bant geçiren uyarılma filtresi, 565 nm'lik kesme dikroik ayna ve 605/55 nm bant geçiş emisyon filtresi ile TRITC için bir filtre küpü kullanın.
- Edinme yazılımını kullanarak bir görüntüleme protokolü oluşturun.
- Yazılım içinde bulunan mevcut plakalar listesinden doğru tipte çoklu plakayı seçin (üretici ve kod). Alternatif olarak plakalar ve kuyu boyutları kullanarak kendi çok plakalı tabla biçiminizi tanımlayın.
- Kuyu plakasını yazılımın talimatlarına uygun olarak, örneğin dört dış köşe kuyusunun iki köşesini tanımlayarak hizalayın. Bu adım fotoğraf makinesi yönü varyasyonlarını kapsar.
- Edinilmesi gereken kuyuları seçin. Bu seçenek yazılımda mevcut değilse, seçilen kuyulara karşılık gelen manuel olarak tanımlanmış bir XY-lokasyonları seti kullanın.
- Alım ayarlarını (pozlama süresi, lamba yoğunluğu, EM kazancı) optimize edin.İki kanalı ayrı olarak test plakasını kullanın. Floresans uyarma ışığının kendisinin ROS'u uyarmasıyla pozlama ve yoğunluğu en aza indirin. Ancak, sinyalin arka plan oranına, TBHP tedavisinden önce bazal CM-H 2 DCFDA ve TMRM için en az 2 olduğundan ve TBHP tedavisinden sonra doygunluğun olmadığından emin olun. Edinim ayarları büyük oranda kullanılan mikroskopi kurulumuna ve hücre türüne bağlıdır ancak referans olarak, ışık kaynağı olarak 130 W metal halid ampulünü ve protokolün talimatlarına göre boyanan NHDF hücrelerini kullanırken gösterge ayarları aşağıdaki gibidir: her iki CM- H 2 DCFDA ve TMRM, sırasıyla 15 (13 MHz; 14-bit) ve 4 (27 MHz; 14-bit) EM kazancı ile kombine edilen 200 ms'lik bir maruz kalma süresi ve ND filtre 8 kullanılmıştır. Belirli bir kurulum ve hücre türü için optimize edildiğinde, bu adım atlanabilir.
NOT: edinme ayarlarının tüm görüntüleme işlemi boyunca aynı tutulması esastır. Büyük ölçekli, çok günlük deneyler için, lamba staBilitelik, düzenli kalite kontrolü ile garanti altına alınmalıdır. - Ardışık bir lambda (dalga boyu) edinimi içeren bir edinim protokolü tanımlayın. Ölçümden önce ışık maruziyetini en aza indirgemek için, ilk önce edinilecek CM-H2 DCFDA kanalını seçin.
- 2.3.4'te tanımlanan edinim protokolünü kullanarak kuyu seçiminin her bir kuyusunun ortasına yerleştirilmiş düzenli olarak aralıklı, örtüşmeyen 4 adet görüntü elde etmek için iyi plakalı bir halkayı tanımlayın. Kayıplı görüntü toplama, yani soldan sağa , önce B02'den B11'e, sonra geri sağdan sola, C11'den C02 ye kadar ( şekil 2A ) seçin. Bu, soldan sağa resim edinme ile karşılaştırıldığında zamandan kazandırır. Bu seçenek yazılımda mevcut değilse, 2.3.3'te oluşturulan XY konumlarının özel setini bu görüntüleme modelini alacak şekilde ayarlayın.
- Yeniden gözden geçirme imkânı sağlamak için, görüntüleme konumlarının XY koordinatlarını kaydedin ( örn . Ayrı bir xml dosyası)Mikroskop yeniden kalibre edilmesi durumunda. Bu tahlilin okuması, aynı hücreler için bir post-hoc immünofloresan (IF) boyama ile korele edilmesi gerekiyorsa, bu özellikle önemlidir.
3 . 96-yuvalı bir plakada tohumlanan hücreler (45 - 90 dk, Farklı Hücre Hatlarının Sayısına Göre)
- Sınıf 2 biyogüvenlik kabini gibi steril ortamda çalışın ve eldiven giyin.
- Damıtılmış su içinde% 70 v / v etanol kullanarak tüm yüzeyleri ve malzemeleri temizleyin.
- İnkübatörden% 90 birleşmiş hücre kültürü bulunan bir hücre kültürü balonu alın ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
- Hücreleri PBS 1x ile iki kez yıkayın.
- Hücrelere,% 0.05'lik tripsin-EDTA çözeltisinin uygun miktarını ekleyin, komple hücre yüzeyinin kaplandığından emin olun ( örneğin , bir T25 şişesi için 1 mL) ve 37 ° C'de ve% 5 C02'de 2 dakika inkübe edin.
- Tüm hücreler ayrılırsa (mikroskopta kontrol edin) ), Tripsin-EDTA çözeltisini inaktive etmek için kültür ortamı (DMEM +% 10 FBS +% 1 penisilin-streptomisin; T25 şişesi içinde ± 4 mL) ilave edin.
- Oda sıcaklığında 300 xg'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın ve hücre peletini kültür ortamında tekrar süspanse edin. Hücre sayımı ile uyumlu bir hücre konsantrasyonu elde etmek için her hücre türü için ortam miktarını belirleyin. Tipik olarak,% 90 konfluent T25 NHDF şişesi yaklaşık 1-1.5 milyon hücre içerir, bunlar 3-4 mL kültür ortamında yeniden askıya alınır.
- Bir hücre sayma odası veya Coulter sayacı kullanarak hücreleri sayın.
- İnce 60'lık bir plakanın iç 60 kuyusunun her birinde, ince sürekli polistiren veya cam altlı (görüntü sırasında bitişik kuyular arasında dağılma ve çapraz konuşmayı önlemek için siyah) 8000-10.000 hücre tohumlandı. Farklı koşullar / işlemler / hücre hatları kullanırken, plak etkilerini en aza indirgemek için tohumlama yerlerini homojen bir şekilde plakaya dağıtın (Incir "> Şekil 2A) B01 ve A01 kuyularının dışındaki dış kuyular, kenar efektlerine daha yatkın oldukları için kullanılmazlar.
- B01'de 8000-10.000 hücre tohumlandı. Bu kuyu, görüntü elde etmeden hemen önce odağı ayarlamak için kullanılacaktır.
- Kuyu ve çevre arasındaki gradyanlar (sıcaklık, nem, vb. ) En aza indirgemek için boş olan dış kuyuları ortamla doldurun.
- Hücrelerin yamalardan büyümesini önlemek için inkübatöre tekrar koymadan önce plakaya hafifçe dokunun.
- Hücreleri 24 saat boyunca veya yaklaşık birleşik bir dereceye kadar kültürleyin. % 70.
- Deneyin tedavi bilgilerini "Setup.xlsx" adlı bir e-tabloya kaydedin. Dosya dört sütun içermelidir ve veri analizi sırasında tedavileri kuyularla ve görüntü bilgileriyle bağlantılandırmak için kullanılacaktır. Dört sütun şunlardır: 'İyi', 'Tedavi Numarası', 'Tedavi' ve 'Kontrol' (her kuyu için bir sıra). Her tedavi birleştiğindeArsaların X ekseni üzerindeki işlemlerin sırasını belirlemek için veri görselleştirme sırasında kullanılan benzersiz bir tedavi numarası ile. Kontrol sütunu, geçerli sıradaki muamele için kontrol olarak işlev gören tedaviyi belirtir. Tipik bir deneysel düzenin ve buna karşılık gelen kurulum dosyalarının örnekleri Şekil 2'de gösterilmektedir.
4. CM-H 2 DCFDA ve TMRM ile Hücrelerin Yüklenmesi (± 45 dakika)
NOT: Deney günü hücrelerin tutulması steril bir ortamda (biyogüvenlik kabini) yapılabilir, ancak hücreler atılacak veya doğrudan test sonrasında sabitleneceğinden, bu zorunlu değildir.
- HH tamponunu 37 ° C'ye ısıtın.
- 1 mM stok solüsyonunu HH tamponu içinde 50 kez seyrelterek 20 μM TMRM çalışma solüsyonu hazırlayın (1 mıkron 10 μL TMRM stok solüsyonuna 490 μL HH tamponu ilave edin).
- Yük hazırla2 μM CM-H 2 DCFDA ve 100 nM TMRM içeren bir solüsyon. Bu amaçla, 1 mM CM-H2 DCFDA stok solüsyonu 500x ve 20 μM TMRM çalışma solüsyonu 200x HH tamponu içinde seyreltin.
- Tipik olarak, 60 kuyucuk için, 75 mL yükleme solüsyonu hazırlayın; bu hacim, 7447.5 μL HH'ye 15 μL CM-H 2 DCFDA ve 37.5 μL TMRM solüsyonu ilave ederek hazırlanır.
- Kültür ortamını plakaları ters çevirerek tek bir sıvı hareketi ile hücrelerden atın.
- Çok kanallı bir pipet (100 uL / çukur) kullanarak HH tamponu ile hücreleri hafifçe iki kez yıkayın. Tek bir akışkan hareketle plakayı ters çevirerek HH tamponunu yıkama adımları arasına atın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak tekrar her bir oyuğa 100 μL yükleme çözeltisi ekleyerek hücreleri CM-H 2 DCFDA ve TMRM ile yükleyin. Karanlıkta, oda sıcaklığında 25 dakika inkübe edin. Unutmayın B01.
- Bu 25 dakika boyunca, oksidan TBHP'nin çalışma solüsyonlarını hazırlayın ve mikroskop ve aksesuar donanımının açık olduğundan emin olun.
- Çalışma solüsyonunu hazırlayın I: 7M stok solüsyonunu 70x 100 mM'ye seyreltin (690 μL HH tamponu içinde 10 μL stok).
- Çalışma solüsyonu II hazırlayın: WS I 100x'i 1 mM'ye seyreltin (990 μL HH tamponunda 10 μL WS I).
- Çalışma solüsyonu III hazırlayın: WS III 25x'i 40 μM'ye seyreltin (60 kuyu için 7200 μL HH tamponda 300 μL WS II ekleyin).
- 25 dakika sonra hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi iki kez 100 uL HH tamponu ile yıkayın.
- 60 iç çukura 100 μL HH tamponu ekleyin.
5. Bazal ROS Düzeyleri ve Mitokondriyal Morfonksiyonu Ölçmek için İlk Canlı Görüntüleme Turu (± 15 dakika)
- Satın alma yazılımının çalışır durumda olduğundan ve görüntüleme protokolünün yüklendiğinden emin olun.
- Mikroskopta plakayı takın, donanımı açınSed otofokus sistemini kullanın ve TM01M kanalını kullanarak otofokus ofsetini ayarlamak için iyi B01 kullanın. Bu prosedür, CM-H2 DCFDA sinyal yoğunluğunda bir artış meydana getirdiğinden, bu kuyruk, aşağı akış görüntü analizinden çıkarılır.
- Görüntüleme protokolünü çalıştırın.
6. İndüklenen ROS Seviyelerini Ölçmek İçin TBHP Eklenmesinden Sonra İkinci Canlı Görüntüleme Yuvarlak (± 20 dakika)
- Mikroskoptan dikkatlice 96 oyuklu plakayı çıkarın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak her göze 100 μL TBHP WS III (40 μM) ekleyin (Kuyularda 20 μM TBHP konsantrasyonu elde edilir). Bu bileşik, indüklenen ROS düzeylerini ölçmek için bir araç olduğu kadar CM-H2 DCFDA boyamasında (sinyalin yükselmesi için) dahili pozitif bir kontrol olarak kullanılır.
NOT: H 2 O 2 , TBHP yerine de kullanılabilir, ancak bu bileşik daha az kararlıdır ve bu nedenle daha az güvenilirdir. - TBHP'nin tamamen reaksiyona girmesine izin vermek için en az 3 dakika bekleyin wIkincisi CM-H 2 DCFDA.
- Bu süre zarfında, iyi A01'e 100 μL antikor çalışma solüsyonu (1 / 1,000) ekleyin.
- Plakayı mikroskop üzerine geri monte edin ve yeniden B01 odak noktasını kullanarak odağı kontrol edin.
- Aynı görüntüleme protokolünü kullanarak ilk görüntüleme turunda olduğu gibi aynı konumları elde edin.
- Edindiğiniz veri kümelerini tek bir tiff dosyası olarak, altına ayılarla ayrılmış plakaya, TBHP öncesi veya sonrası tretmanlara, kuyuya, kanala ve kanaldan referans alan standart terminolojiyi kullanarak tek tek tiff dosyaları olarak dışa aktarın. Plaka 1, TBHP öncesi işlem, iyi B02, alan 1 ve kanal 1 için 'P01_Pre_B02_0001_C1'. Bu bilgi, görüntü analizinde ( örneğin , uygun segmentasyon ayarlarını seçmek için) ve veri analizi sırasında (analiz verilerini bağlamak için kullanılır Doğru tedaviler ile).
- Alım protokolünü kullanarak A01 kuyusunun ortasındaki dört konumda her iki kanal için düz alan görüntüleri elde edin. Inci kaydedinAşağıdaki standart terminolojiyi kullanarak diğer görüntülerle aynı klasöre bireysel tiff dosyaları olarak girin: '1 no'lu plaka 1, alan 1 ve kanal 1 için' P01_FF_A01_0001_C1 '. Sinyallerin dinamik aralıkta olduğundan emin olun; Doygunluk durumunda, daha düşük konsantrasyonda bir antikor çalışma solüsyonu kullanın.
- Plakayı atın veya ileri işlem için kaydedin.
NOT: Plakayı mikroskoptan çıkarmak yerine, TBHP çözümünü eklemek için çok kanallı bir pipet kullanarak, otomatikleştirilmiş bir pipet mikroskop sahnesine yerleştirilebilir ve bir tetikleyerek işlev görecek şekilde satın alma yazılımı ile bağlantı kurabilir. Bu, bir sonraki kuyuya geçmeden önce, TBHP'yi ilk kazanımdan hemen sonra her kuyuya eklemeye izin verir. Bu şekilde, ilk görüntüleme turu tamamlandığında ikincisi hemen başlayabilir ve tüm kuyular TBHP ile eşit bir inkübasyon süresine sahip olacaklardır.
7. Görüntü İşleme ve Analiz (± 30 dakika / per96 gözlü plaka)
NOT: Tüm görüntü işleme FIJI (http://fiji.sc), ImageJ freeware paketlenmiş bir sürümünde yapılır. Hücre içi ROS ve mitokondriyal sinyaller ile morfolojik parametrelerin otomatik olarak analizi için özel bir senaryo yazılmıştır (RedoxMetrics.ijm, istek üzerine temin edilebilir). Altta yatan algoritmalar Sieprath ve ark. 1 .
- FIJI'nın kurulu ve çalışır durumda olduğundan emin olun.
- FIJI'yi başlatın ve makro setini yükleyin (Eklentiler -> Makrolar -> Yükle ...). Bu, Şekil 3A'da gösterildiği gibi, analiz ayarlarını optimize etmek için birkaç yeni makro komutunun yanı sıra bir dizi eylem aracını da çağıracaktır .
- 'S' düğmesine tıklayarak analiz ayarlarını yapmak için kurulum arayüzünü açın ( Şekil 3B ).
- Görüntü türünü, kanal sayısını ve kullanılan kuyuyu seçinDüz görüntü elde etmek için.
- Hangi kanalın hücreleri (CM-H2 DCFDA kanalı) veya mitokondri (TMRM-kanalı) içerdiğini belirtin ve görüntü kalitesine bağlı olarak her kanal için ön işleme ve segmentasyon parametrelerini ayarlayın ( Şekil 3B ). Sırasıyla arka plan çıkarma veya kontrastlı sınırlı uyarlanabilir histogram eşitleme 16 gerçekleştirmek için 'Arka Plan' ve 'Kontrast' onay kutularını işaretleyin. Hücrelerin Gauss bulanıklaştırılması ve mitokondriyanın Laplace geliştirilmesi için bir sigma tanımlayın. Otomatik bir eşikleme algoritması seçin ve boyut hariç tutma sınırlarını (piksel cinsinden) doldurun. Otomatik eşikleme algoritması yerine sabit bir eşik seçilirse üst eşik değerini girin.
- Elde edilen veri kümelerinin seçilen birkaç görüntüsündeki segmentasyon ayarlarını açarak ve sırasıyla hücre veya mitokondriyal segmentasyon için menüde 'C' veya 'M' düğmelerini tıklatarak test edin,Ve gerekirse ayarları yapın. Örnek bir sonuç Şekil 3C'de gösterilmektedir .
- Parti analizini, '#' düğmesini tıklayıp resimlerin bulunduğu klasörü seçerek, ilgili klasör (ler) üzerinde çalıştırın. Her klasör için, görüntü başına ayrı ROI setleri (zip dosyaları) ve sonuç dosyaları (.txt) içeren yeni bir 'Çıktı' dizini üretecektir. Her iki kanal için sonuç dosyaları yoğunluk ve morfolojik tanımlayıcılar içeriyor. CM-H 2 DCFDA kanalı (hücreleri) sonuç dosyası, bir resim içindeki toplam ROI'lerin ortalama değerini tanımlayıcı başına içerir. TMRM kanalı için sonuçlar dosyası, her ayrı ayrı bölünmüş mitokondriyal ROI için tanımlayıcı başına bir değer içerir.
- Toplu analizden sonra, 'V' düğmesine tıklayarak tüm ROI yer paylaşımı ile tüm görüntülerin bir hiper istifi olan bir 'Doğrulama yığıtı' üzerindeki segmentasyon performansını görsel olarak doğrulayın. Bu yolla, aşırı-/ Alt bölümleme, odak görüntüler dışında veya toz parçacıkları / görüntülerde bulunan lifler önceden hızlı bir şekilde fark edilebilir. Daha fazla kürasyon, veri kalitesi kontrolü sırasında yapılabilir (§8).
8. Veri Analizi, Kalite Kontrol (QC) ve Görselleştirme
Ham verilerin işlenmesi ve analizi, R statistik freeware (http://www.rproject.org - version 3.3.2) ve RStudio (http://www.rstudio.com/ - version 1.0.44) kullanılarak yapılır. Sonuçları çabucak elde etmek ve görselleştirmek için, sıcaklık haritaları ve kutu çizgelerindeki verileri bütünleştiren ve görselleştiren ve aynı zamanda istatistiksel analizler gerçekleştiren sezgisel bir Shiny uygulaması 17 (istek üzerine temin edilebilir) tasarlanmıştır. Genel olarak, iş akışı iki ardışık adımdan oluşur. İlk olarak, veriler anormal veri noktalarını algılamak için 96 gözlü plaka başına işlenir ve denetlenir. İkinci olarak, belirli bir deneyin tüm plakalarından seçilmiş veriler birleştirildi ve non-parametrik çokluDeğişken testler 18 ve bir ana bileşen analizi.
- R ve RStudio'nun kurulu ve çalışır durumda olduğundan emin olun.
- RStudio'yu başlatın.
- RedoxMetrics parlak uygulamasını açın ve uygulamayı çalıştırın (harici bir tarayıcıda çalıştırmayı seçin).
- 'Girdi' sayfasında, RedoxMetrics.ijm dosyasındaki sonuç dosyalarının bulunduğu dizini seçin.
- 'Setup.xlsx' (adım 3.15'de oluşturulmuş) dizininin de bu dizinde bulunduğundan emin olun.
- Sonuç dosyaları ve kurulum bilgileri otomatik olarak içe aktarılır, yeniden düzenlenir ve görselleştirilir.
- 'Deneysel kurulum' sayfası deneyin düzenini gösterir. Doğrulama için bu sayfayı kullanın.
- Bir sonraki sayfada 'levha başına sonuçlar', renk kodlu çoklu kuyu plakası düzeninde ve iyi isim ve resim numarasıyla etiketlenmiş aykırı değerlere sahip kutu çizimlerinde, her plakanın verilerini ayrı ayrı gösterir. Sonuncusu, kolay denetim ve identAnormal veri noktalarının belirtileri (belirli bir muamele için ölçülen ortalama değerlerle karşılaştırıldığında aşırı yüksek veya düşük değerler - örnek için Şekil 4'e bakın).
Bu bilgileri kullanarak, anormal noktalara karşılık gelen görüntüleri doğrulayın. Anormallikler tespit edilirse, analizden çıkarılması gerekir. Çoğu anormallik, görüntünün (kısmi) odağın dışına çıktığında veya yüksek flüoresan toz parçacıklarının düzgün bölünmeyi bozması durumunda yanlış segmentasyon nedeniyle oluşur. Aşırı durumlarda, doğrulama yığın aracını kullanarak hızlı bir şekilde lekelenebilir (adım 7.5), ancak bu aşamada daha ufak olaylar keşfedilmiştir. Anormal değer için belirgin veya teknik bir neden bulunamadığında, görüntü analizden kaldırılmamalıdır. - İsteğe bağlı: 'Bırak' adı verilen yalnızca bir sütun içeren 'Drop.xlsx' adlı yeni bir e-tablo oluşturun. Bu sütunda, tüm görüntülerin dosya adlarını (".tif" uzantısı dahil) listeleyin(Adım 7.5 veya adım 8.6.2'de tanımlanan) analizden kaldırılması gerekenler. Bu dosyayı 'giriş' sayfasını kullanarak yükleyin.
- 'Sonuçların tamamı deneyi' sayfası birleştirilen tüm tabakalardan alınan sonuçları gösterir. Bir açılan dosya yüklendiyse, bu dosya belirtilen veri noktalarını analizden kaldırmak için kullanılır.
Her bir parametre için ayrı ayrı veriler, ilgili kontrollerine göre plaka başına normalleştirilir. Daha sonra, tüm plakalardan elde edilen veriler birleştirilir, ardından nparcomp paketi 18'den parametrik olmayan çok değişkenli testler yapılır. Sadece 2 tedavi karşılaştırıldığında parametrik olmayan Behrens-Fisher problemi için iki numune testi yapılır. 2'den fazla tedavi için non-parametrik kontrastlı çoklu karşılaştırma testi kullanılır. Sonuçlar, kutu çizimleri kullanılarak görselleştirilir. - 'Küme analizi' sayfası bir ana bileşen analizi (PCA - R çekirdek 'istatistikler' paketi) sonuçlarını gösterir. 5 parametreden veri (baSal ve indüklenen ROS ve mitokondriyal zar potansiyeli, boyut ve dairesellik), farklı tedavileri duyarlı bir redoks profiline dayalı olarak ayırt etmek için birleştirilir. Bu amaçla ana bileşen analizi (PCA) gerçekleştirilir (R core 'stats' paketi). Sonuçlar biplot (ggbiplot paketi - http://github.com/vqv/ggbiplot) kullanılarak görselleştirilir.
- İşlenmiş ve yeniden düzenlenmiş verileri içeren arka uç veri çerçevelerini indirmek için 'veri indir' sayfasını kullanın; böylece daha gelişmiş veri görselleştirme veya istatistiksel analizler için yeniden kullanılabilirler.
NOT: Tipik tuzaklar ve olası çözümler Tablo 1'de listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deney, çeşitli kontrol deneyleri kullanılarak kıyaslandı; bunların sonuçları Sieprath ve diğ. 1 . Kısacası, CM-H2 DCFDA ve TMRM'nin , sırasıyla , hücre içi ROS ve Δψ m'deki dışa bağımlı değişmelere karşı flüoresan yanıtı, dinamik aralığı belirlemek için nicelendirildi. CM-H 2 DCFDA için NHDF, 10 uM ila 160 uM aralığında artan TBHP konsantrasyonları ile tedavi edildiğinde flüoresans sinyalinde doğrusal bir artış gösterdi. Benzer şekilde, TMRM için, NHDF hücreleri, 1 ila 10 ug / μL aralık içinde artan oligomisin konsantrasyonları (Δψ m hiperpolarizasyona neden olan) ile tedavi edildiğinde mitokondriyal flüoresansında doğrusal bir artış gösterdi. Tersine, Δψ m depolarizasyonunu indükleyen bir antibiyotik olan valinomisin'in gerçek zamanlı ilavesi, kademeli, kantitatifTMRM floresansının azaltılabilir hali .
Test, hücre tipleri veya tedavileri arasındaki redoks durumundaki farklılıkları ortaya çıkarmak için 1 , 15 deneyleri için de kullanılmıştır. Bunu göstermek için, NHDF'nin HIV proteaz inhibitörü Saquinavir (SQV) ile işleme tabi tutulduğu bir deneyin sonuçları gösterilmektedir ( Şekil 5 ). Tarif edilen protokolü kullanarak, DMSO ile muamele edilen kontrol hücrelerine kıyasla hem bazal hem de indüklenmiş ROS seviyeleri için belirgin bir artış tespit edildi ( Şekil 5B ). SQV tedavisi mitokondriyal morfofonksiyonu da önemli derecede etkiledi. Morfolojik olarak, mitokondriyal, yüksek bir dairesellik ve bireysel mitokondrinin daha küçük ortalama boyutu ile teyit edilen, oldukça parçalanmış bir model kazanmıştır. İşlevsel olarak, Δψ m , mitok başına ortalama TMRM sinyali olarak ölçülmüştürOndrial piksel de önemli ölçüde artmıştır ( Şekil 5A ). Yukarıda açıklanan 5 parametrenin verilerini birleştirirken, iki koşul (kontrol ve SQV) ana bileşen analizi ile birbirinden net bir şekilde ayrılabilir. Üç bağımsız biyolojik çoğaltmadan elde edilen veriler, toplam varyansın% 81.4'ünü açıklayan ilk iki ana bileşeni gösteren 2D-biplot'ta gösterilmektedir ( Şekil 5C ). Bu, tahlilin sağlamlığını kanıtlar ve kombine göstergenin, hücresel sağlık durumunun hassas bir göstergesi olabileceğini önermektedir.
Şekil 1 : Hücre içi Bazal ve İndüklenmiş ROS Düzeyleri ile Mitokondrial Morfofonksiyonun Eşzamanlı Ölçümü için Yüksek İçerikli Görüntüleme Analizine Genel Bir Bakış. ( A ) SAna işletme bloklarının kimyasal gösterimi. ( B ) Resimli örnek: hücreler çok sayıda özdeş 96 oyuklu plakaya ekilir. Standart bir kuyu plakası düzeni Şekil 2A'da daha ayrıntılı olarak gösterilmiştir . Boyama sonrasında, her kuyunun ortasında kanal başına 4 görüntü elde edilir, hem TBHP öncesi hem de sonrası işlem uygulanır, bu da yerleştirilmiş büyük montajlarla gösterilir. Görüntü analizinden sonra yoğunluk sonuçları, iyi plaka yerleşimine yansıtılan sezgisel bir ısı haritasını kullanarak görselleştirilir. Bu plaka efektlerinin veya anormal kuyuların hızlı tespit edilmesine izin verir. Komple deneysel veri setlerinin küratörlüğünden sonra, nihai veri analizi tek ve çok parametreli çıktılar ile sonuçlanır. (Bu resim Springer'in izniyle referans 1'den değiştirildi) Daha büyük bir versiyona ulaşmak için lütfen tıklayınızBu rakam n.
Şekil 2 : Tipik bir Deneysel 96-Bölme Düzeni ve Karşılık gelen 'Kurulum' Dosyası. ( A ) 4 farklı koşul plakanın iç kuyularında homojen olarak dağıtılır. İyi B01 hücreleri de içerir, ancak yalnızca görüntülemeden önce ilk PFS ofsetini ayarlamak için kullanılır. Diğer dış kuyular hücre kültürü sırasında gradyanlar (sıcaklık, nem, vb. ) En aza indirgemek için yalnızca kültür ortamı ile doldurulur. Görüntü toplama, dolambaçlı bir şekilde, yani ilk soldan sağa doğru, iyi B02'den B11'e, daha sonra sağdan sola, C11'den C02'ye kadar devam eder ve devam eder. Görüntü elde ettikten sonra, düz alan görüntüleri, resim A ve B'de mekansal aydınlatma heterojenliğini düzeltmek için kullanılan A01'de elde edilir. alysis. ( B ) İlgili kurulum dosyası (Setup.xlsx), deney düzeni hakkında bilgi içeren bir elektronik tablodur. Çoklu plakadaki her bir muamele yerini ve ilgili kontrollerini belirtir. Her sıra bir kuyu temsil eder. Her muamele, verilerin analizi esnasında üretilen parsellerin X ekseni üzerinde muamele sırasını belirlemek için kullanılan kendi benzersiz muamele numarasına sahiptir. 'Kontrol' sütunu aynı satırda belirtilen tedavinin verilerini normalleştirmek için bir kontrol olarak kullanılması gereken tedaviyi içerir. Örnekte, tedavi 1, diğer tüm tedavilerden gelen verilerin normalleştirilmesi için kontrol olarak kullanılan tedavi yöntemidir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
9 / 55449fig3.jpg "/>
Şekil 3 : RedoxMetrics Makro seti, Yerleşim ve Kurulum Arabirimi. ( A ) FIJI için RedoxMetrics makro seti kurulduğunda, menü çubuğunda analiz ayarlarını test etmek ve optimize etmek için birkaç yeni makro komutunun yanı sıra bir dizi eylem aracı oluşturulur. 'S' kurulum arayüzünü çağırır. 'F' açık bir resim üzerinde düz bir düzeltme yapar. 'C' ve 'M', kurulumda seçilen analiz ayarlarını kullanarak tek bir açılmış görüntü üzerinde sırasıyla hücresel bölgeler ("Hücre", CM-H2DCFDA kanalı) ve mitokondriyal bölgeler ("Mito", TMRM kanalları) için bir test bölümlemesi gerçekleştirir Arayüzü, segmentli ilgi alanlarının (ROI'lar) bir yer paylaşımı döndürerek. '#', Kurulum arayüzünde belirtilen ayarları (genellikle bir veya birkaç resim üzerinde doğrulama yapıldıktan sonra) kullanarak bir klasör klasörü üzerinde toplu analiz gerçekleştirir. 'V', kullanarak bir doğrulama hiperstack oluştururG Toplu analizdeki çıktı verilerini. Bu hiperstak, klasörde mevcut olan tüm ham görüntülerin ve ilgili ilgi bölgelerinin (ikinci bir kanalda çizilmiş) bileşik bir görüntüsüdür. 'O' bölümlenmiş bölgenin yer paylaşımını göstermek veya gizlemek için tıklanabilir. ( B ) Kurulum arayüzü. Burada görüntü türünü (uzantı), kanal sayısını (dalga boyları) ve düzlük düzeltmesi için kullanılan kuyu gibi genel bilgiler de dahil olmak üzere tüm analiz ayarları seçilir. Ardından, resim içerik türüne özgü ayarlar (Hücre veya Mito) var. Her iki durumda da, bir arka plan düzeltme ("arka plan") ve yerel kontrast geliştirme ("kontrast") eklemek için seçenekler (onay kutuları) vardır. Hücre bölütlemesi için, gürültüyü azaltmak için bir Gauss bulanıklık yarıçapı (sigma) tanımlama seçeneği bulunur. Mitoz segmentasyonu için, mitokondrinin seçici bir şekilde arttırılması için bir Laplace operatörünün yarıçapını tanımlama seçeneği vardır. Sonraki segmentasyon pIçerik türüne göre tanımlanabilen otomatik (veya sabit) eşikleme yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir. Sabit bir eşik seçildiğinde, üst eşik değeri manuel olarak sağlanabilir. Son olarak, analiz, minimum ve maksimum boyutlara düşen nesnelerin bir bölümüyle sınırlanabilir. ( C ) "C" (üst) veya "M" (alt) komutu ile çalıştırılan ve sarı renkle ilgi gören bölgelerle birlikte gri olarak çiğ görüntü olarak gösterilen bir bölütleme sonucuna bir örnek. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Ara Veri Görselleştirmelerinin Resimli Örneği. ( A ) B02 ve D07 kuyularının göründüğü çok plakalı plaka görselleştirmeşüpheli. ( B ) Aynı verileri temsil eden kutu çizgisi, dışsal değerler iyi isim ve resim adı ile etiketlenmiştir. F03_0003 ile birlikte, B02 ve D07 görüntüleri aykırı değerler olarak yeniden görünür. ( C ) Bu görüntülerin görsel olarak incelenmesi, segmentasyon hataları (kırmızı 'X' ile gösterilen) olduğundan B02_0000 ve D07_0001'in daha fazla analizden çıkarılması gerektiğini göstermektedir. F03_0003, görünür bölünme veya teknik hata olmadığı için tutulmalıdır. (Sapma için herhangi bir teknik sebep bulunmazsa, veriler kaldırılmamalıdır). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Birincil İnsan Fibrasında Saquinavir (SQV; 20 uM) EtkisiOblast (kontrol DMSO'dur). ( A ) TMRM ( B ) ile ölçülen mitokondriyal membran potansiyeli (ΔΨ m ) ve mitokondriyal morfoloji (dairesellık ve ortalama bireysel mitokondri boyutu) CM-H2 DCFDA ile ölçülen hücreiçi ROS'un bazal seviyeleri ve indüklenen ROS'a karşı tepki, ölçülmüştür 20μM TBHP ilavesinin ardından nispi kazanç olarak yoğunluk kazanması. ( C ) yukarıda açıklanan 5 değişken (bazal ve indüklenmiş ROS seviyeleri, ortalama mitokondrial boyut, dairesellik ve ΔΨ m ) üzerinde bir PCA analizinden ilk 2 ana bileşenin (PC'ler) 2D dağılımı. Siyah oklar, ana bileşenlere göre orijinal 5 değişkenin yönlerini temsil etmektedir. (Bağımsız çoğaltmalar farklı bir renkle çizilir; tüm veriler DMSO-kontrolüne göre normalize edilir; * = p değeri <0.05; ** = p değeri <0.01; *** = p değeri <0.001; Y -Eksenler, farklılıkları en iyi şekilde gösterecek şekilde ayarlandı; Bu rakam Springer'in izniyle referans 1'den değiştirildi.) Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız .
| Sorun | Potansiyel sebep | Olası çözüm |
| Görüntüleme sırasında kuyularda çok az hücre var | Çok az hücre toplandı | Görüntülemeden 24 saat önce daha fazla hücre tohumlandı |
| Zayıf hücre büyümesi | Kültür koşullarını kontrol edin (orta, sıcaklık kararlılığı, CO 2 kontrolü) | |
| Çok şiddetli yıkama adımları | Hücreleri uzakta yıkamaktan, nazikçe pipetlemekten kaçının | |
| Görüntüleme sırasında oyuklarda çok fazla hücre var | ÇokBirçok hücre tohumlandı | Görüntülemeden 24 saat önce tohum az hücreler |
| CM-H2 DCFDA floresanının uyarıya zayıf sinyaller veya lineer olmayan tepki | Çok düşük / yüksek boya konsantrasyonu kullanıldı | NHDF hücreleri dışında kullanılıyorsa, optimal yükleme konsantrasyonları ampirik olarak belirlenmelidir |
| Boya yükleme yetersizdir | Alma oranını arttırmak için% 0.02 w / v sürfaktan Pluronic-127'yi yükleme solüsyonuna ilave edin. | |
| CM-H 2 DCFDA sinyali, pozlama süresi boyunca görsel olarak artar | Çok yüksek boya konsantrasyonu | Boya konsantrasyonunu azalt |
| Uyarma yoğunluğu çok yüksek | ND filtreleri kullanarak uyarma yoğunluğunu azaltın ve / veya pozlama süresini azaltın | |
| CM-H 2 DCFDA yoğunluğu, kuyu plakası edinimi sırasında azalır | CM-H 2 DCFDA sızdırıyorhücre. | 2 mM Probenicid (anyon pompası inhibitörü) kullanın. Sızıntıyı azaltmak için yükleme çözeltisinin yanı sıra görüntüleme tamponunu ekleyin |
| TBHP ilavesinden sonra CM-H2 DCFDA sinyal yoğunluğunda bir artış görülmez | TBHP aktif değil | Yeni TBHP'yi kullanın |
| CM-H 2 DCFDA hücre dışına sızıyor. | Probenicid'i yukarıda tarif edildiği gibi kullanın. | |
| (Bazılarında) alınan görüntüler odak dışında görünüyor, kontrol edildiğinde odak tamam görünüyor. | Plaka eğik olarak monte edildi ve odağın PFS ofsetinin ötesine geçmesine neden oldu | Plakanın ve sahne seviyesinin montajını kontrol edin, Plakanın yerini değiştirin |
| Plakanın tabanı toz veya düzensizlikler içeriyor | Plakanın tabanını etanolle ıslanmış bir mercek kağıdı ile temizleyin | |
| Hücreler görüntüleme sırasında ölür | Uyarıcı yoğunluğunu azaltın veya kuyu başına daha az görüntü elde edin. | |
| Yanlış görüntüleme arabelleği bileşimi | Yenileme görüntüleme arabelleği | |
| Görüntülerde odak flüoresan lekeleri yok. | Müstakil hücreler odak dışında yüzüyor. | Yükleme protokolü sırasında daha yavaş yıkayın |
| Bir veya daha fazla kolon plakanın diğer oyuklarına göre daha düşük bir yoğunluğa sahiptir | Çok kanallı pipetten bir veya daha fazla ipucu sıkıca bağlanmadı ve bu nedenle bu kuyulara daha az muhabir eklendi. | Çok kanallı bir pipet kullandığınızda, tüm ipuçlarının mükemmel olup olmadığını iyice kontrol edin. |
| Görüntü yakalama esnasında odaklama dramatik biçimde sürükleniyor | Plakanın polistiren tabanı, bir yağ mercek kullanılırken daldırma yağı ile reaksiyona girebilir | Kuru bir mercek kullanın ya da bir gla ile çoklu plaka kullanınSs bottom |
| TMRM sinyal yoğunluğu, ilk ve son kuyuyu görüntüleme arasında artar | Raportör yükleme süresi yeterince uzun değildi, TMRM hala dengeye geliyor | Muhabir yükleme süresini arttır |
| TBHP tedavisinden sonra CM-H 2 DCFDA sinyali, kuyu plakası edinimi sırasında artar | TBHP ile ikinci görüntü turunun başlaması arasındaki zaman yeterince uzun değildi, TBHP halen CM-H2 DCFDA'yı oksitlemektedir. | TBHP ile ikinci görüntüleme turu arasındaki inkübasyon süresini artırın. (En az 3 dakika ile başlayın) |
| Düz alan görüntüleri doymuş | Antikor çalışma çözeltisi konsantre | Daha düşük konsantrasyonda bir antikor çalışma solüsyonu kullanın |
| Edinme ayarları optimize edilmiyor (yüksek maruz kalma süresi, ND filtresi düşük ...) | Edinme ayarlarını optimize edin,Sinyalin sensörün dinamik aralığında olması gerekir | |
| Düz alan görüntüleri karanlıktır. | Antikor çalışma solüsyonu seyreltilip | Daha yüksek konsantrasyonda antikor çalışma solüsyonu kullanın |
| Edinme ayarları optimize edilmiyor (yüksek maruz kalma süresi, ND filtresi düşük ...) | Alım ayarlarını optimize edin, sinyal sensörün dinamik aralığında olmalıdır | |
| Üzerinde / Alttan Düşünme Artefaktları | Eşik doğru ayarlanmamış | Eşik ayarını yapın |
| Boyut filtreleri düzgün şekilde ayarlanmamış | Görüntü analizi için min ve max boyut kriterlerini ayarlayın | |
| Hücre konfluansı çok yüksek | Doğru konfüzyon seviyesi, güvenilir görüntü analizi için çok önemlidir. NHDF'ye kıyasla diğer hücre tipleri için optimum ekim yoğunluğu ampirik olarak belirlenmelidir | |
| Parlak uygulama çalışmıyor | Yanlış dizin seçildi | Giriş sayfasındaki doğru dizini seçin. |
| Dizinde dosyalar eksik | Seçilen dizinde gerekli tüm dosyaların (imagej makrosu ve kurulum dosyası çıktısı) bulunduğundan emin olun | |
| Eksik paketler | Normalde uygulama gerekli tüm paketleri denetler ve yükler ancak bu başarısız olduğunda aşağıdaki paketleri elle kontrol edin: devtools, ggbiplot, pacman, ggplot2, plyr, nparcomp, data.table, readxl, gplots, ggbiplot, parlak, shinyFiles, pbapply Ve tüm bağımlılıklar dahil shinyjs. |
Tablo 1: Tipik tuzaklar ve olası çözümler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, NHDF'de hücre içi ROS düzeyleri ve mitokondriyal morfofonksiyonun eşzamanlı olarak ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. SQV ile tedavi edilen NHDF üzerine bir vaka çalışmasıyla performansı gösterildi. Sonuçlar, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 ayrı deneylerde de olsa, artmış ROS düzeyleri veya mitokondriyal disfonksiyonun tip 1 HIV proteaz inhibitörleri ile tedaviden sonra gözlemlendiği literatürdeki daha önceki kanıtları desteklemektedir. Önemli fark, tarif edilen tahlilin aynı canlı hücrelerde aynı anda bu parametreleri morfolojik verilerle birlikte ölçebildiğidir. Bu yaklaşımın en büyük avantajı, her iki faktörün birlikte uzayda ve tNedensel ilişkileri saptamaya izin veren ime. Belirli pertürbasyonların hassas bir redoks profilini üretmeye izin veren bir ana bileşen analizi gerçekleştirilir. Bununla birlikte, daha gelişmiş veri madenciliği teknikleri ve (denetlenen) kümeleme algoritmaları, tahmini redoks profillemeyi etkinleştirmek için çıkarılmış veriler üzerinde de kullanılabilir. Bu, dijital patolojideki tanısal veya prognostik sınıflandırma araçlarının yanı sıra terapötik hedefler için tarama için değerli bir özellik olabilir, örneğin güçlü sınıflandırma modelleri oluşturulduktan sonra, küçük molekül kütüphaneleri, oksidatif strese karşı koymak için terapötik adaylar bulmak üzere taranabilir; Insan mitokondriyal hastalıkları için terapi gelişiminde umut vadeden yol açan yeni bir ekran 26 .
Deney, NHDF için tasarlanmıştı fakat diğer yapışkan hücre tiplerine adapte edilebilir. Bu, boyama protokolünün ve raportör boya konsantrasyonlarının optimizasyonunu gerektirir. R miktarı Aşırı yükleme, soğutma nedeniyle doğrusal olmayan etkilere neden olabilir veya hatta sitotoksik hale gelebildiğinden, koruyucu boyanın en aza indirgenmesi gerekir 27 . Süspansiyon hücrelerine tahlilin uzatılması, bu tür hücrelerin fizyolojik olarak monte edilmesi ve gözlemlenmesindeki güçlüklerden ötürü daha az belirgindir. Bir lamel üzerinde sitospun veya yapışmayı indüklemek için serumsuz ortamda kültürlenebilirler, ancak bu işlemlerin her ikisi de fizyolojik koşullarla müdahale eder 28 , 29 . Bununla birlikte, bu kısıtlamalar, yaşamsal özelliklerini koruyan 30 küçük mikro kuyucuklarda sıkışmış olan bireysel hücreleri (yapışkan veya yapışkan olmayan) tutan mikro-paternli hücre kültürü destekleri kullanılarak veya görüntüleme sırasında hücreleri yakalamak için bir termo-tersinir hidrojel kullanılarak giderilebilir 31 . Bu yöntemler, hali hazırda, plazma membran potansiyelinin yüksek özünürlüklü taramasında veya tek tek süspansiyon hücrelerinde hücresel oksijenin taranması için kullanılmıştır= "Xref"> 32 , 33 veya canlı, oldukça hareketli parazitlerdeki intraselüler belirteçlerin görüntülenmesi 31 . Bu hücrelerdeki mitokondriyal ağın morfolojik analizi, dönen disk konfokal veya Bessel beam ışık saçan mikroskopi 34 , 35 gibi hızlı 3D kazanım özelliklerine ve analizlere ihtiyaç duyacağından, görüntüleme modalitesine de uyarlamalar yapılması gerekir. Morfolojik parametreleri hesaplarken Z-boyutunu dahil etmek.
Deney, 96 oyuklu plakalar için optimize edildi, ancak tabii ki, örneğin 384 oyuklu plakalara yükseltme yapmak daha uygun oldu. En büyük kısıtlayıcı faktör, plaka edinme zamanı, yani bütün kuyulardan görüntü elde etmek için geçen zamandır. Floresan sinyalleri, bu zaman çerçevesi boyunca dengeli kalmalıdır; böyleceBireysel kuyular. Ancak lekelenme geçici olduğu ve araştırılan süreç dinamik olduğu için bu bir sorun teşkil ediyor. Bu nedenle, flüoresan sinyalleri bir dizi çoğaltılmış deneyle ölçülmüştür ve bu CM-H2 DCFDA ve TMRM sinyallerinin boyanmadan sonra en az 50 dakika stabil kaldığını göstermiştir (değişim katsayısı <% 2). Bu, yaklaşık 40 dakikalık bir pencere verir. 96 gözlü bir plaka tipik olarak yaklaşık 10 dakika sürer. Böylece, 384-kuyucuklu plakalara yapılan ekstrapolasyon, kazanma süresini istikrarlı zaman aralığında tutacaktır. Görüntü başına ortalama 50 hücre (20X'lik bir objektif ve NHDF hücrelerinin kullanımına dayanılarak) ile, taramanın saat başına yaklaşık 30.000 hücre verisi elde edilecek ve bu da tahlilin istatistiksel gücüne büyük katkı sağlıyor. Flüoresan sinyali kararlılığını etkileyen diğer bir faktör de sıcaklıktır. CM-H2 DCFDA'nın (yani hücre içi veziküllerde boya birikmesi) vakum haline getirilmesini önlemek için, heteroGenetik boyama ve doğrusal olmayan etkilerle inkübasyon oda sıcaklığında 37 ° C yerine gerçekleşir. Stabilitenin yanı sıra, canlı hücrelerin floresan uyarılma ışığına maruz kalmasının ROS üretimini başlattığına dikkat etmek önemlidir. Bu, pozlama koşullarının (pozlama süresi ve uyarma ışığı yoğunluğu) mutlak bir minimumda tutulması gerektiği anlamına gelir. Aynı zamanda, gerçek görüntüler elde edildiğinde tüm oyukların yalnızca açığa çıkması gerektiği anlamına gelir. Bu, yazılımla etkinleştirilmiş otofokus yöntemlerini kullanmayı dışlar ve donanıma dayalı bir otofokus sisteminin kullanılmasını garanti eder.
Açıklanan yöntemin bir avantajı genel karakteridir. Spektral olarak uyumlu flüoresan gazetecilerin neredeyse tüm kombinasyonları kullanılabilir. Bu, canlı hücre 1 , 15 için mitokondriyal ROS'u ölçmek için Calcein / MitoSOX kombinasyonunu kullanarak gösterildi. Dahası, uygulamalar int ile sınırlı değildir Egrated ROS / mitokondrial ölçümü. Test, post hoc immün boyama ile uzatılabilir (ikinci görüntüleme turundan sonra). Tam görüntüleme yerleri kaydedildiğinden, redoks analizleri, aynı hücrelerdeki konum proteomikleri ile doğrudan ilişkilendirilebilir. Bu, genellikle redoks biyolojisini veya genel olarak flüoresan yoğunluklarını değerlendirmek için kullanılan diğer yöntemlerle tam tersine, moleküler okumayı büyük ölçüde artırır. Örneğin, florimetre (mikroplak okuyucu) nispeten düşük maliyet (temel kurulum € 4000 kadar düşüktür) ve sığ öğrenme eğrisi nedeniyle yaygın olarak kullanılır, ancak kara kutu olmakla birlikte, şüpheli faktörlerin Hücre yoğunluğu veya arka plan (oto-) floresans, örneğin toz bulaşıkları kirleten. Dahası, plaka okuyucuları morfolojik parametrelerin çıkarılmasına izin vermez, tek hücreleri ölçemez ve dinamik veya geçici sinyalleri ölçmek için daha az hassas ve güvenilir olurlarLass = "xref"> 36 , 37 . Akış sitometrisi tek hücrelerin ölçüm kapasitesine sahiptir ve hız avantajına sahiptir. Nitekim, 384 gözlü bir plak, birden fazla markör 38 için yüksek hassasiyetle 12 dakika gibi kısa bir sürede taranabilir. Bu, geniş alan mikroskobunda mümkün olanın çok daha hızlıdır. Ancak, spinalitarsız bilgiler ( örn. , Hücre içi lokalizasyon, morfolojik veriler ve / veya zamana bağlı kinetik) sağlanmadığı gibi, aynı hücrelerin bir tedavi sırasında veya sonrasında tekrar ziyaret edilmesine izin vermediği de bilinmelidir . Dahası, hücrelerin süspansiyon içinde olması gerekir; bu da yapışkan hücrelerin fizyolojisini incelemek için akış sitometrisinin daha az uygun olmasını sağlar. Yüksek içerikli mikroskopinin başlıca dezavantajları, diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, büyük resim veri saklama, yoğun işleme gücü ve karmaşık görüntü analizlerine ihtiyaç duyulmasıdır. Sunulan analiz, görüntü edinme sürecini standartlaştırır ve analizleri düzleştirirBu işlem süresini en aza indirgemek, kullanımı kolaylaştırmak ve bu nedenle tahlilin daha erişilebilir olmasını sağlamak için.
Sonuç olarak ve CM-H2 DCFDA ve TMRM'nin kullanımına özgü, tarif edilen redoks profillemesi yöntemi sağlam, hassas ve güvenilirdir. Çok parametreli ve niceliksel doğasından ötürü, diğer flüorüre dayalı yöntemlerden üstün. Bu yolla, mitokondriyal fonksiyon ile hücre içi ROS sinyallemesi arasındaki ilişkiyi aydınlatmak yardımcı olabilir; bu da, redoks homeostazının bozulduğu çok çeşitli patolojileri daha iyi anlamak için çok önemlidir. Ayrıca, jenerik karakteri sayesinde tahlil, orijinal kapsamının çok ötesinde uygulamalara izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, yarışan finansal çıkarların veya başka çıkar çatışmasının olmadığını belirtiyorlar. İlgili yazar aynı zamanda tüm yazarlardan herhangi bir çıkar çatışmasını ifşa etmesini istemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology? Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , https://CRAN.R-project.org/package=shiny (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
