Summary
I dette papir præsenteres en mikroskopisk arbejdsstrøm med høj indhold til samtidig kvantificering af intracellulære ROS-niveauer samt mitokondrielt membranpotentiale og morfologi - i fællesskab betegnet mitokondriel morfofunktion - i levende adhærente celler ved anvendelse af de cellemeorante fluorescerende reportermolekyler 5- (og- 6) -chloromethyl-2 ', 7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetat, acetylester (CM-H2 DCFDA) og tetramethylrhodaminmethylester (TMRM).
Abstract
Reaktive oxygenarter (ROS) regulerer væsentlige cellulære processer, herunder genekspression, migration, differentiering og proliferation. Overdrivne ROS-niveauer fremkalder imidlertid en tilstand af oxidativ stress, som ledsages af irreversibel oxidativ skade på DNA, lipider og proteiner. Således giver kvantificering af ROS en direkte proxy for cellulær sundhedstilstand. Da mitokondrier er blandt de store cellulære kilder og mål for ROS, er fælles analyse af mitochondrielle funktion og ROS-produktion i de samme celler afgørende for bedre at forstå sammenkoblingen i patofysiologiske forhold. Derfor blev en højmikroskopibaseret strategi udviklet til samtidig kvantificering af intracellulære ROS-niveauer, mitokondrielt membranpotentiale (ΔΨ m ) og mitokondrielmorfologi. Den er baseret på automatiseret widefield fluorescensmikroskopi og billedanalyse af levende vedhæftende celler, der vokser i plader med flere brønde og staineD med de celle-permeable fluorescerende reportermolekyler CM-H2 DCFDA (ROS) og TMRM (ΔΨm og mitokondrielmorfologi). I modsætning til fluorimetri eller flowcytometri tillader denne strategi kvantificering af subcellulære parametre på niveauet af den enkelte celle med høj spatiotemporal opløsning, både før og efter forsøgsstimulering. Det er vigtigt, at den billedbaserede natur af metoden tillader ekstraktion af morfologiske parametre ud over signalintensiteter. Det kombinerede funktionssæt bruges til eksplorativ og statistisk multivariat dataanalyse til at detektere forskelle mellem subpopulationer, celletyper og / eller behandlinger. Her gives en detaljeret beskrivelse af analysen sammen med et eksempeleksperiment, der viser dets potentiale for entydig forskelsbehandling mellem cellulære tilstande efter kemisk forstyrrelse.
Introduction
Koncentrationen af intracellulær ROS reguleres omhyggeligt gennem et dynamisk samspil mellem ROS-producerende og ROS-defusionssystemer. Ubalance mellem de to fremkalder en tilstand af oxidativ stress. Blandt de vigtigste kilder til ROS er mitokondrier 1 . På grund af deres rolle i cellulær respiration er de ansvarlige for størstedelen af intracellulære superoxid (O 2 • - ) molekyler 2 . Dette skyldes for det meste elektrondækage til O2 i kompleks 1 af elektrontransportkæden under betingelser med stærkt negativt indre mitokondrialmembranpotentiale (ψψ m ), dvs. mitokondriel hyperpolarisering. På den anden side er mitokondrielt depolarisering også korreleret med øget ROS-produktion, der peger på flere virkemåder 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Endvidere korrigerer ROS ved hjælp af redoxmodifikationer i proteiner fra fissionsfusionsmaskineriet mitokondriemorfologi 9. For eksempel er fragmentering korreleret med øget ROS-produktion og apoptose 10 , 11 , mens filamentøse mitokondrier er blevet forbundet med næringsstult og beskyttelse mod Mitofagi 12 . I betragtning af det indviklede forhold mellem cellulær ROS og mitokondrialt morfofunktion, bør begge ideelt set kvantificeres samtidigt i levende celler. For at gøre netop dette blev der udviklet et billeddannelsesassay med høj indhold baseret på automatiseret widefieldmikroskopi og billedanalyse af adherente cellekulturer farvet med fluorescerende prober CM-H 2 DCFDA (ROS) og TMRM (mitokondriel Δψ m og morfologi). Højindhold billeddannelse refererer til udvinding af spAtiotemporalt rige ( dvs. stort antal beskrivende egenskaber) information om cellulære fænotyper ved hjælp af flere komplementære markører og automatiserede billedanalyser. Når de kombineres med automatiseret mikroskopi, kan mange prøver screenes parallelt ( dvs. høj gennemstrømning) og derved øge analysens statistiske effekt. Faktisk er et primært aktiv i protokollen, at det giver mulighed for samtidig kvantificering af flere parametre i samme celle, og dette for et stort antal celler og betingelser.
Protokollen er opdelt i 8 dele (beskrevet detaljeret i protokollen nedenfor): 1) Seedceller i en 96-brønds plade; 2) Fremstilling af stamopløsninger, arbejdsløsninger og billeddannelsesbuffer; 3) Opsætning af mikroskop; 4) Indlæsning af cellerne med CM-H2 DCFDA og TMRM; 5) Første levende billeddannelsesrunde til måling af basale ROS niveauer og mitokondriel morphofunktion; 6) Anden levende billeddannelsesrunde efter tilsætning af tert -butylPeroxid (TBHP) til måling af inducerede ROS-niveauer; 7) Automatiseret billedanalyse; 8) Dataanalyse, kvalitetskontrol og visualisering.
Assayet blev oprindeligt udviklet til normale humane dermal fibroblaster (NHDF). Da disse celler er store og flade, er de velegnede til vurdering af mitokondriamorfologi i 2D widefield-billeder 13 , 14 . Men med mindre ændringer er denne metode gældende for andre vedhængende celletyper. Desuden er arbejdsflowet ved siden af kombinationen af CM-H 2 DCFDA og TMRM i overensstemmelse med en række fluorescerende farvestofpar med forskellige molekylære specificiteter 1 , 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen nedenfor beskrives som udført for NHDF-celler og ved anvendelse af multiwellpladerne, der er angivet i materialefilen. Se Figur 1 for et generelt overblik over arbejdsgangen.
1. Fremstilling af reagenser
- Forbered komplet medium ved at supplere Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% v / v føtalt bovint serum (FBS) og 100 IE / ml penicillin og 100 IE / ml streptomycin (PS). Til 500 ml komplet medium tilsættes 50 ml FBS og 5 ml PS til 445 ml DMEM.
- Forbered HBSS-HEPES (HH) billedbuffer ved at supplere Hank's Balanced Salt Solution (med magnesium og calcium, men uden phenolrød) med 20 mM HEPES. Til 500 ml HH tilsættes 10 ml 1 M HEPES stamopløsning til 490 ml HBSS. Kontroller pH og juster om nødvendigt til pH 7,2.
- Forbered 1 mM CM-H2 DCFDA stamopløsning ved at opløse 50 μg CM-H2 DCFDA lyofiliseret pulver i 86,5 &# 181; L vandfrit DMSO. Bland ved vortexing eller pipettering op og ned og lav 20 μL alikvoter i brune mikrocentrifugerør. Opbevares i mørke ved -20 ° C og brug inden for 1 uge. Ved opbevaring under N 2- atmosfære kan holdbarheden øges i mindst 1 måned.
- Forbered 1 mM TMRM stamopløsning ved at opløse 25 mg TMRM pulver i 50 ml vandfri DMSO. Bland ved vortexing eller pipettering op og ned og lav 10 μl alikvoter i brune mikrocentrifugerør. Opbevares i mørke ved -20 ° C. Denne løsning er stabil i mindst et år.
- Klargør en frisk alikvot af Tert -butylperoxid (TBHP) lager (~ 7 M) for hvert forsøg ved direkte pipettering af et volumen fra 70% stamopløsningen (10 μl / 96 brønds plade). Opbevar denne alikvot ved 4 ° C indtil videre brug.
- Forbered antistof arbejdsløsning (AB) ved at fortynde to sekundære antistoffer (Alexa Fluor 488 æsel anti-kanin og CY3 æsel-anti-kanin) 1.000 gange i 1x HH-buffer.
2. Opsætning af Microscope og Acquisition Protocol (± 15 min)
BEMÆRK: Billedoptagelse udføres med et bredfeltmikroskop, der er udstyret med automatiseret scene og skodder samt et hardwarebaseret autofokussystem ved hjælp af et 20X luftplankorrigeret mål (NA = 0.75) og et EM-CCD kamera. Ved indstilling af analysen for første gang bruges en testplade, der indeholder kontrolceller, farvet i overensstemmelse med protokolens instruktioner til at kalibrere XY-scenen og for at optimere opkøbsindstillingerne. Hvis opkøbsindstillingerne allerede er fastslået, kan kalibrering udføres ved hjælp af en tom plade.
- Sænk målet til det absolutte basisniveau og kalibrér XY-scenen efter software-instruktionerne.
- Sørg for, at de korrekte filterkasser er installeret. For at visualisere CM-H 2 DCFDA skal du bruge en standard GFP filterkube med et 472/30 nm exciteringsbåndpassfilter, en 495 nm cutoff dichroIc spejl og et 520/35 nm bandpass emissionsfilter. For TMRM, brug en filterkube til TRITC med et 540/25 nm bandpass excitationsfilter, et 565 nm cutoff dichroic spejl og et 605/55 nm bandpass emissionsfilter.
- Opret en billedprotokoll ved hjælp af købsprogrammet.
- Vælg den korrekte type multiwellplade (fabrikant og kode) fra listen over tilgængelige plader, der leveres i softwaren. Du kan også definere dit eget multiwellplatteformat ved hjælp af plade- og brøndsdimensioner.
- Juster brøndpladen i overensstemmelse med softwareens anvisninger, f.eks. Ved at definere to hjørner af de fire ydre hjørnebrønde. Dette trin dækker for variation af kameraorientering.
- Vælg de brønde, der skal erhverves. Hvis denne indstilling ikke er tilgængelig i softwaren, skal du bruge et sæt manuelt definerede XY-steder, som svarer til de valgte brønde.
- Optimer opkøbsindstillingerne (eksponeringstid, lampens intensitet, EM-forstærkning) for thE to kanaler separat ved brug af testpladen. Minimere eksponering og intensitet som fluorescens excitations lys i sig selv inducerer ROS. Men sørg for, at signalet til baggrundsforholdet er mindst 2 for basal CM-H 2 DCFDA og 3 for TMRM før TBHP-behandling, og at der ikke er nogen mætning efter TBHP-behandling. Opkøbsindstillinger afhænger i høj grad af mikroskopiopsætningen og den anvendte celletype, men som reference er vejledende indstillinger ved brug af en metalhalogenpære på 130 W som lyskilde og NHDF-celler farvet i overensstemmelse med protokollens anvisninger, som følger: for begge CM- H 2 DCFDA og TMRM anvendes en eksponeringstid på 200 ms og ND filter 8, kombineret med en EM-forstærkning på henholdsvis 15 (13 MHz, 14 bit) og 4 (27 MHz, 14 bit). Når det er optimeret til en bestemt opsætning og celletype, kan dette trin springes over.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at opkøbsindstillingerne holdes ens i hele billedprocessen. Til store, flere dages eksperimenter, lampe staBør være berettiget ved regelmæssig kvalitetskontrol. - Definer en overtagelsesprotokol, der består af en sekventiel lambda (bølgelængde) erhvervelse. Vælg CM-H 2 DCFDA-kanalen, der skal erhverves først, for at minimere lyseksponering før måling.
- Definer en brøndpladesløjfe for at erhverve 4 ikke-overlappende billeder med jævne mellemrum placeret omkring midten af hver brønd i brøndvalget ved hjælp af den overtagelsesprotokol, der er defineret i 2.3.4. Vælg bugtende billedforbrug, dvs. først fra venstre mod højre, fra brønd B02 til B11, derefter tilbage, fra højre til venstre, fra brønd C11 til C02 og så videre ( figur 2A ). Dette sparer tid sammenlignet med venstre-til-højre-billedoptagelse. Hvis denne indstilling ikke er tilgængelig i softwaren, skal du justere det brugerdefinerede sæt XY-steder, der er oprettet i 2.3.3 for at tage dette billeddannelsesmønster på.
- Gem XY-koordinaterne for billeddannelsespositionerne ( fx i en separat xml-fil) for at gøre det nemt at gennemgåNg i tilfælde af mikroskopomkalibrering. Dette er især vigtigt, hvis aflæsningen fra dette assay skal korreleres med en posthoc immunofluorescens (IF) farvning for de samme celler.
3 . Sædceller i en 96-brønds plade (45 - 90 minutter afhængigt af antallet af forskellige cellelinjer)
- Arbejd i sterilt miljø som et klasse 2 biosikkerhedsskabe og brugshandsker.
- Dekontaminere alle overflader og materialer ved anvendelse af 70% v / v ethanol i destilleret vand.
- Tag en cellekulturflaske med en 90% konfluent cellekultur fra inkubatoren og læg den i biosikkerhedskabinet.
- Vask cellerne to gange med PBS 1x.
- Tilsæt passende mængde 0,05% trypsin-EDTA-opløsning på cellerne, og sørg for, at den komplette celleoverflade er dækket ( f.eks . 1 ml for en T25-kolbe) og inkuber i 2 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Hvis alle celler løsnes (kontroller med et mikroskop ), Tilsæt kulturmedium (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin; ± 4 ml i en T25-kolbe) for at inaktivere trypsin-EDTA-opløsningen.
- Centrifuger i 5 minutter ved 300 xg ved stuetemperatur.
- Kassér supernatanten og resuspender cellepellet i dyrkningsmedium. Bestem mængden af medium for hver celletype for at opnå en cellekoncentration, der er kompatibel med celletælling. Typisk indeholder en 90% konfluent T25-kolbe af NHDF ca. 1-1,5 millioner celler, der resuspenderes i 3-4 ml dyrkningsmedium.
- Tæl cellerne ved hjælp af et celletællingskammer eller Coulter-tæller.
- Sæd 8.000-10.000 celler i hver af de indre 60 brønde af en sort 96-brønds plade med en tynd kontinuerlig polystyren eller glasbund (sort for at undgå spredning og krydspredning mellem tilstødende brønde under billeddannelse). Ved anvendelse af forskellige betingelser / behandlinger / cellelinjer fordeles deres sædesteder homogent på pladen for at minimere pladseffekter (Fig.>> Figur 2A). De ydre brønde, bortset fra brønd B01 og A01, anvendes ikke, fordi de er mere tilbøjelige til kanteneffekter.
- Sæd 8.000-10.000 celler i B01. Denne brønd vil blive brugt til fokusjustering lige før billedforetagelsen.
- Fyld de tomme ydre brønde med medium for at minimere gradienter (temperatur, fugtighed osv. ) Mellem brøndene og miljøet.
- Tryk forsigtigt pladen tre gange, før du sætter den tilbage i inkubatoren for at undgå, at celler vokser i pletter.
- Kultur cellerne i 24 timer, eller op til en konfluensgrad på ca. 70%.
- Gem behandlingsoplysningerne for eksperimentet i et regneark kaldet "Setup.xlsx". Filen skal indeholde fire kolonner og bruges til at forbinde behandlinger med brønde og billedinformation under dataanalyse. De fire kolonner er: 'Nå', 'Behandlingsnummer', 'Behandling' og 'Kontrol' (en række pr. Brønd). Hver behandling er kobletMed et unikt behandlingsnummer, som anvendes under datavisualisering for at bestemme rækkefølgen af behandlingerne på plotens X-akse. Kontrol-kolonnen angiver den behandling, der fungerer som kontrol for behandlingen i den aktuelle række. Illustrationer af et typisk eksperimentel layout og tilsvarende installationsfil er afbildet i figur 2 .
4. Indlæsning af cellerne med CM-H 2 DCFDA og TMRM (± 45 min)
BEMÆRK: Håndtering af cellerne på forsøgsdagen kan udføres i et sterilt miljø (biosikkerhedskabinet), men dette er ikke obligatorisk, fordi cellerne kasseres eller fastgøres umiddelbart efter analysen.
- Opvarm HH-bufferen til 37 ° C.
- Forbered en 20 μM TMRM-arbejdsløsning ved at fortynde 1 mM stamopløsningen 50 gange i HH-buffer (tilsæt 490 μL HH-buffer til 1 alikvot af 10 μl TMRM stamopløsning).
- Forbered en belastningOpløsning med 2 μM CM-H2 DCFDA og 100 nM TMRM. Til dette formål fortyndes 1 mM CM-H2 DCFDA stamopløsning 500x og 20 μM TMRM arbejdsløsning 200x i HH-buffer.
- Typisk fremstiller i 60 brønde 7,5 ml ladningsopløsning ved tilsætning af 15 μl CM-H2 DCFDA og 37,5 μl TMRM-opløsning til 7447,5 μL HH.
- Kassér dyrkningsmediet fra cellerne ved at dreje pladen på hovedet i en enkelt væskebevægelse.
- Vask forsigtigt cellerne to gange med HH-buffer ved anvendelse af en flerkanalspipette (100 μl / brønd). Kassér HH-bufferen mellem vaskningstrinnene ved at dreje pladen på hovedet i en enkelt væskebevægelse.
- Indlæs cellerne med CM-H 2 DCFDA og TMRM ved at tilsætte 100 μL af ladningsopløsningen til hver brønd igen ved hjælp af en flerkanalspipette. Inkubér i 25 minutter i mørke ved stuetemperatur. Glem ikke godt B01.
- I løbet af disse 25 min skal du forberede arbejdsløsninger af oxidant TBHP og sørge for at mikroskop og tilbehør er tændt.
- Forbered arbejdsløsning I: Fortynd 7M stamopløsningen 70x til 100 mM (10 μl stamme i 690 μL HH-buffer).
- Forbered arbejdsopløsning II: Fortynd WS I 100x til 1 mM (10 μl WSI i 990 μL HH-buffer).
- Forbered arbejdsløsning III: Fortynd WS III 25x til 40 μM (til 60 brønde tilsættes 300 μL WS II i 7200 μL HH buffer).
- Efter 25 minutter vaskes cellerne igen to gange med 100 μl HH-buffer som beskrevet tidligere.
- Tilsæt 100 μL HH-buffer til alle 60 indre brønde.
5. Første levende billedrunde til måling af basale ROS-niveauer og mitokondriel morphofunktion (± 15 min)
- Sørg for, at overtagelsessoftwaren er i drift, og billedbehandlingsprotokollen er indlæst.
- Installer pladen på mikroskopet, tænd hardware baSed autofokus-system og brug brønd B01 til at justere autofokusforskydningen ved hjælp af TMRM-kanalen. Da denne procedure inducerer en stigning i CM-H2 DCFDA signal intensitet, er denne brønd udelukket fra nedstrøms billedanalyse.
- Kør billeddannelsesprotokollen.
6. Second Live Imaging Round efter tilsætning af TBHP til at måle inducerede ROS niveauer (± 20 min)
- Fjern forsigtigt 96-brøndspladen fra mikroskopet.
- Tilsæt 100 μL TBHP WS III (40 μM) til hver brønd ved hjælp af en flerkanalspipette (dette resulterer i en 20 μM TBHP-koncentration i brøndene). Denne forbindelse anvendes som en intern positiv kontrol for CM-H 2 DCFDA-farvningen (signalet skal stige) såvel som et middel til måling af inducerede ROS-niveauer.
BEMÆRK: H 2 O 2 kan også bruges i stedet for TBHP, men denne forbindelse er mindre stabil og derfor mindre pålidelig. - Vent mindst 3 minutter for at tillade fuldstændig reaktion af TBHP wI CM-H 2 DCFDA.
- I løbet af denne tid tilsættes 100 μL antistof arbejdsløsning (1/1000) til brønd A01.
- Monter pladen tilbage på mikroskopet og kontroller fokus igen ved brug af brønd B01.
- Få de samme positioner som i den første billedrunde ved brug af samme billedprotokol.
- Eksporter de overførte datasæt i en enkelt mappe som individuelle tiff-filer ved hjælp af standardiseret nomenklatur, der indeholder henvisning til pladen, før- eller post-TBHP-behandling, brønd, felt og kanal, adskilt af understreger, f.eks . 'P01_Pre_B02_0001_C1' til plade 1, pre-TBHP-behandling, brønd B02, felt 1 og kanal 1. Disse oplysninger vil blive brugt under billedanalyse ( f.eks. For at vælge de relevante segmenteringsindstillinger) såvel som under dataanalyse (for at forbinde analysedata Med de rigtige behandlinger).
- Få flatfeltbilleder til begge kanaler på alle fire positioner omkring midten af brønd A01 ved hjælp af overtagelsesprotokollen. Gem thEm som individuelle tiff-filer i samme mappe som de andre billeder ved hjælp af følgende standardiserede nomenklatur: 'P01_FF_A01_0001_C1' til plade 1, felt 1 og kanal 1. Sørg for, at signalerne ligger inden for det dynamiske område; I tilfælde af mætning, brug en lavere koncentration af antistof arbejdsløsning.
- Kassér pladen eller gem den til videre behandling.
BEMÆRK: I stedet for at fjerne pladen fra mikroskopet og bruge en flerkanalspipette til at tilføje TBHP-løsningen, kan en automatiseret pipette installeres på mikroskopfasen og forbindes med opkøbsprogrammet for at fungere ved modtagelse af en trigger. Dette giver mulighed for at tilføje TBHP til hver brønd direkte efter den første opkøb, inden du flytter til den næste brønd. På denne måde, når den første billedrunde er færdig, kan den anden starte med det samme, og alle brønde vil have haft en lige inkubationstid med TBHP.
7. Billedbehandling og analyse (± 30 min pr96-brønds plade)
BEMÆRK: All billedbehandling udføres i FIJI (http://fiji.sc), en pakket version af ImageJ freeware. Et dedikeret script blev skrevet til automatiseret analyse af intracellulære ROS- og mitokondriske signaler, såvel som morfologiske parametre (RedoxMetrics.ijm, tilgængelig på anmodning). De underliggende algoritmer er beskrevet i Sieprath et al. 1 .
- Sørg for, at FIJI er installeret og funktionsdygtig.
- Start FIJI og installer makrosættet (Plugins -> Macros -> Install ...). Dette vil påberåbe sig et antal nye makrokommandoer samt et sæt handlingsværktøjer til optimering af analyseindstillingerne, som vist i figur 3A .
- Åbn opsætningsgrænsefladen for at indstille analyseindstillingerne ved at klikke på 'S' knappen ( Figur 3B ).
- Vælg billedtype, antal kanaler og brønden, der blev brugtTil at erhverve flatfield billeder.
- Angiv hvilken kanal der indeholder celler (CM-H 2 DCFDA-kanal) eller mitokondrier (TMRM-kanal) og juster præprocessions- og segmenteringsparametrene for hver kanal afhængigt af billedkvaliteten ( Figur 3B ). Marker afkrydsningsfelterne 'Baggrund' og 'Kontrast' for at udføre henholdsvis baggrunds-subtraktion eller kontrastbegrænset adaptivt histogramudligning 16 . Definer en sigma for gaussisk sløring af celler og laplacian forbedring af mitokondrier. Vælg en automatisk tærskelalgoritme og udfyld grænser for begrænsning af størrelsen (i pixel). Hvis en fast tærskel vælges i stedet for en automatisk tærskelalgoritme, skal du udfylde den øvre tærskel.
- Test segmenteringsindstillingerne på et par udvalgte billeder af de overtagne datasæt ved at åbne dem og klikke på 'C' eller 'M'-knapperne i menuen for henholdsvis celle- eller mitochondria-segmentering,Og juster indstillingerne om nødvendigt. Et eksempel resultat er vist i figur 3C .
- Kør batchanalysen på den eller de relevante mapper ved at klikke på '#' knappen og vælge mappen med billederne. Per mappe vil dette producere en ny 'Output'-mappe, der indeholder individuelle ROI-sæt (zip-filer) og resultatfiler (.txt) pr. Billede. For begge kanaler indeholder resultatfilen intensitet og morfologiske beskrivere. CM-H 2 DCFDA-kanal (celler) -resultatsfilen indeholder per beskrivelsesværdi gennemsnitsværdien for de kombinerede ROI'er inden for et billede. For TMRM-kanalen indeholder resultatfilen pr. Beskrivende værdi værdien for hvert enkelt segmenteret mitokondrielt ROI.
- Efter batchanalyse, visuelt verificere segmenteringsydelsen på en 'Verifikationsstabel', en hyperstack af alle billeder med deres respektive ROI-overlay ved at klikke på 'V'-knappen. På denne måde kan artefakter som over-/ Undersegmentering, billeder uden fokus eller støvpartikler / fibre i billeder kan allerede ses hurtigt. Yderligere kurering kan foretages under data kvalitetskontrol (jf. §8).
8. Dataanalyse, kvalitetskontrol (QC) og visualisering
Behandling og analyse af de rå data udføres ved hjælp af R statistisk freeware (http://www.rproject.org - version 3.3.2) og RStudio (http://www.rstudio.com/ - version 1.0.44). For hurtigt at opnå og visualisere resultaterne er en intuitiv skinnende applikation 17 (tilgængelig på forespørgsel) udtænkt, der integrerer og visualiserer dataene i varmekort og boxplots og udfører også statistiske analyser. Generelt består arbejdsgangen af to på hinanden følgende trin. For det første behandles data og inspiceres pr. 96-brønds plade for at opdage afvigende datapunkter. For det andet kombineres kuraterede data fra alle plader af et givet eksperiment og analyseres ved anvendelse af ikke-parametrisk multiVariatortest 18 og en hovedkomponentanalyse.
- Sørg for, at R og RStudio er installeret og funktionsdygtig.
- Start RStudio.
- Åbn RedoxMetrics skinnende applikation og kør appen (vælg at køre den i en ekstern browser).
- På siden 'input' skal du vælge den mappe, hvor resultatfilerne fra RedoxMetrics.ijm er placeret.
- Sørg for, at 'Setup.xlsx' (oprettet i trin 3.15) også findes i denne mappe.
- Resultatfiler og installationsoplysninger importeres automatisk, omarrangeres og visualiseres.
- Siden 'eksperimentelle opsætninger' viser eksperimentets layout. Brug denne side til bekræftelse.
- På den næste side, "resultater pr. Plade" vises dataene for hver plade separat i et farvekodet multi-brøndspladet layout samt i kasser med outliers mærket med velnavn og billednummer. Sidstnævnte muliggør let inspektion og identUdlevering af afvigende datapunkter (ekstremt høje eller lave værdier i forhold til gennemsnitsværdierne målt for den specifikke behandling - se figur 4 til et eksempel).
Brug disse oplysninger til at kontrollere de billeder, der svarer til de afvigende punkter. Hvis der opdages abnormiteter, skal de fjernes fra analysen. De fleste abnormiteter skyldes ukorrekt segmentering, når (del) af billedet er ude af fokus, eller når stærkt fluorescerende støvpartikler forstyrrer korrekt segmentering. Ekstreme tilfælde kan allerede ses hurtigt ved hjælp af verifikationsstableringsværktøjet (trin 7.5), men mere subtile forekomster opdages på dette trin. Når der ikke findes nogen åbenbar eller teknisk grund til den afvigende værdi, skal billedet ikke fjernes fra analyse. - Valgfrit: Opret et nyt regneark kaldet 'Drop.xlsx' med kun en kolonne kaldet 'Drop'. I denne kolonne skal du liste filnavne (inklusive ".tif" -udvidelse) for alle billederneDer skal fjernes fra analysen (identificeret i trin 7.5 eller trin 8.6.2). Upload denne fil ved hjælp af siden 'input'.
- Resultatet af hele eksperimentet viser resultaterne fra alle plader kombineret. Hvis en drop-fil blev uploadet, bruges denne fil til at fjerne de angivne datapunkter fra analysen.
For hver parameter enkeltvis normaliseres dataene pr. Plade i henhold til deres respektive kontroller. Data fra alle plader kombineres derefter, efterfulgt af ikke-parametriske multivariate tests fra nparcomp-pakken 18 . Hvis kun 2 behandlinger sammenlignes, udføres to prøveforsøg for det ikke-parametriske Behrens-Fisher-problem. I mere end 2 behandlinger anvendes en ikke-parametrisk kontrastbaseret multipel sammenligningstest. Resultaterne visualiseres ved hjælp af boxplots. - Siden 'Cluster Analysis' viser resultaterne af en hovedkomponentanalyse (PCA - R core 'stats' pakke). Data fra 5 parametre (baSal & induceret ROS og mitokondrielt membranpotentiale, størrelse og cirkularitet) kombineres for at diskriminere de forskellige behandlinger baseret på en følsom redoxprofil. Til dette formål udføres en hovedkomponentanalyse (PCA) (R core 'stats' pakke). Resultaterne visualiseres ved hjælp af en biplot (ggbiplot-pakke - http://github.com/vqv/ggbiplot).
- Brug siden 'download data' til at downloade backend-datarammerne, der indeholder de behandlede og omarrangerede data, så de kan genbruges til mere avanceret datavisualisering eller statistiske analyser.
BEMÆRK: Typiske faldgruber og potentielle løsninger er angivet i tabel 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assayet er blevet benchmarked ved anvendelse af adskillige kontrolforsøg, hvis resultater er beskrevet i Sieprath et al. 1 . Kort fortalt er fluorescensresponsen af CM-H2 DCFDA og TMRM til extrant inducerede ændringer i intracellulær ROS og Δψm blevet kvantificeret til bestemmelse af det dynamiske område. For CM-H2 DCFDA viste NHDF en lineær stigning i fluorescenssignalet, når det blev behandlet med stigende koncentrationer af TBHP mellem et område på 10 μM til 160 μM. På samme måde viste NHDF-celler for en TMRM en lineær forøgelse af mitokondriefluorescens, når de blev behandlet med stigende koncentrationer af oligomycin (som inducerer Δψm-hyperpolarisering) inden for et område på 1 til 10 μg / μl. Omvendt resulterede realtidsadditionen af valinomycin, et antibiotikum, der inducerer Δψm depolarisering, en gradvis kvantOmdirigent fald i TMRM fluorescens .
Assayet er også blevet anvendt i en række eksperimenter for at afsløre forskelle i redoxstatus mellem celletyper eller behandlinger 1 , 15 . For at illustrere dette er resultaterne vist af et eksperiment, hvor NHDF blev behandlet med HIV proteasehæmmeren Saquinavir (SQV) ( Figur 5 ). Ved anvendelse af den beskrevne protokol blev en signifikant forøgelse detekteret for både basale og inducerede ROS-niveauer sammenlignet med kontrolceller behandlet med DMSO ( Figur 5B ). SQV-behandling påvirket også mitokondrielt morfofunktion betydeligt. Morfologisk erhvervede mitokondrier et stærkt fragmenteret mønster, som også blev bekræftet af en højere cirkularitet og mindre gennemsnitlig størrelse af de enkelte mitokondrier. Funktionelt, Δψ m , målt som gennemsnitligt TMRM signal pr. MitokOndrial pixel blev også signifikant øget ( figur 5A ). Når man kombinerer dataene fra de 5 ovenfor beskrevne parametre, kunne de to betingelser (kontrol og SQV) klart adskilles fra hinanden ved hovedkomponentanalyse. Data fra tre uafhængige biologiske replikater er vist i en 2D-biplot, der viser de to første hovedkomponenter, der forklarer 81,4% af den totale varians ( Figur 5C ). Dette beviser robustheden af analysen og antyder, at den kombinerede aflæsning kan tjene som en følsom indikator for cellulær sundhedstilstand.
Figur 1 : Generel oversigt over High-content Imaging Assay til samtidig måling af intracellulære basale og inducerede ROS-niveauer og mitokondriel morphofunktion. ( A ) SKemisk repræsentation af de vigtigste operationelle blokke. ( B ) Illustreret eksempel: celler er podet i flere identiske 96-brøndsplader. Et standard brøndplade layout er vist mere detaljeret i figur 2A . Efter farvning opsamles 4 billeder per kanal omkring midten af hver brønd, både før og efter TBHP- behandling, som illustreres af de store montager med indsats. Efter billedanalyse er intensitetsresultaterne visualiseret ved hjælp af et intuitivt varmekort projiceret på brøndpladens layout. Dette tillader hurtig påvisning af pladseffekter eller afvigende brønde. Efter helbredelse af de komplette eksperimentelle datasæt udføres den endelige dataanalyse, der resulterer i single- og multi-parameter output. (Denne figur blev ændret fra reference 1 , med tilladelse fra Springer) Klik venligst her for at se et større versioN af denne figur.
Figur 2 : En typisk eksperimentel 96-brønds layout og tilsvarende "Setup" -fil. ( A ) 4 forskellige betingelser fordeles homogent over pladens indre 60 brønde. Godt B01 indeholder også celler, men bruges kun til at justere den oprindelige PFS-forskydning lige før billeddannelsen. De andre ydre brønde fyldes kun med dyrkningsmedium for at minimere gradienter (temperatur, fugtighed osv. ) Under cellekultur. Billedoptagelse udføres på en meanderende måde, dvs. først fra venstre mod højre fra brønd B02 til B11 og derefter tilbage fra højre til venstre fra brønd C11 til C02 og så videre. Efter billedkøb opnås fladfeltbilleder i brønd A01, som bruges til at korrigere rumlig belysnings heterogenitet under billedet en ANALYSE. ( B ) Den tilsvarende installationsfil (Setup.xlsx) er et regneark, der indeholder oplysninger om eksperimentets layout. Det specificerer placeringen af hver behandling i multiwellpladen og deres respektive kontroller. Hver række repræsenterer en brønd. Hver behandling har sit eget unikke behandlingsnummer, som bruges til at specificere rækkefølgen af behandlingerne på X-aksen for de genererede tomter under dataanalyse. Kolonnen 'Kontrol' indeholder den behandling, der skal bruges som en kontrol for normalisering af data for den behandling, der er angivet i samme række. I eksemplet er behandling 1 den behandling, der anvendes som kontrol for normalisering af data fra alle de andre behandlinger. Klik her for at se en større version af denne figur.
9 / 55449fig3.jpg "/>
Figur 3 : RedoxMetrics Macro-sæt, Layout og Setup Interface. ( A ) Når makro-sætet RedoxMetrics for FIJI er installeret, oprettes en række nye makrokommandoer samt et sæt handlingsværktøjer til test og optimering af analyseindstillingerne i menulinjen. 'S' anvender opsætningsgrænsefladen. 'F' udfører en flatfeltkorrektion på et åbent billede. 'C' og 'M' udfører en testsegmentering for celleområder ("Celle", CM-H2DCFDA-kanal) og mitokondrieområder ("Mito", TMRM-kanaler) henholdsvis på et enkelt åbent billede ved hjælp af de analyseindstillinger, der er valgt i opsætningen Interface, der returnerer et overlay af de segmenterede regioner af interesse (ROI). '#' Udfører batchanalyse i en mappe med billeder ved hjælp af de indstillinger, der er angivet i installationsgrænsefladen (normalt efter verifikation på et eller få billeder). 'V' opretter en kontrol hyperstack usinG outputdata fra batchanalysen. Denne hyperstack er et sammensat billede af alle råbilleder, der er til stede i mappen og deres respektive interesseområder (tegnet i en anden kanal). 'O' kan klikkes for at vise eller skjule overlejringen af den segmenterede region. ( B ) Setup grænseflade. Her vælges alle analyseindstillinger, herunder generel information såsom billedtype (udvidelse), antal kanaler (bølgelængder) og brønden, der blev brugt til flatfieldkorrektion. Dernæst er der indstillinger, der er specifikke for billedindholdstypen (Cell eller Mito). I begge tilfælde er der muligheder (afkrydsningsfelter) for at inkludere en baggrundskorrektion ("baggrund") og lokal kontrastforøgelse ("kontrast"). Til cellesegmentering er der mulighed for at definere en gaussisk sløretradius (sigma) for at reducere støj. Til mito segmentering er der mulighed for at definere radius af en Laplacian operatør for selektiv forbedring af mitokondrier. Efterfølgende segmentering er pOmformet ved hjælp af en automatisk (eller fast) tærskelmetode, som kan defineres pr. Indholdstype. Når en fast tærskel vælges, kan den øvre tærskelværdi leveres manuelt. Endelig kan analysen begrænses til et udvalg af objekter, der falder inden for et minimum og en maksimal størrelse. ( C ) Et eksempel på et segmenteringsresultat som køre med kommandoen "C" (øverst) eller "M" (nederst), der vises som det råbillede i grå overlejret med de områder af interesse for gul. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Illustreret eksempel på mellemliggende datavisualiseringer. ( A ) Multiwell-pladevisualisering, hvor brøndene B02 og D07 forekommermistænksom. ( B ) Boxplot, der repræsenterer de samme data, med outliers mærket med velnavn og billednavn. Sammen med F03_0003 vises billeder fra B02 og D07 som outliers. ( C ) Visuel inspektion af disse billeder viser, at B02_0000 og D07_0001 skal fjernes fra yderligere analyse, fordi der er segmenteringsfejl (illustreret af den røde 'X'). F03_0003 bør opbevares, fordi der ikke er nogen åbenbar segmentering eller teknisk fejl. (Hvis der ikke findes nogen teknisk grund til afvigelsen, skal dataene ikke fjernes). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5 : Effekt af Saquinavir (SQV; 20 μM) på primært humant FibrOblasts (kontrol er DMSO). ( A ) Mitokondriemembranpotentiale (ΔΨ m ) og mitokondriamorfologi (cirkulære og gennemsnitlige størrelse af individuelle mitokondrier) målt ved TMRM ( B ) Øgede basale niveauer af intracellulær ROS som målt ved CM-H 2 DCFDA og respons mod induceret ROS målt Som relativ forstærkning i intensitet efter tilsætning af 20 μM TBHP-tilsætning. ( C ) 2D scatterplot af de første 2 hovedkomponenter (PC'er) fra en PCA-analyse på de 5 ovenfor beskrevne variabler (basale og inducerede ROS-niveauer, gennemsnitlig mitokondrielstørrelse, cirkularitet og ΔΨ m ). De sorte pile repræsenterer retningen af de oprindelige 5 variabler med hensyn til hovedkomponenterne. (Uafhængige replikater er plottet med en anden farve; Alle data er normaliseret med hensyn til DMSO-kontrollen; * = p-værdi <0,05; ** = p-værdi <0,01; *** = p-værdi <0,001; Y -Akser er blevet indstillet til optimalt at vise forskellene; Denne figur blev ændret fra reference 1 , med tilladelse fra Springer) Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
| Problem | Mulig årsag | Mulig løsning |
| For få celler i brøndene under billeddannelse | For få celler podet | Sæd flere celler 24 timer før billeddannelse |
| Dårlig cellevækst | Tjek kulturbetingelserne (medium, temperatur stabilitet, CO 2 kontrol) | |
| For voldelige vask trin | Undgå at vaske celler væk, pipetter forsigtigt | |
| For mange celler i brøndene under billeddannelse | OgsåMange celler podet | Sæd mindre celler 24 timer før billeddannelse |
| Svage signaler eller ikke-lineær respons af CM-H 2 DCFDA fluorescens til stimulus | Anvendes for lav / høj farvestofkoncentration | Ved anvendelse af andre end NHDF-celler skal optimale belastningskoncentrationer bestemmes empirisk |
| Farvebelastning er utilstrækkelig | Tilsæt 0,02% w / v af det overfladeaktive middel Pluronic-127 til påfyldningsopløsningen for at øge optagelsen. | |
| CM-H 2 DCFDA-signalet øges visuelt under eksponeringstiden | For høj farvekoncentration | Reducer farvestofkoncentrationen |
| Excitationsintensiteten er for høj | Reducer excitationsintensiteten ved at bruge ND-filtre og / eller reducere eksponeringstiden | |
| CM-H 2 DCFDA intensiteten falder under opkøb af brøndpladen | CM-H 2 DCFDA lækker ud afcellen. | Brug 2 mM probenicid (anionpumpeinhibitor). Tilføj til påfyldningsopløsningen, såvel som billedbufferen for at reducere lækage |
| Der er ingen stigning i CM-H 2 DCFDA signalintensitet efter tilsætning af TBHP | TBHP er ikke aktiv | Brug frisk TBHP |
| CM-H 2 DCFDA lækker ud af cellen. | Brug probenicid som beskrevet ovenfor. | |
| (Nogle af de) overførte billeder vises ude af fokus, mens fokus virker ok, når det kontrolleres. | Pladen er monteret kantet, hvilket medfører, at fokuset strækker sig ud over PFS-forskydningen | Kontrollér monteringen af pladen og sceneniveauet, Placer pladen igen |
| Bunden af pladen indeholder støv eller uregelmæssigheder | Rengør bunden af pladen med et ethanolfugtet linsepapir | |
| Celler dør under billeddannelse | Reducer excitationsintensiteten eller erhverver færre billeder pr. Brønd. | |
| Forkert billeddannende buffer sammensætning | Remake imaging-buffer | |
| Der er ude af fokus fluorescerende pletter i billederne | Afmonterede celler flyder uden fokus | Vask mere forsigtigt under indlæsningsprotokollen |
| En eller flere søjler har en lavere intensitet end de andre brønde på pladen | Et eller flere tip fra flerkanalspipetten var ikke fastgjort, og derfor blev mindre reporter tilføjet til disse brønde | Kontroller grundigt, om alle tip er fyldt perfekt, når du bruger en flerkanalspipette. |
| Fokus opererer dramatisk under billedindsamling | Polystyrenbunden af pladen kan reagere med nedsænkningsolie, når der anvendes en olieobjektiv | Brug en tør linse, eller brug en multiwellplade med et glasSs bunden |
| TMRM-signalintensiteten øges imellem billeddannelsen af den første og den sidste brønd | Reporterindlæsningstiden var ikke lang nok, TMRM er stadig ækvilibrering | Forøg reporterens ladetid |
| CM-H 2 DCFDA-signal efter TBHP-behandling øges under opkøbet af brøndpladen | Tiden mellem behandling med TBHP og starten af den anden billeddannelsesrunde var ikke lang nok, og TBHP oxiderer stadig CM-H2 DCFDA. | Forøg inkubationstiden mellem behandlingen med TBHP og den anden billedrunde. (Start med mindst 3 min) |
| Flatfeltbilleder er mættede | Antistof arbejdsløsning er at koncentrere | Brug en lavere koncentration af antistof arbejdsløsning |
| Opkøbsindstillingerne er ikke optimeret (eksponeringstid til høj, ND-filter til lavt, ...) | Optimer opkøbsindstillinger,Signalet skal være i dynamisk rækkevidde af sensoren | |
| Flatfeltbilleder er mørke | Antistof arbejdsløsning er at fortyndes | Brug en højere koncentration af antistof arbejdsløsning |
| Opkøbsindstillingerne er ikke optimeret (eksponeringstid til høj, ND-filter til lavt, ...) | Optimer opkøbsindstillinger, signalet skal være i dynamisk rækkevidde af sensoren | |
| Over / Undersegmentation artefakter | Tærsklen er ikke korrekt indstillet | Juster tærskelindstillingen |
| Størrelsesfiltre er ikke justeret korrekt | Juster min og max størrelse kriterier for billedanalyse | |
| Cellekonfluens er for høj | Det korrekte konfluensniveau er meget vigtigt for pålidelig billedanalyse. For andre celletyper end NHDF skal den optimale såddensitet bestemmes empirisk | |
| Den skinnende applikation virker ikke | Forkert mappe valgt | Vælg den rigtige mappe på indtastningssiden. |
| Manglende filer i mappen | Sørg for, at alle nødvendige filer (output fra imagej makro og installationsfil) er til stede i den valgte mappe | |
| Manglende pakker | Normalt kontrollerer appen og installerer alle nødvendige pakker, men når dette mislykkes, skal du manuelt kontrollere følgende pakker: devtools, ggbiplot, pacman, ggplot2, plyr, nparcomp, data.table, readxl, gplots, ggbiplot, skinnende, glansfiler, pbapply Og shinyjs herunder alle afhængigheder. |
Tabel 1: Typiske faldgruber og potentielle løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette papir beskrives en højindholdsmikroskopimetode til samtidig kvantificering af intracellulære ROS-niveauer og mitokondriel morfofunktion i NHDF. Dens præstation blev demonstreret ved en casestudie om SQV-behandlet NHDF. Resultaterne understøtter tidligere beviser fra litteratur, hvor der er observeret forhøjede ROS-niveauer eller mitokondrielle dysfunktion efter behandling med HIV-proteasehæmmere af type 1, om end i separate forsøg 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Den vigtige forskel er, at det beskrevne assay er i stand til at måle disse parametre samtidigt i de samme levende celler sammen med morfologiske data. Den største fordel ved denne tilgang er dens entydige bestemmelse af begge faktorer sammen i rummet og tIme, som gør det muligt at fastslå årsagsforhold. En hovedkomponentanalyse udføres, som muliggør dannelse af en følsom redoxprofil af specifikke forstyrrelser. Men mere avancerede data mining teknikker og (overvåget) clustering algoritmer kan også bruges på den udvundne data for at muliggøre predictive redox profilering. Dette kan være en værdifuld funktion for diagnostiske eller prognostiske klassifikationsværktøjer i digital patologi, såvel som i screening for terapeutiske mål, fx når der først er opbygget robuste klassifikationsmodeller, kan små molekylbiblioteker screenes for at finde terapeutiske kandidater til at modvirke oxidativ stress, analogt med En nylig skærm for lovende fører til terapiudvikling for humane mitokondriale lidelser 26 .
Assayet blev udtænkt for NHDF, men kan tilpasses til andre adhærente celletyper. Dette kræver optimering af farvningsprotokollen og reporterfarvestofkoncentrationerne. Mængden af r Eporterfarvestoffer skal minimeres, da overbelastning kan forårsage ulinjære virkninger på grund af slukning eller endda at blive cytotoksisk 27 . Forlængelse af analysen til suspensionsceller er mindre indlysende på grund af vanskeligheder med montering og observation af sådanne celler på en fysiologisk måde. De kan være cytospun på en dæksel eller dyrkes i serumfri medier for at fremkalde adhæsion, men begge disse processer interfererer med fysiologiske tilstande 28 , 29 . Imidlertid kunne disse begrænsninger overvindes ved anvendelse af mikropatenterede cellekulturbærere, som holder individuelle celler (klæbende eller ikke-klæbende) fanget i små mikrobrønde, mens deres levedygtighed 30 opretholdes eller ved anvendelse af en termo-reversibel hydrogel til fældeceller under billeddannelse 31 . Disse metoder er allerede blevet anvendt til højindholdsscreening af plasmamembranpotentiale, eller cellulært oxygen i individuelle suspensionsceller= "Xref"> 32 , 33 eller billeddannelsen af intracellulære markører i de levende, stærkt motile parasitter 31 . Tilpasninger skal også gøres til billeddannelsesmodaliteten, da morfologisk analyse af mitokondrie-netværket i disse celler ville kræve hurtige 3D-overtagelsesfunktioner såsom spin-disk-konfokal eller Bessel-stråle-lysarkmikroskopi 34 , 35 samt analysen Pipeline, for at indbefatte Z-dimensionen, mens man beregner morfologiske parametre.
Assayet blev optimeret til plader med 96 brønde, men det er åbenbart muligt at opskalere, fx til 384 brøndsplader. Den største begrænsende faktor er pladetiden, dvs. den tid det tager at erhverve billeder af alle brøndene. De fluorescerende signaler skal forblive stabile i løbet af denne tidsramme for således at kunne sammenligne målene mellemIndividuelle brønde. Men fordi farvningen er forbigående og den undersøgte proces er dynamisk, udgør dette en udfordring. Derfor blev fluorescerende signaler målt i et sæt replikerede eksperimenter, og dette viste, at både CM-H2 DCFDA og TMRM signaler forbliver stabile fra 7 til mindst 50 min efter farvning (variationskoefficient <2%). Dette giver et vindue på ca. 40 min. En 96-brønds plade tager typisk ca. 10 minutter. Således ville en ekstrapolering til 384 brøndsplader holde opkøbsvarigheden inden for den stabile tidsluke. Med et gennemsnit på 50 celler pr. Billede (baseret på brugen af en 20X objektiv og NHDF celler) vil dette resultere i data for ca. 30.000 celler pr. Time screening, hvilket i høj grad tilføjer til den statistiske effekt af analysen. En anden faktor der påvirker fluorescerende signalstabilitet er temperaturen. For at undgå vakuolisering af CM-H 2 DCFDA (dvs. farvestofakkumulering i intracellulære vesikler), hvilket ville give anledning til heteroGenøse farvning og ikke-lineære virkninger finder inkubationen sted ved stuetemperatur i stedet for 37 ° C. Bortset fra stabilitet er det vigtigt at bemærke, at eksponering af levende celler til fluorescens excitationslys selv fremkalder ROS-produktion. Dette indebærer, at eksponeringsbetingelserne (eksponeringstid og excitationslysintensitet) skal holdes på et absolut minimum. Det betyder også, at alle brønde kun skal udsættes, når de faktiske billeder er erhvervet. Dette udelukker brugen af softwareaktiverede autofokuseringsmetoder og garanterer brugen af et hardwarebaseret autofokussystem.
En fordel ved den beskrevne metode er dens generiske karakter. Næsten enhver kombination af spektral kompatible fluorescerende journalister kan anvendes. Dette blev påvist ved anvendelse af Calcein / MitoSOX kombinationen til måling af mitokondriel ROS pr. Levende celle 1 , 15 . Desuden er ansøgningerne ikke begrænset til int Egrated ROS / mitochondrial måling. Assayet kan også forlænges med en posthoc immunostaining (efter den anden billeddannelsesrunde). Da de nøjagtige billeddannelsessteder gemmes, kan redoxanalyser direkte korreleres med lokalitetsproteomik i de samme celler. Dette øger i høj grad den molekylære aflæsning, som er i skarp kontrast til andre metoder, der ofte anvendes til at vurdere redoxbiologi eller fluorescensintensiteter generelt. For eksempel anvendes fluorimetri (mikropladslæser) i vid udstrækning på grund af sin relativt lave pris (grundlæggende opsætning tilgængelig for så lavt som € 4000) og overfladisk læringskurve, men er en sort boks, men er mere tilbøjelige til at forstyrre faktorer som variationer i Celle densitet eller baggrund (auto-) fluorescens, fx af forurenende støvpartikler. Desuden tillader ikke pladelæser at udvinde morfologiske parametre, de kan ikke måle enkeltceller, og de er mindre følsomme og pålidelige til at måle dynamiske eller forbigående signalerLass = "xref"> 36 , 37 . Flowcytometri har kapacitet til at måle enkeltceller og har fordelen af hastighed. Faktisk kan en 384 brøndsplader screenes på så lidt som 12 min med høj følsomhed for flere markører 38 . Dette er meget hurtigere end hvad der er muligt med widefield mikroskopi. Men der gives stadig ingen spatiotemporale oplysninger ( dvs. subcellulær lokalisering, morfologiske data og / eller tidsafhængig kinetik), og det tillader heller ikke at genoprette de samme celler under eller efter en behandling (dvs. i fluxo) . Desuden skal celler være i suspension, hvilket gør flowcytometri mindre egnet til at studere fysiologien af adherente celler. Større ulemper ved højmikroskopi sammenlignet med de andre metoder er behovet for stor billeddataopbevaring, intensiv proceskraft og komplekse billedanalyser. Den præsenterede analyse standardiserer billedanskaffelsesprocessen og strømlinierer analysenS for at minimere denne behandlingstid, øge brugervenlighed og derfor gøre analysen mere tilgængelig.
Som konklusion og specifikt for brugen af CM-H 2 DCFDA og TMRM er den beskrevne redoxprofileringsmetode robust, følsom og pålidelig. På grund af sin multifarametriske og kvantitative karakter er den bedre end andre fluorescensbaserede metoder. På denne måde kan det bidrage til at belyse forholdet mellem mitokondrielle funktion og intracellulær ROS-signalering, hvilket er afgørende for bedre at forstå en lang række patologier, hvor redox homeostase er forstyrret. På grund af dets generiske karakter tillader analysen også applikationer langt ud over det oprindelige omfang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne siger, at der ikke er konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter. Den tilsvarende forfatter sikrer også, at alle forfattere er blevet bedt om at afsløre alle interessekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology? Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , https://CRAN.R-project.org/package=shiny (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
