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Biology

उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए सेल्यूलर रेडॉक्स प्रोफाइलिंग

Published: May 14, 2017 doi: 10.3791/55449
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Laboratory of Cell Biology and Histology, Department of Veterinary Sciences, University of Antwerp, 2Cell Systems and Imaging Research Group (CSI), Department of Molecular Biotechnology, Ghent University, 3Department of Biochemistry , Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center

Summary

इस पत्र में इंटरेसेल्युलर आरओएस स्तरों के साथ-साथ मितोचोनड्रियल झिल्ली की क्षमता और आकृति विज्ञान के लिए एक उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोपी वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया गया है - संयुक्त रूप से सेल-ट्रांसमिशन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अणुओं का उपयोग करते हुए अनुयायी कोशिकाओं में रहने वाले जीवों में- मिटोकॉन्ड्रियल मॉर्फफ़ोन - 5- (और- 6) - क्लोरोमिथाइल -2 ', 7'-डाइक्लोरोडाइहाइड्रोफ्लोरेससेन डिसासेट, एसीटील एस्टर (सीएम-एच 2 डीसीएफडीए) और टेट्रामिथिलोहाडामाइन मेथिलिएस्टर (टीएमआरएम)।

Abstract

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) जीन की अभिव्यक्ति, प्रवासन, भेदभाव और प्रसार सहित आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करती है। हालांकि, अत्यधिक आरओएस स्तर ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति पैदा करता है, जिसके साथ डीएनए, लिपिड और प्रोटीन को अपरिवर्तनीय ऑक्सीडेटिव नुकसान होता है। इस प्रकार, आरओएस की मात्रा का ठहराव सेलुलर स्वास्थ्य की स्थिति के लिए एक सीधा प्रॉक्सी प्रदान करता है। चूंकि मिटोचोरडिया आरओएस के प्रमुख सेलुलर स्रोतों और लक्ष्यों में से हैं, मिटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के संयुक्त विश्लेषण और उसी कोशिका में आरओएस उत्पादन पैथोफिज़ियोलॉजिकल स्थितियों में एक दूसरे संबंध को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, एक उच्च-सामग्री वाली माइक्रोस्कोपी-आधारित रणनीति को इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों के साथ-साथ मात्रात्मक मात्रा के लिए विकसित किया गया था, मिटोकोंड्रियल झिल्ली क्षमता (ΔΨ एम ) और मिटोचोनड्रियल आकारिकी। यह स्वचालित वाइडफ़िल्ल्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और रहने वाले पक्षपाती कोशिकाओं का चित्र विश्लेषण पर आधारित है, जो बहु-अच्छी प्लेटों में उगता है, और स्टैनडी-सेल पारगम्य फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अणुओं के साथ सीएम-एच 2 डीसीएफडीए (आरओएस) और टीएमआरएम (एमएम और मिटोचोनड्रियल आकारिकी)। फ्लोराइमेट्री या प्रवाह-साइटमैट्री के विपरीत, यह रणनीति प्रायोगिक उत्तेजना के पहले और बाद में, उच्च स्टेटियोटेम्पोरल रिजोल्यूशन वाले व्यक्तिगत सेल के स्तर पर सबसेलुलर मापदंडों की मात्रा का ठहराव प्रदान करती है। महत्वपूर्ण रूप से, विधि की छवि-आधारित प्रकृति तीव्रता संकेतों के साथ-साथ रूपरेखाओं को निकालने की अनुमति देती है। संयुक्त फीचर सेट का प्रयोग एक्सप्पुप्पुलेशन, सेल प्रकार और / या उपचार के बीच मतभेदों का पता लगाने के लिए अन्वेषणपूर्ण और सांख्यिकीय बहुभिन्नरूपी डेटा विश्लेषण के लिए किया जाता है। यहां, परख का विस्तृत वर्णन एक उदाहरण प्रयोग के साथ प्रदान किया गया है, जो रासायनिक घबरने के बाद सेलुलर राज्यों के बीच स्पष्ट भेदभाव के लिए अपनी क्षमता साबित करता है।

Introduction

इंट्रासेल्युलर आरओएस की एकाग्रता सावधानीपूर्वक आरओएस उत्पादन और आरओएस डिफोजिंग सिस्टम के बीच एक गतिशील परस्पर क्रिया के माध्यम से विनियमित होती है। दोनों के बीच असंतुलन, ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति को उत्तेजित करता है। आरओएस के प्रमुख स्रोतों में मिटोकॉन्ड्रिया 1 है सेलुलर श्वसन में उनकी भूमिका को देखते हुए, वे इंट्रासेल्युलर सुपरऑक्साइड (ओ 2 - - ) अणुओं के थोक के लिए ज़िम्मेदार हैं। यह अधिकतर इलेक्ट्रान रिसाव से अधिकतर इलेक्ट्रान ट्रांसपोर्ट चेन के परिसर 1 में ओ 2 के लिए परिणाम होता है जिसके तहत मजबूत नकारात्मक आंतरिक मिटोचोनड्रियल झिल्ली क्षमता (Δψ मी ), अर्थात् मिटोकॉन्ड्रियल हाइपरपरॉलरेशन दूसरी ओर, मिटोकोंड्रियल विध्रुवण भी आरओएस उत्पादन में बढ़ोतरी से संबंधित है , जो कि कार्रवाई के कई तरीकों को इंगित करता है 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 इसके अलावा, विखंडन-फ्यूजन मशीनरी के प्रोटीन में रेडॉक्स संशोधनों के माध्यम से, आरओएस मिटोचॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान 9 को सह-विनियमित करता है .उदाहरण के लिए, विखंडन बढ़ते आरओएस उत्पादन और एपोप्टोसिस 10 , 11 के साथ सहसंबंधित है, जबकि फिलामेंटिक मितोचोन्द्रिया को पोषक तत्वों की भूख और संरक्षण से जोड़ा गया है एमटोफैजी 12 सेलुलर आरओएस और माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फफ़ोन के बीच के जटिल रिश्ते को देखते हुए, दोनों ही जीवित कोशिकाओं में एक साथ मात्रा निर्धारित होना चाहिए। ऐसा करने के लिए, एक उच्च-सामग्री इमेजिंग परख स्वचालित चौड़ा माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट जांच सीएम-एच 2 डीसीएफडीए (आरओएस) और टीएमआरएम (मिटोकोडायड्रियल Δψ एम और मोर्फोलॉजी) के साथ दाग वाले पक्षपाती सेल संस्कृतियों के चित्र विश्लेषण के आधार पर विकसित किया गया था। उच्च-सामग्री इमेजिंग एसपी की निकासी को दर्शाती हैएकाधिक पूरक मार्करों और स्वचालित छवि विश्लेषण का उपयोग करते हुए सेल्युलर फिनोटाइप्स के बारे में जानकारी ( अर्थात् बड़ी संख्या में वर्णनात्मक विशेषताएं) स्वचालित माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर कई नमूने समानांतर ( यानी उच्च-थ्रुपुट) में जांच की जा सकती हैं, जिससे परख की सांख्यिकीय शक्ति बढ़ती है। दरअसल, प्रोटोकॉल की मुख्य संपत्ति यह है कि यह एक ही सेल में एक से अधिक मापदंडों के एक साथ मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, और यह बड़ी संख्या में कोशिकाओं और शर्तों के लिए है।

प्रोटोकॉल को 8 भागों में बांटा गया है (नीचे प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित है): 1) एक 96-अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को सीडिंग; 2) शेयर समाधान, काम कर रहे समाधान और इमेजिंग बफर की तैयारी; 3) माइक्रोस्कोप की स्थापना; 4) सीएम-एच 2 डीसीएफडीए और टीएमआरएम के साथ कोशिकाओं का लोडिंग; 5) बेसल आरओएस स्तर और माइटोकॉन्ड्रियल morphofunction को मापने के लिए पहले लाइव इमेजिंग दौर; 6) टीर्ट -बटिल के अलावा दूसरा लाइव इमेजिंग राउंडप्रेरित आरओएस स्तरों को मापने के लिए पेरोक्साइड (टीबीएचपी); 7) स्वचालित छवि विश्लेषण; 8) डेटा विश्लेषण, गुणवत्ता नियंत्रण और विज़ुअलाइज़ेशन

परख मूल रूप से सामान्य मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट (एनएचडीएफ) के लिए विकसित किया गया था। चूंकि ये कोशिका बड़े और सपाट हैं, वे 2 डी विस्तृतफील्ड छवियों 13 , 14 में मिटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के आकलन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। हालांकि, मामूली संशोधनों के साथ, यह विधि अन्य पक्षपाती सेल प्रकारों पर लागू होती है। इसके अलावा, सीएम-एच 2 डीसीएफडीए और टीएमआरएम के संयोजन के बगल में , कार्यप्रवाह विभिन्न आणविक विशिष्टताओं 1 , 15 के साथ विभिन्न प्रकार के फ्लोरोसेंट डाई जोड़ी का अनुपालन करता है।

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Protocol

नीचे दिए गए प्रोटोकॉल को एनएचडीएफ कोशिकाओं के लिए और सामग्री फ़ाइल में विनिर्दिष्ट मल्टीवेल प्लेटों के उपयोग के लिए वर्णित किया गया है। कार्यप्रवाह के सामान्य अवलोकन के लिए चित्र 1 देखें।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 10% वी / वी भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) और 100 आईयू / एमएल पेनिसिलिन और 100 आईयू / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (पीएस) के साथ दल्बेईको के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) को पूरक करके पूरा माध्यम तैयार करें। 500 एमएल पूर्ण माध्यम के लिए, 50 एमएल ऑफ एफबीएस और 5 एमएल ऑफ पीएस से 445 एमएल डीएमईएम जोड़ें।
  2. एचएमबीएस-एचईपीईएस (एचएच) इमेजिंग बफर को एचएमसी के बैलेंस्ड नमक समाधान (मैग्नीशियम और कैल्शियम के साथ, लेकिन फिनोल लाल के बिना) को 20 एमएम HEPES के साथ तैयार करके तैयार करें। 500 एमएल एचएच के लिए, 4 एमएल एचबीएसएस के लिए 10 एमएल 1 एम HEPES स्टॉक समाधान जोड़ें। पीएच को सत्यापित करें और, यदि आवश्यक हो, तो पीएच 7.2 में समायोजित करें।
  3. 86.5 में सीएम-एच 2 डीसीएफडीए लैओफिलाइज्ड पाउडर के 50 ग्राम को भंग करके 1 एमएम सीएम-एच 2 डीसीएफडीए स्टॉक समाधान तैयार करें।# 181; एल निर्जल डीएमएसओ भंवर में या नीचे पिपेट करके और भूरे रंग के microcentrifuge ट्यूबों में 20 μL aliquots बनाने के द्वारा मिलाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें और 1 सप्ताह के अंदर का उपयोग करें। यदि एन 2- टामोस्फीयर शेल्फ लाइफ के तहत संग्रहीत किया जा सकता है तो कम से कम 1 महीने तक बढ़ाया जा सकता है।
    1. 50 एमएल निर्जल डीएमएसओ में 25 मिलीग्राम TMRM पाउडर भंग करके 1 एमएम TMRM स्टॉक समाधान तैयार करें। भंवर से ऊपर या नीचे पिपेट करके और भूरे रंग के microcentrifuge ट्यूबों में 10 μL aliquots बनाओ। -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें यह समाधान कम से कम एक वर्ष के लिए स्थिर है
  4. सीधे 70% स्टॉक समाधान (10 μL / 96-अच्छी तरह से प्लेट) से एक वॉल्यूम pipetting द्वारा प्रत्येक प्रयोग के लिए Tert -butyl पेरोक्साइड (टीबीएचपी) स्टॉक (~ 7 एम) के एक ताजा विभाज्य तैयार करें। इस विभाज्य को 4 डिग्री सेल्सियस तक आगे का उपयोग न करें।
  5. 1x एचएच-बीयू में 1,000 बार दो माध्यमिक एंटीबॉडी (एलेक्सा फ्लूर 488 गधा विरोधी खरगोश और सीए 3 गधा विरोधी खरगोश) को कम करके एंटीबॉडी कार्य समाधान (एबी) तैयार करेंffer।

2. माइक्रोस्कोप और अधिग्रहण प्रोटोकॉल (± 15 मिनट) की स्थापना

नोट: छवि अधिग्रहण एक 20x वायु योजना-सही उद्देश्य (एनए = 0.75) और एक ईएम-सीसीडी कैमरा का उपयोग करते हुए एक स्वचालित चरण और शटर के साथ सुसज्जित एक व्यापक-क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ किया जाता है, और एक हार्डवेयर आधारित ऑटोफोकस सिस्टम। पहली बार परख लगाने पर, प्रोटोकॉल के निर्देशों के अनुसार दाग वाले नियंत्रण कक्षों वाले एक टेस्ट प्लेट का उपयोग एक्सवाई-चरण को जांचने और अधिग्रहण सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए किया जाता है। यदि अधिग्रहण सेटिंग्स पहले से ही निर्धारित की गई हैं, तो कैलिब्रेशन एक खाली प्लेट का उपयोग करके किया जा सकता है।

  1. पूर्ण आधार स्तर के उद्देश्य को कम करें और सॉफ़्टवेयर निर्देशों के बाद XY- चरण का परीक्षण करें।
  2. सुनिश्चित करें कि सही फिल्टर cubes स्थापित कर रहे हैं। सीएम-एच 2 डीसीएफडीए की कल्पना करने के लिए, 472/30 एनएम उत्तेजना बैंडपास फ़िल्टर के साथ एक मानक जीएफपी फिल्टर क्यूब का उपयोग करें, एक 495 एनएम कटऑफ डिचरोआईसी दर्पण और एक 520/35 एनएम bandpass उत्सर्जन फिल्टर। टीएमआरएम के लिए, 540/25 एनएम बैंडपास उत्तेजना फिल्टर के साथ TRITC के लिए एक फिल्टर क्यूब का उपयोग करें, एक 565 एनएम कटऑफ डायक्रोइकिक दर्पण और 605/55 एनएम बैंडैस उत्सर्जन फिल्टर।
  3. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक इमेजिंग प्रोटोकॉल बनाएं।
    1. सॉफ्टवेयर के भीतर उपलब्ध प्लेट्स की सूची से मल्टीवेल प्लेट (निर्माता और कोड) का सही प्रकार चुनें। वैकल्पिक रूप से प्लेट और अच्छी तरह से आयामों का उपयोग करके अपने खुद के मल्टीवेल प्लेट प्रारूप को परिभाषित करें।
    2. सॉफ़्टवेयर के निर्देशों के अनुसार अच्छी तरह से थाली को संरेखित करें, जैसे चार बाहरी कोने के कुएं के दो कोनों को परिभाषित करके। यह चरण कैमरा ओरिएंटेशन भिन्नता के लिए शामिल है।
    3. जिन कुओं को अधिग्रहित करने की आवश्यकता है उन्हें चुनें यदि यह विकल्प सॉफ्टवेयर में उपलब्ध नहीं है, तो चयनित कुएं के अनुरूप मैन्युअल रूप से परिभाषित XY- स्थानों का एक समूह का उपयोग करें।
    4. वें के लिए अधिग्रहण सेटिंग्स (एक्सपोज़र का समय, दीपक की तीव्रता, ईएम-लाभ) का अनुकूलन करेंई दो चैनल अलग से परीक्षण प्लेट का उपयोग कर। प्रतिदीप्ति उत्तेजना प्रकाश के रूप में जोखिम और तीव्रता को कम से कम आरओएस लाती है। लेकिन, सुनिश्चित करें कि टीबीएचपी उपचार से पहले टीएमएचएम के लिए मूलभूत सीएम-एच 2 डीसीएफडीए और 3 के लिए पृष्ठभूमि अनुपात का संकेत कम से कम 2 है, और टीबीएचपी उपचार के बाद कोई संतृप्ति नहीं है। अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग माइक्रोस्कोपी सेटअप और सेल प्रकार पर निर्भर करता है, लेकिन एक संदर्भ के रूप में, संकेतक सेटिंग्स जब 130 डब्ल्यू की हल्की प्रकाश बल्ब का उपयोग करते समय प्रकाश स्रोत और एनएचडीएफ कोशिकाओं को प्रोटोकॉल के निर्देशों के अनुसार दाग दिया जाता है: दोनों सीएम- एच 2 डीसीएफडीए और टीएमआरएम क्रमशः 200 एमएस और एनडी फ़िल्टर 8 का एक्सपोजर टाइम उपयोग किया जाता है, जो क्रमशः 15 (13 मेगाहर्ट्ज, 14-बिट) और 4 (27 मेगाहर्ट्ज, 14-बिट) के ईएम-लाभ के साथ जुड़ता है। एक बार एक निश्चित सेटअप और सेल प्रकार के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया, यह चरण छोड़ दिया जा सकता है।
      नोट: यह आवश्यक है कि संपूर्ण इमेजिंग प्रक्रिया में अधिग्रहण सेटिंग को एक ही रखा जाना चाहिए। बड़े पैमाने पर, बहु-दिवसीय प्रयोगों के लिए, दीपक स्टैनियमित गुणवत्ता नियंत्रण द्वारा सक्षम होना चाहिए
    5. एक अनुक्रमिक लैम्ब्डा (तरंगलांबी) अधिग्रहण से मिलकर अधिग्रहण प्रोटोकॉल को परिभाषित करें। मापन से पहले प्रकाश एक्सपोजर को कम करने के लिए सीएम-एच 2 डीसीएफडीए चैनल को पहले अधिग्रहित करने का चयन करें।
    6. 2.3.4 में परिभाषित अधिग्रहण प्रोटोकॉल का उपयोग करके अच्छी तरह से चयन के प्रत्येक कुएं के केंद्र के चारों ओर स्थित चार नियमित रूप से स्थान पर गैर-अतिव्यापी छवियों को प्राप्त करने के लिए, एक अच्छी-प्लेट लूप परिभाषित करें। सबसे अच्छा छवि अधिग्रहण, अर्थात्, पहले बाएं से दाएं, अच्छी तरह से B02 से B11 तक, पीछे से, दाएं से बाएं, अच्छी तरह से C11 से C02 तक और इसी तरह ( चित्रा 2 ए )। यह बाएं से दाएं छवि अधिग्रहण की तुलना में समय बचाता है। यदि यह विकल्प सॉफ़्टवेयर में उपलब्ध नहीं है, तो इस इमेजिंग पैटर्न को लेने के लिए 2.3.4 में बनाए गए XY- स्थानों के कस्टम सेट को समायोजित करें।
    7. आसान पुनरीक्षण की अनुमति देने के लिए इमेजिंग-पोजीशंस ( जैसे एक अलग xml-file में) के XY- निर्देशांक सहेजेंमाइक्रोस्कोप पुनर्नवीनीकरण के मामले में एनजी यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर इस परख से पढ़ें को एक ही कोशिका के लिए पोस्ट-हॉक इम्युनोफ्लोरेसेंस (IF) के साथ सहसंबद्ध होना चाहिए।

3 एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में सीडिंग सेल (45 - 90 मिनट, विभिन्न सेल लाइनों की संख्या के आधार पर)

  1. बाँझ वातावरण में काम करें जैसे कक्षा 2 जैव सुरक्षा कैबिनेट और दस्ताने पहनें।
  2. डिस्टिल्ड वॉटर में 70% वी / वी एथेनॉल का उपयोग करके सभी सतहों और सामग्री को नष्ट करें।
  3. इनक्यूबेटर से 90% संगम कोशिका संस्कृति के साथ एक सेल कल्चर फ्लास्क लें और इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें।
  4. पीबीएस 1x से दो बार कोशिकाओं को धो लें
  5. कोशिकाओं पर 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान की उचित मात्रा जोड़ें, यह सुनिश्चित कर लें कि पूरी कोशिका की सतह को कवर किया गया है ( जैसे , टी 25 फ्लास्क के लिए 1 एमएल), और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. अगर सभी कोशिकाओं को अलग कर दिया जाता है (माइक्रोस्कोप के साथ जांचें ), ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान को निष्क्रिय करने के लिए संस्कृति माध्यम (डीएमईएम + 10% एफबीएस + 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन; टी -20 फ्लास्क में ± 4 एमएल) जोड़ें।
  7. कमरे के तापमान पर 300 x ग्रा में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
  8. सतह पर तैरनेवाला को त्यागें और संस्कृति माध्यम में सेल गोली resuspend। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए एक सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए माध्यम की मात्रा निर्धारित करें जो कि सेल गिनती के साथ संगत है। आमतौर पर, एनएचडीएफ के एक 9 0% मिला हुआ टी -25 फ्लास्क में लगभग 1-1.5 मिलियन कोशिकाएं होती हैं, जो कि संस्कृति के 3-4 एमएल संस्कृति में रिसाव होते हैं।
  9. एक सेल गिनती कक्ष या कल्टर काउंटर का प्रयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  10. एक पतली सतत polystyrene या कांच के नीचे (इमेजिंग के दौरान बिखरने से बचने और आसन्न कुओं के बीच क्रॉस-टॉक से बचने के लिए काला) के साथ एक काले रंग की 96-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक 60 आंतरिक कुंड में 8,000-10,000 कोशिकाओं। विभिन्न स्थितियों / उपचार / सेल लाइनों का उपयोग करते समय, प्लेट पर समान रूप से अपने बीजों के स्थान वितरित करता है ताकि प्लेट प्रभाव को कम किया जा सके (अंजीर "> चित्रा 2 ए)। बाहरी कुएं, अच्छी तरह से B01 और A01 को छोड़कर, इसका उपयोग नहीं किया जाता है क्योंकि वे किनारे प्रभावों की अधिक संभावना रखते हैं।
  11. B01 में 8,000-10,000 कोशिकाओं बीज। यह अच्छी तरह से फ़ोकस समायोजन के लिए उपयोग किया जाएगा, केवल छवि अधिग्रहण से पहले।
  12. कुओं और पर्यावरण के बीच ढाले (तापमान, आर्द्रता, आदि ) को कम करने के लिए माध्यम के साथ खाली बाहरी कुएं भरें।
  13. पैच में बढ़ने से कोशिकाओं से बचने के लिए इनक्यूबेटर में इसे वापस रखने से पहले तीन बार प्लेट को धीरे से टैप करें।
  14. संस्कृति 24 घंटे या लगभग एक संगम की डिग्री तक की कोशिकाओं 70%।
  15. प्रयोग के लिए "Setup.xlsx" नामक एक स्प्रैडशीट में इलाज की जानकारी सहेजें फ़ाइल में चार कॉलम शामिल होने चाहिए और डेटा विश्लेषण के दौरान कुओं और छवि जानकारी के उपचार के साथ लिंक करने के लिए उपयोग किया जाएगा। चार स्तंभ हैं: 'वेल', 'ट्रीटमेंटनंबर', 'ट्रीटमेंट' और 'कंट्रोल' (एक पंक्ति प्रति अच्छी तरह से) हर उपचार युग्मित हैएक अनूठे उपचार संख्या के साथ, जिसका इस्तेमाल चित्रों के एक्स-अक्ष पर उपचार के आदेश को निर्धारित करने के लिए डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के दौरान किया जाता है। नियंत्रण-स्तंभ उस उपचार को निर्दिष्ट करता है जो वर्तमान पंक्ति के उपचार के लिए नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। एक विशिष्ट प्रायोगिक लेआउट और संबंधित सेटअप फ़ाइल के चित्र चित्र 2 में दर्शाए गए हैं।

4. सीएम-एच 2 डीसीएफडीए और टीएमआरएम (± 45 मिनट) के साथ सेल लोड हो रहा है

नोट: प्रयोग के दिन कोशिकाओं को संभालने के लिए एक बाँझ वातावरण (जैव सुरक्षा कैबिनेट) में किया जा सकता है, लेकिन यह अनिवार्य नहीं है क्योंकि कोशिकाओं को त्यागने के बाद या सीधे तय किया जाएगा।

  1. एचएच-बफर को 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम करें
  2. 1 एमएम शेयर समाधान को एचएच-बफर में 50 गुना (10 μL TMRM स्टॉक समाधान के 1 विभाज्य के लिए 4 9 0 μL एचएच-बफर जोड़ें) में 20 माइक्रोन टीएमआरएम कामकाजी समाधान तैयार करें।
  3. एक लोड तैयार करें2 माइक्रोन सीएम-एच 2 डीसीएफडीए और 100 एनएम टीएमआरएम के साथ समाधान करना इस समाप्ति के लिए, 1 एमएम सीएम-एच 2 डीसीएफडीए स्टॉक सॉल्यूशन 500x और एचआईबी-बफर में 20 माइक्रोग्राम टीएमआरएम कामकाजी समाधान 200x पतला।
    1. आमतौर पर, 60 कुओं के लिए, सीएम-एच 2 डीसीएफडीए के 15 μL और एचआर के 7447.5 μL को TMRM समाधान के 37.5 μL जोड़कर 7.5 मिलीलीटर लोडिंग समाधान तैयार करें।
  4. एक द्रव गति में उल्टा प्लेट को मोड़कर कोशिकाओं से संस्कृति माध्यम को त्यागें।
  5. एक मल्टीचैनल पिपेट (100 μL / अच्छी तरह) का उपयोग करके एचएच-बफर के साथ दो बार कोशिकाओं को धीरे से धो लें एक तरल द्रव्यमान गति में प्लेट को उल्टा करके मोड़कर धोने के चरणों में एचएच-बफर को त्यागें।
  6. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके फिर से हर अच्छी तरह से लोडिंग समाधान के 100 μL जोड़कर CM-H 2 DCFDA और TMRM वाले कक्षों को लोड करें। कमरे के तापमान पर, अंधेरे में 25 मिनट सेते हैं। अच्छी तरह से B01 मत भूलना।
  7. इन 25 मिनट के दौरान, ऑक्सीडेंट टीबीएचपी के कामकाज समाधान तैयार करें और सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप और गौण हार्डवेयर चालू हैं।
    1. कार्यशील समाधान तैयार करें I: 7 एम स्टॉक सोल्यूशन 70x से 100 मिमी (6 9 μL एचएच-बफर में 10 μL स्टॉक) को पतला।
    2. कार्यशील समाधान तैयार करें I: डब्लूएस I 100x से 1 एमएम (9 9 0 μL एचएच-बफर में 10 μL डब्ल्यूएस आई) को पतला करें।
    3. कार्यशील समाधान तैयार करें III: डब्ल्यूएस III 25x से 40 माइक्रोन (60 कुओं के लिए 7200 μL एचएच बफर में 300 μL डब्ल्यूएस II जोड़ें) को पतला करें।
  8. 25 मिनट के बाद, कोशिकाओं को दो बार फिर से 100 μL एचएच-बफर से दो बार धो लें जैसा कि पहले बताया गया है।
  9. सभी 60 आंतरिक कुएं में 100 μL एचएच-बफर जोड़ें।

5. बेसल आरओएस स्तर और मिटोकॉन्ड्रियल मॉर्फफ़ंक्शन (± 15 मिनट) को मापने के लिए पहले लाइव इमेजिंग राउंड

  1. सुनिश्चित करें कि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चालू है और इमेजिंग प्रोटोकॉल लोड किया गया है।
  2. माइक्रोस्कोप पर प्लेट स्थापित करें, हार्डवेयर बा चालू करेंSed ऑटोफोकस सिस्टम और टीएमआरएम चैनल का उपयोग करके ऑफसेट ऑटफ़ोकस को समायोजित करने के लिए अच्छी तरह से B01 का उपयोग करें। चूंकि इस प्रक्रिया में सीएम-एच 2 डीसीएफडीए सिग्नल की तीव्रता में वृद्धि हुई है, यह अच्छी तरह से डाउनस्ट्रीम इमेज विश्लेषण से बाहर रखा गया है।
  3. इमेजिंग प्रोटोकॉल चलाएं

6. प्रेरित लाइव रोशनी स्तर (± 20 मिनट) को मापने के लिए टीबीएचपी की वृद्धि के बाद दूसरी लाइव इमेजिंग राउंड

  1. माइक्रोस्कोप से 96-अच्छी तरह से प्लेट को हटा दें
  2. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से 100 μL टीबीएचपी डब्ल्यूएस III (40 सुक्ष्ममापी) को जोड़ें (यह कुओं में 20 माइक्रोन टीबीएचपी एकाग्रता का परिणाम है)। इस परिसर को सीएम-एच 2 डीसीएफडीए धुंधला के लिए एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है (संकेत बढ़ना चाहिए) साथ ही प्रेरित आरओएस स्तरों को मापने के लिए एक साधन।
    नोट: टीबीएचपी के बजाय एच 2 ओ 2 का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह परिसर कम स्थिर है और इसलिए कम विश्वसनीय है।
  3. टीबीएचपी डब्ल्यू की पूरी प्रतिक्रिया देने के लिए कम से कम 3 मिनट की प्रतीक्षा करेंIth सीएम-एच 2 डीसीएफडीए
  4. इस समय के दौरान, 100 μL एंटीबॉडी कार्य समाधान (1 / 1,000) को अच्छी तरह से A01 जोड़ें।
  5. माइक्रोस्कोप पर वापस प्लेट माउंट करें और ठीक से B01 का उपयोग करके फिर से ध्यान केंद्रित करें।
  6. एक ही इमेजिंग प्रोटोकॉल का प्रयोग करते हुए पहले इमेजिंग राउंड के समान पदों को प्राप्त करें।
  7. मानकीकृत नामकरण का प्रयोग करते हुए व्यक्तिगत टिफ फाइल के रूप में एक फ़ोल्डर में अधिग्रहीत डेटासेट्स को निर्यात करें जिसमें प्लेट, पूर्व- या टीबीएचपी उपचार, ठीक है, फ़ील्ड और चैनल, अंडरस्कोर द्वारा अलग किए गए संदर्भ, जैसे । प्लेट 1, प्री-टीबीएचपी उपचार, बी02, फ़ील्ड 1 और चैनल 1 के लिए 'पी 01_Pre_B02_0001_C1'। यह जानकारी छवि विश्लेषण के दौरान इस्तेमाल की जाएगी ( उदाहरण के लिए उपयुक्त विभाजन सेटिंग का चयन करना), साथ ही डेटा विश्लेषण के दौरान (विश्लेषण डेटा कनेक्ट करने के लिए) सही उपचार के साथ)
  8. अधिग्रहण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए अच्छी तरह से A01 के केंद्र के चारों ओर चारों स्थानों पर दोनों चैनलों के लिए फ्लैट फील्ड चित्र प्राप्त करें। वें बचाओउन्हें निम्न मानकीकृत नामकरण का उपयोग करते हुए अन्य चित्रों के रूप में एक ही फ़ोल्डर में व्यक्तिगत झगड़ा फ़ाइलों के रूप में: प्लेट 1, फ़ील्ड 1 और चैनल के लिए 'P01_FF_A01_0001_C1'। सुनिश्चित करें कि संकेत गतिशील श्रेणी के भीतर अच्छी तरह से हैं; संतृप्ति के मामले में, एंटीबॉडी काम करने वाले समाधान की कम एकाग्रता का उपयोग करें।
  9. प्लेट को त्याग दें या आगे की प्रक्रिया के लिए बचें।
    नोट: टीबीएचपी समाधान जोड़ने के लिए माइक्रोस्कोप से प्लेट को निकालने और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के बजाय, एक स्वचालित विंदुक माइक्रोस्कोप स्टेज पर स्थापित किया जा सकता है और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से जुड़ा हो सकता है ताकि एक ट्रिगर प्राप्त करने पर कार्य किया जा सके। यह अगले अधिग्रहण के बाद सीधे अगले अच्छी तरह से जाने से पहले प्रत्येक अच्छी तरह से टीबीएचपी को जोड़ने के लिए अनुमति देता है। इस तरह, जब पहली इमेजिंग का दौर समाप्त हो गया है, दूसरा दूसरा तुरंत शुरू हो सकता है और सभी कुओं में टीबीएचपी के साथ एक समान ऊष्मायन समय होगा।

7. छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण (प्रति ± 30 मिनट प्रति96-अच्छी तरह से प्लेट)

नोट: सभी छवि प्रसंस्करण FIJI (http://fiji.sc), ImageJ फ्रीवेयर के एक पैक संस्करण में किया जाता है एक समर्पित स्क्रिप्ट को इंट्रासेल्युलर आरओएस- और मितोचोन्ड्रियल सिग्नल के स्वचालित विश्लेषण के लिए लिखा गया था, साथ ही आकृतिगत मापदंडों (अनुरोध पर उपलब्ध रेडॉक्समेट्रिक्स.आईजेएम)। अंतर्निहित एल्गोरिदम का वर्णन साइफाथ एट अल में किया गया है। 1

  1. सुनिश्चित करें कि FIJI स्थापित और परिचालनात्मक है।
  2. FIJI को प्रारंभ करें और मैक्रो-सेट स्थापित करें (प्लगइन्स -> मैक्रो -> इंस्टॉल करें ...)। यह चित्रा 3 ए में दिखाए अनुसार, विश्लेषण सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए कई नए मैक्रो आदेशों के साथ-साथ एक्शन टूल्स का एक सेट भी लाएगा ।
  3. 'एस' बटन पर क्लिक करके विश्लेषण सेटिंग्स सेट करने के लिए सेटअप इंटरफ़ेस खोलें ( चित्रा 3 बी )।
    1. छवि प्रकार का चयन करें, चैनलों की संख्या और उपयोग की गई अच्छी तरह सेफ्लैटफील्ड छवियों को प्राप्त करने के लिए
    2. इंगित करें कि किस चैनल में कोशिकाओं (सीएम-एच 2 डीसीएफडीए चैनल) या मिटोचोनड्रिया (टीएमआरएम-चैनल) शामिल हैं और छवि गुणवत्ता ( चित्रा 3 बी ) के आधार पर प्रत्येक चैनल के लिए प्री-प्रोसेसिंग और सेगमेंटेशन पैरामीटर समायोजित करें। पृष्ठभूमि घटाव या कंट्रास्ट सीमित अनुकूली हिस्टोग्राम आकलन 16 , क्रमशः प्रदर्शन करने के लिए 'पृष्ठभूमि' और 'कंट्रास्ट' चेकबॉक्स टिक करें। गौसी को धुंधला कोशिकाओं और मिटोचांद्रिया की लाप्लासीयन वृद्धि के लिए सिग्मा को परिभाषित करें। एक स्वचालित थ्रेशोल्डिंग एल्गोरिदम चुनें और आकार अपवर्जन सीमाएं (पिक्सेल में) भरें। यदि एक निश्चित दहलीज एक स्वचालित थ्रेशोल्डिंग एल्गोरिथ्म के बजाय चुना जाता है, तो ऊपरी सीमा को भरें
    3. अधिग्रहित डेटा सेटों के कुछ चयनित छवियों पर विभाजन सेटिंग को खोलकर उन्हें क्रमशः कक्ष- या मितोचोनड्रिया खंड के लिए मेनू में 'सी' या 'एम' बटन पर क्लिक करके टेस्ट करें,और यदि आवश्यक हो तो सेटिंग्स को समायोजित करें एक उदाहरण का परिणाम चित्र 3 सी में दिखाया गया है
  4. '#' बटन पर क्लिक करके और छवियों के साथ फ़ोल्डर को चुनकर ब्रेड के फ़ोल्डर पर बैच विश्लेषण चलाएं। प्रति फोल्डर, यह एक नई 'आउटपुट' निर्देशिका का उत्पादन करेगा, जिसमें प्रत्येक ROI सेट (ज़िप फ़ाइलें) और परिणामी फ़ाइलें (.txt) प्रति छवि होगी। दोनों चैनलों के लिए परिणाम फ़ाइल में तीव्रता और रूपात्मक वर्णनकर्ता होते हैं सीएम-एच 2 डीसीएफडीए चैनल (सेल) परिणाम फ़ाइल में प्रत्येक प्रतिरूप में एक छवि के भीतर संयुक्त आरओआई के लिए औसत मूल्य होता है। TMRM चैनल के लिए, परिणाम फ़ाइल में प्रति डिस्क्रिप्टर प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से खंडित mitochondrial ROI के लिए मूल्य होता है।
  5. बैच विश्लेषण के बाद, 'वी' बटन पर क्लिक करके अपने ROI ओवरले के साथ सभी छवियों के हाइपरस्टैक, 'सत्यापन स्टैक' पर विभाजन प्रदर्शन को नेत्रहीन रूप से सत्यापित करें इस तरह, कलाकृतियों जैसे ओवर-/ निगलना, छवियों में फोकस छवियों या धूल-कणों / फाइबर से पहले ही जल्दी से देखा जा सकता है डाटा कंट्रोल कंट्रोल (सीएफएफ़ §8) के दौरान आगे क्युरेक्शन किया जा सकता है।

8. डेटा विश्लेषण, गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) और विज़ुअलाइज़ेशन

कच्चे आंकड़ों का प्रसंस्करण और विश्लेषण आर सांख्यिकीय फ्रीवेयर (http://www.rproject.org - संस्करण 3.3.2) और आर स्टुडियो (http://www.rstudio.com/ - संस्करण 1.0.44) का उपयोग किया जाता है। परिणामों को जल्दी से प्राप्त करने और कल्पना करने के लिए, सहज ज्ञान युक्त चमकदार आवेदन 17 (अनुरोध पर उपलब्ध) का अनुमान लगाया गया है कि गर्मी और बक्सेप्लेट्स में डेटा को एकीकृत और दृश्यित किया जाता है, और यह सांख्यिकीय विश्लेषण भी करता है। सामान्य तौर पर, वर्कफ़्लो में दो लगातार चरण होते हैं सबसे पहले, डेटा 96 बिलियन अच्छी तरह से प्लेट का निरीक्षण किया जाता है जिसमें बेपरेट डेटा बिन्दुओं का पता लगाया जा सकता है। दूसरे, किसी दिए गए प्रयोग के सभी प्लेटों के क्यूरेटेड डेटा को संयुक्त और गैर-पैरामीट्रिक मल्टी का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता हैविविध परीक्षण 18 और एक प्रमुख घटक विश्लेषण

  1. सुनिश्चित करें कि आर और आरस्टुडियो स्थापित और परिचालन हैं
  2. प्रारंभ करें RStudio
  3. रेडॉक्स मैट्रिक्स चमकदार एप्लिकेशन को खोलें और ऐप को चलाएं (इसे किसी बाहरी ब्राउज़र में चलाने के लिए चुनें)।
  4. 'इनपुट' पृष्ठ पर, डायरेक्टरी का चयन करें जहां रेडॉक्सीमेट्रिक्स.आईजीएम से परिणाम फाइलें स्थित हैं।
  5. सुनिश्चित करें कि 'Setup.xlsx' (चरण 3.15 में बनाया गया) भी इस निर्देशिका में मौजूद है।
  6. परिणाम फ़ाइलें और सेटअप जानकारी स्वचालित रूप से आयात की जाती है, पुन: व्यवस्थित और विज़ुअलाइज़ की जाती है।
    1. 'प्रयोगात्मक सेटअप' पृष्ठ प्रयोग का लेआउट दिखाता है। सत्यापन के लिए इस पृष्ठ का उपयोग करें
    2. अगले पृष्ठ, 'परिणाम प्रति प्लेट' प्रत्येक प्लेट के डेटा को अलग-अलग रंग-कोडित मल्टी-प्लेयलेट प्लेट लेआउट के साथ-साथ अच्छी तरह से नाम और छवि संख्या वाले लेबल के साथ बॉक्सप्लेट में दिखाता है। बाद में सहज निरीक्षण और पहचान की अनुमति देता हैअभद्र डेटा बिंदुओं का अवलोकन (उस विशिष्ट उपचार के लिए मापा औसत मूल्यों की तुलना में बेहद ऊंची या कम मूल्य - उदाहरण के लिए चित्रा 4 देखें)।
      इस जानकारी का उपयोग करते हुए, बेपरवाह अंक के अनुरूप चित्रों को सत्यापित करें। यदि असामान्यताओं का पता चल गया है, तो उन्हें विश्लेषण से हटा दिया जाना चाहिए। अधिकांश असामान्यताएं अनुचित विभाजन के कारण होती हैं जब छवि का (भाग) फ़ोकस से बाहर है, या जब अत्यधिक फ्लोरोसेंट धूल कणों को उचित विभाजन को परेशान किया जाता है। चरम मामले पहले से सत्यापन स्टैक उपकरण (चरण 7.5) का उपयोग करके जल्दी से देखा जा सकता है, लेकिन इस चरण में अधिक सूक्ष्म घटनाएं खोज की जाती हैं। जब अपरिवर्तनीय मूल्य के लिए कोई स्पष्ट या तकनीकी कारण नहीं मिल पाया, तो छवि को विश्लेषण से हटाया नहीं जाना चाहिए।
    3. वैकल्पिक: 'ड्रॉप। एक्सएलएसएक्स' नामक एक नई स्प्रेडशीट 'ड्रॉप' नामक एक कॉलम के साथ बनाएँ इस कॉलम में, सभी छवियों के फ़ाइल नामों (".tif" एक्सटेंशन सहित) को सूचीबद्ध करेंजिसे विश्लेषण से हटा दिया जाना चाहिए (चरण 7.5 या चरण 8.6.2 में पहचाना गया है)। इस फ़ाइल को 'इनपुट' पेज का उपयोग करके अपलोड करें
    4. 'परिणाम पूरे प्रयोग' पेज सभी प्लेटों के परिणाम संयुक्त से दिखाता है यदि एक बूंद फाइल अपलोड की गई थी, तो इस फाइल का उपयोग विश्लेषण से निर्दिष्ट डेटा बिंदुओं को निकालने के लिए किया जाता है।
      प्रत्येक पैरामीटर के लिए अलग-अलग, डेटा को प्रत्येक प्लेट के अनुसार उनके संबंधित नियंत्रणों के अनुसार सामान्यीकृत किया जाता है। सभी प्लेटों के डेटा को संयुक्त रूप से जोड़ा जाता है, इसके बाद nparcomp पैकेज 18 से गैर-पैरामीट्रिक बहुभिन्नरूपी परीक्षणों के साथ। यदि केवल दो उपचार की तुलना नॉनपारामेटिक बेहेरेन-फ़िशर समस्या के लिए दो नमूना परीक्षणों की तुलना में की जाती है। 2 से अधिक उपचारों के लिए, एक गैर-पैरामीट्रिक विपरीत-आधारित एकाधिक तुलना परीक्षण का उपयोग किया जाता है। परिणाम बॉक्सप्लेट्स का उपयोग करके देखे जा सकते हैं
    5. 'क्लस्टर विश्लेषण' पृष्ठ एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए - आर कोर 'आंकड़े' पैकेज) के परिणाम दिखाता है। 5 मापदंडों से डेटा (बीएसैल और प्रेरित आरओएस, और मिटोकोंड्रियल झिल्ली की क्षमता, आकार और परिपत्र) एक संवेदनशील रेडॉक्स प्रोफाइल के आधार पर विभिन्न उपचारों को भेदभाव करने के लिए जोड़ा जाता है। इसके लिए, एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) किया जाता है (आर कोर 'आंकड़े' पैकेज)। परिणाम एक बाप्लोट (ggbiplot पैकेज - http://github.com/vqv/ggbiplot) का उपयोग करके देखे जा सकते हैं।
    6. संसाधित और पुन: व्यवस्थित डेटा वाले बैकएंड डेटा फ़्रेम डाउनलोड करने के लिए 'डेटा डाउनलोड करें' पृष्ठ का उपयोग करें, जैसे वे अधिक उन्नत डेटा विज़ुअलाइज़ेशन या सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पुन: उपयोग किए जा सकते हैं।
      नोट: विशिष्ट नुकसान और संभावित समाधान तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं

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Representative Results

परख को कई नियंत्रण प्रयोगों का उपयोग करके बेंचमार्क किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप साइफाथ एट अल में वर्णित हैं । 1 संक्षेप में, क्रमशः आरओएस और Δψ एम में सीम-एच 2 डीसीएफडीए और टीएमआरएम के प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया को क्रमशः गतिशील रेंज को निर्धारित करने के लिए निर्धारित किया गया है। सीएम-एच 2 डीसीएफडीए के लिए, एनएचडीएफ ने टीबीएचपी की 10 माइक्रोग्राम से 160 माइक्रोन के बीच में बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया जब प्रतिदीप्ति संकेत में एक रैखिक वृद्धि देखी गई। इसी तरह, टीएमआरएम के लिए, एनएचडीएफ कोशिकाओं ने मिटोकोडायड्रियल प्रतिदीप्ति में एक रैखिक वृद्धि का प्रदर्शन किया जब ओलिगॉमीसीन की बढ़ती सांद्रता (जो कि Δψ एम हाइपरपरॉलरेशन को प्रेरित करती है) 1 से 10 माइक्रोग्राम / μL रेंज के भीतर फैलती है। इसके विपरीत, वैलिनोमाइसिन की वास्तविक समय में वृद्धि, एक एंटीबायोटिक जो कि Δψ एम विध्रुवण को प्रेरित करता है, परिणामस्वरूप एक क्रमिक, मात्राTMRM प्रतिदीप्ति के जरिए कमी

सेल प्रकार या उपचार 1 , 15 के बीच रेडॉक्स स्थिति में अंतर प्रकट करने के लिए परख का प्रयोग विभिन्न प्रकार के प्रयोगों में भी किया गया है। इसे स्पष्ट करने के लिए, परिणाम एचआईवी प्रोटीज अवरोधक साकिनावीर (एसक्यूवी) ( चित्रा 5 ) के साथ एनएचडीएफ का इलाज किया गया था, जिसमें एक प्रयोग का दिखाया गया है। वर्णित प्रोटोकॉल का प्रयोग, डीएमएसओ ( चित्रा 5 बी) के साथ नियंत्रित कोशिकाओं की तुलना में, बेसल और प्रेरित आरओएस दोनों स्तरों के लिए एक महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चला था। एसक्यूवी उपचार भी मिटोकॉन्ड्रियल morphofunction प्रभावित। रूपविकीय रूप से, मितोचोनड्रिया ने एक उच्च विखंडित पैटर्न का अधिग्रहण किया, जो कि एक उच्च वृहदता और व्यक्तिगत माइटोकोंड्रिया के छोटे औसत आकार से भी पुष्टि की गई थी। कार्यात्मक रूप से, Δψ मी , औसत टीएमआरएम सिग्नल प्रति मिटोच के रूप में मापा जाता हैOndrial पिक्सेल भी काफी वृद्धि हुई थी ( चित्रा 5 ए )। ऊपर वर्णित 5 पैरामीटर के डेटा के संयोजन करते समय, दो घटक (नियंत्रण और SQV) मुख्य घटक विश्लेषण द्वारा स्पष्ट रूप से एक दूसरे से अलग हो सकते हैं। तीन स्वतंत्र जीववैज्ञानिक प्रतिकृतियों के डेटा को 2 डी-बिप्लोट में दिखाया गया है जो पहले दो प्रमुख घटकों को प्रदर्शित करता है, जो कुल विचलन ( चित्रा 5C ) का 81.4% समझाता है। यह परख की मजबूती को साबित करता है और सुझाव देता है कि संयुक्त रीडआउट सेलुलर स्वास्थ्य स्थिति के एक संवेदनशील संकेतक के रूप में काम कर सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1 : इंट्रासेल्युलुलर बेसल और प्रेरित आरओएस स्तर और मिटोकॉन्ड्रियल मॉर्फफ़ोनेशन के एक साथ माप के लिए उच्च-सामग्री इमेजिंग परख के सामान्य अवलोकन। ( ए ) एसप्रमुख परिचालन ब्लॉकों के रासायनिक प्रदूषण ( बी ) इलस्ट्रेटेड उदाहरण: कोशिकाओं को एक से अधिक समान 96-अच्छी तरह प्लेटों में सीड किया जाता है। एक मानक अच्छी तरह से प्लेट लेआउट चित्रा 2 ए में अधिक विस्तार से दिखाया गया है। धुंधला होने के बाद, प्रत्येक छवि के चारों ओर प्रत्येक चैनल के चार चैनलों को 4 छवियां प्राप्त की जाती हैं, जो टीबीएचपी उपचार के पूर्व और बाद में हैं , जो इनसेट के साथ बड़े मॉन्टेज द्वारा स्पष्ट किया गया है। छवि विश्लेषण के बाद, तीव्रता वाले परिणाम को सहज-प्लेट लेआउट पर अनुमानित गर्मी-नक्शा का उपयोग करके देखा जाता है। यह प्लेट प्रभाव या बेरहम कुओं का तेजी से पता लगाने की अनुमति देता है। पूर्ण प्रयोगात्मक डेटा सेटों को बनाने के बाद, अंतिम डेटा विश्लेषण किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप एकल-साथ-साथ बहु-पैरामीटर आउटपुट होते हैं। (यह आंकड़ा संदर्भ 1 से संशोधित किया गया था, स्प्रिंगर की अनुमति के साथ) कृपया यहां क्लिक करें एक बड़े संस्करण को देखने के लिएइस आंकड़े के n

चित्र 2
चित्रा 2 : एक विशिष्ट प्रायोगिक 96-अच्छी तरह से लेआउट और अनुरूप 'सेटअप' फ़ाइल ( ए ) 4 अलग-अलग स्थितियों को प्लेट के भीतरी 60 कुओं में समरूप रूप से वितरित किया जाता है। खैर B01 में भी कोशिकाएं होती हैं, लेकिन इमेजिंग से पहले ही प्रारंभिक पीएफएस ऑफ़सेट समायोजित करने के लिए ही उपयोग किया जाता है। कोशिका संस्कृति के दौरान अन्य बाहरी कुएं संस्कृति के माध्यम से ही भरे हुए हैं (तापमान, आर्द्रता, आदि )। इमेज अधिग्रहण एक हंसमुख तरीके से किया जाता है, अर्थात्, सबसे पहले बाएं से दाएं, अच्छी तरह से B02 से B11 तक, फिर वापस, दाएं से बाएं, अच्छी तरह से C11 से C02 और इतने पर। छवि अधिग्रहण के बाद फ्लैट फ़ील्ड छवियों को अच्छी तरह से A01 में अधिग्रहण किया जाता है, जो छवि के दौरान स्थानिक रोशनी विविधता को सुधारने के लिए उपयोग किया जाता है alysis। ( बी ) संबंधित सेटअप फ़ाइल (Setup.xlsx) एक स्प्रेडशीट है जिसमें प्रयोग के लेआउट के बारे में जानकारी शामिल है। यह मल्टीवेल प्लेट और उनके संबंधित नियंत्रणों में प्रत्येक उपचार के स्थानों को निर्दिष्ट करता है। प्रत्येक पंक्ति एक अच्छी तरह से प्रतिनिधित्व करता है प्रत्येक उपचार का अपना अनूठा उपचार नंबर होता है, जिसका उपयोग डेटा विश्लेषण के दौरान उत्पन्न भूखंडों के एक्स-अक्ष पर उपचार के आदेश को निर्दिष्ट करने के लिए किया जाता है। 'कंट्रोल' कॉलम में ऐसे उपचार शामिल हैं, जिन्हें एक ही पंक्ति में निर्दिष्ट उपचार के डेटा को सामान्य करने के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। उदाहरण के तौर पर, उपचार 1 उपचार है जो अन्य सभी उपचारों के डेटा को सामान्य करने के लिए नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

9 / 55449fig3.jpg "/>
चित्रा 3 : रेडॉक्स मैट्रिक्स मैक्रो-सेट, लेआउट और सेटअप इंटरफ़ेस। ( ए ) जब FIXI स्थापित करने के लिए रेडोक्स मैट्रिक्स मैक्रो-सेट होता है, तो कई बार मैक्रो आदेश और साथ ही एक्शन टूल्स का एक सेट विश्लेषण सेटिंग्स का परीक्षण और अनुकूलन मेनू पट्टी में बनाया जाता है। 'एस' सेटअप इंटरफ़ेस आह्वान करता है 'एफ' एक खुली छवि पर एक फ्लैटफील्ड सुधार करता है 'सी' और 'एम' क्रमशः सेलुलर क्षेत्रों ("सेल", सीएम-एच 2 डीसीएफडीए चैनल) और मिटोकोडायड्रियल क्षेत्र ("एमटो", टीएमआरएम चैनल) के लिए एक परीक्षण खंड, एक खुली हुई छवि पर सेटअप में चयनित विश्लेषण सेटिंग्स का उपयोग करते हैं इंटरफ़ेस, ब्याज के खंड वाले क्षेत्रों (आरओआई) के एक ओवरले लौट रहा है '#' सेटअप इंटरफ़ेस में निर्दिष्ट सेटिंग्स का उपयोग करते हुए छवियों के एक फ़ोल्डर पर बैच विश्लेषण करता है (आमतौर पर एक या कुछ छवियों पर सत्यापन के बाद) 'वी' एक सत्यापन हाइपरस्टैक उपयोग करता हैबैच विश्लेषण से आउटपुट डेटा जी यह हाइपरस्टैक फ़ोल्डर में उपस्थित सभी कच्ची छवियों और उनके संबंधित क्षेत्रों (दूसरे चैनल में तैयार किए गए) की एक समग्र छवि है। 'ओ' को खंड वाले क्षेत्र के ओवरले को दिखाने या छिपाने के लिए क्लिक किया जा सकता है ( बी ) सेटअप इंटरफ़ेस यहां सभी विश्लेषण सेटिंग्स का चयन किया जाता है, जैसे कि छवि प्रकार (विस्तार), चैनलों की संख्या (तरंगदैर्ध्य) और सफ़लफ़िल्ल्ड सुधार के लिए उपयोग किए जाने वाले अच्छी तरह से सामान्य जानकारी सहित इसके बाद वहाँ छवि सामग्री प्रकार (सेल या मिटो) के लिए विशिष्ट सेटिंग्स हैं दोनों मामलों में, पृष्ठभूमि सुधार ("पृष्ठभूमि") और स्थानीय विपरीत वृद्धि ("कंट्रास्ट") को शामिल करने के लिए विकल्प (चेकबॉक्स) होते हैं। सेल विभाजन के लिए, शोर को कम करने के लिए गॉसियन ब्लर त्रिज्या (सिग्मा) को परिभाषित करने का विकल्प होता है। मिटो विभाजन के लिए मिटोचोनड्रिया की चयनात्मक वृद्धि के लिए एक लैपलासीयन ऑपरेटर के त्रिज्या को परिभाषित करने का विकल्प होता है। बाद के विभाजन को पी हैएक स्वतन्त्र (या निश्चित) थ्रेशोल्डिंग विधि का उपयोग करके भ्रमित हो सकता है जिसे प्रति सामग्री प्रकार परिभाषित किया जा सकता है। जब एक निश्चित थ्रेशोल्ड चुना जाता है, तो ऊपरी थ्रेशोल्ड मान को मैन्युअल रूप से प्रदान किया जा सकता है। अंत में, विश्लेषण न्यूनतम वस्तुओं और अधिकतम आकार के भीतर आने वाली वस्तुओं के चयन के लिए सीमित किया जा सकता है ( सी ) "सी" (शीर्ष) या "एम" (नीचे) कमांड के साथ चलने वाले एक विभाजन परिणाम का एक उदाहरण, पीले रंग में रुचि के क्षेत्रों के साथ भूरे रंग में कच्चे छवि के रूप में प्रदर्शित किया गया। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : इंटरमीडिएट डाटा विज़ुअलाइज़ेशन के इलस्ट्रेटेड उदाहरण। ( ए ) मल्टीवेल प्लेट दृश्य जहां कुएं B02 और D07 दिखाई देते हैंसंदिग्ध। ( बी ) बॉक्स प्लॉट समान डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं, साथ ही आउटलेयर्स को नाम और छवि नाम के साथ लेबल किया जाता है। साथ साथ F03_0003, आउटलेटर्स के रूप में B02 और D07 की छवियां फिर से दिखती हैं ( सी ) इन चित्रों के दृश्य निरीक्षण से पता चलता है कि बी02_0000 और डी07_0001 को आगे के विश्लेषण से हटा दिया जाना चाहिए, क्योंकि सेगमेंटेशन त्रुटियां हैं (लाल 'एक्स' द्वारा सचित्र)। F03_0003 रखा जाना चाहिए क्योंकि कोई स्पष्ट विभाजन या तकनीकी त्रुटि नहीं है (यदि विपथन के लिए कोई तकनीकी कारण नहीं है, तो डेटा को हटाया नहीं जाना चाहिए)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5 : प्राइमरी मानव फाइब्र पर साकिनावीर (एसक्यूवी; 20 सुक्ष्ममापी) का प्रभावओब्लास्ट (नियंत्रण डीएमएसओ है) ( ए ) मिटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएम) और मिटोचोनड्रियल आकृति विज्ञान (टीएमआरएम ( बी ) द्वारा मापा गया परिमाण और औसत आकार) सीआर-एच 2 डीसीएफडीए द्वारा मापा गया और रेट्रो आरओएस के प्रति प्रतिक्रिया के अनुसार इंट्रासेल्युलर आरओएस के बेसल स्तर में वृद्धि 20μM टीबीएचपी अतिरिक्त के अतिरिक्त के बाद तीव्रता में सापेक्ष लाभ के रूप में। ( सी ) ऊपर वर्णित 5 वेरिएबल (बेसल और प्रेरित आरओएस स्तर, औसत मितोचोन्ड्रियल आकार, परिपत्रता, और ΔΨ एम ) पर पीसीए विश्लेषण से पहले 2 प्रमुख घटकों (पीसी) के 2 डी स्कैटरप्लोट। काले तीर प्रमुख घटकों के संबंध में मूल 5 चर के निर्देशों का प्रतिनिधित्व करते हैं। (स्वतंत्र प्रतिकृतियां एक अलग रंग के साथ रखी गई हैं; सभी डेटा को डीएमएसओ-नियंत्रण के संबंध में सामान्यीकृत किया जाता है; * = पी मूल्य <0.05; ** = पी मान <0.01; *** = पी मान <0.001; वाई -कुल्हाड़ियों को बेहतर ढंग से अंतर प्रदर्शित करने के लिए समायोजित किया गया है; इस आंकड़े को संदर्भ 1 से संशोधित किया गया था, स्प्रिंगर की अनुमति के साथ) कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मुसीबत संभावित कारण संभावित समाधान
इमेजिंग के दौरान कुओं में बहुत कम कोशिकाएं बहुत कुछ कोशिकाओं को वरीयता दी इमेजिंग से पहले 24 घंटे पहले और अधिक कोशिकाओं के बीज
गरीब सेल वृद्धि संस्कृति की स्थिति की जांच करें (मध्यम, तापमान स्थिरता, सीओ 2 नियंत्रण)
बहुत हिंसक वॉशिंग चरण कोशिकाओं को दूर धोने से बचें, धीरे से विंदुक
इमेजिंग के दौरान कुओं में बहुत से कोशिकाएं बहुतकई कक्षों की वरीयता इमेजिंग से पहले 24 घंटे से कम कोशिकाओं बीज
सीएम-एच 2 डीसीएफडीए प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए कमजोर संकेत या गैर-रेखीय प्रतिक्रिया बहुत कम / उच्च डाई एकाग्रता का इस्तेमाल किया अगर एनएचडीएफ कोशिकाओं के अलावा अन्य का उपयोग करना, इष्टतम लोडिंग सांद्रता को अनुभवपूर्वक निर्धारित किया जाना चाहिए
डाई-लोडिंग अपर्याप्त है एक्स्ट्राक्टेंट प्लुरोनिक-127 की 0.02% वाइड / वी बढ़ाएं ताकि तेज बढ़ने के लिए लोडिंग समाधान में जा सके।
सीएम-एच 2 डीसीएफडीए संकेत एक्सपोजर टाइम के दौरान नेत्रहीन बढ़ता है बहुत अधिक डाई एकाग्रता डाई एकाग्रता कम करें
उत्तेजना की तीव्रता बहुत अधिक है एनडी फिल्टर का उपयोग करके और / या जोखिम समय कम करने के द्वारा उत्तेजना की तीव्रता कम करें
सीएम-एच 2 डीसीएफडीए की तीव्रता अच्छी तरह से प्लेट के अधिग्रहण के दौरान घट जाती है सीएम-एच 2 डीसीएफडीए बाहर से लीक हो रहा हैकोशिका। 2 मिमी प्रोएनिसीड (आयन पंप अवरोधक) का उपयोग करें लोडिंग समाधान में जोड़ें, साथ ही रिसाव घटाने के लिए इमेजिंग बफर
टीबीएचपी के अतिरिक्त सीएम-एच 2 डीसीएफडीए सिग्नल की तीव्रता में कोई वृद्धि नहीं हुई है टीबीएचपी सक्रिय नहीं है ताजा टीबीएचपी का उपयोग करें
सीएम-एच 2 डीसीएफडीए सेल से बाहर निकल रहा है। ऊपर वर्णित के रूप में प्रोएनिसीड का उपयोग करें
(कुछ) अधिग्रहीत छवियां फ़ोकस के बाहर दिखाई देती हैं, जबकि ध्यान देने पर फोकस ठीक लगता है। प्लेट की तरफ झुका हुआ है जिसके कारण पीएफएस ऑफ़सेट से आगे बढ़ने का फ़ोकस होता है थाली और चरण स्तर के बढ़ते की जांच करें, प्लेट की स्थिति में बदलाव करें
प्लेट के नीचे धूल या अनियमितताएं होती हैं प्लेट के नीचे एक इथेनॉल-गीले लेंस पेपर के साथ साफ करें
इमेजिंग के दौरान सेल मर जाते हैं उत्तेजना तीव्रता कम करें या अच्छी तरह से कम छवियाँ प्राप्त करें।
गलत इमेजिंग-बफर संरचना रीमेक इमेजिंग-बफर
छवियों में फ़ोकस फ्लोरोसेंट स्पॉट्स के बाहर नहीं हैं अलग-अलग कोशिका फ़ोकस से बाहर चल रही हैं लोडिंग प्रोटोकॉल के दौरान अधिक धीरे धो लें
प्लेट के अन्य कुओं की तुलना में एक या एक से अधिक स्तंभों में सभी तरफ कम तीव्रता है मल्टीचैनल विंदुक से एक या अधिक युक्तियां दृढ़ता से संलग्न नहीं थीं और इसलिए इन कुओं में कम रिपोर्टर जोड़ा गया था अच्छी तरह से जांचें कि सभी टिप्स पूरी तरह भरे हुए हैं जब भी आप मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करते हैं
छवि अधिग्रहण के दौरान फोकस नाटकीय रूप से बहाव करता है तेल के लेंस का उपयोग करते समय थाली के पॉलीस्टाइरिन नीचे, विसर्जन के तेल के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है सूखी लेंस का प्रयोग करें, या एक ग्लो के साथ मल्टीवेल प्लेट का उपयोग करेंएस एस नीचे
पहली और अंतिम अच्छी तरह से इमेजिंग के बीच TMRM सिग्नल तीव्रता बढ़ जाती है रिपोर्टर लोडिंग का समय काफी लंबा नहीं था, टीएमआरएम अभी भी संतुलित है रिपोर्टर लोडिंग टाइम बढ़ाएं
टीबीएचपी उपचार के बाद सीएम-एच 2 डीसीएफडीए संकेत अच्छी तरह से प्लेट के अधिग्रहण के दौरान बढ़ रहा है टीबीएचपी और दूसरे इमेजिंग दौर की शुरुआत के बीच का समय काफी लंबा नहीं था, टीबीएचपी अभी भी सीएम-एच 2 डीसीएफडीए ऑक्सीकरण कर रहा है। टीबीएचपी और दूसरे इमेजिंग गोल के साथ इलाज के बीच ऊष्मायन समय बढ़ाएं (कम से कम 3 मिनट के साथ शुरू करें)
फ्लैट फ़ील्ड चित्र संतृप्त हैं एंटीबॉडी काम करने का समाधान केंद्रित है एंटीबॉडी काम के समाधान की एक कम एकाग्रता का उपयोग करें
अधिग्रहण सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ नहीं हैं (उच्च के लिए एक्सपोज़र का समय, एनडी-फ़िल्टर को कम, ...) अधिग्रहण सेटिंग का अनुकूलन करें,संकेत सेंसर की गतिशील रेंज में होना चाहिए
फ्लैट फ़ील्ड चित्र अंधेरे हैं एंटीबॉडी काम करने का समाधान पतला है एंटीबॉडी कार्य समाधान का एक उच्च एकाग्रता का उपयोग करें
अधिग्रहण सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ नहीं हैं (उच्च के लिए एक्सपोज़र का समय, एनडी-फ़िल्टर को कम, ...) अधिग्रहण की अनुकूलन सेटिंग्स, संकेत सेंसर की गतिशील रेंज में होना चाहिए
ओवर / अंडरग्रेजेशन कलाकृतियों थ्रेशोल्ड सही ढंग से सेट नहीं है थ्रेसहोल्ड सेटिंग समायोजित करें
आकार फिल्टर ठीक से समायोजित नहीं छवि विश्लेषण के लिए न्यूनतम और अधिकतम आकार मानदंड समायोजित करें
सेल का सामंजस्य बहुत अधिक है विश्वसनीय छवि विश्लेषण के लिए सामंजस्य का सही स्तर बहुत महत्वपूर्ण है। NHDF से अन्य प्रकार के सेल के लिए, इष्टतम बोने वाले घनत्व को अनुभवपूर्वक निर्धारित किया जाना चाहिए
चमकदार आवेदन काम नहीं करता है गलत निर्देशिका चयनित इनपुट पृष्ठ पर सही निर्देशिका चुनें।
निर्देशिका में फ़ाइलें गुम हैं सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक फ़ाइलें (छवि जगत मैक्रो और सेटअप फ़ाइल से आउटपुट) चयनित निर्देशिका में मौजूद हैं
अनुपलब्ध पैकेज आम तौर पर ऐप सभी आवश्यक पैकेजों के लिए जांच करता है और इन्हें स्थापित करता है, लेकिन जब यह विफल रहता है, तो निम्नलिखित पैकेजों के लिए मैन्युअल रूप से जांचें: devtools, ggbiplot, pacman, ggplot2, plyr, nparcomp, डेटा, योग्य, रीडक्स, gplots, ggbiplot, चमकदार, चमकदारफ़ाइलें, pbapply और सभी निर्भरता सहित shinyjs

तालिका 1: विशिष्ट नुकसान और संभावित समाधान

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Discussion

यह पत्र एनएचडीएफ में इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों और मिटोचोनड्रियल मॉर्फफ़ोन के साथ-साथ मात्रात्मक मात्रा में एक उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोपी विधि का वर्णन करता है। इसका प्रदर्शन एसक्यूवी से इलाज वाले एनएचडीएफ पर एक केस स्टडी के साथ प्रदर्शित किया गया था। परिणाम साहित्य के पहले के प्रमाणों का समर्थन करते हैं जिसमें आरओएस स्तर बढ़ने या मिटोकोंड्रियल डिसफंक्शन को 1 एचआईवी प्रोटीज इनहिबिटर के साथ इलाज के बाद देखा गया है, यद्यपि अलग-अलग प्रयोगों में 1 9 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 । महत्वपूर्ण अंतर यह है कि वर्णित परख इन मापदंडों को एक साथ मापने में सक्षम है, एक ही जीवित कोशिकाओं में, रूपरेखा डेटा के साथ। इस दृष्टिकोण का प्रमुख लाभ अंतरिक्ष में दोनों कारकों का एकमात्र निर्धारण है और टी में हैIime, जो कारण संबंधों को तुच्छ पहचानने की अनुमति देता है एक प्रमुख घटक विश्लेषण किया जाता है जो विशिष्ट ख़तरे के एक संवेदनशील रेडॉक्स प्रोफाइल को उत्पन्न करने की अनुमति देता है। हालांकि, अधिक उन्नत डेटा खनन तकनीकों और (पर्यवेक्षण) क्लस्टरिंग एल्गोरिदम का उपयोग अनुमानित रेडॉक्स प्रोफाइलिंग को सक्षम करने के लिए निकाले गए डेटा पर भी किया जा सकता है। यह डिजिटल पैथोलॉजी में नैदानिक ​​या पूर्वकथात्मक वर्गीकरण टूल के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है, साथ ही चिकित्सीय लक्ष्य के लिए स्क्रीनिंग में हो सकता है, जैसे एक बार मजबूत वर्गीकरण मॉडल बनाए जाते हैं, छोटे अणु पुस्तकालयों को चिकित्सीय उम्मीदवारों को ऑक्सीडेटिव तनाव का सामना करने के लिए स्क्रीनिंग किया जा सकता है। मानव मिथोकॉन्ड्रियल विकारों के लिए चिकित्सा विकास में आशाजनक सुराग के लिए एक हालिया स्क्रीन 26

परख NHDF के लिए कल्पना की गई थी, लेकिन अन्य पक्षपाती सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके लिए धुंधला प्रोटोकॉल और रिपोर्टर डाई सांद्रता के अनुकूलन की आवश्यकता है। आर की मात्रा ईवरर डाई को कम से कम करना पड़ता है क्योंकि ओवरलोडिंग शुक्राणु होने या यहां तक ​​कि साइटोटॉक्सिक 27 के कारण गैर-रेखीय प्रभाव पैदा कर सकता है। शारीरिक रूप से ऐसी कोशिकाओं को बढ़ते और देखकर कठिनाइयों के कारण निलंबन कोशिकाओं पर परख का विस्तार कम स्पष्ट है। वे एक कवरलिप पर cytospun या सीरम मुक्त मीडिया में सुसंस्कृत आसंजन पैदा कर सकते हैं, लेकिन इन दोनों प्रक्रियाओं शारीरिक शर्तों 28 , 29 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। हालांकि, इन सीमाओं को माइक्रोप्रेटेड सेल संस्कृति का समर्थन करने से दूर किया जा सकता है, जो व्यक्तिगत कोशिकाओं (अनुयायी या गैर-अनुयायी) को छोटे सूक्ष्म कुओं में फंसकर रखता है, जबकि उनकी व्यवहार्यता 30 को बनाए रखती है या इमेजिंग के दौरान कोशिकाओं को फेंकने के लिए थर्मावो-प्रतिवर्ती हाइड्रोगेल के इस्तेमाल से 31 । इन विधियों का उपयोग पहले से प्लाज्मा झिल्ली की उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग, या व्यक्तिगत निलंबन कोशिकाओं में सेलुलर ऑक्सीजन के लिए किया जा चुका है= "Xref"> 32 , 33 या जीविका में अंतःक्रियाशील मार्करों की इमेजिंग, अत्यधिक गतिशील परजीवी 31 इन इमेजिंग विधियों के लिए अनुकूलन भी करना होगा, चूंकि इन कोशिकाओं में मिटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के आकारिकी विश्लेषण में तेजी से 3 डी-अधिग्रहण क्षमताओं की आवश्यकता होती है जैसे डिस्क कन्फोकल या बेसेल बीम प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी 34 , 35 , साथ ही विश्लेषण के लिए रूपात्मक मापदंडों की गणना करते समय Z- आयाम को शामिल करने के लिए पाइपलाइन

परख 96 अच्छी तरह प्लेटों के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन यह स्पष्ट रूप से आगे बढ़ाने के लिए अनुकूल है, उदाहरण के लिए 384-अच्छी तरह प्लेटें प्रमुख सीमित कारक प्लेट अधिग्रहण का समय है, अर्थात, सभी कुओं की छवियों का अधिग्रहण करने का समय। फ्लोरोसेंट संकेतों को इस समय-सीमा के दौरान स्थिर रहना होगा ताकि आत्मविश्वास के बीच में माप की तुलना कर सकेंव्यक्तिगत कुओं लेकिन, क्योंकि धुंधला क्षणिक है और जांच की प्रक्रिया गतिशील है, यह एक चुनौती है। इसलिए, फ्लोरोसेंट सिग्नल को दोहराया प्रयोगों के एक सेट में मापा गया और यह दिखाया कि दोनों सीएम-एच 2 डीसीएफडीए और टीएमआरएम सिग्नल धुंधला हो जाने के बाद कम से कम 50 मिनट में 7 से स्थिर बने हुए हैं (भिन्नता का गुणांक <2%)। यह लगभग 40 मिनट की एक खिड़की देता है एक 96-अच्छी तरह से थाली आमतौर पर लगभग 10 मिनट लगती है। इस प्रकार, 384-अच्छी तरह प्लेट्स के लिए एक्सट्रपलेशन, स्थिर समय स्लॉट के भीतर अधिग्रहण अवधि को बनाए रखेगा। प्रति छवि (प्रति 20X उद्देश्य और एनएचडीएफ कोशिकाओं के उपयोग के आधार पर) की औसत प्रति 50 कोशिकाओं के साथ, यह स्क्रीनिंग के प्रति घंटे लगभग 30,000 कोशिकाओं के डेटा का परिणाम होगा, जो परख की सांख्यिकीय शक्ति को बहुत अधिक जोड़ता है। फ्लोरोसेंट सिग्नल स्थिरता को प्रभावित करने वाला एक और पहलू तापमान है। सीएम-एच 2 डीसीएफडीए (यानी इंट्रासेल्युलर vesicles में डाई संचय) के रिकुलाइजेशन से बचने के लिए, जो कि ऊतक को जन्म देगीजीनियस धुंधला हो जाना और गैर रेखीय प्रभाव, ऊष्मायन 37 डिग्री सेल्सियस के बजाय कमरे के तापमान पर होता है स्थिरता के अलावा, यह ध्यान रखना ज़रूरी है कि प्रतिरक्षा उत्तेजना प्रकाश के लिए जीवित कोशिकाओं का जोखिम आरओएस उत्पादन को प्रेरित करता है। इसका अर्थ है कि एक्सपोजर की स्थिति (एक्सपोज़र का समय और उत्तेजना हल्की तीव्रता) को एक न्यूनतम न्यूनतम पर रखा जाना चाहिए। इसका यह भी अर्थ है कि सभी कुएं केवल उजागर होने चाहिए जब वास्तविक चित्र प्राप्त हो जाएंगे। यह सॉफ़्टवेयर-सक्षम ऑट्रोफोकसिंग विधियों के उपयोग से बाहर निकलता है और एक हार्डवेयर-आधारित ऑटोफोकस सिस्टम के उपयोग को वारंट करता है।

वर्णित विधि का एक फायदा इसकी सामान्य वर्ण है। वास्तव में संगत फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के किसी भी संयोजन का इस्तेमाल किया जा सकता है। कैल्सेन / मिटोस्क्स संयोजन का उपयोग करके यह जीवित कोशिका 1 , 15 के अनुसार मिटोकोंड्रियल आरओएस को मापने के लिए दिखाया गया था। इसके अलावा, अनुप्रयोगों int तक सीमित नहीं हैं इग्रेटेड आरओएस / माइटोकॉन्ड्रियल मापन। इस परख को बाद में इम्यूनोस्टाईंग (दूसरे इमेजिंग राउंड के बाद) के साथ बढ़ाया जा सकता है। चूंकि सटीक इमेजिंग स्थान सहेजे जाते हैं, रेडॉक्स का विश्लेषण समान कोशिकाओं में स्थान प्रोटिओमिक्स के साथ सीधे सहसंबद्ध हो सकता है। यह आणविक रीडआउट को बहुत बढ़ाता है, जो आमतौर पर रेडॉक्स बायोलॉजी या सामान्य रूप से प्रतिदीप्ति तीव्रता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किये जाने वाले अन्य विधियों के विपरीत है। उदाहरण के लिए, fluorimetry (microplate reader) का व्यापक रूप से इसके अपेक्षाकृत कम लागत (मूल रूप से 4000 रूपए के लिए उपलब्ध है) और उथले सीखने की अवस्था के कारण व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, लेकिन एक ब्लैक बॉक्स होने के कारण, इसमें भिन्नताएं जैसे, सेल घनत्व या पृष्ठभूमि (ऑटो) प्रतिदीप्ति, उदाहरण के लिए धूल कण दूषित। इसके अलावा, प्लेट पाठकों ने रूपात्मक मापदंडों को निकालने की अनुमति नहीं दी, वे एकल कोशिकाओं को माप नहीं सकते हैं, और वे गतिशील या क्षणिक संकेतों को मापने के लिए कम संवेदनशील और विश्वसनीय हैंLass = "xref"> 36 , 37 फ्लो साइटमैट्री में एकल कोशिकाओं को मापने की क्षमता होती है और गति का लाभ होता है दरअसल, एक 384 अच्छी तरह से थाली को कई मार्करों 38 के लिए उच्च संवेदनशीलता के साथ 12 मिनट के रूप में छोटा किया जा सकता है। यह व्यापकफ़ाइल माइक्रोस्कोपी के साथ क्या संभव है से बहुत तेज है लेकिन, अभी तक कोई भी स्तिमितिक जानकारी प्रदान नहीं की जाती है ( यानी उपशीर्षक स्थानीयकरण, आकृति विज्ञान डेटा और / या समय पर निर्भर कैनेटीक्स), और न ही उपचार के दौरान या उसके बाद के दौरान उसी कोशिका को पुनरीक्षित करने की अनुमति देता है (यानी, फ्लक्सो में) । इसके अलावा, कोशिकाओं को निलंबन में होना चाहिए, जिससे प्रवाह कोशिकाएं पक्षपाती कोशिकाओं के शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए कम अनुकूल बनाती हैं। अन्य तरीकों की तुलना में उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोपी के प्रमुख नुकसान बड़े छवि डेटा संग्रहण, गहन प्रसंस्करण शक्ति और जटिल छवि विश्लेषण की आवश्यकता है। प्रस्तुत परख छवि अधिग्रहण प्रक्रिया को मानकीकृत करती है और एनालिसिस को सुव्यवस्थित करती हैइस प्रसंस्करण के समय को कम करने के लिए उपयोग में आसानी हो और इसलिए इस परख को और अधिक सुलभ बनाएं।

निष्कर्ष, और सीएम-एच 2 डीसीएफडीए और टीएमआरएम के इस्तेमाल के लिए विशिष्ट, रेडॉक्स प्रोफाइलिंग विधि का वर्णन मजबूत, संवेदनशील और विश्वसनीय है। इसकी बहुप्रामाणिक और मात्रात्मक प्रकृति के कारण, यह अन्य प्रतिदीप्ति आधारित तरीकों से बेहतर है। इस तरह, यह मिटोकोडायड्रियल फ़ंक्शन और इंट्रासेल्युलर आरओएस सिग्नलिंग के बीच के संबंध को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है, जो कि विषाक्तता की एक विस्तृत विविधता को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें रेडॉक्स होमोस्टेसिस परेशान है। इसके अलावा, इसके सामान्य चरित्र के कारण, परख अनुप्रयोगों को इसके मूल दायरे से परे भी अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों का कहना है कि कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हितों या ब्याज के अन्य संघर्ष नहीं हैं। संबंधित लेखक यह भी सुनिश्चित करता है कि सभी लेखकों को ब्याज के किसी भी और सभी संघर्ष का खुलासा करने के लिए कहा गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) ThermoFisher Scientific T668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) ThermoFisher Scientific C6827
Dimethyl sulfoxide Sigma)Aldrich D8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded Brooks life science systems MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mL Lonza BE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamine Lonza BE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg Lonza BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL Lonza 17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) Solution Lonza BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson 711-166-152 Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson 711-546-152 Antibody used for acquiring flat-field image
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscope Nikon
Perfect Focus System (PFS) Nikon hardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objective Nikon
Name Company Catalog Number Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module Nikon This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44 Rstudio
R version 3.3.2

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References

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Sieprath, T., Corne, T., Robijns, J., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55449, doi:10.3791/55449 (2017).

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