Summary
この論文は、細胞透過性蛍光レポーター分子5-（および - ）を使用して、生存接着細胞において、細胞内ROSレベル、ならびにミトコンドリア膜電位および形態（ミトコンドリア形態機能とも併せて参照される）の同時定量化のための、 6） - クロロメチル-2 '、7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、アセチルエステル（CM-H 2 DCFDA）およびテトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）。
Abstract
反応性酸素種（ROS）は、遺伝子発現、移動、分化および増殖を含む必須の細胞プロセスを調節する。しかしながら、過剰なROSレベルは、酸化ストレスの状態を誘導し、DNA、脂質およびタンパク質に対する不可逆的な酸化的損傷を伴う。したがって、ROSの定量化は、細胞の健康状態の直接プロキシミティを提供する。ミトコンドリアはROSの主要な細胞供給源および標的の1つであるため、同じ細胞におけるミトコンドリア機能とROS産生の共同分析は、病態生理学的条件における相互接続の理解を深める上で極めて重要です。したがって、細胞内ROSレベル、ミトコンドリア膜電位（ΔΨm）およびミトコンドリア形態の同時定量のために、高含量顕微鏡法に基づく戦略が開発された。これは、自動化された広視野蛍光顕微鏡法およびマルチウエルプレートで増殖させた生着細胞の画像解析および染色dを、細胞透過性蛍光レポーター分子CM-H 2 DCFDA（ROS）およびTMRM（ΔΨmおよびミトコンドリア形態）と比較した。蛍光測定法またはフローサイトメトリーとは対照的に、この戦略は、実験刺激の前後の両方で、時空間分解能の高い個々の細胞のレベルでの細胞内パラメータの定量化を可能にする。重要なことに、この方法の画像ベースの性質は、信号強度に加えて形態学的パラメータを抽出することを可能にする。組合せ特徴セットは、亜集団、細胞タイプおよび/または処置間の差異を検出するための探索的および統計的多変量データ分析に使用される。ここでは、アッセイの詳細な説明を、化学摂動後の細胞状態間の明白な識別の可能性を証明する実験例と共に提供する。
Introduction
細胞内ROSの濃度は、ROS生成系とROS解離系との間の動的相互作用によってきめ細かく調節される。両者の間の不均衡が酸化ストレスの状態を引き起こす。 ROSの主要な供給源には、ミトコンドリア1がある。細胞内呼吸での役割を考えると、細胞内スーパーオキシド（O 2 ・ - ）分子の大部分を担っている2 。これは、主に強い負の内部ミトコンドリア膜電位（Δψm）、 すなわちミトコンドリア過分極の条件下での電子輸送鎖の複合体1でのO 2への電子漏出に起因する。他方、ミトコンドリアの脱分極は、複数の作用様式を指し示すROS産生の増加と相関している> 6,7,8。さらに、核分裂融合機構のタンパク質のレドックス修飾によって、ROSはミトコンドリア形態を共調節する9。例えば、断片化は、ROS産生およびアポトーシスの増加と相関する10,11。繊維状ミトコンドリアは栄養飢餓および防御に関連しているミトファジー12 。細胞のROSとミトコンドリアの形態機能との複雑な関係を考えると、両者は理想的には生存細胞中で同時に定量されるべきである。これを正確に行うために、蛍光プローブCM-H 2 DCFDA（ROS）およびTMRM（ミトコンドリアΔΨmおよび形態学）で染色された付着細胞培養の自動化された広視野顕微鏡法および画像分析に基づいて、高含量画像アッセイを開発した。高含量イメージングとは、sp複数の相補的マーカーおよび自動画像解析を用いた細胞表現型に関する非同時期に豊富な（ すなわち 、多数の記述的特徴）情報。自動顕微鏡検査と組み合わせると、多くの試料を並行してスクリーニングすることができ（ すなわちハイスループット）、アッセイの統計力を高めることができます。実際、プロトコルの主な資産は、同一細胞内の複数のパラメータの同時定量化が可能であり、これは多数の細胞および条件についての定量化を可能にすることである。
プロトコルは8つの部分に分かれています（以下のプロトコールで詳細に説明されています）。1）96穴プレートに細胞を播種する。 2）ストック溶液、作業溶液およびイメージングバッファーの調製; 3）顕微鏡のセットアップ。 4）細胞にCM-H 2 DCFDAおよびTMRMを負荷する。 5）基礎的なROSレベルおよびミトコンドリアの形態機能を測定するための最初のライブイメージングラウンド; 6） tert-ブチルの添加後のラウンド2回目のイメージング誘導されたROSレベルを測定するための過酸化物（TBHP） 7）自動画像解析。 8）データ分析、品質管理、視覚化。
このアッセイは、もともとは正常ヒト真皮線維芽細胞（NHDF）のために開発されたものである。これらの細胞は大きく平らであるため、2Dワイドフィールド画像13,14におけるミトコンドリアの形態を評価するのに適しています。しかしながら、わずかな改変を加えれば、この方法は他の接着細胞タイプにも適用可能である。さらに、CM-H 2 DCFDAとTMRMの組み合わせの次に、ワークフローは、異なる分子特異性1,15を有する様々な蛍光色素対に準拠する。
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Protocol
以下のプロトコールは、NHDF細胞について、および材料ファイルで指定されたマルチウェルプレートを使用して実施されるものとして記載されている。ワークフローの概要については、 図1を参照してください。
1.試薬の調製
- 10％v / vウシ胎仔血清（FBS）および100IU / mLペニシリンおよび100IU / mLストレプトマイシン（PS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補充することにより完全培地を調製する。 500mLの完全培地について、50mLのFBSおよび5mLのPSを445mLのDMEMに添加する。
- ハンクス平衡塩溶液（マグネシウムおよびカルシウムを含むが、フェノールレッドを含まない）を20mMのHEPESで補充することによって、HBSS-HEPES（HH）イメージングバッファーを調製する。 500mLのHHについては、10mLの1M HEPESストック溶液を490mLのHBSSに加える。 pHを確認し、必要に応じてpH 7.2に調整する。
- 50μgのCM-H 2 DCFDA凍結乾燥粉末を86.5℃で溶解して1mM CM-H 2 DCFDA原液を調製する。＃181; L無水DMSO。ボルテックスまたはピペットで上下に混合し、茶色のマイクロ遠心チューブで20μL分取する。 -20℃で暗所に保管し、1週間以内に使用してください。 N 2 -大気中で保存した場合、保存期間は少なくとも1ヶ月まで延長することができます。
- 25 mLのTMRMパウダーを50 mLの無水DMSOに溶解して1 mM TMRM原液を調製する。ボルテックスまたはピペッティングで上下に混合し、褐色のマイクロ遠心チューブで10μL分取する。 -20℃で暗所に保存する。このソリューションは少なくとも1年間は安定しています。
- 70％ストック溶液（10μL/ 96ウェルプレート）から容量を直接ピペッティングすることにより、すべての実験でTert-butyl peroxide（TBHP）ストック（〜7 M）の新しいアリコートを調製します。その後の使用までこのアリコートを4°Cに保つ。
- 2つの二次抗体（Alexa Fluor 488ロバ抗ウサギおよびCY3ロバ抗ウサギ）を1倍のHH-buで1,000倍に希釈することによって抗体ワーキング溶液（AB）を調製するffer。
2.顕微鏡と測定プロトコルの設定（±15分）
注：画像取得は、自動ステージおよびシャッターを備えた広視野顕微鏡、および20X空気計画補正対物レンズ（NA = 0.75）およびEM-CCDカメラを使用するハードウェアベースのオートフォーカスシステムを用いて行われる。最初にアッセイを設定する場合、プロトコルの指示に従って染色された対照細胞を含有する試験プレートを使用して、XYステージを較正し、獲得設定を最適化する。取得設定が既に決定されている場合、キャリブレーションは空のプレートを使用して行うことができます。
- 対物レンズを絶対ベースレベルに下げ、ソフトウェア指示に従ってXYステージをキャリブレーションします。
- 正しいフィルタキューブがインストールされていることを確認してください。 CM-H 2 DCFDAを可視化するには、472/30 nm励起バンドパスフィルター、495 nmカットオフダイクロイックicミラーと520/35 nmバンドパスエミッションフィルターを備えています。 TMRMでは、540/25 nm帯域通過励起フィルター、565 nmカットオフダイクロイックミラー、605/55 nm帯域通過フィルターを使用したTRITC用フィルターキューブを使用します。
- 取得ソフトウェアを使用してイメージングプロトコルを作成します。
- ソフトウェア内に用意されている使用可能なプレートのリストから、正しいタイプのマルチウェルプレート（メーカーおよびコード）を選択します。または、プレートとウェルの寸法を使用して独自のマルチウェルプレートフォーマットを定義します。
- ソフトウェアの指示に従って、 例えば 4つの外側コーナーウェルの2つのコーナーを定義することによって、ウェルプレートを整列させる。このステップはカメラの向きの変化をカバーします。
- 取得する必要があるウェルを選択します。ソフトウェアでこのオプションを使用できない場合は、選択したウェルに対応する手動で定義されたXY位置のセットを使用します。
- thの取得設定（露光時間、ランプ強度、EMゲイン）を最適化する2つのチャンネルを別々にテストプレートを使用して測定します。蛍光励起光そのものがROSを誘発するので、露出と強度を最小限に抑えます。しかし、TBHP処理前のシグナル対バックグラウンド比が基底CM-H 2 DCFDAについて少なくとも2、TMRMについて3であり、TBHP処理後に飽和がないことを確認する。取得設定は、使用される顕微鏡の設定および細胞の種類に大きく依存するが、光源として130Wの金属ハロゲン化物電球およびプロトコールの指示に従って染色されたNHDF細胞を使用する場合の参照設定は以下の通りである： H 2 DCFDAおよびTMRMの露光時間は200ms、NDフィルタ8は15（13MHz; 14ビット）および4（27MHz; 14ビット）のEMゲインと組み合わせて使用されます。特定のセットアップとセルタイプに最適化されたら、このステップをスキップすることができます。
注：イメージングプロセス全体を通して取得設定を同じに保つことが不可欠です。大規模な、複数日の実験では、ランプスタンド通常の品質管理によって保証されるべきである。 - 連続したラムダ（波長）取得からなる取得プロトコルを定義します。測定前に露光量を最小限に抑えるには、最初に取得するCM-H 2 DCFDAチャネルを選択します。
- well-plateループを定義して、2.3.4で定義した取得プロトコルを使用して、ウェル選択の各ウェルの中心の周りに配置された、規則的に間隔を置いて配置された4つの重複しない画像を取得する。井戸B02からB11へ、次に右から左へ、ウェルC11からC02へ、蛇行する画像取得（左から右へ）を選択します（ 図2A ）。これにより、左から右の画像取得と比較して時間が節約されます。このオプションがソフトウェアで使用できない場合は、2.3.3で作成したXY位置のカスタムセットを調整して、このイメージングパターンを適用します。
- イメージング位置のXY座標を（ 例えば 、別のXMLファイルに）保存して、容易に再訪できるようにする顕微鏡の再較正の場合には、これは、このアッセイからの読み出しが同じ細胞についての事後免疫蛍光（IF）染色と相関しなければならない場合に特に重要である。
3 。 96ウェルプレート中の細胞の播種（異なる細胞株の数に依存して45〜90分）
- クラス2のバイオセーフティキャビネットなどの無菌環境で作業し、手袋を着用する。
- 蒸留水中70％v / vエタノールを使用して、すべての表面と材料を除染する。
- 培養器から90％コンフルエントな細胞培養液を入れた細胞培養フラスコを取り出し、バイオセーフティキャビネットに入れます。
- 細胞をPBS 1xで2回洗浄する。
- 適切な量の0.05％トリプシン-EDTA溶液を細胞に添加し、完全な細胞表面が覆われていることを確認し（ 例えば 、T25フラスコについては1mL）、37℃および5％CO 2で2分間インキュベートする。
- すべての細胞が分離されている場合（顕微鏡で確認する ）、培養培地（DMEM + 10％FBS + 1％ペニシリン - ストレプトマイシン; T25フラスコ中±4mL）を加えてトリプシン-EDTA溶液を不活性化する。
- 室温で300 xgで5分間遠心分離する。
- 上清を捨て、細胞ペレットを培地に再懸濁する。細胞計数と適合する細胞濃度を得るために、各細胞タイプの培地の量を決定する。典型的には、NHDFの90％コンフルエントなT25フラスコは約1~1.5百万の細胞を含み、これを3~4mLの培地に再懸濁する。
- 細胞カウントチェンバーまたはコールターカウンターを使用して細胞を数える。
- 薄い連続ポリスチレンまたはガラス底面を有する黒色96ウェルプレート（画像化中に隣接するウェル間の散乱およびクロストークを回避するために黒色）を有する黒色96ウェルプレートの内部60ウェルのそれぞれに8,000〜10,000細胞を種蒔ける。異なる条件/処理/細胞株を使用する場合、プレート効果を最小限に抑えるように、プレート上にそれらの播種位置を均一に分配する（図2A）。ウェルB01およびA01を除いた外側のウェルは、エッジ効果がより起こりやすいので使用されない。
- B01に8,000〜10,000個の細胞を播種する。この井戸は、画像取得の直前に、焦点調整のために使用される。
- 空の外側ウェルに培地を充填し、ウェルと環境との間の勾配（温度、湿度など ）を最小化する。
- 静かにプレートを3回タップしてからインキュベーターに戻し、細胞の増殖を避けます。
- 細胞を24時間培養するか、またはコンフルエンス程度まで培養する。 70％。
- 実験用の治療情報を「Setup.xlsx」というスプレッドシートに保存します。このファイルには4つの列が含まれており、データ分析中にウェルと画像情報との処理をリンクするために使用されます。 4つの列は、「ウェル」、「治療番号」、「治療」および「コントロール」（ウェルあたり1列）である。すべての治療が結合されるプロットのX軸上の処理の順序を決定するためにデータ視覚化の間に使用される固有の処理番号を有する。 control-columnは、現在の行の処理の制御として機能する処理を指定します。典型的な実験レイアウトと対応するセットアップファイルの図を図2に示します。
CM-H 2 DCFDAおよびTMRMを用いた細胞のローディング（±45分）
注：実験当日の細胞の取り扱いは、滅菌環境（バイオセーフティキャビネット）で行うことができますが、アッセイ後に細胞を廃棄または固定するため、これは必須ではありません。
- HH緩衝液を37℃に加熱する。
- HHバッファー（50μLのHHバッファーを10μLのTMRMストック溶液の1つのアリコートに加える）中で1mMストック溶液を50倍に希釈することにより、20μMTMRM作業溶液を調製する。
- 負荷を準備する2μMのCM-H 2 DCFDAおよび100nMのTMRMを含む溶液に添加した。この目的のために、1mM CM-H 2 DCFDA原液500倍および20μMTMRM作動液をHH緩衝液中で200倍に希釈する。
- 典型的には、60ウェルに対して、CMH- 2 DCFDA15μLおよびTMRM溶液37.5μLをHH7447.5μLに添加することにより、7.5mLのローディング溶液を調製する。
- プレートを逆さまにして単一の液体の動きで細胞から培地を捨てる。
- マルチチャンネルピペット（100μL/ウェル）を用いて、HH緩衝液で細胞を2回静かに洗浄する。洗浄工程の間にHH緩衝液を捨て、プレートを1回の流体の動きで上下逆さまにします。
- 再度、マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルに100μLのローディング溶液を添加することにより、CM-H 2 DCFDAおよびTMRMを細胞に負荷する。室温で暗所で25分間インキュベートする。 B01をよく忘れないでください。
- これらの25分間、酸化剤TBHPの作業溶液を調製し、顕微鏡およびアクセサリのハードウェアがオンになっていることを確認します。
- 作業用溶液Iを調製する：7Mストック溶液を100mMに希釈する（690μLのHH緩衝液中10μLのストック）。
- 作業溶液IIを調製する：WS 100xを1mMに希釈する（990μLHH緩衝液中10μLWS I）。
- 作業溶液IIIを調製する：WS III 25xを40μMに希釈する（60ウェルについては、7200μLHHバッファー中に300μLWS IIを加える）。
- 25分後、前述のように100μLのHH緩衝液で細胞を2回洗浄する。
- 100ウェルのウェルに100μLのHH緩衝液を添加する。
5.基礎的なROSレベルとミトコンドリアのモルフォファンクションを測定するための最初のライブイメージングラウンド（±15分）
- 取得ソフトウェアが動作しており、イメージングプロトコルがロードされていることを確認してください。
- プレートを顕微鏡に取り付け、ハードウェアの電源を入れるTMRMチャネルを使用してオートフォーカスオフセットを調整するには、B01をよく使用してください。この手順はCM-H 2 DCFDAシグナル強度の増加を誘導するので、この井戸は下流の画像解析から除外される。
- イメージングプロトコルを実行します。
6.誘発されたROSレベル（±20分）を測定するためのTBHPの添加後の2回目のライブイメージング
- 慎重に顕微鏡から96ウェルプレートを取り出します。
- マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに100μLのTBHP WS III（40μM）を添加する（これはウェル中に20μMのTBHP濃度をもたらす）。この化合物は、誘導されたROSレベルを測定する手段と同様に、CM-H 2 DCFDA染色（シグナルが上昇すべきである）のための内部陽性対照として使用される。
注記：H 2 O 2はTBHPの代わりに使用することもできますが、この化合物は安定性が低く、信頼性が低くなります。 - TBHP wを完全に反応させるために少なくとも3分間待つi番目のCM-H 2 DCFDA。
- この間、100μLの抗体作業溶液（1 / 1,000）をウェルA01に添加する。
- プレートを顕微鏡に戻し、ウェルB01を使用して再度焦点を確認します。
- 同じイメージングプロトコルを使用して、最初のイメージングラウンドと同じ位置を取得します。
- 取得されたデータセットを単一のフォルダにエクスポートし、標準化された命名法を使用して、個々のTIFFファイルとしてエクスポートする。プレート名、TBH前またはTBH処理、ウェル、フィールドおよびチャネルをアンダースコアで区切って参照する。この情報は、画像分析（ 例えば 、適切なセグメンテーション設定の選択）のために、ならびにデータ分析中（分析データを接続するために）に使用される（「P01_Pre_B02_0001_C1」、プレート1、TBHP前処理、ウェルB02、正しい治療法を用いて）。
- 収集プロトコルを使用して、ウェルA01の中心のまわりの4つの位置の両方のチャネルについて、フラットフィールド画像を取得する。 thを保存次の標準化された命名法を使用して、他の画像と同じフォルダ内の個別のTIFFファイルとして、プレート1、フィールド1、およびチャネル1に「P01_FF_A01_0001_C1」を追加します。飽和の場合は、より低い濃度の抗体作業溶液を使用してください。
- プレートを捨てるか、さらに処理するために保存してください。
注：顕微鏡からプレートを取り外し、マルチチャンネルピペットを使用してTBHP溶液を添加する代わりに、顕微鏡ステージに自動ピペットを取り付け、トリガーを受けて機能するように取得ソフトウェアに接続することができます。これにより、次のウェルに移動する前に、最初の取得後すぐに各ウェルにTBHPを添加することができます。このようにして、第1のイメージングラウンドが終了すると、第2のイメージングラウンドがすぐに開始され、全てのウェルがTBHPと等しいインキュベーション時間を有するであろう。
7.画像処理と解析（±30分/96ウェルプレート）
注：すべての画像処理は、ImageJフリーウェアのパッケージ版であるFIJI（http://fiji.sc）で実行されます。細胞内ROSおよびミトコンドリアシグナルの自動分析、ならびに形態学的パラメーター（RedoxMetrics.ijm、要求に応じて入手可能）のための専用のスクリプトが作成された。根底にあるアルゴリズムは、Sieprath et al。 1 。
- FIJIがインストールされ、操作可能であることを確認します。
- FIJIを起動し、マクロセットをインストールします（プラグイン - >マクロ - >インストール...）。これは、 図3Aに示すように、解析設定を最適化する一連のアクションツールと同様に、多数の新しいマクロコマンドを呼び出すでしょう。
- セットアップインターフェースを開き、 'S'ボタン（ 図3B ）をクリックして分析設定を設定します。
- 使用した画像タイプ、チャンネル数、ウェルを選択してくださいフラットフィールド画像を取得する。
- どのチャネルに細胞（CM-H 2 DCFDAチャネル）またはミトコンドリア（TMRMチャネル）が含まれているかを示し、画像品質に応じて各チャネルの前処理およびセグメンテーションパラメータを調整する（ 図3B ）。 「背景」チェックボックスおよび「コントラスト」チェックボックスを選択すると、それぞれ背景減算またはコントラスト限定適応ヒストグラム等化16が実行される。細胞のガウスぼやけのシグマとミトコンドリアのラプラシアン増強を定義する。自動閾値アルゴリズムを選択し、サイズ除外限度（ピクセル単位）を入力します。自動しきい値アルゴリズムの代わりに固定しきい値を選択した場合は、上限しきい値を入力します。
- 取得したデータセットのいくつかの選択された画像のセグメンテーション設定をテストし、それらを開いて、それぞれ細胞またはミトコンドリアのセグメンテーションのメニューで 'C'または 'M'必要に応じて設定を調整してください。一例の結果を図3Cに示す 。
- [＃]ボタンをクリックし、画像が保存されているフォルダを選択して、該当するフォルダのバッチ分析を実行します。フォルダごとに、画像ごとに個別のROIセット（zipファイル）と結果ファイル（.txt）を含む新しい '出力'ディレクトリが作成されます。両方のチャネルについて、結果ファイルには強度および形態記述子が含まれています。 CM-H 2 DCFDAチャネル（セル）結果ファイルは、記述子ごとに、1つの画像内の結合されたROIの平均値を含む。 TMRMチャネルの場合、結果ファイルには、個別にセグメント化されたミトコンドリアROIごとの値がディスクリプタごとに含まれています。
- バッチ分析後、 'V'ボタンをクリックすると、それぞれのROIオーバーレイを持つすべての画像のハイパースタックである '検証スタック'でセグメント化のパフォーマンスを視覚的に確認できます。このようにして、/アンダーグラジェティング、画像の焦点が合っていない画像、またはゴミ粒子/ファイバーは、すでにすばやく検出できます。データの品質管理（§8参照）中にさらにキュレーションを行うことができます。
8.データ分析、品質管理（QC）、可視化
生データの処理と分析は、R統計的フリーウェア（http://www.rproject.org - バージョン3.3.2）とRStudio（http://www.rstudio.com/ - バージョン1.0.44）を使用して行われます。結果を迅速に取得して可視化するために、ヒートマップとボックスプロットのデータを統合して可視化し、統計分析も実行する、直感的なShinyアプリケーション17 （要望に応じて利用可能）が考えられています。一般に、ワークフローは2つの連続するステップからなる。まず、96ウェルプレートごとにデータを処理して検査し、異常データポイントを検出する。第2に、所与の実験の全てのプレートからの選別されたデータを組み合わせ、ノンパラメトリックマルチ変量テスト18および主成分分析。
- RとRStudioがインストールされ、操作可能であることを確認してください。
- RStudioを起動します。
- RedoxMetricsの光沢のあるアプリケーションを開き、アプリケーションを実行します（外部ブラウザで実行することを選択します）。
- 「入力」ページで、RedoxMetrics.ijmの結果ファイルが置かれているディレクトリを選択します。
- このディレクトリ内に「Setup.xlsx」（手順3.15で作成）が存在することを確認してください。
- 結果ファイルと設定情報は自動的にインポート、再配置、視覚化されます。
- 「実験設定」ページには実験のレイアウトが表示されます。確認のためにこのページを使用してください。
- 次のページ、「プレートごとの結果」は、色分けされたマルチウェルプレートレイアウトでの各プレートのデータとウェル名とイメージ番号でラベル付けされたアウトライアーを伴うボックスプロットで個別にデータを示します。後者は、容易な検査とident異常データポイントの特定（その特定の治療法で測定された平均値と比較して極めて高い値または低い値 - 例については図4を参照）。
この情報を使用して、異常な点に対応する画像を確認します。異常が検出された場合は、分析から除外する必要があります。ほとんどの異常は、画像の一部がピントの合っていない場合、または蛍光塵粒子が適切なセグメンテーションを妨げる場合に不適切なセグメンテーションによって引き起こされます。極端なケースは、検証スタックツール（ステップ7.5）を使用してすぐに検出することができますが、このステップではさらに微妙な事象が検出されます。異常値に関して明らかな理由または技術的理由が見つからない場合、画像を分析から除去すべきではない。 - オプション：「Drop.xlsx」という新しいスプレッドシートを作成し、「Drop」という1つの列だけを作成します。この列には、すべての画像のファイル名（拡張子「.tif」を含む）分析（ステップ7.5またはステップ8.6.2で特定）から取り除かなければならない。このファイルを '入力'ページでアップロードします。
- 「結果全体実験」ページには、すべてのプレートを組み合わせた結果が表示されます。ドロップファイルがアップロードされた場合、このファイルは分析から指定されたデータポイントを削除するために使用されます。
個々のパラメータごとに、データは、それぞれのコントロールに従ってプレートごとに正規化される。次いで、すべてのプレートからのデータを組み合わせ、続いてnparcompパッケージ18からの非パラメトリック多変量試験を行う。 2つの処置のみを比較すると、ノンパラメトリックなBehrens-Fisher問題の2つのサンプル・テストが実行されます。 3つ以上の治療については、非パラメトリックコントラストベースの多重比較試験が用いられる。結果はボックスプロットを使用して視覚化されます。 - 「クラスタ解析」ページには、主成分分析（PCA-Rコアの統計パッケージ）の結果が表示されます。 5つのパラメータからのデータ（baサルおよび誘導ROS、およびミトコンドリア膜電位、大きさおよび真円形）を組み合わせて、敏感なレドックスプロファイルに基づいて異なる治療法を識別する。この目的のために、主成分分析（PCA）が行われる（R core 'stats'パッケージ）。結果は、biplot（ggbiplotパッケージ - http://github.com/vqv/ggbiplot）を使用して視覚化されます。
- 「データのダウンロード」ページを使用して、処理され再配置されたデータを含むバックエンドデータフレームをダウンロードし、より高度なデータの視覚化または統計分析に再利用できるようにします。
注記：一般的な落とし穴や潜在的な解決策を表1に示します。
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Representative Results
アッセイはいくつかの対照実験を用いてベンチマークされており、その結果はSieprath et al。 1 。要するに、CM-H 2 DCFDAおよびTMRMの細胞内ROSおよびΔψmの外から誘導された変化に対する蛍光応答を定量化して、ダイナミックレンジを決定した。 CM-H 2 DCFDAについて、NHDFは、10μM〜160μMの範囲のTBHPの濃度を増加させて処理した場合、蛍光シグナルの線形増加を示した。同様に、TMRMについて、NHDF細胞は、1〜10μg/μLの範囲内の増加する濃度のオリゴマイシン（ΔΨm過分極を誘発する）で処理した場合、ミトコンドリア蛍光の線形増加を実証した。逆に、ΔΨmの脱分極を誘発する抗生物質であるバリノマイシンのリアルタイム添加は、徐々に、定量的になったTMRM蛍光の明らかな減少。
このアッセイはまた、細胞の種類または処理1,15間の酸化還元状態の差異を明らかにするために、様々な実験に用いられている。これを説明するために、NHDFをHIVプロテアーゼ阻害剤Saquinavir（SQV）で処理した実験の結果を示す（ 図5 ）。記載されたプロトコールを用いて、DMSOで処理した対照細胞と比較して、基礎および誘導ROSレベルの両方について有意な増加が検出された（ 図5B ）。 SQV治療はミトコンドリアの形態機能にも大きな影響を与えた。形態学的に、ミトコンドリアは高度に断片化されたパターンを獲得したが、これは個々のミトコンドリアのより高い円形度およびより小さい平均サイズによっても確認された。機能的には、ミトクロンあたりの平均TMRMシグナルとして測定されるΔψmオンデリートピクセルも有意に増加した（ 図5A ）。上記の5つのパラメータのデータを組み合わせると、主成分分析によって2つの条件（制御とSQV）を明確に分離することができます。 3つの独立した生物学的複製からのデータが、最初の2つの主成分を示す2D-バイプロットで示され、これは全分散の81.4％を説明する（ 図5C ）。これはアッセイの堅牢性を証明し、組み合わせた読み出しが細胞の健康状態の敏感な指標として役立つことを示唆している。
図1 ：細胞内基底および誘導されたROSレベルとミトコンドリアのモルホファンクションの同時測定のためのハイコンテントイメージングアッセイの概要。 （ A ）S主要な操作ブロックの化学表現。 （ B ）図示の例：細胞を複数の同一96ウェルプレートに播種する。標準的なウェルプレートレイアウトを図2Aにさらに詳細に示す 。染色後、各ウェルの中心の周りのチャネルごとに4枚の画像が得られ、 TBHPの 前処理および後処理の両方がインセットを有する大きなモンタージュによって示される。画像解析後、ウェルプレートレイアウトに投影された直感的なヒートマップを使用して、輝度結果を視覚化します。これは、プレート効果または異常なウェルの迅速な検出を可能にする。完全な実験データセットのキュレーション後、最終的なデータ分析が実行され、結果として単一および複数のパラメータ出力が得られる。 （この図は、Springerの許可を得て、参考文献1から変更されました） より大きな Versio を表示するには、ここをクリックしてくださいこの図のn。
図2 ：典型的な実験的96ウェルレイアウトおよび対応する「セットアップ」ファイル。 （ A ）4つの異なる条件が、プレートの内側60ウェルにわたって均一に分布する。ウェルB01にはセルも含まれていますが、イメージング直前の初期PFSオフセットを調整するためにのみ使用されます。他の外側ウェルは、細胞培養中の勾配（温度、湿度など ）を最小にするために培養培地のみで満たされる。画像取得は、最初に左から右へ、井戸B02からB11へ、次いで奥から、右から左へ、井戸C11からC02へと蛇行して行われる。画像取得フラットフィールド画像がウェルA01で取得された後、画像中の空間照明異質性を補正するために使用される。 alysis。 （ B ）対応するセットアップファイル（Setup.xlsx）は、実験のレイアウトに関する情報を含むスプレッドシートです。マルチウェルプレート内の各処理の位置とそれぞれのコントロールを指定します。各行はウェルを表します。各治療には独自の治療番号があり、データ分析中に生成されたプロットのX軸上での治療の順序を指定するために使用されます。 「コントロール」列には、同じ行に指定された治療のデータを正規化するためのコントロールとして使用する必要のある治療が含まれています。この例では、処置1は、他のすべての処置からのデータを標準化するための対照として使用される処置である。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図3 ：RedoxMetricsマクロセット、レイアウト、セットアップインターフェイス （ A ）FIJI用のRedoxMetricsマクロセットがインストールされている場合、解析設定をテストおよび最適化する一連のアクションツールと同様に、多数の新しいマクロコマンドがメニューバーに作成されます。 'S'はセットアップインターフェイスを呼び出します。 'F'は開いている画像に対してフラットフィールド補正を行います。単一の開かれた画像上の細胞領域（「細胞」、CM-H2DCFDAチャネル）およびミトコンドリア領域（「Mito」、TMRMチャネル）のそれぞれについて、「C」および「M」は試験セグメンテーションを行うセグメント化された関心領域（ROI）のオーバーレイを返す。 '＃'は、セットアップインターフェースで指定された設定（通常は1つまたは数個の画像の検証後）を使用して、画像のフォルダをバッチ分析します。 'V'は検証ハイパースタックを作成しますgバッチ分析の出力データ。このハイパースタックは、フォルダ内のすべての生画像とそのそれぞれの関心領域（第2のチャンネルで描画されたもの）の合成画像である。 'O'をクリックすると、セグメント化された領域のオーバーレイを表示または非表示にすることができます。 （ B ）セットアップインターフェース。ここでは、画像タイプ（拡張）、チャネル数（波長）、フラットフィールド補正に使用されたウェルなどの一般的な情報を含む、すべての解析設定が選択されています。次に、画像コンテンツタイプ（CellまたはMito）に固有の設定があります。どちらの場合も、バックグラウンド補正（「背景」）とローカルコントラスト強調（「コントラスト」）を含むオプション（チェックボックス）があります。セルのセグメンテーションには、ノイズを低減するためのガウスぼかし半径（シグマ）を定義するオプションがあります。ミトセグメンテーションのために、ミトコンドリアの選択的増強のためのラプラシアン演算子の半径を定義するオプションがある。後続のセグメンテーションはpコンテンツタイプごとに定義できる自動（または固定）閾値処理方法を使用して作成されます。固定された閾値が選択された場合には、手動で上限閾値を提供することができる。最後に、分析は、最小および最大サイズ内に入るオブジェクトの選択に限定することができる。 （ C ） "C"（上）または "M"（下）コマンドで実行されたセグメンテーション結果の例。グレーの生画像として、関心領域が黄色で重ねられて表示されます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4 ：中間データの視覚化の例。 （ A ）ウェルB02およびD07が現れるマルチウェルプレートの可視化疑わしい。 （ B ）同一のデータを表すボックスプロットであり、アウトライヤーはウェル名とイメージ名でラベル付けされている。 F03_0003とともに、B02とD07の画像が異常値として再現されます。 （ C ）これらの画像を目視検査すると、セグメンテーションエラー（赤い 'X'で示されている）があるため、B02_0000とD07_0001を後で分析から削除する必要があります。 F03_0003は明らかなセグメンテーションまたは技術的なエラーがないため、保持する必要があります。 （収差について技術的理由が見つからない場合、データを除去すべきではない）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5 ：一次ヒトFibrに対するサキナビル（SQV;20μM）の効果oblasts（対照はDMSOである）。 （ A ）TMRM（ B ）によって測定されたミトコンドリア膜電位（ΔΨm）およびミトコンドリア形態（個々のミトコンドリアの円形度および平均サイズ）CM-H 2 DCFDAによって測定された細胞内ROSの基礎レベルの増加および誘導ROS 20μMのTBHP添加後の強度の相対的な増加として示した。 （ C ）上記の5つの変数（基底および誘導ROSレベル、平均ミトコンドリアサイズ、真円度、およびΔΨm）に関するPCA分析からの最初の2つの主成分（PC）の2D散布図。黒い矢印は、元の5つの変数の主成分に対する方向を表しています。 （独立した複製物は異なる色でプロットされている;全てのデータはDMSO対照に関して標準化されている; * = p値<0.05; ** = p値<0.01; *** = p値<0.001; Y -差を最適に表示するように調整されています。この図は、Springerの許可を得て、参考文献1から変更されました）この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| 問題 | 潜在的な理由 | 可能な解決策 |
| イメージング中にウェルに細胞が少なすぎる | 播種した細胞が少なすぎる | イメージングの24時間前に細胞を種まきます |
| 不十分な細胞増殖 | 培養条件のチェック（培地、温度安定性、CO 2コントロール） | |
| あまりにも激しい洗い行程 | 細胞を洗い流したり、静かにピペットで吸い取ったりしないでください | |
| イメージング中にウェルに細胞が多すぎる | あまりにも多くの細胞が播種された | イメージングの24時間前に種子を少なくする |
| 刺激に対するCM-H 2 DCFDA蛍光の弱いシグナルまたは非線形応答 | 古すぎる/高濃度の染料を使用する | NHDF細胞以外を使用する場合、最適な負荷濃度は経験的に決定されなければならない |
| 染料の充填が不十分です | 0.02％w / vの界面活性剤Pluronic-127を添加溶液に添加して取り込みを増加させる。 | |
| CM-H 2 DCFDA信号は、露光時間中に視覚的に増加する | 染料濃度が高すぎる | 染料濃度を下げる |
| 励起強度が高すぎる | NDフィルターを使用して励起強度を下げる、および/または露光時間を短縮する | |
| ウェルプレートの獲得中にCM-H 2 DCFDA強度が減少する | CM-H 2 DCFDAが漏れている細胞。 | 2 mMのプロベニシド（陰イオンポンプ阻害剤）を使用する。ローディングソリューションに追加するだけでなく、イメージングバッファにもリークを減らす |
| TBHP添加後のCM-H 2 DCFDAシグナル強度の増加はない | TBHPはアクティブではありません | 新鮮なTBHPを使用する |
| CM-H 2 DCFDAがセルから漏れている。 | 上記のようにプロベニシドを使用してください。 | |
| （一部の）取得した画像はピントがずれて表示され、フォーカスはチェックされているように見えます。 | プレートは傾斜して取り付けられ、焦点がPFSオフセットを超えて広がる | プレートの取り付けとステージのレベルを確認し、プレートの位置を変えてください |
| プレートの底面には、ほこりや凹凸があります | エタノール湿らせたレンズペーパーでプレートの底を清掃する | |
| イメージング中に細胞が死ぬ | 励起強度を低減するか、1ウェルあたりの画像数を減らします。 | |
| 間違ったイメージングバッファー組成 | イメージングバッファを再作成する | |
| 画像に焦点が合っていない蛍光斑がある | 切り離されたセルの焦点がずれている | ローディングプロトコール中により穏やかに洗浄する |
| 1つ以上のカラムは、プレートの他のウェルよりも低い強度を有する | マルチチャンネルピペットからの1つまたは複数のチップがしっかりと取り付けられていなかったため、これらのウェルにはより少ないレポーターが加えられました | マルチチャンネルピペットを使用するたびに、すべてのヒントが完全に満たされているかどうかを徹底的に確認してください。 |
| 画像取得中にフォーカスが劇的に変化する | プレートのポリスチレン底面は、オイルレンズ使用時には浸漬油と反応します | ドライレンズを使用するか、またはglaを持つマルチウェルプレートを使用してくださいss bottom |
| TMRMシグナル強度は、最初と最後のウェルのイメージング間で増加する | レポーターの読み込み時間が十分ではなく、TMRMはまだ平衡しています | レポーターのローディング時間を増やす |
| TBHP処理後のCM-H 2 DCFDAシグナルは、ウェルプレートの獲得中に増加する | TBHPによる処理と第2のイメージングラウンドの開始との間の時間は十分ではなく、TBHPは依然としてCM-H 2 DCFDAを酸化している。 | TBHPによる処理と第2回目の画像化とのインキュベーション時間を増加させる。 （少なくとも3分で開始する） |
| フラットフィールド画像が飽和している | 抗体作業溶液は濃縮されています | より低い濃度の抗体作業溶液を使用する |
| 取得設定が最適化されていない（露光時間が長い、NDフィルタが低い、など） | 取得設定を最適化し、信号はセンサのダイナミックレンジ内になければならない | |
| フラットフィールド画像が暗くなる | 抗体作業溶液は希釈されています | より高い濃度の抗体作業溶液を使用する |
| 取得設定が最適化されていない（露光時間が長い、NDフィルタが低い、など） | 取得設定を最適化する、信号はセンサーのダイナミックレンジになければならない | |
| オーバー/アンダーセージングアーチファクト | しきい値が正しく設定されていません | しきい値の設定を調整する |
| サイズフィルタが正しく調整されていない | 画像解析の最小サイズと最大サイズの基準を調整する | |
| 細胞集密度が高すぎる | 適切なレベルのコンフルエントは、信頼性の高い画像解析にとって非常に重要です。 NHDF以外の細胞型については、最適な播種密度は経験的に決定されなければならない | |
| 光沢のあるアプリケーションは動作しません | 間違ったディレクトリが選択されました | 入力ページの正しいディレクトリを選択します。 |
| ディレクトリにファイルがありません | 必要なすべてのファイル（imagejマクロとセットアップファイルの出力）が選択したディレクトリに存在することを確認します | |
| 不足しているパッケージ | 通常、アプリはすべての必要なパッケージをチェックしてインストールしますが、失敗した場合は、devtools、ggbiplot、pacman、ggplot2、plyr、nparcomp、data.table、readxl、gplots、ggbiplot、shiny、shinyFiles、pbapplyすべての依存関係を含むshinyjs。 |
表1：典型的な落とし穴と潜在的な解決策。
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Discussion
本稿では、NHDFにおける細胞内ROSレベルとミトコンドリア機能の同時定量化のための高含量顕微鏡法について述べる。その性能は、SQV処理NHDFに関する事例研究によって実証された。この結果は、19,20,21,22,23,24,25の別個の実験ではあるが、1型HIVプロテアーゼ阻害剤による治療後に、ROSレベルまたはミトコンドリア機能障害の増加が観察された文献からの以前の証拠を裏付けている。重要な違いは、記載されたアッセイが形態細胞データと共に同じ生きた細胞内でこれらのパラメータを同時に測定できることである。このアプローチの主な利点は、スペースとtの両方の要素を明確に決定することですこれは、因果関係を正確に示すことができます。特定の摂動の敏感なレドックスプロファイルを生成することを可能にする主成分分析が行われる。しかし、より高度なデータマイニング技術および（監督された）クラスタリングアルゴリズムを、予測されるレドックスプロファイリングを可能にするために抽出されたデータに使用することもできる。これは、デジタル病理学における診断または予後分類ツール、ならびに治療標的のスクリーニングにおいて価値ある特徴であり得る。 例えば 、堅牢な分類モデルが作成されると、小分子ライブラリーをスクリーニングして、酸化ストレスに対抗する治療候補を見出すことができる。ヒトミトコンドリア障害の治療開発における有望なリードの最近のスクリーニング26 。
アッセイはNHDFのために考案されたが、他の接着細胞タイプに適応させることができる。これには、染色プロトコールおよびレポーター色素濃度の最適化が必要である。 rの量過負荷はクエンチングによる非線形効果を引き起こすか、細胞傷害性になる可能性があるため、エポーター色素を最小限に抑える必要があります。このような細胞を生理学的な様式で載せて観察することが困難であるため、懸濁細胞へのアッセイの延長はあまり明白ではない。これらは、カバースリップ上で細胞培養することができ、または無血清培地で培養して接着を誘導することができるが、これらのプロセスはいずれも生理学的状態を妨害する28,29 。しかし、これらの制限は、生存率30を維持しながら、小さなマイクロウェルに個々の細胞（粘着性または非粘着性）を閉じ込める微細パターンの細胞培養支持体を用いて、または画像化中に細胞を捕捉する熱可逆性ヒドロゲルの使用によって克服することができる31。 。これらの方法は、細胞膜電位または個々の懸濁細胞における細胞性酸素の高含量スクリーニングにすでに使用されている= "xref"> 32,33または生きた運動性の高い寄生虫31の細胞内マーカーのイメージング。これらの細胞におけるミトコンドリアネットワークの形態学的解析には、スピンディスク共焦点またはベッセルビーム光シート顕微鏡法34,35などの迅速な3D捕捉能力、ならびに分析に必要とされるので、画像化モダリティへの適応も行われなければならない形態学的パラメータを計算しながらZ次元を含むようにする。
このアッセイは、96ウェルプレートに対して最適化されたが、明らかに、 例えば 384ウェルプレートにさらにアップスケールすることができる。主な制限因子は、プレート獲得時間、 すなわち、全てのウェルの画像を獲得するのに要する時間である。蛍光シグナルは、この時間枠内で安定していなければならず、その結果、個々の井戸。しかし、染色は一過性であり、調査中のプロセスは動的であるため、これは課題を提起する。したがって、蛍光シグナルを一連の複製実験で測定したところ、これはCM-H 2 DCFDAおよびTMRMシグナルの両方が染色後2〜2分以内に安定したままであることを示した（変動係数<2％）。これにより、約40分のウィンドウが得られます。 96ウェルプレートは、典型的には約10分かかる。したがって、384ウェルプレートへの外挿は、安定した時間スロット内で獲得期間を維持するであろう。 1画像あたり平均50個の細胞（20X対物レンズおよびNHDF細胞の使用に基づく）を用いると、1時間当たり約30,000細胞のスクリーニングのデータが得られ、アッセイの統計力が大幅に向上する。蛍光シグナルの安定性に影響を及ぼす別の要因は、温度である。 CM-H 2 DCFDAの空胞化（すなわち、細胞内小胞内の色素蓄積）を避けるために、ヘテロ遺伝子的染色および非線形効果のために、インキュベーションは37℃の代わりに室温で行われる。安定性とは別に、蛍光励起光への生細胞の曝露自体がROS産生を誘導することに注意することが重要である。これは、露光条件（露光時間および励起光強度）が絶対最小値に保たれるべきであることを意味する。また、実際の画像が取得されたときにのみ、すべてのウェルを露光する必要があることを意味します。これはソフトウェア対応オートフォーカス方式の使用を排除し、ハードウェアベースのオートフォーカスシステムの使用を保証します。
記載された方法の利点は、その一般的な特徴である。実質的に、スペクトル的に適合する蛍光レポーターの任意の組み合わせを使用することができる。これは生存細胞1,15あたりのミトコンドリアROSを測定するためにCalcein / MitoSOXの組み合わせを使用することによって実証された。さらに、アプリケーションはintに限定されない測定されたROS /ミトコンドリア測定。アッセイは、 ポストホック免疫染色（第2のイメージングラウンド後）で延長することもできる。正確なイメージング位置が保存されるので、酸化還元分析は、同じ細胞内の位置プロテオミクスと直接相関する可能性がある。これは、レドックス生物学、または一般に蛍光強度を評価するためにしばしば使用される他の方法とははるかに対照的である、分子読み取り値を大幅に増加させる。例えば、蛍光測定法（マイクロプレートリーダ）は、比較的低コスト（基本的なセットアップは4000ユーロ）と浅い学習曲線のために広く使用されているが、ブラックボックスであるため、細胞密度またはバックグラウンド（自動）蛍光、 例えば混入する塵粒子の蛍光。さらに、プレートリーダは、形態学的パラメータの抽出を可能にせず、単一細胞を測定することができず、動的または過渡シグナルを測定するために感度が低く信頼性が低いlass = "xref"> 36,37。フローサイトメトリーは単一細胞を測定する能力を有し、速度の利点を有する。実際に、384ウェルプレートは、マルチマーカー38に対して高感度でわずか12分でスクリーニングすることができる。これは、広視野顕微鏡で可能なものよりもはるかに高速です。しかし、時空間情報（ すなわち、細胞内局在、形態学的データおよび/または時間依存動力学）は提供されず、治療中または治療後（すなわち、フラックス）で同じ細胞を再訪することもできない。さらに、細胞は浮遊状態にある必要があり、フローサイトメトリーは付着細胞の生理学を研究するのに適していない。高含量顕微鏡法の主な欠点は、他の方法と比較して、大きな画像データ記憶、強力な処理能力および複雑な画像分析の必要性である。提示されたアッセイは、画像取得プロセスを標準化し、分析を合理化するこの処理時間を最小限に抑え、使用の容易性を高め、したがってアッセイをよりアクセス可能にする。
結論として、CM-H 2 DCFDAおよびTMRMの使用に特有の記載されたレドックスプロファイリング法は、堅牢で、敏感で信頼性がある。その多重パラメトリックおよび定量的性質のため、他の蛍光ベースの方法より優れています。このようにして、レドックスホメオスタシスが乱される多種多様な病態をよりよく理解する上で重要な、ミトコンドリア機能と細胞内ROSシグナル伝達との関係を解明するのに役立ちます。さらに、その一般的性質のために、このアッセイは、その元の範囲をはるかに超える用途を可能にする。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益または他の利益相反はないと述べている。対応する著者はまた、すべての著者がすべての利益相反を開示するよう頼まれていることを保証する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
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