Summary
一种全身免疫组织化学方法，可以显示Suncus murinus肝外胆道中的神经丝蛋白表达。在这里介绍。该方案可用于分析小鼠或其他物种中所有内脏器官的神经支配。
Abstract
本文详细描述了全基因免疫组织化学染色方法，使用神经丝蛋白抗体标记阳性丝猴（ S. murinus）胆道神经支配 ）。首先从S. murinus中切下标本并固定在4％多聚甲醛（PFA）中。其次，进行酶处理和潜在的内源性过氧化物酶失活。然后将标本暴露于一抗，抗神经丝蛋白抗体3-6天。然后与与辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育。通过使样品与3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物反应来显示显色反应。该方法可用于分析所有内脏器官的神经支配。此外，该方案还可以适应于测试其他神经元抗体，但优化抗体应先做好。这种方法最初由Kuratani和Tanaka 1，2，3引入。
Introduction
房子麝香rew，，，属于食虫纲和家Sor科。这种小型哺乳动物分布在整个东南亚，栖息在靠近人类栖息地或牛栏的房屋和草地上。与其他实验室动物（如小鼠，大鼠和兔5）相比，该物种具有与人类相似的一般形态特征。以前，使用具有S. murinus神经丝蛋白（NFP）的外周神经元标记的全蛋白免疫染色来标记胰腺6 ，主要十二指肠乳头7 ，幽门8 ，胆囊5和肝外胆道9中的外周神经。
NFP是成熟神经元细胞骨架的一部分的大分子复合物。神经丝相关蛋白介导NFP和Zygosome之间的相互作用。酶功能和接头蛋白的结构均受NFP 10调控。 NFP复合物由三种多肽组成：NF-L（70kDa），NF-M（150-160kDa）和NF-H（200kDa）。 NFP可以在中枢神经系统和外周神经系统的神经元轴突中发现。已经显示抗人NFP抗体标记中枢和周围神经系统的轴突。解剖和电生理调查表明，括约肌，胆囊和近端胃肠道连接11,12,13,14。然而，他们的神经元连接的形态特征尚未被定义。
这项工作表明使用全套免疫组织化学染色方法来标记耻骨球菌的神经支配使用NFP抗体。
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Protocol
所有实验程序均由东京都大学体育动物护理与使用委员会（IACUC）批准。根据“实验动物护理和使用 指南”和 “加拿大动物护理委员会实验动物护理和使用指南”，将动物饲养和处理。我们在日本东京都大学前沿健康科学系功能形态学实验室养殖和维护动物。
动物护理和住房
- 从封闭的繁殖群中获得7只小鼠 （3只雌性和4只雄性，重70-90克）。
- 在装有含有纸条的木制巢箱的塑料笼中断奶后分别保存S. murinus （出生后20 d）。将它们保存在常规条件的动物室内：23-27℃，无湿度控制，12:12小时：黑暗循环。供应商业唾液丸和水随意。
2.组织准备
- 为了制备4％（w / v）多聚甲醛（PFA），将40g PFA溶于1,000mL 0.01M磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）中。在通风柜中，使用涡流进行混合，直到溶液清亮。在4℃下储存4％PFA O / N。
注意：在处理PFA时佩戴适当的个人防护装备（PPE）。 - 灌注并固定动物，用乙醚麻醉，然后腹膜内注射睡眠素（戊巴比妥钠，0.6 mL / kg体重）。
- 动物完全麻醉后，用解剖刀打开腹腔，形成3厘米长的中线腹部切口。在切除下腔静脉用于放血时，将导管逆行插入腹主动脉，在该动脉分叉上方的水平进入髂总动脉。
- 注射嗜睡眠（戊巴比妥）ium，1.0mL / kg体重）。完全安乐死后，用0.01M PBS（pH 7.4）灌注，然后用4％PFA灌装在通风柜中。
- 灌注后，注入2-3mL白色氯丁橡胶胶乳（稀释的白色氯丁橡胶胶乳3：2，用蒸馏水（DW））标记血管。
- 将有关神经和血管的腹部器官，包括肝脏，胆囊，胆总管，十二指肠和胰腺一起提取。
- 将约0.1mL蓝色氯丁橡胶胶乳（向一滴稀释的白色氯丁橡胶胶乳中加入一滴蓝色墨水）注入胆汁以标记胆汁系统。
- 在4℃下用4％PFA固定过夜以进行全套免疫染色。
注意：PFA有毒。避免直接使用PFA。 PFA应用于通风柜。
3.全身免疫组织化学
注意：在整个方案中，包括在洗涤，抗体孵育和着色期间，e样品必须留在钳子上，轻轻地在室温或4℃下摇摆。
- 第1天：酶促处理和灭活潜在的内源性过氧化物酶
- 在适当尺寸的玻璃小瓶中，每个室温下用DW 4x将制备的样品洗涤1小时。将样品轻轻摇匀，以除去PFA。避免在交换溶液时损坏样品。
- 为了制备1％（w / v）的正周期酸，将1g正周期酸溶于100mL的DW中。
- 在室温下将样品在1％正二碘酸中孵育20分钟，以防止任何内在的过氧化物酶反应。
- 通过将0.004g木瓜蛋白酶溶解在100mL 0.025mol / L Tris-HCl缓冲液（pH7.6）中来制备0.004％（w / v）木瓜蛋白酶。
- 在室温下用DW清洗样品10分钟。
- 将样品在新鲜制备的0.004％木瓜蛋白酶中，在37℃下，在温和摇摆的恒温槽中孵育2小时。
- 用D清洗试样W在室温下保持50-60分钟。
- 以4°CO / N将样品储存在4％PFA中。
- 第2天：酶治疗
- 用DW洗涤存放的样品4次，每次1小时。
- 将样品在新鲜制备的0.004％木瓜蛋白酶中，在37℃下，在温和摇摆的恒温槽中孵育2小时。
- 在室温下用DW洗涤样品50-60分钟。以4°CO / N将样品储存在4％PFA中。
- 第3天：冷冻治疗
- 按照上述方式，在室温下用DW 4x洗涤储存的样品1小时。
- 通过将2.5g，5g和10g蔗糖分别溶解在100mL的0.01M PBS（0.5g / l）中制备2.5％（w / v），5％（w / v）和10％（w / v） pH 7.4）。
- 将样品浸入2.5％（w / v），5％（w / v）和10％（w / v）蔗糖中30分钟。
- 将样品在-20℃下冷冻30-60分钟，然后在室温下完全解冻;重复周期3x。
- 最佳补充2％Triton X-100（v / v），加入2mL Triton X-100至100mL的0.01M PBS（pH7.4）。
- 将样品以4°CO / N存放在2％Triton X-100中。
- 第4天：初次抗体孵育
- 通过将0.2g牛血清白蛋白（BSA），0.3mL Triton X-100和0.1g叠氮化钠溶解在100mL 0.01M PBS（pH 7.4）中来制备第一抗体的稀释溶液。
注意：叠氮化钠具有剧毒性。必须避免吸入和接触。穿合适的PPE。 - 在上述稀释缓冲液中稀释第一抗体（NFP）1:600（步骤3.4.1）。在4℃下将标本与NFP抗体孵育3-6天，保持标本轻轻地摇动。较大的标本将需要更长的孵化时间。
- 通过将0.2g牛血清白蛋白（BSA），0.3mL Triton X-100和0.1g叠氮化钠溶解在100mL 0.01M PBS（pH 7.4）中来制备第一抗体的稀释溶液。
- 二次抗体孵育
- 在PBS中将样品洗涤1次，每次1小时，以除去未结合的一抗。 通过将0.2g BSA和0.3mL Triton X-100溶解在100mL 0.01M PBS（pH 7.4）中来制备二抗的稀释溶液。
- 在稀释缓冲液中稀释第二抗体（过氧化物酶缀合的，亲和纯化的绵羊抗小鼠IgG-HRP）1:600（步骤3.5.2）。在4℃下将样品与二次抗体孵育3 d，并将样品轻轻晃动在养分器上。
- 着色
- 通过在通风橱下在100mL 0.05mol / L Tris-HCl缓冲液（pH7.6）中加入0.002g 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）制备DAB着色溶液，将溶液保持在黑暗中。
- 在PBS中4℃洗涤样品1小时。
- 在新制备的DAB着色溶液中加入10μL的30％H 2 O 2 ，并在4°CO / N下孵育3 d，同时在养分器上轻轻晃动。
- 停止pla的反应当达到最佳染色强度时，用0.04％叠氮化钠在PBS中取样。
注意：在此步骤之前，避免使用叠氮化钠，因为它可以抑制辣根过氧化物酶。
- 成像染色的组织
- 小心地将样品转移到含有PBS的培养皿中（5厘米高，直径10厘米）。使用安装在立体显微镜上的相机拍摄整个安装的图像。
注意：将完全染色的组织成像，完全浸入PBS中的透明玻璃皿上。
- 小心地将样品转移到含有PBS的培养皿中（5厘米高，直径10厘米）。使用安装在立体显微镜上的相机拍摄整个安装的图像。
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Representative Results
图 1-4显示了S. murinus肝外胆道中NFP阳性神经纤维的典型结果。抗NFP的抗体可重复标记肝外胆管（ 图1 ），胆囊（ 图2 ），上胆管（ 图3 ）和十二指肠乳头区域（ 图4 ）的整个图像中的神经支配，具有高特异性和最小背景。
对于样本的所有组织，无论形状和大小如何，可以同时染色被盖的神经。除了肝外胆道的神经支配外，食管和胃的迷走神经的运行和分布密度明确地展现（ 图1 ）。
图2 ）。
在上胆管中，标记了两种类型的神经束。精神神经束形成不规则且密集的神经网络，粘连，并居住在胆道上/胆道;较粗的神经束平行于胆道表面分布（ 图3 ）。
胆总管用蓝色氯丁橡胶胶乳和含有氯丁橡胶胶乳的容器进行标记。在胆总管末端和十二指肠乳头区域的细小神经纤维明显表现为高c ontrast（ 图4 ）。
图1：胆道，食道和胃中的NFP阳性神经纤维。箭头显示迷走神经沿食道行进到胃。 CBD，常见胆管;食道，食道;圣，胃。刻度棒=1,300μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：胆囊中的NFP阳性神经纤维。胆囊的血管用白色胶乳标记。在胆囊颈部发现丰富的神经支配（箭头）。刻度棒=1,000μm。ref =“http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg”target =“_ blank”>请点击此处查看此图的较大版本。
图3：上胆管中NFP阳性神经纤维。观察到两种类型的神经束。一种类型是粘连地存在于肝外胆道（箭头）上的细神经束;另一种类型是较厚的神经束，其平行于肝外胆道表面分布并在胆囊和十二指肠（三角形）之间运行。 PV，门静脉。刻度尺=650μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：十二指肠乳头区域中的NFP阳性神经纤维。胆总管标有蓝色胶乳和白色胶乳（*）。箭头显示胆总管末端的神经支配，三角形显示来自胆总管和血管的十二指肠乳头区域（P）的神经支配。刻度棒=1,000μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这项工作描述了使用抗神经丝蛋白的抗体对肝外胆道神经支配的可视化的实验程序。该协议根据Kuratani和Tanaka 1，2，3描述的方案进行了改编。
对于这个实验，计划每个实验的时间表，因为整体染色方法持续2-3周。包含组织的容器必须始终在营养器上旋转，除非在冻融过程中。特别是在与一级和二级抗体一起孵育的同时，将样品置于冷藏室中，同时在养分器上旋转以确保试样均匀地暴露于反应溶液中。几种溶液 - 1％（w / v）正周期酸，0.004％（w / v）木瓜蛋白酶和用于初级/次级抗体的稀释缓冲液死亡 - 必须为每个实验新鲜。在整个协议中，为避免在更换溶液时接触和损坏样品，应将溶液倒出而不是用镊子15去除。
用PFA固定后，应用DW或PBS充分洗涤样品。此外，用木瓜蛋白酶孵育的酶处理是重要的。用于抗原回收的热和酶有助于制备抗体穿透的组织。为了增强溶液的渗透性，组织的外膜应在-20℃冷冻处理30分钟或-80°CO / N 15时被破坏。
将实验样品完全浸没在足够体积的缓冲溶液中以确保溶液能够孵育整个样品是重要的。一次抗体的孵育时间必须经验确定d用于不同的组织和样品量。通常2-3厘米的样品必须是3天。每个抗体必须经验确定最佳稀释度。当使用适当的抗体缓冲液时，推荐使用1:600的稀释度作为主抗体和第二抗体。
这项工作详细描述了一种通用的全蛋白免疫组织化学方法来揭示S. murinus胆道中的神经丝蛋白表达的方案。该方法可用于分析许多物种中所有内脏器官的神经支配。此外，该方案还可以适应于测试其他神经元抗体，但是应该进行抗体的优化。
然而，该技术在标记浅层神经组织和构建三维神经支配模型方面受到限制。此外，它不能确定神经纤维的特征（ 即交感神经或par无症状，运动或感觉等 ）。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者没有确认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
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