Introduction
En la ingeniería de tejidos y biosensores, la capacidad de controlar la organización espacial de las proteínas y células en una escala de micras, se ha convertido cada vez más importante en los últimos cuatro décadas 1, 2, 3. Organización espacial precisa de las proteínas y células ha permitido a los investigadores examinar la interacción entre las células y sustratos que contienen tipos similares o diferentes de células, para guiar el crecimiento celular, y para inmovilizar biomoléculas para la fabricación de biosensores 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Los métodos actuales de proteínas de modelado incluyen photopatterning y la impresión por microcontacto. Photopatterning utiliza material sensible a la luz que se entrecruza con la exposición a ultruna violeta (UV). Luz UV dirigida a una fotomáscara (que consta de zonas transparentes con regiones más oscuras para prevenir la transmisión de luz UV) provoca reticulación en regiones específicas que luego se pueden utilizar para la unión subsiguiente de los biomateriales o células 10, 11. Aunque este esquema es muy precisa y permite un control preciso de la topografía de la superficie de cultivo, que se limita a biomoléculas sensibles a UV que pueden ser modeladas por la radiación UV 12. La impresión por microcontacto es otro método popular de proteínas específicas modelando 13, 14. En este método, un siloxano (PDMS) sello de poli-dimetil se trata con una variedad de reactivos de modificación de la superficie antes de ser sumergida en una solución del sustrato biomolecular elegido. A continuación, se presiona suavemente sobre un cubreobjetos de vidrio u otra superficie de este modo el "sacrificio" de la biomolécula sobre la superficie de cultivo. HoWever, estampado se limita al tipo de material que puede ser transferida, así como la humectabilidad de las biomoléculas a la superficie de los PDMS sello 15.
Patrón directa de las células puede ser más difícil y se basa en métodos complejos tales como sustratos conmutables, métodos basados en la plantilla, o patrones con las moléculas de adhesión celular específicos 16, 17. Estos métodos están limitados en su capacidad de células de patrón debido a la falta de sustratos de adhesión celular compatibles, incompatibilidad de que el proceso funcione con células sensibles biológicos y limitaciones, la inconsistencia en la reproducción del patrón, y la complejidad del procedimiento. Por ejemplo, con sustratos conmutables, sustratos personalizados necesitan ser diseñadas para cada tipo de célula, para cambiar su adhesión a tipos celulares específicos sin la degradación a la exposición a la luz UV y calor usado en proceso 17, < SUP = "xref"> 18, 19, 20. procedimientos de modelado en base de la plantilla son versátiles en su capacidad de células de patrón; sin embargo, es difícil de fabricar plantillas de PDMS en los espesores adecuados para uso 16, 21. La inyección directa de células en los canales de microfluidos PDMS tiene algunas ventajas, tales como: 1) la facilidad de fabricación de canales de microfluidos y 2) de idoneidad para muchas células y sustratos diferentes. Sin embargo, el problema frecuente de la captura de burbujas de aire durante el proceso de inyección debido a la hidrofobicidad de PDMS sin el uso de limpieza de plasma, u otros métodos para reducir las burbujas de aire, hace que sea difícil crear consistentemente células modelados en el vidrio o de plástico superficies 21.
Este trabajo amplía micromoldeo capilar 22, 23,lass = "xref"> 24, 25, 26 y reporta un método para inyectar proteínas celulares y suspensiones en microcanales. El método utilizado aquí demuestra el patrón de sustratos y ambos patrones directa e indirecta de determinados tipos de células. Esta técnica supera la alta hidrofobicidad de PDMS y elimina la presencia de burbujas durante la inyección de cualquiera de los sustratos o las células mediante el aprovechamiento de la permeabilidad al gas de PDMS 27. Este documento muestra el uso de la técnica con varios sustratos diferentes y tipos de células. El artículo también destaca la fabricación de moldes para la litografía blanda usando fotolitografía convencional, así como un adhesivo simple y de bajo costo método de la cinta útil en entornos con recursos limitados 28, 29.
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Protocol
NOTA: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Algunos de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos y cancerígenos. Por favor, use todas las prácticas de seguridad apropiadas (campana de humos, guantera) y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados) cuando se utilizan materiales tóxicos o ácido / base.
1. La fabricación de moldes maestros para litografía blanda usando fotolitografía
- Dibuje el trazado de los microcanales utilizando una herramienta de dibujo de diseño asistido por ordenador (CAD).
- Imprimir el diseño en una placa de máscara en blanco utilizando el escritor máscara láser.
- Enjuagar una oblea de silicio de 4 pulgadas con acetona seguido por isopropanol y secar con una pistola de aire de nitrógeno para asegurar que ningún disolvente se deja en la oblea.
- Deshidratar la oblea por cocción en una placa caliente a 200 ° C durante 5 min.
- Seleccionar un fotorresistente negativo diseñado para la altura deseada de los microcanales. Fo ejemplo, utilizar fotoprotector negativo SU-8 50 para obtener microcanales con una altura de 50 m.
- Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente, y luego alinear la oblea en el plato de una recubridora de rotación.
- Dispensar 4 ml (1 ml de diámetro / pulgada de la oblea) de resina fotosensible negativa sobre el centro de la oblea.
- Girar la capa de la oblea con un ciclo de centrifugado en dos fases utilizando una ruleta. En primer lugar, aplicar un ciclo de propagación de 500 rpm con una aceleración de 100 rpm / s durante 10 s. A continuación, aplicar un ciclo de centrifugado de 2000 rpm con una aceleración de 300 rpm / s 2 durante 30 s para obtener un revestimiento 50 micras de material fotorresistente sobre una oblea.
- hornear la oblea suave en dos pasos en un plato caliente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para un recubrimiento de 50 micras de resina fotosensible, primera pre-hornear la oblea a 65 ° C durante 6 minutos y luego la rampa inmediatamente la temperatura de la placa caliente a la post-hornear la oblea a 95 ° C durante 20 minutos.
- Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente y después cargue ella oblea en el escenario litografía.
- Alinear la máscara sobre la oblea usando alineador de máscara y exponer la oblea a la luz UV (según las instrucciones del fabricante) a una intensidad de 1,5 mW / cm 2 para 146 s para aplicar la dosis total de UV de 220 mJ / cm 2 requerida para una 50 m de espesor de capa de resina fotosensible.
- Aplicar horneado posterior a la exposición a la oblea en dos pasos sobre una placa caliente. Para un recubrimiento de 50 micras de resina fotosensible, primera pre-hornear la oblea a 65 ° C durante 1 min e inmediatamente la rampa encima de la temperatura de la placa caliente a la post-hornear a 95 ° C durante 5 min.
- Desarrollar la oblea en sumergiendo la oblea en el SU-8 desarrollador y agitando suavemente hasta que las funciones se aclaran en la oblea. Desarrollar la oblea de ~ 6 min para la fotoprotección de espesor de 50 micras.
- Enjuague el exceso de revelador con isopropanol y etanol, y luego secar la oblea con una pistola de aire de nitrógeno.
- Duro hornear la oblea de silicio sobre una placa caliente a 150 ° C durante 15 min.
- Colocar eloblea en un desecador con 25 l de agente de silanización tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-triclorosilano.
NOTA: El agente de silanización es corrosivo, por lo tanto se debe utilizar en una campana de extracción ácido / base, con el equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, cerrado-dedo del pie zapatos). - Aplicar el vacío durante 5 min y exponer la oblea a los vapores de silano durante 30 min sin liberar el vacío.
- La transferencia de la oblea en una placa de Petri de tamaño adecuado.
2. La fabricación de moldes maestros para litografía suave con cinta adhesiva
- Dibuje el trazado de los microcanales utilizando una herramienta de dibujo CAD e imprimir el dibujo sobre papel blanco.
- Limpiar un portaobjetos de vidrio lo suficientemente grande para acomodar el diseño con isopropanol y luego secar el portaobjetos con una pistola de aire.
- Pegue cinta adhesiva sobre el portaobjetos de vidrio limpia. Tenga cuidado no para atrapar las burbujas de aire.
- Cinta de los lados de la glass deslice sobre el papel con el diseño, con la cinta hacia arriba.
- Utilizar un bisturí para cortar la cinta en el portaobjetos de vidrio utilizando el diseño de papel como referencia y luego pelar la cinta de áreas no deseadas de la lámina de vidrio.
- Enjuague el portaobjetos de vidrio con isopropanol y luego se seca con una pistola de aire. Hornear el portaobjetos de vidrio en un horno a 65 ° C durante 30 min.
- rodar suavemente sobre la cinta con un rodillo de goma para eliminar las burbujas de aire y permitir que la corredera se enfríe a temperatura ambiente.
3. Fabricación suave Litografía de los dispositivos PDMS
- Mezclar PDMS elastómero y su agente de curado en una relación de 10: 1 (w: w), se agita la mezcla vigorosamente, y luego desgasificar la mezcla colocándolo en una cámara de vacío hasta que no aparecen burbujas de aire en la mezcla.
- Verter la mezcla en un molde de silicona del molde silanizado o cinta adhesiva en una placa de Petri para obtener un ~ 2 gruesa capa de PDMS y desgasificar mm hasta que todo el aire de las burbujas desaparecen.
- Curar el PDMS en un hornoa 65 ° C durante 2 h.
- Utilizar un bisturí para cortar la capa de PDMS al menos 5 mm de distancia de las características y luego pelar el PDMS curado fuera del molde usando pinzas.
- Perforar un único orificio de entrada con una biopsia de 1 mm está en cualquier parte del microcanal, preferiblemente en el extremo de una red de microcanales como se ve en la Figura 2a y 4b.
- Limpiar el PDMS emitidos con cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo adsorbidos en el dispositivo. Esterilizar el dispositivo de microcanales PDMS (PDMS fundido) de un enjuague con una solución de etanol al 70% seguido de agua desionizada estéril (DI), y exponer a los rayos UV durante 30 min.
- Mantenga el dispositivo PDMS estéril en una placa de Petri estéril hasta su uso.
4. Sustrato Patrones
- Coloque el PDMS estériles emitidos con unas pinzas sobre un cubreobjetos de vidrio estéril o placa de Petri y aplicar una suave presión con la punta de las pinzas.
NOTA: El molde de PDMS realiza una conformación sello pero reversible con el glcubreobjetos culo o placa de Petri que forma microcanales sin el uso de ningún adhesivo. - Colocar una gota (20 - 40 l) de la solución de sustrato en la entrada que cubre completamente el orificio de entrada. Modelo de poli-D-lisina (PDL) mediante la colocación de una gota de 20 l de PDL en tampón de tetraborato de sodio en la entrada de los microcanales.
- Poner la placa de Petri en un vacío de ~ 254 mmHgA (equivalente a vacío de la casa en laboratorios biológicos) durante 10 min, y observar aire que sale del canal en forma de burbujas.
- Liberar el vacío y observar la solución de sustrato que fluye en el microcanal.
- Incubar el plato en las condiciones apropiadas para la adhesión sustrato. Ver las Tablas 1 y 2 para las condiciones de incubación (estos varían dependiendo del sustrato). Para PDL patrón, se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
- cuidadosamente retire el sello de PDMS con unas pinzas estériles y se lava el patrón sobre cubreobjetos tres veces con agua DI. Añadir una solución de 1% de albúmina de suero bovino (BSA) a la placa de Petri para cubrir el plato o el cubreobjetos de vidrio y se incuba durante la noche a 37 ° C.
NOTA: Esto reducirá la adherencia no específica en las regiones no recubiertas. - Aspirar la solución de BSA al 1%, y el sustrato modelado ya está listo para usar.
5. Patrones indirecta de células
- Preparar la suspensión de células en medio de cultivo libre de suero. El tipo de célula y la densidad celular se enumeran en la Tabla 1.
- Añadir la suspensión de células a la placa de Petri con dibujos y sumergir completamente la región modelada en suspensión de células.
- Incubar la placa de Petri a 37 ° C en una incubadora durante 15 minutos para permitir que las células se unan al sustrato modelado.
- Aspirar el exceso de suspensión de células de la placa de Petri y se lavan las células con dibujos tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), mientras agitando suavemente durante 10 s para eliminar las células no unidas.
- Añadir la unamedio de cultivo apropiadas, con a los cultivos celulares con dibujos y se incuban las células con dibujos a 37 ° C en una incubadora de CO 2.
6. Patrones directa de las células
NOTA: Esta técnica es una alternativa a los patrones de células indirecto descrito en la etapa 5. Sin embargo, a diferencia de en el paso 5, en esta técnica las células se modelan en las superficies de cultivo de tejidos con o sin recubrimiento de sustrato.
- Esterilizar el dispositivo microfluídico de un enjuague con una solución de 70% de etanol seguido de agua DI.
- Remojar el dispositivo durante la noche en una solución de 1% de BSA para evitar la adhesión celular a los PDMS.
- Secar el dispositivo a temperatura ambiente y adjuntarlo a la parte inferior de la placa de Petri tratada con cultivo de tejidos.
- Preparar la suspensión de células en medio de cultivo libre de suero. El tipo de célula y la densidad celular se enumeran en la Tabla 2.
- Colocar una gota (4-8 l) de la suspensión celular, suficiente para llenar elmicrocanales, en la entrada que cubre por completo el orificio de entrada.
- Poner la placa de Petri en un vacío de 10 min y observar aire que sale del canal en forma de burbujas. Liberar el vacío y observar la suspensión de células que fluye en el microcanal.
- Incubar la placa de Petri en una incubadora para promover la adhesión de células como por las condiciones de incubación (dependerá de tipo de célula de modelado) mencionados en la Tabla 2. Añadir PBS a la placa de Petri sumergir el dispositivo de PDMS.
- Pelar el PDMS con cuidado la placa de Petri con pinzas y lavar el patrón con PBS. Añadir medio de cultivo celular a la placa de Petri y colocar el cultivo de células en la incubadora.
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Representative Results
Este método permite que el patrón de proteínas y patrones indirecta de células usando sin salida canales de microfluidos con dimensiones tan pequeñas como 10 micras y equipo disponible en casi todos los laboratorios biológicos una vez que se hizo el molde maestro. Esta técnica se puede utilizar con los canales de microfluidos PDMS creados usando fotolitografía tradicional suave, o con canales de microfluidos PDMS creadas con cinta adhesiva de fabricación (Figura 1) 28, 29. Hemos demostrado previamente la utilización de este procedimiento en el patrón indirecta de las células neuronales para la evaluación de guiado de los axones en los fotorreceptores 4, 30, y ahora han demostrado su uso en varios tipos de células adicionales de diferentes orígenes. de embriones de rata neuronas corticales estampadas en el poli-D-lisina (PDL) y laminina superficies demuestran adherenc generale para las áreas estampadas y el crecimiento a lo largo del PDL y rayas laminina (Figura 3A). Líneas celulares de mioblastos C2C12 también se adhieren a la zona de modelado y demuestran de fusión en miotubos multinucleados (Figura 3B). También hemos adaptado esta técnica de modelado directo de células como se ha visto con los fibroblastos en la Figura 4. Como se informó anteriormente, este método patrón celular directa no mostró ningún efecto adverso sobre la supervivencia de las células 30. Las variables que conducen a un éxito patrones directa o indirecta de los tipos de células indicadas se enumeran en la Tabla 1 y 2. Así, en el futuro, los investigadores pueden utilizar esta técnica para células de patrón y descubrir los fenómenos relacionados con su patrón específico.
Figura 1: La fabricación del molde mediante litografía blanda. Izquierda: Fotolitografíay proceso. SU-8 es revestimiento por centrifugación sobre una oblea de silicio, expuesta a la radiación UV, y desarrollado para eliminar el exceso de SU-8. Derecha: Adhesivo proceso de fabricación de la cinta. Cinta adhesiva se une a un portaobjetos de vidrio limpio, se cortó con un escalpelo, y el exceso de cinta se retira cuidadosamente. PDMS fundido se fabrica a continuación, a partir de cada molde usando litografía blanda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplo de un dispositivo de PDMS para Sustrato Patrones. (A) PDMS reparto de microfluidos con una entrada utilizada para el patrón de microfluidos de sustratos. De entrada fue perforado en un extremo de microcanales. (B) del canal de microfluidos como se ve en el microscopio de contraste de fase. canales de microfluidos son 15 mm de longitud, 20 m de ancho, unad separados por 200 m. La figura 2 se reproduce con permiso de IOP Publishing. Todos los derechos reservados 30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Patrón de la célula indirecta. (A) de vacío asistida proceso de modelado de proteínas. PDMS dispositivo de canal microfluídico está unido a una placa de Petri, solución de sustrato se carga en la entrada, se aplica vacío a la cámara brevemente y se suelta, se elimina dispositivo de PDMS, patrón se lava, y listo para usar. (B) neuronas de rata corticales embrionarias sembraron sobre un cubreobjetos con un sustrato PDL y laminina con patrón. Líneas (c) C2C12 mioblastos cultivados en células PDL con dibujos y laminina. Las figuras 3a y 3c se reproducen con permission de IOP Publishing. Todos los derechos reservados 30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Patrón teléfono directo. (A - c) Los fibroblastos modeladas a través del patrón celular directa. (A) Dispositivo de canal de microfluidos fabricado utilizando la litografía cinta adhesiva. (B) los canales de microfluidos después del llenado con la suspensión celular de fibroblastos utilizando asistida por vacío técnica de modelado. (C) Los fibroblastos después de la eliminación del dispositivo de microfluidos. (D) La calceína-AM tinción de los fibroblastos después de patrones de microfluidos. contraste de la imagen (e) Fase de fibroblastos después de los patrones de microfluidos. (F - g 30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| El modelado de la célula indirecta | sustrato | Condiciones de incubación de proteínas | La densidad celular | Adhesión Celular Duración |
| PC12 | Colágeno-1 | 1 hora a 50 ° C | 5 x 10 6 / ml | 1 hora a 37 ° C |
| fibroblastos | Colágeno-1 | 1 hora a 50 ° C | 5 x 10 6 / ml | 1 hora a 37 ° C |
| C2C12 | PDL + laminina | 1 hora a 37 ° C, se lavan PBS, durante la noche a 37 ° C | 2 x 10 6 / mL | 15 min a 37 ° C |
| Embrionarias de rata neuronas corticales | PDL + laminina | 1 hora a 37 ° C, se lavan PBS, durante la noche a 37 ° C | 2 x 10 6 / mL | 15 min a 37 ° C |
| Las neuronas de la retina salamandra | Sal-1 | durante la noche a 10 ° C | N / A | 1 hora a 10 ° C |
Tabla 1: Condiciones indirectos Patterning celular. Lista de condiciones de incubación, tales como el tipo de sustrato, el tiempo, la temperatura y la densidad de células para tipos de células típicas. Los investigadores deben optimizar las condiciones de incubación para sus propios sustratos modelo y tipo de células. Sal-1 es el sustrato de anticuerpos utilizadas para el cultivo Salamander neuronas de la retina.
| El modelado directo de la célula | sustrato | La densidad celular | Tiempo de adhesión de la célula |
| PC12 | Colágeno-1 | 6 x 10 6 / mL | 1 hora a 37 ° C |
| fibroblastos | Colágeno-1 | 6 x 10 6 / mL | 1 hora a 37 ° C |
| C2C12 | PDL + laminina | 2 x 10 6 / mL | 15 min a 37 ° C |
| Embrionarias de rata neuronas corticales | PDL + laminina | 2 x 10 6 / mL | 15 min a 37 ° C |
| Las neuronas de la retina salamandra | Sal-1 | N / A | 1 hora a 10 ° C |
Tabla 2: Condiciones Patterning celular directa. Lista de condiciones de incubación tales como temperatura, tiempo, y la densidad de células para tipos de células típicas. Los investigadores deben optimizar las condiciones de incubación para su propio tipo de célula modelo.
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Discussion
Mientras que la fotolitografía convencional es una técnica bien establecida para la realización de moldes de litografía blanda, el equipo, los materiales y las habilidades necesarias para utilizar la fotolitografía convencional no están fácilmente disponibles para la mayoría de los laboratorios. Para los laboratorios que no tienen acceso a estos recursos, hemos presentado la fabricación de cinta adhesiva como un método de creación de moldes con características relativamente simples para dispositivos de microfluidos. Este método permite que cualquier laboratorio para crear y utilizar dispositivos de microfluidos para fines de investigación con herramientas fácilmente disponibles. El método de la cinta adhesiva puede mejorarse con un bajo costo cortadora de vinilo de escritorio 31. cortadoras de vinilo de escritorio pueden aumentar la reproducibilidad, la resolución, así como la complejidad de diseño. Cada una de estas opciones, fotolitografía convencional, cortadoras de escritorio, o de fabricación de cintas adhesivas tienen diferentes capacidades y limitaciones y los investigadores deben considerar cuidadosamente qué método sería suficientepara sus necesidades.
En PDMS curado, las cadenas poliméricas largas de dimetil siloxano forman una celosía, la estructura nanoporoso que crea regiones vacías que pueden ser llenados con las moléculas de aire 27. Esta propiedad es permeable a los gases clave de nuestra forma de proveer los canales de microfluidos. Cuando se coloca en un entorno de baja presión, las moléculas de aire se eliminan del material a granel PDMS, así como los propios 25 microcanales. Cuando el PDMS se expone entonces a la presión atmosférica, el material y microcanales mayor PDMS retienen una presión negativa durante un tiempo 25, 30. Esta presión negativa extrae líquido en los microcanales de llenado automáticamente los canales de microfluidos. Esta presión negativa sigue atrayendo líquido en el canal hasta el PDMS a granel se equilibra con la presión atmosférica.
Esta técnica asistida por vacío permite patterning de proteínas y sustratos específicos sobre un sustrato de crecimiento. En este estudio, hemos sido capaces de patrón de varios sustratos diferentes y tipos de células, tanto directa como indirectamente (Tabla 1 y 2). Sin embargo, el experimentador puede necesitar para probar diferentes tiempos de incubación, las densidades de células o medios de siembra para su tipo de célula particular. Estas variables probablemente se refieren a la capacidad innata de cualquiera de la célula o sustrato para adherirse a la superficie que está siendo colocado sobre. Por ejemplo, aquí C2C12 células requieren el uso de medios libres de suero para los medios de comunicación antes de la siembra de cultivo de las células en DMEM con suero de caballo al 2%. Además, las condiciones pueden variar dependiendo de si se está modelada un cubreobjetos de vidrio o placa de Petri de plástico. Aquí, tanto funcionó bien para permitir el patrón específico de diversos tipos de células.
Una de las preocupaciones iniciales que hemos probado la utilización de esta técnica fue como exposición al vacío podría afectar la viabilidad celular. Este estudio y pestudios de la mera existencia, sin embargo, deben aliviar estas preocupaciones como hemos demostrado que el vacío tiene poco o ningún efecto en una variedad de células 30. Wang et al. previamente utilizado desgasificada irreversiblemente cámaras selladas de microfluidos para cargar células HeLa 32. Otros estudios han utilizado la siembra de células asistida por vacío para una variedad de tipos de células incluyendo las células madre humanas, las células adherentes y no adherentes, y la línea celular híbrida de hámster humano (A L) de las células de carga en los canales microfluidos 33. Además, otros investigadores han sometido las células a presiones de vacío mucho mayor en comparación con este estudio con poco o ningún efecto discernible sobre las células 33. Las burbujas que se forman durante la eliminación de aire de los microcanales tienden a congregarse en la superficie de la gota de la suspensión en la entrada. A menudo, estas burbujas no se rompen debido a la tensión superficial de la suspensión. No hemos OBSERVed una disminución notable en la viabilidad celular debido a burbujas. Además, el experimento con calceína-AM no sugiere una disminución significativa de la viabilidad celular. Debido a esto, no hemos examinado a fondo la muerte celular específicamente debido a las burbujas.
Los intentos anteriores para sustratos patrón o células a menudo se ven afectadas por problemas tales como la formación de burbujas de aire en los dispositivos de microfluidos. La formación de burbujas de aire hacía difícil inyectar líquidos fácilmente y eficientemente sin el uso de equipos o materiales que no están disponibles en la mayoría de los laboratorios. Por ejemplo, los métodos anteriores utilizan el uso de tratamiento con plasma o tratamiento corona para disminuir la hidrofobicidad de microcanales PDMS 15, 34. Aunque son eficaces, plasma y tratadores corona no están fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios. En este protocolo, se demuestra la capacidad de las células de patrón y el simple uso de sustratos labora comúnaspiradoras tory. Utilizando la técnica de fabricación de cinta adhesiva, la metodología se puede utilizar para crear canales de microfluidos PDMS a sustratos patrón o células en casi cualquier laboratorio.
Con el fin de sustratos patrón o células con el protocolo patrón de vacío, varios pasos son críticos para el patrón de éxito. En primer lugar, para fabricar el maestro de cinta adhesiva, la cinta adhesiva debe estar bien conectado a la placa de vidrio y libre de burbujas de aire. Las burbujas de aire debilitar la unión entre la cinta y el portaobjetos de vidrio y puede conducir a la cinta se desprendan una vez curado PDMS se despega del molde cinta adhesiva. Además, las burbujas de distorsionarán la geometría del canal de microfluidos haciendo que la superficie de los canales para ser no plana. Para hacer que el PDMS emitidos, de SU-8 molde, el molde SU-8 debe ser silanizada antes de la colada con PDMS. Este paso es crítico en la prevención de la unión permanente de PDMS al molde SU-8 después del curado de PDMS. Antes de sellar conformaldel canal de microfluidos PDMS a cubreobjetos de vidrio o placas de Petri de plástico, el PDMS se deben limpiar de todas las partículas de polvo. Estas partículas pueden prevenir la formación de un sello de conformación entre PDMS y de vidrio y por lo tanto evitar que la inyección de células o sustratos en el canal microfluídico. Como se indica en el protocolo anterior, la limpieza de los canales de PDMS con cinta adhesiva es crítica antes de adherir el microcanal a cubreobjetos de vidrio o placas de Petri de plástico. Finalmente, después de colocar el dispositivo en la cámara de vacío, el vacío debe ser liberado con cuidado para evitar el desplazamiento de la gota de sustrato o célula solución desde el orificio de entrada.
Si no se observa fluido que fluye en el canal microfluídico, puede haber una fuga en el canal microfluídico que evitar que el líquido que fluye en el canal. Retire el sello de PDMS, seco y limpiarlo y luego repetir el paso 4, 5 ó 6 de la técnica. Si la solución no fluye en el microcanal después de release de vacío, asegúrese de que la solución cubra completamente la entrada del microcanal. Esto se puede hacer por la solución pipeteando arriba y abajo varias veces mientras que pone en el orificio de entrada. Si el sustrato, después de la inyección en el microcanal, no adjuntar al vidrio, evaluar y determinar las condiciones óptimas de incubación necesarios para el sustrato utilizado. Si la eliminación de los PDMS emitidos desde la superficie de vidrio o placa de Petri de plástico hace que las células o sustratos estructurados para ser destruidas, utilizar un molde PDMS más delgada, sumergir los PDMS emitidos en PBS o medios de comunicación, y lenta y suavemente pelar los PDMS emitidos desde el cristal o superficie de plástico con unas pinzas.
Finalmente, BSA puede ser crítico en la disminución de la adhesión no específica de las células para el cristal de unpatterned o superficie de plástico. BSA se utiliza típicamente como un reactivo de bloqueo en el Western Blot, inmunotinción, y otras técnicas de biología molecular. Otros investigadores también han utilizado durante indirecta o directaprotocolos de modelado para reducir la adhesión celular no específica 35, 36, 37. Se encontró que la incubación del sustrato con BSA era necesario para la mayoría de tipos de células con excepción de las células de la retina salamandra. Esto puede ser debido a la naturaleza más especializada del sustrato (un anticuerpo llamado Sal-1) que se usó, así como la falta general de la adhesión celular por este tipo de células 38. En nuestras manos, BSA también no disminuyó notablemente la adherencia de las células a las zonas estampadas y sobre todo sirve para disminuir la adherencia no específica.
Si bien este método está diseñado para ser versátil y flexible en su aplicación a diferentes tipos de sustrato y células, existen varias limitaciones a este protocolo y las células compatibles y el sustrato. Debido a la naturaleza misma de modelando las células sobre una superficie, los tipos de células que esta técnica se puede aplicar a se limitan a thoSE, que son susceptibles de cualquier protocolo de patrones tales como aquellas células que son capaces de sobrevivir con más células limitado al contacto celular, así como los que pueden sobrevivir a concentraciones de células de siembra más bajas. Por ejemplo, una aplicación potencial es el patrón de células de levadura para microscopía de fuerza atómica (AFM) 39. Si bien hemos probado diversos sustratos celulares, otros sustratos no pueden trabajar con esta técnica en particular tales como los que forman geles tridimensionales. En este momento, no hemos examinado si los geles se forman adecuadamente y se quedan en la superficie del cubreobjetos de vidrio o placa de Petri de plástico después de patrones. Esta técnica es capaz de modelando formas complejas y grandes superficies. Sin embargo, no puede patrón de una gran variedad de formas separadas individuales sin interconexión de microcanales. En ausencia de microcanales interconectados, cada uno de forma individual pudiera requerir su propia entrada de toma de la técnica engorroso. Aunque no vimos ninguna falta de uniformidad en patterning de proteínas, la distribución de células modelado dentro del microcanal puede ser no uniforme. Esta falta de uniformidad puede ser debido a la distribución aleatoria de las células en suspensiones celulares, la geometría y dimensiones de los microcanales, y la viscosidad de la suspensión de células.
En el futuro, esta técnica se puede aplicar a otros tipos de sustratos y células. Por ejemplo, los geles tridimensionales tales como la matriz de la membrana basal o andamios de colágeno potencialmente pueden ser estampadas y forman utilizando PDMS canales de microfluidos. Mediante la inyección de un hidrogel en el dispositivo microfluídico, el hidrogel puede tomar en la forma del dispositivo de microfluidos y ser capaz de formar patrones complejos sin el uso de impresoras 3-D u otras tecnologías. Estos permitirían la rápida creación de andamios estructuradas con herramientas fácilmente disponibles y dispositivos de microfluidos.
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Acknowledgments
Los fondos para esta investigación fue proporcionado por la Comisión de New Jersey en la médula espinal de Investigación (NJCSCR) (a FHK), otorgar CSCR14IRG005 (a BLF), NIH subvención R15NS087501 (a CHC), y la Fundación FM Kirby (a ETA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
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