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Bioengineering

Patterning के प्रोटीन और कोशिकाओं की एक बहुमुखी विधि

Published: February 26, 2017 doi: 10.3791/55513
Automatic Translation
*1, *2, 3, 2, 3, 4
1Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Pharmacology, Physiology, and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School
* These authors contributed equally

Introduction

ऊतक इंजीनियरिंग और biosensing में, प्रोटीन और एक माइक्रोन पैमाने पर कोशिकाओं के स्थानिक संगठन को नियंत्रित करने की क्षमता है, पिछले चार दशकों से 1, 2, 3 में तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है। प्रोटीन और कोशिकाओं की सटीक स्थानिक संगठन, शोधकर्ताओं ने कोशिकाओं और कोशिकाओं के समान या विभिन्न प्रकार युक्त, सेल के विकास का मार्गदर्शन करने के लिए, और biosensors 4, 5, 6, 7, 8 के निर्माण के लिए biomolecules स्थिर करने के लिए substrates के बीच बातचीत की जांच करने की अनुमति दे दी है 9।

patterning प्रोटीन के मौजूदा तरीकों photopatterning और microcontact मुद्रण शामिल हैं। Photopatterning प्रकाश के प्रति संवेदनशील सामग्री है जो ultr के लिए जोखिम पर crosslinked है इस्तेमालएक वायलेट (यूवी) प्रकाश। पराबैंगनी प्रकाश एक photomask (गहरा क्षेत्रों पराबैंगनी प्रकाश संचरण को रोकने के साथ पारदर्शी क्षेत्रों से मिलकर) के निर्देश पर विशिष्ट क्षेत्रों जो तब biomaterials या कोशिकाओं 10, 11 के बाद कुर्की के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में crosslinking का कारण बनता है। हालांकि यह योजना बहुत सटीक है और संस्कृति की सतह की स्थलाकृति के सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, यह यूवी संवेदनशील biomolecules कि पराबैंगनी विकिरण 12 से नमूनों की जा सकती तक सीमित है। Microcontact मुद्रण विशिष्ट प्रोटीन patterning 13, 14 का एक लोकप्रिय तरीका है। इस विधि में, एक पाली डाइमिथाइल siloxane (PDMS) स्टाम्प चुना biomolecular सब्सट्रेट के एक समाधान में भिगो जा रहा से पहले सतह संशोधन अभिकर्मकों की एक किस्म के साथ व्यवहार किया जाता है। यह तो धीरे एक गिलास coverslip या अन्य सतह इस प्रकार संस्कृति सतह पर "मुद्रांकन" बायोमोलिक्यूल पर दबाया जाता है। होwever, मुद्रांकन सामग्री के प्रकार है कि PDMS स्टाम्प 15 सतह के लिए biomolecules के wettability के रूप में भी स्थानांतरित किया जा सकता तक सीमित है।

कोशिकाओं के प्रत्यक्ष patterning और अधिक कठिन हो सकता है और इस तरह के switchable substrates, स्टैंसिल आधारित विधियों, या विशेष सेल आसंजन अणुओं 16, 17 के साथ patterning के रूप में जटिल तरीकों पर निर्भर करता है सकते हैं। इन विधियों संगत कोशिका आसंजन substrates की कमी के कारण पैटर्न कोशिकाओं करने की क्षमता में सीमित कर रहे हैं, इस प्रक्रिया की असंगति संवेदनशील जैविक कोशिकाओं और बाधाओं, patterning reproducing में विसंगति, और प्रक्रिया की जटिलता के साथ काम करने के लिए। उदाहरण के लिए, switchable substrates के साथ, कस्टम substrates पराबैंगनी प्रकाश और गर्मी प्रक्रिया 17 में इस्तेमाल किया, के लिए जोखिम पर गिरावट के बिना विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को उनके पालन स्विच करने के लिए, हर कोशिका प्रकार के लिए तैयार होने की जरूरत < समर्थन वर्ग = "xref"> 18, 19, 20। स्टैंसिल आधारित patterning तरीकों पैटर्न कोशिकाओं के लिए उनकी क्षमता में बहुमुखी हैं; हालांकि, यह प्रयोग 16, 21 के लिए उपयुक्त मोटाई पर PDMS स्टेंसिल निर्माण करने के लिए मुश्किल है। 1) microfluidic चैनलों के निर्माण में आसानी और 2) कई अलग कक्षों और substrates के लिए उपयुक्तता: PDMS microfluidic चैनलों में कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के रूप में कुछ फायदे हैं। हालांकि, प्लाज्मा सफाई, या अन्य तरीकों का उपयोग हवा के बुलबुले कम करने के लिए बिना PDMS की hydrophobicity के कारण इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान एयर बबल कब्जा की प्रचलित मुद्दा है, यह मुश्किल लगातार पर कांच या प्लास्टिक की सतहों 21 नमूनों की कोशिकाओं को बनाने के लिए बनाता है।

इस काम केशिका micromolding 22, 23 पर फैलता है,लड़की = "xref"> 24, 25, 26 और microchannels में प्रोटीन और सेल निलंबन इंजेक्षन करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट। यहां इस्तेमाल किया विधि substrates के patterning और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के दोनों प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष patterning को दर्शाता है। इस तकनीक PDMS की उच्च hydrophobicity पर काबू पा और PDMS 27 की गैस पारगम्यता का लाभ लेने से या तो substrates या कोशिकाओं के इंजेक्शन के दौरान बुलबुले की उपस्थिति समाप्त। इस पत्र में कई अलग अलग substrates और प्रकार की कोशिकाओं के साथ तकनीक के उपयोग को दर्शाता है। लेख में यह भी पारंपरिक photolithography के साथ ही एक सरल और कम लागत वाली चिपकने वाला टेप विधि संसाधन में उपयोगी सीमित सेटिंग्स 28, 29 का उपयोग कर नरम लिथोग्राफी के लिए नए नए साँचे के निर्माण पर प्रकाश डाला गया।

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Protocol

नोट: उपयोग करने से पहले कृपया सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त रसायनों में से कुछ विषाक्त और कैंसर हैं। जब विषाक्त या एसिड / आधार सामग्री का उपयोग कर सभी उचित सुरक्षा प्रथाओं (धूआं हुड, glovebox) और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पैंट पूरी लंबाई, बंद पैर के जूते) का उपयोग करें।

Photolithography का उपयोग कर नरम लिथोग्राफी के लिए मास्टर Molds के निर्माण 1.

  1. एक कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) ड्राइंग उपकरण का उपयोग microchannel के लेआउट ड्रा।
  2. लेजर मुखौटा लेखक का उपयोग कर एक खाली मुखौटा प्लेट पर लेआउट प्रिंट।
  3. isopropanol और एक नाइट्रोजन हवा बंदूक के साथ सूखी द्वारा पीछा किया एसीटोन के साथ एक 4 इंच सिलिकॉन वेफर कुल्ला सुनिश्चित करें कि कोई विलायक वेफर पर छोड़ दिया है।
  4. 5 मिनट के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर पाक द्वारा वेफर निर्जलीकरण।
  5. microchannels के वांछित ऊंचाई के लिए बनाया गया एक नकारात्मक photoresist का चयन करें। एफया उदाहरण के लिए, 50 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ microchannels प्राप्त करने के लिए नकारात्मक photoresist SU-8 50 का उपयोग करें।
  6. वेफर कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति दें, और फिर एक स्पिन coater के चक पर वेफर संरेखित।
  7. वेफर के केंद्र पर नकारात्मक photoresist की 4 एमएल (1 एमएल / इंच वेफर के व्यास) बग़ैर।
  8. एक दो कदम स्पिन एक स्पिनर का उपयोग कर चक्र के साथ कोट वेफर स्पिन। सबसे पहले, 10 एस के लिए 100 rpm / एस के एक तेजी के साथ 500 आरपीएम की एक फैल चक्र लागू होते हैं। फिर एक वेफर पर photoresist की एक 50 माइक्रोन कोटिंग प्राप्त करने के लिए 30 एस के लिए 300 rpm / एस 2 के एक तेजी के साथ 2,000 आरपीएम की एक स्पिन चक्र लागू होते हैं।
  9. शीतल सेंकना निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक गर्म थाली पर दो चरणों में वेफर। photoresist की एक 50 माइक्रोन कोटिंग के लिए, पहले पूर्व सेंकना 6 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर वेफर और फिर तुरंत 20 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर वेफर सेंकना पोस्ट करने के लिए गर्म थाली के तापमान को रैंप।
  10. वेफर कमरे के तापमान को शांत करने के लिए और फिर से लोड करने की अनुमति देंलिथोग्राफी मंच पर वफ़र।
  11. मुखौटा aligner का उपयोग कर वेफर पर नकाब संरेखित और 146 एस के लिए 1.5 मेगावाट / 2 सेमी की तीव्रता में 220 एमजे की कुल यूवी खुराक लागू करने के लिए पराबैंगनी प्रकाश के वेफर बेनकाब (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) / 2 सेमी एक के लिए आवश्यक photoresist की 50 माइक्रोन मोटी परत।
  12. एक गर्म थाली पर दो चरणों में वेफर को पद जोखिम सेंकना लागू करें। photoresist की एक 50 माइक्रोन कोटिंग के लिए, पहले पूर्व सेंकना 1 मिनट और तुरंत के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर वेफर अप गर्म थाली तापमान 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर यह सेंकना पोस्ट करने के लिए रैंप।
  13. SU-8 डेवलपर में वेफर जलमग्न और धीरे जब तक सुविधाओं वेफर पर स्पष्ट हो झटकों से वेफर में विकास करना। 50 माइक्रोन मोटी photoresist के लिए ~ 6 मिनट के लिए वेफर का विकास करना।
  14. isopropanol और इथेनॉल के साथ अतिरिक्त डेवलपर बंद कुल्ला, तो एक नाइट्रोजन हवा बंदूक के साथ वेफर सूखी।
  15. हार्ड 15 मिनट के लिए 150 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर सिलिकॉन वेफर सेंकना।
  16. इसे रखोsilanizing एजेंट के 25 μL के साथ एक desiccator में वेफर tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane।
    नोट: silanizing एजेंट संक्षारक है, इस प्रकार एक एसिड / आधार धूआं हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ, (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पैंट पूरी लंबाई, बंद पैर के जूते)।
  17. 5 मिनट के लिए वैक्यूम लागू करें और वैक्यूम जारी करने के बिना 30 मिनट के लिए silane की वाष्प को वेफर बेनकाब।
  18. एक उपयुक्त आकार पेट्री डिश में वेफर स्थानांतरण।

2. नरम लिथोग्राफी के लिए मास्टर molds के निर्माण के लिए चिपकने वाला टेप का उपयोग

  1. एक सीएडी ड्राइंग उपकरण का उपयोग microchannel के लेआउट ड्रा और सफेद कागज पर ड्राइंग मुद्रित।
  2. एक गिलास स्लाइड काफी बड़े isopropanol साथ डिजाइन को समायोजित करने के लिए और फिर एक हवाई बंदूक के साथ स्लाइड सूखी साफ।
  3. साफ गिलास स्लाइड पर चिपकने वाला टेप संलग्न। फंसाने के लिए सावधान नहीं किसी भी हवाई बुलबुले रहें।
  4. जीएलए के पक्ष टेपएसएस डिजाइन के साथ कागज पर स्लाइड, टेप पक्ष के साथ।
  5. एक छुरी का प्रयोग एक संदर्भ के रूप में कागज डिजाइन का उपयोग कर गिलास स्लाइड पर टेप में कटौती और फिर गिलास स्लाइड के अवांछित क्षेत्रों से टेप छील करने के लिए।
  6. एक एयर गन के साथ isopropanol के साथ कांच स्लाइड और फिर सूखी कुल्ला। 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में कांच स्लाइड सेंकना।
  7. धीरे एक रबर रोलर के साथ टेप पर रोल हवाई बुलबुले को दूर करने और स्लाइड कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देने के लिए।

3. PDMS उपकरणों के नरम लिथोग्राफी निर्माण

  1. PDMS elastomer और उसके इलाज एजेंट मिश्रण 10 के अनुपात में: 1 (डब्ल्यू: डब्ल्यू), मिश्रण सख्ती हलचल, और फिर इसे एक निर्वात चैम्बर में रखकर मिश्रण देगास तक कोई हवाई बुलबुले के मिश्रण में दिखाई देते हैं।
  2. सभी हवाई बुलबुले गायब हो जाते हैं जब तक एक ~ 2 मिमी PDMS की मोटी परत और देगास प्राप्त करने के लिए एक पेट्री डिश में एक silanized सिलिकॉन मोल्ड या चिपकने वाला टेप मोल्ड पर मिश्रण डालो।
  3. एक ओवन में PDMS इलाज2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. एक छुरी का प्रयोग PDMS परत कटौती करने के लिए कम से कम 5 मिमी सुविधाओं से दूर है और फिर ढालना चिमटी से नोचना का उपयोग कर बंद ठीक PDMS छील।
  5. एक 1 मिमी बायोप्सी के साथ एक एकल प्रवेश छेद अधिमानतः microchannels के एक नेटवर्क के अंत में microchannel पर कहीं भी पंच के रूप में चित्रा 2A में देखा और 4 बी पंच।
  6. PDMS चिपकने वाला टेप के साथ डाली धूल कणों डिवाइस पर adsorbed दूर करने के लिए साफ करें। 70% इथेनॉल बाँझ विआयनीकृत (डीआई) पानी के बाद की एक समाधान के साथ rinsing द्वारा PDMS microchannel डिवाइस (PDMS डाली) जीवाणुरहित, और 30 मिनट के लिए यूवी को बेनकाब।
  7. उपयोग करें जब तक एक बाँझ पेट्री डिश में बाँझ PDMS डिवाइस रखें।

4. सब्सट्रेट patterning के

  1. बाँझ चिमटी का उपयोग कर डाली PDMS एक बाँझ गिलास coverslip या पेट्री डिश पर रखें और चिमटी की नोक का उपयोग कर कोमल दबाव लागू होते हैं।
    नोट: PDMS डाली जीएल के साथ एक conformal लेकिन प्रतिवर्ती मुहर बनाता हैगधा coverslip या पेट्री किसी भी चिपकने के उपयोग के बिना microchannels बनाने पकवान।
  2. पूरी तरह से इनलेट छेद को कवर इनलेट पर सब्सट्रेट समाधान की - (40 μL 20) एक छोटी बूंद रखें। पैटर्न पाली-डी lysine (पीडीएल) microchannels के प्रवेश पर सोडियम tetraborate बफर में पीडीएल की एक 20 μL छोटी बूंद रखकर।
  3. 10 मिनट के लिए (जैविक प्रयोगशालाओं में वैक्यूम घर के बराबर), और हवा के बुलबुले के रूप में चैनल से बाहर आने का निरीक्षण ~ 254 mmHgA की एक निर्वात में पेट्री डिश में डाल दिया।
  4. वैक्यूम रिलीज और सब्सट्रेट समाधान microchannel में बह निरीक्षण करते हैं।
  5. सब्सट्रेट पालन के लिए उपयुक्त परिस्थितियों में पकवान सेते हैं। टेबल्स 1 और ऊष्मायन स्थितियों के लिए 2 (इन सब्सट्रेट के आधार पर बदलती) देखें। पीडीएल patterning के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  6. ध्यान से बाँझ चिमटी का उपयोग PDMS स्टाम्प छील और डि पानी के साथ तीन बार गिलास coverslip पर पैटर्न धो लें। डिश या गिलास coverslip को कवर किया और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सेते पेट्री डिश के लिए एक 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) समाधान जोड़ें।
    नोट: यह uncoated क्षेत्रों में गैर विशिष्ट पालन कम हो जाएगा।
  7. 1% बीएसए समाधान है, और नमूनों सब्सट्रेट बंद महाप्राण अब उपयोग करने के लिए तैयार है।

5. प्रकोष्ठों के अप्रत्यक्ष patterning के

  1. सीरम मुक्त संस्कृति के माध्यम में सेल निलंबन तैयार करें। सेल प्रकार और सेल घनत्व 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं।
  2. नमूनों पेट्री डिश के लिए सेल निलंबन जोड़ें और पूरी तरह से सेल निलंबन में नमूनों क्षेत्र डूब।
  3. 15 मिनट के लिए एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश सेते कोशिकाओं के नमूनों सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए।
  4. पेट्री डिश से अतिरिक्त सेल निलंबन Aspirate और जबकि धीरे 10 एस के लिए मिलाते हुए स्वाधीन कोशिकाओं को हटाने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ तीन बार नमूनों कोशिकाओं धो लें।
  5. एक जोड़ेनमूनों सेल संस्कृतियों के लिए ppropriate संस्कृति के माध्यम से और एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की कोशिकाओं को सेते हैं।

6. कोशिकाओं के प्रत्यक्ष patterning के

नोट: इस तकनीक चरण 5 में हालांकि 5. चरण में वर्णित है, के विपरीत अप्रत्यक्ष सेल patterning के लिए एक विकल्प है, इस तकनीक में कोशिकाओं पर साथ या सब्सट्रेट कोटिंग के बिना टिशू कल्चर सतहों नमूनों हैं।

  1. डि पानी के द्वारा पीछा इथेनॉल के 70% की एक समाधान के साथ rinsing द्वारा microfluidic युक्ति जीवाणुरहित।
  2. 1% बीएसए का एक समाधान करने के लिए PDMS कोशिका आसंजन को रोकने के लिए रात भर डिवाइस लेना।
  3. कमरे के तापमान पर डिवाइस सूखी और टिशू कल्चर का इलाज पेट्री डिश के तल को देते हैं।
  4. सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया में सेल निलंबन तैयार करें। सेल प्रकार और सेल घनत्व 2 टेबल में सूचीबद्ध हैं।
  5. सेल निलंबन की - (8 μL 4), भरने के लिए पर्याप्त जगह एक छोटी बूंदmicrochannels, प्रवेश पर पूरी तरह से इनलेट छेद को कवर।
  6. 10 मिनट के लिए एक निर्वात में पेट्री डिश में डाल दिया और हवा के बुलबुले के रूप में चैनल से बाहर आने का पालन। वैक्यूम रिलीज और सेल निलंबन microchannel में बह निरीक्षण करते हैं।
  7. एक मशीन ऊष्मायन शर्तों के अनुसार सेल आसंजन को बढ़ावा देने में पेट्री डिश सेते तालिका 2 में उल्लेख किया है (सेल नमूनों के प्रकार पर निर्भर करती है)। PDMS डिवाइस जलमग्न पेट्री डिश के लिए पीबीएस जोड़ें।
  8. पील PDMS ध्यान से चिमटी के साथ पेट्री डिश बंद और पीबीएस के साथ पैटर्न धो लें। पेट्री डिश के लिए सेल संस्कृति मीडिया जोड़ें और इनक्यूबेटर में सेल संस्कृति जगह है।

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Representative Results

इस विधि प्रोटीन और लगभग सभी जैविक प्रयोगशालाओं में 10 माइक्रोन और उपकरण उपलब्ध के रूप में छोटे आयामों के साथ गतिरोध का microfluidic चैनलों का उपयोग कर एक बार मास्टर मोल्ड बना है कोशिकाओं की अप्रत्यक्ष patterning की patterning अनुमति देता है। इस तकनीक PDMS microfluidic पारंपरिक नरम photolithography, या PDMS microfluidic चिपकने वाला टेप निर्माण (चित्रा 1), 28, 29 के साथ बनाया चैनलों के साथ उपयोग कर बनाई गई चैनलों के साथ उपयोग किया जा सकता है। हम पहले से फोटोरिसेप्टर 4, 30 में अक्षतंतु मार्गदर्शन के मूल्यांकन के लिए neuronal कोशिकाओं के अप्रत्यक्ष patterning में इस प्रक्रिया के उपयोग का प्रदर्शन किया है, और अब अलग-अलग मूल के कई अतिरिक्त प्रकार की कोशिकाओं में इसके उपयोग का प्रदर्शन किया है। भ्रूण चूहे cortical न्यूरॉन्स पाली डी lysine (पीडीएल) की तर्ज पर और laminin सतहों सामान्य adherenc का प्रदर्शननमूनों क्षेत्रों और पीडीएल और laminin धारियों (चित्रा 3) के साथ विकास के लिए ई। C2C12 myoblast सेल लाइनों भी नमूनों क्षेत्र का पालन करना और multinucleated myotubes (चित्रा 3 बी) में संलयन प्रदर्शित करता है। हम यह भी प्रत्यक्ष सेल patterning के लिए इस तकनीक के रूप में चित्रा 4 में fibroblasts के साथ देखा ढाल लिया है। जैसा कि पहले बताया, इस प्रत्यक्ष सेल patterning विधि सेल अस्तित्व 30 पर कोई प्रतिकूल प्रभाव दिखाया। चर कहा गया है कि सेल प्रकार के सफल प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से patterning के लिए नेतृत्व तालिका 1 और 2 में सूचीबद्ध हैं। इस प्रकार भविष्य में, शोधकर्ताओं पैटर्न कोशिकाओं के लिए इस तकनीक का उपयोग और उनकी विशिष्ट patterning से संबंधित घटना खोज कर सकते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: नरम लिथोग्राफी द्वारा मोल्ड का निर्माण। वाम: PhotolithographY प्रक्रिया। SU-8 एक सिलिकॉन वेफर पर लेपित स्पिन, पराबैंगनी विकिरण के संपर्क में हैं, और अतिरिक्त SU-8 दूर करने के लिए विकसित किया है। अधिकार: चिपकने वाला टेप निर्माण की प्रक्रिया। चिपकने वाला टेप एक साफ कांच स्लाइड से जुड़ा हुआ है, एक छुरी के साथ कटौती, और अतिरिक्त टेप ध्यान से निकाल दिया जाता है। PDMS डाली तो मुलायम लिथोग्राफी का उपयोग कर प्रत्येक मोल्ड से निर्मित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: सब्सट्रेट patterning के लिए एक PDMS डिवाइस का उदाहरण है। (क) substrates के microfluidic patterning के लिए इस्तेमाल किया इनलेट साथ microfluidic डाली PDMS। इनलेट microchannels के एक छोर पर बाहर मुक्का मारा गया था। (ख) microfluidic चैनल के रूप में चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत देखा। Microfluidic चैनलों लंबाई में 15 मिमी, 20 माइक्रोन चौड़ा, एक हैंघ 200 माइक्रोन से अलग कर दिया। चित्रा 2 IOP प्रकाशन से अनुमति के साथ reproduced है। सभी अधिकार 30 सुरक्षित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: अप्रत्यक्ष सेल patterning। (क) सहायता वैक्यूम प्रोटीन patterning प्रक्रिया। PDMS microfluidic चैनल डिवाइस एक पेट्री डिश से जुड़ा हुआ है, सब्सट्रेट समाधान इनलेट में भरी हुई है, वैक्यूम संक्षेप में चैम्बर के लिए लागू किया जाता है और जारी की है, PDMS डिवाइस निकाल दिया जाता है, पैटर्न धोया जाता है, और उपयोग करने के लिए तैयार है। (ख) भ्रूण cortical न्यूरॉन्स चूहे एक नमूनों पीडीएल और laminin सब्सट्रेट के साथ एक coverslip पर वरीयता प्राप्त। (ग) C2C12 myoblast सेल लाइनों नमूनों पीडीएल और laminin पर हो। आंकड़े 3 ए और 3 सी पी के साथ प्रतिलिपि हैंIOP प्रकाशन से ermission। सभी अधिकार 30 सुरक्षित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: डायरेक्ट सेल patterning। (एक - सी) डायरेक्ट सेल patterning के माध्यम से नमूनों Fibroblasts। (क) microfluidic चैनल डिवाइस चिपकने वाला टेप लिथोग्राफी का उपयोग कर गढ़े। (ख) सहायता वैक्यूम patterning तकनीक का उपयोग कर fibroblast सेल निलंबन के साथ भरने के बाद microfluidic चैनलों। (ग) microfluidic युक्ति को हटाने के बाद fibroblasts। (घ) Calcein-AM microfluidic patterning के बाद fibroblasts की धुंधला हो जाना। (ई) चरण विपरीत microfluidic patterning के बाद fibroblasts की छवि। (च - जी 30 सुरक्षित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अप्रत्यक्ष सेल patterning सब्सट्रेट प्रोटीन ऊष्मायन शर्तों सेल घनत्व कोशिका आसंजन की अवधि
PC12 कोलेजन -1 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे 5 एक्स 10 6 / एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे
fibroblast कोलेजन -1 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे 5 एक्स 10 6 / एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे
C2C12 पीडीएल + Laminin 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस पर, पीबीएस धोने रात भर 2 एक्स 10 6 / एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट
भ्रूण चूहे cortical न्यूरॉन्स पीडीएल + Laminin 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस पर, पीबीएस धोने रात भर 2 एक्स 10 6 / एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट
समन्दर रेटिना न्यूरॉन्स साल-1 रात भर में 10 डिग्री सेल्सियस एन / ए 10 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे

तालिका 1: अप्रत्यक्ष सेल patterning शर्तें। ऐसे सब्सट्रेट प्रकार, समय, तापमान, और सेल घनत्व विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के लिए के रूप में ऊष्मायन शर्तों की सूची। शोधकर्ताओं ने अपने मॉडल substrates और सेल प्रकार के लिए ऊष्मायन शर्तों का अनुकूलन करना चाहिए। साल-1 एंटीबॉडी समन्दर रेटिना न्यूरॉन्स विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया सब्सट्रेट है।

प्रत्यक्ष सेल patterning सब्सट्रेट सेल घनत्व सेल आसंजन समय
PC12 कोलेजन -1 6 एक्स 10 6 / एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे
fibroblast कोलेजन -1 6 एक्स 10 6 / एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे
C2C12 पीडीएल + Laminin 2 एक्स 10 6 / एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट
भ्रूण चूहे cortical न्यूरॉन्स पीडीएल + Laminin 2 एक्स 10 6 / एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट
समन्दर रेटिना न्यूरॉन्स साल-1 एन / ए 10 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे

तालिका 2: डायरेक्ट सेल patterning शर्तें। जैसे तापमान, समय, और ठेठ प्रकार की कोशिकाओं के लिए सेल घनत्व के रूप में ऊष्मायन शर्तों की सूची। शोधकर्ताओं ने अपने मॉडल सेल प्रकार के लिए ऊष्मायन शर्तों का अनुकूलन करना चाहिए।

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Discussion

जबकि पारंपरिक photolithography नरम लिथोग्राफी, उपकरण, सामग्री, और पारंपरिक photolithography का उपयोग करने के लिए आवश्यक कौशल के लिए नए नए साँचे के निर्माण के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है सबसे प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं हैं। इन संसाधनों के उपयोग के बिना प्रयोगशालाओं के लिए, हम microfluidic उपकरणों के लिए अपेक्षाकृत सरल सुविधाओं के साथ नए नए साँचे बनाने की एक विधि के रूप में चिपकने वाला टेप निर्माण प्रस्तुत किया है। इस विधि के किसी भी प्रयोगशाला बना सकते हैं और आसानी से उपलब्ध उपकरणों के साथ अनुसंधान प्रयोजनों के लिए microfluidic उपकरणों का उपयोग करने की अनुमति देता है। चिपकने वाला टेप विधि एक कम लागत डेस्कटॉप vinyl कटर 31 के साथ सुधार किया जा सकता है। डेस्कटॉप vinyl कटर reproducibility, संकल्प, साथ ही लेआउट जटिलता में वृद्धि हो सकती है। इन विकल्पों में, पारंपरिक photolithography, डेस्कटॉप कटर, या चिपकने वाला टेप निर्माण के प्रत्येक अलग क्षमताओं और सीमाओं और शोधकर्ताओं ने किया है ध्यान से विचार करना चाहिए जो विधि पर्याप्त होगाउनकी जरूरतों के लिए।

ठीक PDMS में, डाइमिथाइल siloxane की लंबी बहुलक श्रृंखला एक जाली, nanoporous संरचना है जो खाली क्षेत्रों हवा अणुओं 27 से भरा जा सकता है कि बनाता है के रूप में। इस गैस पारगम्य संपत्ति microfluidic चैनलों को भरने के बारे में हमारी विधि की कुंजी है। जब एक कम दबाव के माहौल में रखा, हवा अणुओं PDMS थोक सामग्री के रूप में अच्छी तरह से खुद को microchannels 25 से हटा रहे हैं। PDMS तो वायुमंडलीय दबाव के संपर्क में है, PDMS थोक माल और microchannels कुछ समय के 25, 30 के लिए एक नकारात्मक दबाव बरकरार रहती है। यह नकारात्मक दबाव microchannels स्वचालित रूप से microfluidic चैनलों भरने में तरल खींचता है। यह नकारात्मक दबाव जब तक थोक PDMS वायुमंडलीय दबाव के साथ equilibrates चैनल में तरल आकर्षित करने के लिए जारी है।

इस वैक्यूम की सहायता तकनीक patterni के लिए अनुमति देता हैएक विकास सब्सट्रेट पर विशिष्ट प्रोटीन और substrates की एनजी। इस अध्ययन में, हम कई अलग अलग substrates और सेल प्रकार दोनों सीधे और परोक्ष रूप से पैटर्न करने में सक्षम थे (तालिका 1 और 2)। हालांकि, प्रयोगकर्ता को अपने विशेष सेल प्रकार के लिए अलग ऊष्मायन बार, सेल घनत्व, या बोने मीडिया परीक्षण करने के लिए आवश्यकता हो सकती है। इन चर संभावना सतह पर रखा जा रहा है का पालन करने के लिए या तो सेल या सब्सट्रेट की जन्मजात क्षमता से संबंधित हैं। उदाहरण के लिए, यहाँ C2C12 कोशिकाओं 2% घोड़े सीरम के साथ DMEM में संवर्धन कोशिकाओं से पहले बोने मीडिया के लिए सीरम मुक्त मीडिया के उपयोग की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, की स्थिति है कि क्या एक गिलास coverslip या प्लास्टिक पेट्री डिश नमूनों किया जा रहा है पर आधारित भिन्न हो सकते हैं। इधर, दोनों अच्छी तरह से काम के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के विशिष्ट patterning के लिए अनुमति देने के लिए।

प्रारंभिक चिंताओं जबकि इस तकनीक का उपयोग एक हम थे कैसे वैक्यूम करने के लिए जोखिम सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता था। इस अध्ययन और पीछला अध्ययन, हालांकि, उन चिंताओं के रूप में हम पता चला है वैक्यूम 30 कोशिकाओं की एक किस्म पर कोई प्रभाव को कम किया है कि कम करना चाहिए। वांग एट अल। पहले से उपयोग किया अचल microfluidic कक्षों को सील degassed हेला कोशिकाओं 32 लोड करने के लिए। अन्य अध्ययनों से microfluidic चैनलों 33 में लोड करने के लिए मानव स्टेम सेल, पक्षपाती और गैर पक्षपाती कोशिकाओं, और मानव-हम्सटर संकर सेल लाइन (ए एल) कोशिकाओं सहित सेल प्रकार की एक किस्म के लिए वैक्यूम की सहायता सेल बोने का इस्तेमाल किया है। इसके अलावा, अन्य शोधकर्ताओं कोशिकाओं बहुत बड़ा निर्वात के दबाव की तुलना में इस मौजूदा अध्ययन करने के लिए थोड़ा के साथ कोशिकाओं 33 पर कोई प्रत्यक्ष प्रभाव के अधीन है। microchannel से हवा को हटाने के दौरान गठित बुलबुले प्रवेश पर निलंबन की छोटी बूंद की सतह पर एकत्र होते हैं। अक्सर इन बुलबुले निलंबन की सतह तनाव के कारण टूटना नहीं है। हम observ नहीं किया हैबुलबुले के कारण सेल व्यवहार्यता में एक उल्लेखनीय कमी एड। इसके अलावा, Calcein-AM साथ प्रयोग सेल व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण कमी का सुझाव नहीं है। इस वजह से, हम अच्छी तरह से कोशिका मृत्यु विशेष बुलबुले के कारण की जांच नहीं की है।

पैटर्न substrates या कोशिकाओं के लिए पिछले प्रयास अक्सर ऐसे microfluidic उपकरणों में हवा के बुलबुले के गठन के रूप में समस्याओं से ग्रस्त थे। हवा के बुलबुले के गठन के लिए यह मुश्किल उपकरण या सामग्री है कि ज्यादातर प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हैं के उपयोग के बिना आसानी से और कुशलता से तरल पदार्थ इंजेक्षन करने के लिए बनाया है। उदाहरण के लिए, पिछले विधियों प्लाज्मा उपचार या प्रभामंडल उपचार के उपयोग के लिए उपयोग किया PDMS microchannels 15, 34 के hydrophobicity कम करने के लिए। जबकि प्रभावी, प्लाज्मा और कोरोना treaters सबसे प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध नहीं हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम तो सिर्फ आम प्रयोगशाला का उपयोग कर पैटर्न कोशिकाओं और substrates के लिए क्षमता का प्रदर्शनइतिहास वैक्युम। चिपकने वाला टेप निर्माण तकनीक का उपयोग करना, कार्यप्रणाली लगभग किसी भी प्रयोगशाला में पैटर्न substrates या कोशिकाओं के लिए PDMS microfluidic चैनलों बनाने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

पैटर्न substrates या वैक्यूम patterning प्रोटोकॉल के साथ कोशिकाओं के लिए आदेश में, कई कदम सफल patterning के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, चिपकने वाला टेप मास्टर बनाना, चिपकने वाला टेप पूरी तरह से कांच स्लाइड से जुड़ी है और हवा के बुलबुले से मुक्त होना चाहिए। हवा के बुलबुले टेप और गिलास स्लाइड के बीच बंधन को कमजोर और जब ठीक PDMS चिपकने वाला टेप ढालना से खुली है से खुली जा रही टेप करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसके अलावा, बुलबुले microfluidic चैनल चैनलों की सतह के कारण गैर-तलीय होने की ज्यामिति की विकृत करेंगे। PDMS SU-8 ढालना से डाली बनाने के लिए, SU-8 ढालना PDMS के साथ कास्टिंग से पहले silanized किया जाना चाहिए। यह कदम PDMS के इलाज के बाद SU-8 मोल्ड करने के लिए PDMS की स्थायी संबंधों को रोकने में महत्वपूर्ण है। conformal सील करने से पहलेकांच coverslips या प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए PDMS microfluidic चैनल की, PDMS सब धूल के कणों की साफ किया जाना चाहिए। इन कणों PDMS और कांच के बीच एक conformal मुहर के गठन को रोकने और इस तरह microfluidic चैनल में कोशिकाओं या substrates के इंजेक्शन रोक सकता है। जैसा कि ऊपर प्रोटोकॉल में कहा गया है, चिपकने वाला टेप के साथ PDMS चैनलों की सफाई कांच coverslips या प्लास्टिक पेट्री डिश को microchannel पालन करने से पहले महत्वपूर्ण है। अंत में, निर्वात चैम्बर में डिवाइस रखने के बाद, वैक्यूम धीरे इनलेट छेद से सब्सट्रेट या सेल समाधान की छोटी बूंद के विस्थापन को रोकने के लिए जारी किया जाना चाहिए।

कोई तरल पदार्थ microfluidic चैनल में बह मनाया जाता है, वहाँ microfluidic चैनल जो चैनल में बहने से रोका जा सके तरल में एक रिसाव हो सकता है। PDMS स्टाम्प निकालें, सूखी और यह साफ है और फिर तकनीक के चरण 4, 5, 6 या दोहराएँ। समाधान rele के बाद microchannel में प्रवाह नहीं हैवैक्यूम के एएसई, यह सुनिश्चित करें कि समाधान पूरी तरह से microchannel के प्रवेश द्वार को कवर है। यह समाधान ऊपर और नीचे pipetting कई बार जबकि यह इनलेट छेद में डालने के द्वारा किया जा सकता है। सब्सट्रेट, तो microchannel में इंजेक्शन लगाने के बाद, कांच के लिए देते हैं और मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया सब्सट्रेट के लिए आवश्यक इष्टतम ऊष्मायन शर्तों का निर्धारण नहीं करता। अगर नमूनों कोशिकाओं या substrates नष्ट किया जा करने का कारण बनता PDMS कांच की सतह या प्लास्टिक पेट्री डिश से डाली हटाने, एक पतली PDMS कलाकारों का उपयोग करें, PDMS पीबीएस या मीडिया में डाली डूब, और धीरे धीरे और धीरे PDMS कांच से डाली छील चिमटी के साथ या प्लास्टिक की सतह।

अंत में, बीएसए या तो unpatterned कांच या प्लास्टिक की सतह के लिए कोशिकाओं की अविशिष्ट आसंजन को कम करने में महत्वपूर्ण हो सकता है। बीएसए आम तौर पर पश्चिमी सोख्ता, immunostaining, और अन्य आणविक जीव विज्ञान तकनीक में एक अवरुद्ध अभिकर्मक के रूप में प्रयोग किया जाता है। अन्य शोधकर्ताओं ने यह भी अप्रत्यक्ष या प्रत्यक्ष के लिए उपयोग किया है यहpatterning प्रोटोकॉल अविशिष्ट कोशिका आसंजन 35, 36, 37 में कमी करने के लिए। हमने पाया बीएसए के साथ सब्सट्रेट की कि ऊष्मायन समन्दर रेटिना की कोशिकाओं को छोड़कर सबसे अधिक प्रकार की कोशिकाओं के लिए जरूरी हो गया था। इस सब्सट्रेट के अधिक विशिष्ट प्रकृति की वजह से हो सकता है (एक एंटीबॉडी साल -1 कहा जाता है) कि इस सेल प्रकार 38 से कोशिका आसंजन की सामान्य कमी के रूप में भी इस्तेमाल किया गया था। हमारे हाथ में, बीएसए भी काफ़ी कोशिकाओं के पालन के नमूनों क्षेत्रों के लिए कम नहीं था और मुख्य रूप से अविशिष्ट पालन कम करने के लिए कार्य किया।

इस विधि बहुमुखी और विभिन्न सब्सट्रेट और प्रकार की कोशिकाओं के लिए अपने आवेदन में लचीला होना करने के लिए बनाया गया है, वहीं इस प्रोटोकॉल और संगत कोशिकाओं और सब्सट्रेट करने के लिए कई सीमाएं हैं। एक सतह पर कोशिकाओं patterning के स्वभाव की वजह से, सेल प्रकार है कि इस तकनीक को लागू किया जा सकता है यद्यपि को सीमित कर रहे हैं करने के लिएएसई जो इस प्रकार की उन कोशिकाओं है कि उन है कि कम सेल बोने सांद्रता में जीवित रह सकते हैं और साथ ही सेल से संपर्क करने के लिए और अधिक सीमित सेल के साथ जीवित करने में सक्षम हैं के रूप में किसी भी patterning प्रोटोकॉल के लिए उत्तरदायी हैं। उदाहरण के लिए, एक संभावित आवेदन परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) 39 के लिए खमीर कोशिकाओं के patterning है। हम कई अलग अलग सेल substrates का परीक्षण किया है, वहीं अन्य substrates उन है कि तीन आयामी जैल फार्म के रूप में इस विशेष तकनीक के साथ काम नहीं कर सकते। इस समय, हम जांच नहीं की है, तो जैल ठीक से फार्म और कांच या प्लास्टिक coverslip पेट्री डिश patterning के बाद की सतह पर रहते हैं। इस तकनीक जटिल आकार और बड़े क्षेत्रों patterning के लिए सक्षम है। हालांकि, यह microchannels परस्पर बिना पैटर्न नहीं अलग-अलग अलग आकार की एक सरणी कर सकते हैं। परस्पर microchannels के अभाव में, प्रत्येक व्यक्ति के आकार अपने आप ही इनलेट तकनीक बोझिल बनाने की आवश्यकता होगी। हम पी में किसी भी गैर एकरूपता नोटिस नहीं किया था जबकिatterning प्रोटीन, microchannel अंदर नमूनों कोशिकाओं का वितरण गैर वर्दी हो सकता है। इस गैर एकरूपता सेल निलंबन, ज्यामिति और microchannels के आयामों, और सेल निलंबन की चिपचिपाहट में कोशिकाओं के यादृच्छिक वितरण की वजह से हो सकता है।

भविष्य में, इस तकनीक substrates और कोशिकाओं के अन्य प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इस तरह के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स या कोलेजन scaffolds के रूप में तीन आयामी जैल संभावित नमूनों की जा सकती है और गठन PDMS microfluidic चैनलों का उपयोग कर। microfluidic युक्ति में एक हाइड्रोजेल इंजेक्शन लगाने के द्वारा, हाइड्रोजेल microfluidic युक्ति के आकार लेने के और 3-डी प्रिंटर या अन्य प्रौद्योगिकियों के इस्तेमाल के बिना जटिल पैटर्न बनाने में सक्षम हो सकता है। ये आसानी से उपलब्ध उपकरणों और microfluidic उपकरणों के साथ संरचित मचानों का तेजी से निर्माण के लिए अनुमति होगी।

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Acknowledgments

इस शोध के लिए अनुदान स्पाइनल कॉर्ड रिसर्च (NJCSCR) (FHK करने के लिए) पर न्यू जर्सी आयोग द्वारा उपलब्ध कराया गया था, CSCR14IRG005 (BLF करने के लिए) के लिए अनुदान, एनआईएच R15NS087501 (सीएचसी), और एफएम किर्बी फाउंडेशन (ईटीए के लिए) अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools Corel Corporation, Canada X4 Version 14.0.0.701 CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP Hewlett Packard, CA 1739629 Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator Fisher Scientific, MA 08-594-16B Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape 3M Product, MN Tape 600 Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184 Dow Corning, MI 1064291 Casting polymer
Petri Dish Fisher Scientific, MA 08-772-23 Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan 2976#11 Used to cut the PDMS
Tweezers Ted Pella, CA 5627-07 Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides Fisher Scientific, MA 12-546-2 Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides Fisher Scientific, MA 12-544-4 Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller Dick Blick Art Materials, IL 40104-1004 Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer Heidelberg Instruments, Germany DWL66fs Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) EV Group, Germany EVG 620T(B) Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway Headway Research Inc, TX PWM32-PS-CB15PL Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50 MicroChem, MA Y131269 Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper MicroChem, MA Y020100 Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane UCT Specialties, PA T2492-KG Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol Sigma-Aldrich, MO 190764 Cleaning Solvent
Ethanol Sigma-Aldrich, MO 24102 Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich, MO P0899-10MG PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin Sigma-Aldrich, MO L2020 Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA Fisher Scientific, MA BP1605100 Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline ATCC, VA CRL-1722 Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line ATCC, VA CRL-1721 Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail BD Biosciences 40236 Cell culture
DMEM GIBCO, MA 11965-084 Cell culture
Horse Serum, heat inactivated Fisher Scientific, MA 26050-070 Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) Sigma-Aldrich, MO P1951 To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit Invitrogen, MA L-3224 Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch Ted Pella, CA 15110-10 Punched hole in PDMS

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Patterning के प्रोटीन और कोशिकाओं की एक बहुमुखी विधि
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Shrirao, A. B., Kung, F. H., Yip, D., Firestein, B. L., Cho, C. H., Townes-Anderson, E. A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells. J. Vis. Exp. (120), e55513, doi:10.3791/55513 (2017).

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