Summary
Lasers worden vaak gebruikt in studies van de cellulaire respons op DNA-schade. Echter, ze genereren lesies waarvan de afstand, frequentie en botsingen met replicatievorken worden zelden gekenmerkt. We beschrijven een benadering die de bepaling van deze parameters laser gelokaliseerde crosslinks tussen de strengen mogelijk maakt.
Abstract
Het DNA Damage Response (DDR) is uitgebreid gekarakteriseerd in studies van dubbelstrengs breuken (DSB's) veroorzaakt door micro laser bestraling in levende cellen. De DDR aan helix vervormen DNA covalente modificaties, waaronder DNA crosslinks tussen de strengen (ICL) is niet goed gedefinieerd. We hebben de DDR gestimuleerd door ICL, gelokaliseerd met behulp van laser foto-activatie van immunotagged psoralenen bestudeerd, in de kernen van levende cellen. Om fundamentele vragen over adductverdeling en replicatie vork ontmoetingen pakken, combineerden we laser lokalisatie met twee andere technologieën. DNA vezels worden vaak gebruikt om de voortgang van replicatievorken door immunofluorescentie of nucleosideanalogen ingebracht gedurende korte pulsen geven. Immunoquantum stippen zijn op grote schaal gebruikt voor single molecule imaging. In de nieuwe benadering worden DNA vezels uit cellen die laser gelokaliseerd ICLs uitgespreid op microscoopglaasjes. De getagde ICLs worden weergegeven met immunoquantum stippen en the inter-laesie afstanden bepaald. Replicatievorksnelheid botsingen met ICLs kunnen worden gevisualiseerd en verschillende patronen ontmoeting geïdentificeerd en gekwantificeerd.
Introduction
DNA wordt voortdurend aanval door exogene middelen zoals bestraling, ultraviolet licht, giftige stoffen, verbrandingsproducten, etc. Daarnaast wordt ook aangetast door endogene radicalen geproduceerd door oxidatief metabolisme. Deze hebben het potentieel om de integriteit van DNA 1 chemisch of fysisch te verstoren. Verstoringen in het genoom kan de DNA Damage Response (DDR), een werving en post-translationele modificatie cascade met honderden te activeren, zo niet duizenden, van eiwitten en microRNAs die betrokken zijn bij laesie reparatie, regulatie van de celcyclus, apoptose, veroudering, en inflammatoire pathways 2.
De meeste van onze informatie over de DDR afkomstig uit studies met DSB. Dit is grotendeels vanwege de beschikbaarheid van technieken voor het inbrengen pauzes, zoals sequentiespecifieke onderbrekingen, in genoom DNA in levende cellen 3. Bovendien, de propensity van pauzes om brandpunten van DDR-eiwitten, die kan worden weergegeven door immunofluorescentie veroorzaken, is zeer nuttig geweest voor het identificeren van de kinetiek en eisen te reageren eiwitten. Een van de belangrijkste technologieën voor het bestuderen van de DDR werd geïntroduceerd door Bonner en collega's, die een laserstraal in de kernen van levende cellen 4 gebruikt om een streep van DSB's te richten in een "Region of Interest" (ROI). In feite, creëerden ze een langdurige focus op welke eiwitten van de DDR konden worden geïdentificeerd met immunofluorescentie. Dit werd geïllustreerd door de demonstratie van de sterke streep gefosforyleerd histon H2AX (γ-H2AX) in de laser-belichte cellen. Sindsdien is de laser aanpak toegepast in tal van studies van de DDR veroorzaakt door DSB. Hoewel krachtig en populair, en de bron van dramatische immunofluorescentie beelden, dient te worden opgemerkt dat in de meeste experimenten de laser intensiteit wordt aangepast om waarneembare resultaten te produceren, zonder zorg voor laesie identiteit,dichtheid of tussenruimte. Inderdaad, kan het moeilijk zijn om deze schattingen te maken. Aldus worden zij grotendeels genegeerd, ondanks het grote aantal laesies in DNA geïntroduceerd door lasers 5. Dit draagt bij aan de vele tegenstrijdigheden in de literatuur 6.
In tegenstelling tot DSB meeste chemische modificaties van DNA niet de vorming van afzonderlijke foci van DDR eiwitten stimuleren. Dit is belangrijk in het licht van onze huidige kennis van laesie frequenties. Er wordt geschat dat menselijke cellen in kweek gebracht wel 50 DSB's per celcyclus grotendeels gevormd tijdens S-fase 7, 8, 9. Minder gevormd in niet-prolifererende cellen. Dit in tegenstelling tot het aantal nucleobase verlies of wijziging gebeurtenissen, die in de tienduizenden per cel / dag 1, 10. Dus, we weten het meest overde DDR opgewekt door gebeurtenissen die relatief zeldzaam, en veel minder over die geïnduceerd door helix vervormen laesies, die globaal slechts veel vaker voorkomen.
Met het oog op vragen over de cellulaire respons op wijzigingen van genoom DNA covalente aan te pakken, willen we aan de slag met een helix verstorende DNA adduct dat inherent DDR inductieactiviteit gehad. Verder naar experimenteel ontwerp te vergemakkelijken en de interpretatie we geïnteresseerd waren in een structuur waarvan het binnenbrengen zou kunnen worden gecontroleerd met betrekking tot de tijd en was vatbaar voor visualisatie. Daarom ontwikkelden we een strategie gebaseerd op psoralen. Psoralenen goed gekarakteriseerd fotoactieve DNA intercalerende begunstiging 5'TA: AT sites. In tegenstelling tot andere verknopingsmiddelen zoals stikstof mosterd en mitomycine C (MMC) niet met DNA reactief indien blootgesteld aan lange golf UV (UV) licht. De geïntercaleerde moleculen reageren met thymine basen aan tegenoverliggende strengen helix vervormen crosslinks tussen de strengen te produceren (ICL) 11. Met trimethyl psoralen gebruikt in onze experimenten meeste producten ICLs, relatief weinig monoadducten gegenereerd (minder dan 10%) 12 en intrastrengs verknopingen tussen aangrenzende basen op één streng worden gevormd. Omdat ze krachtige blokken replicatie en transcriptie, psoraleen en andere verknopingsmiddelen, zoals cis-platina en MMC, worden vaak gebruikt bij chemotherapie. Zo psoralen ingeschakeld studies dat de activering van de DDR, gevolgd door een helix vervormen structuur, en ook inzicht gegeven in de cellulaire reactie op een verbinding met de klinische belang.
We synthetiseerden een reagens waarin trimethyl psoralen is verbonden met digoxigenine (Dig), een plantensterol niet in zoogdiercellen en vaak gebruikt als immunotag. De vereiste fotoactivatie maakt lokalisatie met laserlicht (365 nm) van psoraleen ICLs in vastgestelde ROI kernen in levende cellen. Deze kunnen worden weergegeven door immunofluorescence tegen de Dig tag. DNA herstel en DDR eiwitten verscheen in de strips van laser gelokaliseerde ICLs 13, 14.
De DDR geactiveerd door de hoge laserintensiteiten gebruikt voor DSB's te produceren kan het gevolg zijn geïsoleerde of geclusterde schade 15, 16. Bijgevolg is de relevantie van de resultaten van deze experimenten natuurlijk voorkomende laesies aanwezig bij veel lagere concentratie, is onzeker. Op soortgelijke vragen over psoraleen adduct frequentie en tussenruimte in het DNA aan te pakken, hebben we geprofiteerd van DNA vezeltechnologie 17 en immunoquantum stippen. Quantum dots zijn veel helderder dan fluorescerende kleurstoffen en zijn niet gebleekt door blootstelling aan licht. Zo worden ze vaak gebruikt voor single molecule imaging 18 de toepassing waarvoor fluorescente kleurstoffen onvoldoende licht. DNA afzonderlijke vezels kunnen worden gespannen op glass schuiven en kan worden weergegeven door immunofluorescentie tegen nucleoside analogen ingebracht gedurende incubaties vóór oogst cel. We behandelde cellen met Dig-psoraleen en blootgesteld de ROI te laser micro bestraling. Vezels werden bereid uit de cellen en individuele Dig-psoraleen adducten kunnen worden gevisualiseerd met de immunoquantum stippen. Blootstellen van de cellen aan nucleoside-analogen relatief korte tijd (20-60 min) maakt de weergave van replicatie streken in de nabijheid van de laser gelokaliseerde ICL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Dig-TMP
- Meng 50 mg (0,18 mmol) 4'-chloormethyl-4,5' , 8-trimethylpsoraleen en 590 mg (2,7 mmol) 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amine in een droge 25 ml rondbodem -Bottom kolf onder stikstof. Voeg 10 mL tolueen en 12 h onder terugvloeikoeling. Verwijder oplosmiddel in een roterende verdamper onder verlaagde druk.
- Zuiver het residu door flitskolomchromatografie over silicagel. Elueer de kolom met chloroform, methanol en 28% ammonia (9: 1: 0,5). Damp het oplosmiddel in een roterende verdamper onder verminderde druk en herstellen van de zuivere 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5', 8-trimethylpsoraleen als een lichtgele viskeuze vloeistof.
- Meng 5,5 mg (0,012 mmol) 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5', 8-trimethylpsoraleen met 5 mg (0,008 mmol) digoxigenine NHS-ester in een droge rondbodemkolf onder stikstof. Voeg 0,5 mL watervrije dimethylformamide (DMF) eend 3,4 pl trimethylamine en roer bij 50 ° C gedurende 18 uur.
- Verwijder oplosmiddel in een roterende verdamper onder verlaagde druk.
- Los het residu in een minimale hoeveelheid dichloormethaan. Breng de oplossing in 2 pl spots horizontaal over de bodem van een preparatieve dunne-laag plaat met silicagel als stationaire fase. Voer de preparatieve TLC in chloroform: methanol: 28% ammoniumhydroxide (8: 1: 0,1).
- Plak de plaat, behalve in de verticale randen en identificeren van de band product met korte golflengte UV 254 nm lamp. Schrapen het product uit de plaat met een spatel en isoleren van het zuivere product met chloroform: methanol: 28% ammoniumhydroxide (8: 1: 0,1) mengsel.
- Verwijder oplosmiddel in een roterende verdamper onder verlaagde druk. Los het overblijvende pellets in 1 ml 50% EtOH: H2O, af in 50 gl aliquots in 1,5 ml buizen (~ 20 monsters) en drogen in een centrifugale verdamper totdat al het oplosmiddel wordt verdampt (~ 3 uur).
- Weer oplossen elk aliquot in 200 pl 50% EtOH: H2O en droog weer een centrifugale verdamper. Lossen elk monster opnieuw in 200 pl 50% EtOH: H2O, drogen in een centrifugale verdamper en opslag pellets bij -20 ° C voor lange termijn opslag.
- Gebruikt, los de pellet in 50 pl 50% EtOH: H2O Bereid een 1: 100 verdunning van de opgeloste Dig-TMP in H2O en meet OD bij 250 nm. De extinctiecoëfficiënt van Dig-TMP is 25.000. De oplossing is stabiel gedurende ongeveer een maand indien bewaard bij -20 ° C. Controleer de concentratie door meting van OD bij 250 nm voor elk gebruik.
- Bereken voorraadconcentratie: Abs x 100 x 10 6 / 25.000 = concentratie (in uM). Gewoonlijk is de voorraadoplossing ongeveer 3 mM. Het is belangrijk om in dit bereik, teneinde de hoeveelheid EtOH toegevoegd aan het medium te minimaliseren.
2. Laser Gelokaliseerde Dig-TMP ICL
- Perform laser lokalisatie met een confocale microscoop met een SRS stikstoflaser (337 nm) gepompt door een kleurstof cel uitzenden van een lijn van 365 nm en bakken 3 ns pulsen bij 10 Hz, met een vermogen van 0,7 nW.
- Voeg een verticale markering aan de zijkant van een 35 mm glazen bodem celkweek schotel met een markeerstift. Kras kruis in het midden van het glas op het kweekoppervlak met een diamant pen, zodanig dat de zwarte streep op de zijkant van de schaal is bovenaan één arm van het kruis. Het kruis is duidelijk op de groei oppervlak van het glas, zodat de cellen in hetzelfde brandvlak.
- Steriliseer de plaat na merken met een spoeling van 70% EtOH. Dry voor plating cellen.
- Plate cellen (standaard laboratorium stammen zoals HeLa of U2OS) in het kruis gemarkeerde cultuur gerechten een of twee dagen voor. Cell moeten actief worden delen en 50-70% confluent op de dag van het experiment. Incubeer 24 uur bij 1 uM 5-chloor-2-deoxyuridine (CldU) uniform label DNA.
- ToevoegenGraaf-TMP in 50% EtOH: H2O ter celkweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 20 uM. Breng het medium tot 37 ° C. Verander het medium over de cellen en plaats in incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 30 minuten om de Dig-TMP in evenwicht.
- Terwijl de cellen incuberen, stellen de x / y-coördinaten van het gezichtsveld waarin de laser is geactiveerd. Volg ijkprocedure de fabrikant waarin de laser wordt bestuurd door de software een spiegelend glas schuiven langs een horizontale en diagonale lijn etsen. De twee lijnen bepalen de grenzen van het veld waarin de laser een doel kan treffen.
- Plaats de plaat in de klimaatkamer bij 37 ° C met gecontroleerde CO2 en vochtigheid op de microscoop podium en concentreer de olie 60X objectief op het kruispunt van het kruis.
- Richt de 365 nm laserbundel een ROI, vastgesteld door de onderzoeker het vormgereedschap in de software, om een strook van 3 & vormen# 181; mx 0,6 urn. De omtrek van het ROI wordt geschreven door de cursor in kernen van cellen in de onmiddellijke nabijheid van het kruispunt van het kruis. Stel de z brandvlak richten de laser halverwege de kern. Met een laser in het gebied van 350-370 nm. 405 nm lasers kan niet crosslinks 19 induceren.
LET OP: We vinden de ROI in nucleoplasmatische gebieden buiten de nucleoli, die kan worden onderscheiden van nucleoplasm in differentiële interferentie contrast (DIC) beeldvorming. - Controleer de focus en de activiteit van de laser door het verhogen van de energie-instelling tot een niveau voldoende om een cel (de cel wordt donkerder en dan verdwijnen) te wissen. Dit is een belangrijk diagnostisch voor een onbelemmerde lichtweg van de laser door de microscoop en vervolgens door het dekglaasje en in de cellen.
- Verlaag de instelling van het vermogen om net genoeg om de psoraleen en de ICL geïnduceerde DDR (dit moet empirisch worden bepaald voor elke laser / mic activerenroscope combinatie). Met een laser intensiteitsinstelling (1,7% here) die het DDR bij afwezigheid van psoraleen (gevolgd door de vorming van γ-H2AX) niet activeert.
Opmerking: Dit is belangrijk voor het bepalen en de instellingen kunnen worden afgesteld indien de laserbron of een component in de lichtweg verandert. Volg de accumulatie van GFP gemerkte repair eiwitten zoals XPC of FAN1, die beide snel geworven (in seconden) van de laser psoraleen strepen, maar niet roi blootgesteld aan de laser alleen. Sommige eiwitten van de DDR verschijnen binnen enkele seconden, terwijl een paar minuten voor anderen kan nodig zijn. Het is noodzakelijk om het tijdsverloop bepalingen uit te voeren voor elk eiwit van belang. We stellen ook vast dat in cellen die niet werden blootgesteld aan de laser zijn er geen strepen te reageren eiwitten.
- Verlaag de instelling van het vermogen om net genoeg om de psoraleen en de ICL geïnduceerde DDR (dit moet empirisch worden bepaald voor elke laser / mic activerenroscope combinatie). Met een laser intensiteitsinstelling (1,7% here) die het DDR bij afwezigheid van psoraleen (gevolgd door de vorming van γ-H2AX) niet activeert.
- Nadat alle cellen in een veld zijn gericht bewegen de plaat om een nieuw veld, een verblijf in de buurt van het kruispunt van het kruis.
- In experimenten ontworpen om de toonhoogte vanine de verdeling van afstanden tussen laesie bloot cellen aan de laser 20-25 gebied (4-5-cellen / veld) rondom het kruispunt. Om replicatie te analyseren in de nabijheid van de gelokaliseerde ICLs incubeer cellen met 10 uM 5-jood-2-deoxyuridine (IDU) na de laser afvuren.
NB: De incubatietijd met IDU enigszins willekeurig. We hebben gebruikt zo kort als 20 min en zolang 60 min (zie hieronder). Langere pulsen (een paar uur) resulteren vaak in meerdere replicatie traktaten samenvloeien, waardoor de mogelijkheid verliezen om de afbeelding van de voortgang van enkele vorken. In sommige experimenten ces gelabeld met CldU gedurende 24 uur labelen DNA voorafgaand gelijkmatig blootstelling aan Dig-TMP gevolgd door pulsmerking van replicatie stukken.
3. Oogst van cellen en Stretching DNA Vezels
- Verwijder de plaat uit de fase verwijdert het medium en wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS-oplossing. Plaats een 10 ul druppel van een commerciële trypsine/ EDTA-oplossing bij kruispunt van het kruis in het midden van het glasoppervlak.
- Incubeer gedurende 3-4 minuten bij kamertemperatuur (KT) en teken de trypsine-oplossing met de losgemaakte cellen in de pipet tip. Er is geen noodzaak om de trypsine te neutraliseren.
- Plaats de druppel trypsine / EDTA met de cellen aan een uiteinde van een gesilaniseerd microscoopglaasje. Lyseren van de cellen en laat het DNA door toevoeging van 10 ui 0,5% SDS-oplossing en incubeer gedurende 3-4 minuten bij kamertemperatuur voorzichtig te mengen met de pipet tip, waardoor de omtrek van het zwembad te drogen.
- Kantel de slede 20 ° en laat de vloeistof tot aan het einde draaien. De DNA vezels worden verlengd / uitgerekt door de hydrodynamische krachten van de stromende vloeistof. Laat de dia's drogen (-10 min) en fixeer 3: 1 methanol / azijnzuur gedurende 10 min. Montagehulpstukken verwijderen uit de fixeeroplossing en lucht drogen opnieuw. Op dit moment kunnen ze oneindig worden bewaard in 70% EtOH bij -20 ° C. Bij verwijdering van het 70% EtOH aan de lucht drogen vóór het next stap.
- Wassen objectglaasjes in PBS, en vervolgens gedenatureerd in 2,5 M HCl gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Deze behandeling depurinates DNA dat de opgenomen gehalogeneerde nucleobasen toegankelijk voor antilichamen.
- Neutraliseren slides in 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Tweemaal spoelen in PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) gedurende 5 minuten elk.
- Blok glijdt met 5% runderserumalbumine (BSA) en 10% geitenserum in PBS. Bedek de objectglaasjes voorzichtig met een parafilm de blokkerende oplossing gelijkmatig over de glijbaan en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Pipet 100 pi van 1: 200 verdunning in blokkeringsoplossing rat anti-broomdeoxyuridine (detecteert specifiek CldU) primair antilichaam elke dia. Bedek de objectglaasjes voorzichtig met een parafilm de verdunning gelijkmatig over de glijbaan en incuberen in een vochtige kamer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder het parafilm en was de objectglaasjes drie keer in PBST gedurende 5 minuten elk.
- Pipet 100 pl verdund (1: 100) geit anti-rat Alexa Fluor 647 in blokkeeroplossing elke dia. Bedek deschuift voorzichtig met een parafilm en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de objectglaasjes drie keer in PBST gedurende 5 minuten elk.
- Pipet 100 pl verdund (1:40) muizen-anti-broomdeoxyuridine (LDU detecteert en CldU Deze tweeledige specificiteit vereist de blokkering van CldU de rat anti- BrdU in de stand van incubatie.) Primair antilichaam en konijn anti-DIG antilichaam (1: 200 ) in blokkeeroplossing elke dia. Bedek de objectglaasjes voorzichtig met een parafilm en incubeer in een vochtige kamer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel de objectglaasjes drie keer in PBST gedurende 5 minuten elk.
- Pipet 100 pl verdund (1: 100) geit anti-muis Alexa Fluor 488 andc (1: 5000) geiten anti-konijn probe (bijvoorbeeld Qdot 655) in blokkeeroplossing elke dia. Bedek de objectglaasjes voorzichtig af met parafilm en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de objectglaasjes drie keer in PBST gedurende 5 minuten elk.
- Giet overtollige PBST op een papieren handdoek. Voeg 50 ul van antifade fixeermiddel op elk glaasje en bedek met een dekglaasje. Afbeelding of op te slaan voorniet meer dan 48 uur bij -20 ° C.
4. Fiber Imaging met fluorescentiemicroscopie
- Voeren beeldverwerving door een 63x objectief op een omgekeerde microscoop met een aangrenzende volledig gemotoriseerd filterwiel met FITC, Cy5 en Q Dot 655 detecteren. Het excitatiefilter 425 nm en de emissie filter 655 nm 20 nm gecentreerd bij de emissiepiek 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laser gelokaliseerde Dig-TMP (Figuur 1A) ICLs kan worden weergegeven door immunofluorescentie tegen Dig-tag gekoppeld aan het psoraleen. Hoewel de laser kan worden gericht te slaan in een gebied van elke contour strepen niet "natuurlijke" vormen in cellen en legitieme signalen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden van artefacten als gevolg van niet-specifieke binding door primaire of secundaire antilichamen. Deze functie is handig bij het gebruik van antilichamen van minder dan perfect specificiteit. Een voorbeeld van de algemeen bekende indicator van de DDR, γ-H2AX, in een strook van Dig-TMP ICL is getoond in figuur 1B.
De immunofluorescentie van de Dig gemerkte laesies in de laserstroken geen conclusies mogelijk over de frequentie en tussenruimte van adducten. Om te bepalen werden de cellen geïncubeerd met CldU gedurende 24 uur voorafgaand aan het inbrengen van de ICL. De kleuring tegen the CldU maakt de visualisatie van de Dig gemerkte laesies op lange vezels en duidelijkere vezel patronen oplevert dan rechtstreekse vlekken zoals DAPI (4 ', 6-diamino-2-fenylindool) of YOYO {1,1' - (4,4,8 , 8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) bis [4 - [(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) methylideen] -l, 4-dihydroquinolinium]} tetrajodide. Na introductie van ICL laser fotoactivering, werden vezels verspreid van de doelcellen. De analyse van de Dig signalen op de vezels zoals getoond in figuur 2 onthulde dat de inter ICL afstanden varieerde van minder dan 10 kb tot meer dan 160 kb, zoals beschreven in onze recente publicatie 21. Er was geen bewijs voor geclusterde adducten. Aldus de strook van de Dig tag en de accumulatie van de DDR eiwitten in de strook, het gevolg van de aanwezigheid van goed gescheiden laesies, althans gemeten langs de verlengde DNA. Gezien in termen van cellulaire chromatine indien ICLs gevormde nucleosomale arrays met 6voudige compressie van de uitgebreide DNA lengte, zouden ze nog steeds gescheiden worden door het equivalent van ongeveer 1,6 kb DNA.
Experimenten met laser geïnduceerde DNA beschadiging algemeen de inductie van de DDR. Deze experimenten zijn zelden bezig met vragen met betrekking tot DNA-replicatie. Anderzijds worden DNA vezel assays typisch gebruikt voor studies van replicatie. Blootstelling van cellen aan korte pulsen van gehalogeneerde nucleosideanalogen resultaten in hun incorporatie in DNA. Immunofluorescentie analyse van DNA vezels onthult stukken opgenomen analogen vertegenwoordigen Language DNA-synthese. Het was interessant om te vragen of DNA-replicatie opgetreden in de laser gelokaliseerde ICL strepen, en zo ja, welke het patroon van replicatie in de nabijheid van de ICLs zijn? De cellen werden gedurende 24 uur onder CldU de weergave van lange vezels te vergemakkelijken. Laser gelokaliseerde ICLs werden geïntroduceerd in cellen, gevolgd door 1 h puls van IDU. DNA f IBERS werden bereid uit de doelcellen en Dig gemerkte ICL en replicatie stukken weergegeven. De resultaten gaven aan dat laser activering van het psoraleen niet afgesloten replicatie of invloed op de totale frequentie van replicatie patronen. Replicatie opgetreden aan de ene kant, en ook aan beide zijden van de ICLs, met dubbelzijdige patronen in een 4: 1 deel zoals we onlangs aangetoond 21.
Figuur 1: Generatie van Laser Gelokaliseerde Dig-TMP ICL. (A) Structuur van Dig-trimethyl psoralen. (B) Accumulatie van γ-H2AX (groen) ROI met laser gelokaliseerd ICLs (Dig, red). De kern wordt gekleurd met DAPI (blauw). De helderveld foto toont een cel gedeeltelijk op de stempel van de diamant pen. Let op de nucleoli, en de plaatsing van de ROI daarbuiten.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: DNA Vezels met laser gelokaliseerde Dig-TMP signalen. (A) Cellen werden gedurende 24 uur onder CldU om DNA te labelen. Daarna werden laser gelokaliseerd ICLs ingebracht en (B) werden de cellen geoogst en vezels verspreid. (C, D) The Dig signalen werden weergegeven met immunoquantum dot (rood) en CldU immunofluorescentie (groen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De laser lokalisatie techniek vereist het gebruik van hechtende cellen met kernen die zichtbaar helderveld microscopie. We hebben geprobeerd om niet hechtende cellen, zoals primaire lymfocyten of losjes hechtende gekweekte cellen zoals AD293 hechten aan het glasoppervlak met celhechtend preparaten zoals polylysine of collageen, of meer complexe mengsels. Hoewel deze behandelingen van de cellen naar de oppervlakte kunnen binden, vinden we dat zij over het algemeen blijven afgerond waardoor het erg moeilijk om zich te concentreren in de kernen. Bovendien, de cellen vaak niet de eerste wassen na het verwijderen van het groeimedium te overleven. Echter, binnen de vereiste voor hechtende cellen, hebben we met succes gebruik gemaakt van een breed scala aan standaard cellijnen evenals primaire cellen voor deze studies. Het is nuttig om cellen voor mycoplasma besmetting te testen. We vinden dat de cel reacties worden veranderd door deze infecties.
Het brandvlak van de laser is belangrijk. Het doel is omPlaats de ICL binnen de kern. Te hoog en de foto-activatie zullen boven de kern; te laag is en het zal zijn op het glas. We vinden het handig om de scherpstelling van het DIC te verscherpen op de kruising van het cytoplasma en de kern.
De vezel assays zijn niet moeilijk, maar vereist enige oefening voordat interpreteerbare velden worden gewonnen. Het is belangrijk om deze techniek correct uit te voeren. Het aantal cellen gewonnen uit de laser experimenten is laag en elk monster wordt in zijn geheel op één dia. Daarom is het essentieel om de opbrengst van elk experiment maximaliseren als monsters niet kunnen worden gesplitst met aliquots opgeslagen voor latere analyse. Toch kunnen honderden gebeurtenissen worden gewonnen uit een enkel monster. Twee kenmerken van de procedure zijn van cruciaal belang. Eén is de stroomsnelheid van het cellysaat van de glijbaan. Als er te snel, zal een groot deel van de DNA vandoor de dia. De kwaliteit van de glasplaatjes is ook kritisch. We af en toe ręceive kavels die niet effectief zijn. Bijgevolg elke nieuwe partij moet voorafgaand aan het gebruik worden getest.
Zoals geldt voor alle laboratoria manipulaties de betrouwbaarheid van commerciële reagentia antilichamen, immunoquantum punten, etc., is altijd een zorg. Deze zijn niet altijd stabiel en experimentele wordt doorgaans herleid tot problemen met een of andere reagens. De immunoquantum stippen zijn bijzonder problematisch en meer dan één partij kan het nodig zijn om te worden getest met het oog op een die aanvaardbaar is te identificeren. Ineffectief percelen worden gekenmerkt door een hoge achtergrond signalen. Deze zijn niet geassocieerd met vezels en wordt gezien op gebieden van de dia die geen DNA hebben.
Het gebruik van lasers om de lokale DNA-schade te introduceren is erg populair geworden sinds de invoering van de Bonner groep 4. In deze, en de meeste latere experimenten het laservermogen zijn ingesteld om zo de DDR rechtstreeks induceren. We hebben een instelling van het vermogen voldoende laag suc gebruikth dat de activering van de DDR afhankelijk van zowel laser en psoraleen. Zoals hierboven besproken, de scheiding tussen psoraleen adducten stelt dat we kijken naar de respons op afzonderlijke gebeurtenissen. Terwijl het aantal ICLs die worden gevormd door endogene verknopingsmiddelen onbekend is, stellen we vast dat de lokalisatie van het psoraleen adducten de cellen niet doodt, omdat zij in staat zijn de psoraleen adducten binnen 6-8 h (ongepubliceerde gegevens) te verwijderen en aanwezig zijn en gezond 24 uur later. Derhalve is deze benadering minder toxisch voor cellen dan protocollen die blootstelling aan agentia die DNA beschadiging gehele kern en mitochondriën te voeren vereisen.
De laser / psoraleen combinatie introduceren helix vervormen structuur die het DDR activeren. In dit verband de resultaten van deze aanpak resultaten gelden voor een gebied van helix vervormen laesies, gezien de trapsgewijze aard van de DDR, na de activering van de ATM / DNAPK / ATR kinases 22.In dit verband het DNA vezel hier beschreven benadering kan worden uitgebreid tot elk DNA structuur die door immunologische of chemische of biochemische middelen die kunnen worden weergegeven door fluorescentie worden gedetecteerd. Daartoe behoren onder meer UV fotoproducten 23, volumineuze alkylatoren 24, G quadruplexen 25, en oxidatieve laesies 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mede ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) en de Fanconi Bloedarmoede Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5,000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB? Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T.
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
