Summary
Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.
Abstract
Die DNA-Schadensantwort (DDR) wurde in Studien von Doppelstrangbrüchen (DSB), induziert durch Lasermikrostrahlbestrahlung in lebenden Zellen extensiv charakterisiert. Die DDR helix DNA kovalente Modifikationen verzerrenden, einschließlich Interstrang- DNA-Vernetzungen (ICL), ist nicht so gut definiert. Wir haben die von ICLs stimuliert DDR studiert, lokalisiert durch Laser-Photoaktivierung von immunotagged Psoralene, in den Kernen von lebenden Zellen. Um grundlegende Fragen über Adduktverteilung und Replikationsgabel Begegnungen zu adressieren, kombinierten wir Laser-Lokalisierung mit zwei anderen Technologien. DNA-Fasern werden häufig während kurzer Impulse integriert anzuzeigen, den Fortschritt der Replikationsgabeln durch Immunofluoreszenz von Nukleosidanaloga verwendet. Immunoquantum Punkte wurden für Einzelmolekül-Bildgebung weit verbreitet. In dem neuen Ansatz, DNA Fasern aus Zellen, den Laser-lokalisierte ICLs werden auf Objektträger verteilt. Die markierten ICLs sind mit immunoquantum Punkten und th angezeigte inter-Läsion Entfernungen bestimmt. Replikationsgabel Kollisionen mit ICLs visualisiert und andere Begegnung Muster identifiziert und quantifiziert werden.
Introduction
DNA wird unter konstantem Angriff von exogenen Mitteln wie Strahlung, ultraviolettem Licht, Umweltgifte, Verbrennungsprodukte, etc. Darüber hinaus ist es auch durch endogene Radikalspezies hergestellt durch oxidative Stoffwechsel angegriffen wird. All diese Faktoren haben das Potenzial , chemisch oder physikalisch die Integrität der DNA - 1 zu stören. Störungen in dem Genom können die DNA-Schadensantwort (DDR) aktivieren, eine Rekrutierung und posttranslationale Modifikation Kaskade mit Hunderten, wenn nicht Tausende von Proteinen und in Läsion Reparatur beteiligt microRNAs, Regulation des Zellzyklus, Apoptose, Seneszenz und Entzündungsweg 2.
Die meisten unserer Informationen über die DDR stammt aus Studien mit DSBs. Dies ist zum großen Teil durch die Verfügbarkeit von Technologien für Brüche sind , darunter ein sequenzspezifische Pausen, in genomischer DNA in lebenden Zellen 3. Darüber hinaus ist die propensity von Pausen Brennpunkte der DDR-Proteine zu induzieren, die durch Immunofluoreszenz angezeigt werden können, ist sehr hilfreich für die Bestimmung der Kinetik und Anforderungen des Antworten Proteine. Eine der Schlüsseltechnologien für die DDR studiert wurde von Bonner und Kollegen vorgestellt, die einen Laserstrahl verwendet , 4 einen Streifen von DSBs in einer „Region of Interest“ (ROI) in den Kernen von lebenden Zellen zu lenken. In der Tat haben sie einen langen Fokus, in denen Proteine der DDR können durch Immun identifiziert werden. Dies wurde durch die Demonstration der starken Streifen von phosphoryliertem Histon H2AX (γ-H2AX) in den Laser-exponierten Zellen veranschaulicht. Seitdem hat sich der Laser Ansatz in zahlreichen Studien der DDR eingesetzt wurden durch DSBs induziert. Obwohl mächtig und beliebt, und die Quelle der dramatischen Immun Bilder, sei darauf hingewiesen, dass in den meisten Experimenten die Laserintensität eingestellt wird, um beobachtbare Ergebnisse zu produzieren, ohne Sorge um die Läsion Identität,Dichte oder Abstand. Tatsächlich kann es schwierig sein, diese Schätzungen. So sind sie weitgehend ignoriert, trotz der Vielzahl der in die DNA eingeführt Läsionen durch Laser 5. Dies trägt zu den vielen Widersprüche in der Literatur 6.
Im Gegensatz zu DSBs meisten chemischen Modifikationen der DNA nicht stimulieren die Bildung von diskreten Foci von DDR-Proteinen. Dies ist wichtig im Hinblick auf unserem gegenwärtigen Verständnis der Läsion Frequenzen. Es wird geschätzt, dass menschliche Zellen in Kultur nicht weniger als 50 DSBs pro Zellzyklus entstehen, 7 weitgehend während der S - Phase gebildet, 8, 9. Weniger in nicht-proliferierenden Zellen gebildet. Dies kontrastiert mit der Anzahl von Nukleobasen Verluste oder Änderungsereignisse, die 1 in die Zehntausende pro Zelle / Tag, 10. So wissen wir am meistendie DDR durch Ereignisse induziert, die relativ selten sind, und viel weniger über die von Helix zu verzerren Läsionen induziert, die weitaus häufiger in Aggregat sind.
Um Fragen über die zelluläre Antwort zu adressieren Modifikationen der genomischen DNA kovalent, wollten wir mit einer Helix verzerrenden DNA-Addukt arbeiten, die inhärente DDR Induktionsaktivität hatte. Darüber hinaus erleichtern experimentelles Design und Interpretation, die wir waren in einer Struktur, deren Einführung interessiert Bezug auf die Zeit kontrolliert werden konnte und war offen für die Visualisierung. Dementsprechend entwickeln wir eine Strategie, die auf Psoralen. AT sites: Psoralene sind gut photoaktive DNA-Interkalatoren begünstigende 5' TA gekennzeichnet. Im Gegensatz zu anderen Vernetzungsmitteln wie beispielsweise Stickstoffsenfgase und Mitomycin C (MMC) sie sind nicht reaktiv, es sei denn DNA ausgesetzt langwelligem UV (UV-A) Licht. Die interkalierten Moleküle reagieren mit Thymin-Basen auf gegenüberliegenden Strängen helix verzerrenden Interstrang-Vernetzungen (ICLs herzustellen) 11. Mit dem Psoralen trimethyl in unseren Experimenten verwendeten die meisten Produkte sind ICLs, relativ wenige Monoaddukte erzeugt werden (weniger als 10%) 12 und Intrastrang - Quervernetzungen zwischen benachbarten Basen auf einem Strang nicht ausgebildet sind . Weil sie leistungsfähiger Blöcke Replikation und Transkription, Psoralen und andere Vernetzungsmittel sind, wie cis-Platin und MMC, werden in der Chemotherapie eingesetzt. Somit Psoralen Studien ermöglichte, dass die Aktivierung der DDR durch eine Helixstruktur zu verzerren, gefolgt, und auch einen Einblick in die zelluläre Antwort auf eine Verbindung mit der klinischen Bedeutung zur Verfügung gestellt.
Wir ein Reagenz synthetisiert, in dem trimethylpsoralen verknüpft wurde an Digoxigenin (Dig), ein pflanzliches Sterin nicht in Säugerzellen gefunden und häufig als immunotag verwendet. Die Anforderung für die Photoaktivierung erlaubt die Lokalisierung von Laserlicht (365 nm) von Psoralen ICLs in definierten ROI in Kernen in lebenden Zellen. Diese können durch imm angezeigt werdenunofluorescence gegen das Markierungs-Dig. DNA - Reparatur und DDR - Proteine erschienen in den Streifen des Laser lokalisierten ICLs 13, 14.
Die DDR durch die hohen Laserintensitäten aktiviert verwendet DSBs produzieren könnte 15 aufgrund isoliert oder gruppierten Schaden sein, 16. Folglich ist die Relevanz der Ergebnisse aus diesen Experimenten natürlich Läsionen vorhanden bei viel niedrigeren Konzentration auftritt, ist ungewiss. Um ähnliche Fragen zu Psoralen Addukts Frequenz und Abstand in der DNA - Adresse, nutzten wir DNA - Fasertechnologie 17 und immunoquantum Punkte. Quantenpunkte sind deutlich heller als Fluoreszenzfarbstoffe und sind nicht durch Belichtung gebleicht. So werden sie häufig für Einzelmolekül - Bildgebung verwendet 18, eine Anwendung , für die Fluoreszenzfarbstoffe nicht ausreichend hell sein . Einzelne DNA-Fasern können auf g gestrecktlass Dias und können während der Inkubationen vor der Zellernte eingebracht durch Immunofluoreszenz gegen Nukleosidanaloga angezeigt werden. Wir behandelten Zellen mit Dig-Psoralen und den ROI zu Lasermikrobestrahlung ausgesetzt. Die Fasern wurden aus den Zellen und einzelne Dig-Psoralen-Addukte hergestellt mit den immunoquantum Punkte sichtbar gemacht werden konnten. die Zellen ausgesetzt Analoga für relativ kurze Zeiten Nukleosid (20-60 min) ermöglicht die Anzeige der Replikationsweg in der Nähe des Laser lokalisierte ICLs.
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Protocol
1. Herstellung von Dig-TMP
- Mische 50 mg (0,18 mmol) 4'-Chlormethyl-4,5' , 8-Trimethylpsoralen und 590 mg (2,7 mmol) 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanedi-amin in einem trockenen 25 ml Rund -bottom Kolben unter Stickstoff. Zugabe von 10 ml Toluol und Rückfluss für 12 h. Entfernung des Lösungsmittels in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck.
- Reinige den Rückstand durch Flash-Säulenchromatographie über Kieselgel. Eluieren der Säule mit Chloroform, Methanol und 28% iger Ammoniaklösung (9: 1: 0,5). Dampfe das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck und erholen das reine 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5', 8-trimethylpsoralen als ein hellgelbes viskoses Flüssigkeit.
- Mischen 5,5 mg (0,012 mmol) 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5', 8-trimethylpsoralen mit 5 mg (0,008 mmol) Digoxigenin-NHS-Ester in ein trockener Rundkolben unter Stickstoff gegeben. 0,5 mL wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) eind 3,4 & mgr; L Trimethylamin zugegeben und bei 50 ° C für 18 Stunden.
- Entfernung des Lösungsmittels in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck.
- Löse den Rückstand in einer minimalen Menge Dichlormethan. Geben Sie die Lösung in 2 ul spots horizontal über den Boden einer präparativen Dünnschichtplatte mit Kieselgel als stationäre Phase. Führen des präparativen TLC in Chloroform: Methanol: 28% Ammoniumhydroxid (8: 1: 0,1).
- Maskiert die Platte mit Ausnahme der vertikalen Kanten und identifizieren, die Band des Produkts mit kurzwelligem UV-Lampe 254 nm. Schabt das Produkt von der Platte mit einem Spatel und isolieren, um das reine Produkt mit Chloroform: Methanol: 28% Ammoniumhydroxid (8: 1: 0,1) -Mischung.
- Entfernen Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck. Man löst die verbleibenden Pellets in 1 ml 50% EtOH: H 2 O, verzichtet werden in 50 ul - Aliquots in 1,5 - ml - Röhrchen (~ 20 Aliquots) und trocken in einem Zentrifugalverdampfer , bis das gesamte Lösungsmittel verdampft (~ 3 h).
- Wieder aufzulösen jedes Aliquots in 200 ul 50% EtOH: H 2 O und wieder trocken in einem Zentrifugalverdampfer. Man löst jedes Aliquot wieder in 200 ul 50% EtOH: H 2 O, trocken in einem Zentrifugalverdampfer und speichert Pellets bei -20 ° C zur Langzeitlagerung.
- Zur Verwendung lösen sich die Pellets in 50 ul 50% EtOH: H 2 O ein 1 Bereiten: 100 - Verdünnung des gelösten Dig-TMP in H 2 O und OD bei 250 nm messen. Der Extinktionskoeffizient von Dig-TMP ist 25.000. Die Lösung ist für etwa einen Monat stabil , wenn bei -20 ° C gelagert. Überprüfen der Konzentration von OD bei 250 nm vor jeder Verwendung zu messen.
- Berechnen Stammkonzentration: Abs x 100 x 10 6 / 25.000 = Konzentration (in um). Typischerweise wird die Stammlösung etwa 3 mm. Es ist wichtig, in diesem Bereich zu sein, um das Volumen des EtOH zu dem Medium gegeben zu minimieren.
2. Laser Lokalisierte Dig-TMP ICLs
- Perform Laser Lokalisierung mit einem konfokalen Mikroskop mit einem SRS Stickstofflaser (337 nm) gepumpt wird durch eine Farbstoffzelle eine Linie von 365 nm und Brennen 3 ns-Impulse bei 10 Hz, mit einer Leistung von 0,7 nW emittieren.
- Macht eine vertikale Markierung auf der Seite eines 35 mm Glasboden-Zellkulturschale mit einem Markierungsstift. Zerkratzen ein Kreuzes in der Mitte des Glases auf der Kulturfläche mit einem Diamantstift, so daß die schwarzen Streifen auf der Seite der Schale ist an der Spitze eines Arms des Kreuzes. Das Kreuz wird auf der Wachstumsoberfläche des Glases markiert, so dass sie und die Zellen in der gleichen Brennebene sein werden.
- Sterilisieren die Platte mit einer Spülung von 70% EtOH nach der Markierung. Trockene, bevor die Zellen Plattierung.
- Plattenzellen (Standard-Laborstämme wie HeLa oder U2OS) im Kreuz markierten Kulturschalen einen oder zwei Tage vor. Zelle sollte aktiv werden zu teilen und 50-70% konfluent am Tag des Experiments. Inkubiere 24 h mit 1 & mgr; M 5-Chlor-2-desoxyuridin (CldU) gleichmäßig Etikett DNA.
- HinzufügenDig-TMP in 50% EtOH: H 2 O zu Zellkulturmedium bis zu einer Endkonzentration von 20 uM. Bringen des Mediums auf 37 ° C. Ändert das Medium über die Zellen und im Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 30 min dem Dig-TMP äquilibrieren zu ermöglichen.
- Während die Zellen werden inkubiert, schaffen, die x / y-Koordinaten des Sichtfeldes, in dem der Laser aktiv ist. Folgen Sie den Kalibriervorgang des Herstellers, in dem der Laser durch die Software gerichtet ist eine verspiegelte Glasobjektträger entlang einer horizontalen und diagonalen Linie zu ätzen. Die beiden Linien definieren die Grenzen des Feldes, in dem der Laser ein Ziel treffen kann.
- Die Platte wird in der Klimakammer bei 37 ° C mit einem kontrollierten CO 2 und Feuchtigkeit, auf dem Mikroskoptisch und Fokus mit dem 60X Öl Ziel auf dem Schnittpunkt des Kreuzes.
- Direkte den 365 nm-Laserstrahl zu einem ROI, der durch den Untersucher mit dem Form-Werkzeug in der Software, um einen Streifen von 3 & zu bilden# 181; mx 0,6 um. Der Umriss des ROI wird durch die Cursor in den Kernen von Zellen in der unmittelbaren Nähe der Kreuzung des Quer gelegen angeordnet. Stellen Sie die z Brennebene des Lasers auf halbem Wege durch den Zellkern zu zielen. Verwenden eines Lasers im Bereich von 350-370 nm. 405 nm - Laser kann nicht - Vernetzungen 19 induziert.
HINWEIS: Wir finden die ROI in nukleoplasmatischen Bereiche außerhalb der Nukleoli, die aus Nukleoplasma in differentieller Interferenzkontrast (DIC) -Bildgebung unterschieden werden können. - Stellen Sie sicher , den Fokus und die Aktivität des Lasers durch die Leistungseinstellung auf ein Niveau zu erhöhen ausreicht , um eine Zelle zu tilgen (die Zelle wird verdunkeln und dann verschwinden). Dies ist ein wichtige diagnostische für einen ungehinderten Lichtpfad für den Laser durch das Mikroskop und dann durch das Deckglas und in die Zellen.
- Senken Sie die Leistungseinstellung auf gerade genug, um die Psoralen und die ICL induzierte DDR zu aktivieren (dies empirisch für jeden Laser / Mikrofon bestimmt werden muss,ROSCOPE Kombination). Verwenden Sie eine Laserintensität einstellen (1,7% hier), die nicht die DDR in Abwesenheit von Psoralen nicht aktiviert (überwacht durch die Bildung von γ-H2AX).
ANMERKUNG: Dies ist eine wichtige Feststellung, und die Einstellungen können eine Einstellung erfordern, wenn die Laserquelle oder eine Komponente in dem Lichtpfad geändert wird. Folgen Sie die Anhäufung von GFP-Reparaturproteine getaggt wie XPC oder FAN1, welche beide rasch rekrutiert werden (in Sekunden) an den Laser Psoralen Streifen, aber nicht allein den Laser ausgesetzt, um den ROI. Einige Proteine der DDR erscheinen innerhalb von Sekunden, während mehrere Minuten können für andere erforderlich sein. Es ist notwendig, Zeitverlauf Bestimmungen für jedes Protein von Interesse durchzuführen. Wir bemerken auch, dass in Zellen, die nicht mit dem Laser ausgesetzt waren, gibt es keine Streifen reagieren Proteine.
- Senken Sie die Leistungseinstellung auf gerade genug, um die Psoralen und die ICL induzierte DDR zu aktivieren (dies empirisch für jeden Laser / Mikrofon bestimmt werden muss,ROSCOPE Kombination). Verwenden Sie eine Laserintensität einstellen (1,7% hier), die nicht die DDR in Abwesenheit von Psoralen nicht aktiviert (überwacht durch die Bildung von γ-H2AX).
- Nachdem alle Zellen in einem Feld haben die Platte Umzug in ein neues Feld gezielt worden, an der Kreuzung des Kreuzes Aufenthalt in der Nähe.
- In Experimenten bestimine die Verteilung der inter Läsion Abstände Zellen an den Laser in 20-25 Feldern (4-5 Zellen / Feld) um den Schnittpunkt belichten. Um Replikationsmuster in der Nähe der lokalisierten ICLs inkubieren Zellen mit 10 & mgr; M 5-iod-2-desoxyuridin (IDU) nach der Laserbrenn zu analysieren.
HINWEIS: Die Zeit der Inkubation mit IdU ist etwas willkürlich. Wir haben so kurz wie 20 Minuten und solange 60 min (siehe unten) verwendet. Längere Impulse (einige Stunden) führen oft in mehreren Replikationsweg Koaleszieren und damit die Möglichkeit, das Bild zu verlieren, den Fortschritt der einzelnen Gabeln. In einigen Experimenten ces werden 24 h mit CldU markiert vor der Belichtung mit Dig-TMP gleichmäßig zu Markierungs-DNA, gefolgt von Pulsmarkierung Replikationsweg.
3. Ernte von Zellen und Dehnen von DNA-Fasern
- Entfernen der Platte von der Bühne, das Medium entfernen, und wasche mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS-Lösung. Legen Sie eine 10 & mgr; l Tropfen eines handelsüblichen Trypsin/ EDTA-Lösung auf dem Schnittpunkt des Kreuzes in der Mitte der Glasoberfläche.
- Inkubieren für 3-4 min bei Raumtemperatur (RT) und dann mit den abgelösten Zellen in die Pipettenspitze die Trypsinlösung zeichnen. Es besteht keine Notwendigkeit, das Trypsin zu neutralisieren.
- Platzieren Sie den Tropfen Trypsin / EDTA mit den Zellen an einem Ende eines silanisierten Glasobjektträger. Lyse der Zellen und lassen Sie die DNA durch Zugabe von 10 ul 0,5% SDS-Lösung und für 3-4 min bei RT inkubieren vorsichtig mit der Pipettenspitze Mischen, so dass die Peripherie des Pools zu trocknen.
- Kippen Sie die Schlitten 20 ° und die Flüssigkeit bis zum Ende laufen. Die DNA-Fasern werden ausgefahren / ausgestreckt durch die hydrodynamischen Kräfte der fließenden Flüssigkeit. Lassen Sie die Folien der Luft trocknen (~ 10 min) und fixieren in 3: 1 Methanol / Essigsäure 10 min. Entfernen Sie die Folien aus der Fixier-Lösung und Luft wieder trocken. An diesem Punkt kann sie auf unbestimmte Zeit in 70% EtOH bei -20 ° C gelagert werden. Bei der Entfernung aus dem EtOH 70% an der Luft trocknen, bevor die ne ermöglichenxt Schritt.
- Wasche Objektträger in PBS und dann in 2,5 M HCl denaturiert für 1 h bei RT. Diese Behandlung depurinates DNA die inkorporierten halogenierten Nukleobasen für Antikörper zugänglich zu machen.
- Neutralisieren Objektträger in 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Wasche zweimal in PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) für jeweils 5 Minuten.
- Block gleitet und mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) und 10% Ziegenserum in PBS. Deckt die Folien vorsichtig mit einem Parafilm die Blockierungslösung gleichmäßig über die Folie verteilt und für 1 h bei RT inkubiert.
- Jeweils 100 & mgr; l 1: 200-Verdünnung in Blockierlösung von Ratten-Anti-Bromdesoxyuridin (erkennt spezifisch CldU) primäre Antikörper zu jeder Folie. Deckt die Folien vorsichtig mit einem Parafilm die Verdünnung gleichmäßig über den Objektträger zu verteilen und für 1 h bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert. Entfernen Sie den Parafilm und waschen Sie die Folien dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten.
- Jeweils 100 & mgr; l von verdünnten (1: 100), Ziege-anti-Ratte-Alexa Fluor 647 in jede Folie Blockierungslösung. Bedecke, Verdecke dasgleitet sanft mit einem Parafilm und für 45 min bei RT inkubiert. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten.
- Jeweils 100 ul verdünnten (01.40) Maus-Anti-Bromdesoxyuridin (LDU erkennen und CldU Diese duale Spezifität die Blockierung von CldU durch den Ratten-anti BrdU im Stand der Inkubation erforderlich macht.) Primären Antikörper und Kaninchen-anti-DIG-Antikörper (1: 200 ) -Lösung zu jeder Folie in blockieren. Decken Sie die Folien vorsichtig mit einem Parafilm und Inkubation in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei RT. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten.
- Jeweils 100 & mgr; l von verdünnten (1: 100) , Ziege - anti-Maus - Alexa Fluor 488 und c (1: 5000) , Ziegen - anti-Kaninchen - Sonde (zB Qdot 655) in jede Folie Blockierungslösung. Decken Sie die Folien vorsichtig mit Parafilm und Inkubation für 45 min bei RT. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBST für jeweils 5 Minuten.
- Überschüssiges PBST auf einem Papiertuch. Je 50 & mgr; L Antifade Befestigungsmedium auf jeden Objektträger geben und mit einem Deckglas. Bild oder Speicher fürnicht mehr als 48 h bei -20 ° C.
4. Faser Imaging durch Fluoreszenzmikroskopie
- Durchführen der Bildaufnahme durch ein 63X Ziel auf einem inverses Mikroskop mit einem daran befestigten vollständig motorisierten Filterrad mit FITC, Cy5 und Q-Punkt 655 Erkennung. Der Anregungsfilter 425 nm, und das Emissionsfilter 655 nm mit 20 nm an der Emissionsspitze 20 zentriert.
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Representative Results
Laser lokalisierte Dig-TMP (1A) ICLs kann den Psoralen verknüpfte durch Immunofluoreszenz gegenüber der Dig-Markierung angezeigt werden. Obwohl der Laser gerichtet werden kann, auf einer Fläche von jeder Kontur zu schlagen, sind Streifen nicht „natürlich“ Formen in Zellen und berechtigtes Signale leicht von Artefakten aufgrund von nicht-spezifischen Bindung von primären oder sekundären Antikörpern unterschieden werden können. Diese Funktion ist hilfreich, wenn Antikörper von weniger als perfekter Spezifität verwendet. Ein Beispiel des bekannten Marker der DDR, γ-H2AX, in einem Streifen von Dig-TMP ICLs ist in 1B gezeigt.
Die Immunofluoreszenz des Dig getaggt Läsionen in den Laserstreifen erlaubt keine Rückschlüsse auf die Häufigkeit und der Abstand der Addukten. Um diese Bestimmung Zellen zu machen, wurden für 24 h mit CldU inkubiert vor der Einführung der ICLs. Die Färbung gegen the CldU ermöglicht die Visualisierung der Dig Läsionen an langen Fasern markiert und ergibt sich klarer Fasermuster als direkte Flecken wie DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol) oder YOYO {1,1' - (4,4,8 , 8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) bis [4 - [(3-methyl-benzo-1,3-oxazol-2-yl) methyliden] -l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide}. Nach der Einführung von ICLs durch Laser-Photoaktivierungs wurden Fasern aus den Zielzellen zu verbreiten. Die Analyse der Dig - Signale auf den Fasern, wie jene , die in 2 gezeigt ergeben , dass die inter ICL Entfernungen von weniger als 10 kb bis grßer als 160 kb reichten, wie 21 in unserer jüngsten Veröffentlichung beschrieben. Es gab keine Anzeichen für Clustered-Addukte. Somit wird die Streifen des Dig-Tag, und die Akkumulation der DDR-Proteine in dem Streifen, die sich um die Anwesenheit von gut getrennten Läsionen, zumindest entlang der verlängerten DNA gemessen. Betrachtet in Bezug auf zellulärem Chromatin, wenn die in nukleosomalen Arrays gebildet ICLs, mit einem 6fache Kompression der verlängerten DNA-Länge, so würden sie nach wie vor durch das Äquivalent von etwa 1,6 kb DNA getrennt werden.
Experimente mit Laser-induzierten DNA-Schädigung folgen im allgemeinen der Induktion der DDR. Diese Experimente werden selten mit Fragen in Bezug auf die DNA-Replikation betroffen. Auf der anderen Seite wird DNA-Faser Assays typischerweise für die Untersuchung der Replikation verwendet. Exposition von Zellen gegenüber kurzen Impulsen von halogenierten Nukleosid-Analoga führt zu deren Einbau in DNA. Immunofluoreszenz-Analyse von DNA-Fasern zeigt Striche eingebaut Analoga letzte DNA-Synthese darstellt. Es war interessant zu fragen, ob die DNA-Replikation in dem Laser lokalisierte ICL Streifen aufgetreten ist, und wenn ja, was das Muster der Replikation in der Nähe der ICLs wäre? Die Zellen wurden 24 h mit CldU inkubiert Anzeige von langen Fasern zu erleichtern. durch einen Impuls von 1 h IdU gefolgt Laser lokalisierten ICLs wurden in Zellen eingebracht. DNA f Ibers wurden aus den Zielzellen hergestellt und die Dig getaggt ICLs und die angezeigten Replikationswege. Die Ergebnisse zeigten, dass die Laseraktivierung des Psoralens nicht Replikation nicht heruntergefahren oder die Gesamtfrequenz-Replikationsmuster beeinflussen. Replikation erfolgte auf der einen Seite und auch auf beiden Seiten der ICLs, mit den doppelseitigen Mustern in einem 4: 1 - Mehrheit wie wir kürzlich 21 gezeigt haben.
Abbildung 1: Erzeugung von Laser Localized Dig-TMP ICLs. (A) Struktur der Dig-trimethylpsoralen. (B) Die Akkumulation von γ-H2AX (grün) in ROI enthaltenden Laser lokalisierte ICLs (Dig, rot). Der Kern ist mit DAPI (blau) gefärbt. Das Hell Foto zeigt eine Zelle teilweise auf der durch den Diamantstift gemacht Marke. Notieren Sie sich die Kernkörperchen und die Platzierung des ROI außerhalb ihnen.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg“target =‚_ blank‘> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: DNA Fasern mit Laser Localized Dig-TMP - Signale. (A) Die Zellen wurden 24 h mit CldU inkubiert DNA zu markieren. Dann Laser lokalisierte ICLs eingeführt und (B) wurden die Zellen geerntet und die Fasern verteilen. (C, D) die Signale mit einer Dig immunoquantum Punkt (rot) und die CldU durch Immunofluoreszenz (grün) angezeigt wurden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Laser-Lokalisierungstechnologie erfordert die Verwendung von adhärenten Zellen mit Kernen, die in Hellfeld-Mikroskopie sichtbar sind. Wir haben versucht, nicht-adhärente Zellen, wie primäre Lymphozyten zu befestigen, oder lose anhaftenden Kulturzellen wie AD293, auf die Glasoberfläche mit zelladhäsiven Zubereitungen wie Polylysin oder Collagen, oder komplexere Mischungen. Obwohl diese Behandlungen die Zellen an die Oberfläche binden kann, finden wir, dass sie in der Regel gerundet bleiben, was es sehr schwierig, in die Zellkerne zu konzentrieren. Außerdem versagen die Zellen häufig den anfänglichen Wasch nach der Entfernung des Wachstumsmediums, um zu überleben. Doch innerhalb der Anforderung für anhaftende Zellen haben wir erfolgreich eingesetzt, eine breite Palette von Standard-Zelllinien sowie Primärzellen für diese Studien. Es ist nützlich, Zellen für Mykoplasmen-Kontaminationen zu testen. Wir finden, dass Zell-Antworten durch diese Infektionen verändert werden.
Die Brennebene des Lasers, ist wichtig. Ziel ist es,legen Sie die ICLs innerhalb des Zellkerns. Zu hoch und die Photoaktivierungs wird über dem Kern sein; zu niedrig, und es wird auf dem Glas sein. Wir finden es sinnvoll, den Fokus des DIC Bildes an der Schnittstelle zwischen dem Zytoplasma und dem Kern zu schärfen.
Die Faser-Assays ist nicht schwierig, aber erfordert einige Übung, bevor interpretierbare Felder zurückgewonnen werden. Es ist wichtig, diese Technik richtig zu implementieren. Die Anzahl der von den Laser-Experimenten gewonnenen Zellen niedrig ist, und jede Probe wird in seiner Gesamtheit auf einem einzigen Objektträger verwendet. Folglich ist es wichtig, die Ausbeute von jedem Versuch zu maximieren, als Proben, die nicht geteilt werden können, mit Teilmengen für eine spätere Analyse gespeichert. Allerdings können Hunderte von Ereignissen aus einer einzigen Probe gewonnen werden. Zwei Merkmale des Verfahrens sind von zentraler Bedeutung. Eine davon ist die Strömungsgeschwindigkeit des Zelllysats auf der Folie. Wenn zu schnell, ein großer Teil der DNA wird die Folie ablaufen. Die Qualität des Glasträgers ist ebenfalls kritisch. Wir reče gelegentlichive viele, die unwirksam sind. Demzufolge hat sich jeder neuen Charge muss vor der Verwendung getestet werden.
Wie bei allen Labors Manipulationen wahr ist die Zuverlässigkeit des kommerziellen Reagenzien-Antikörpers, immunoquantum Punkte, etc., ist immer ein Problem. Diese sind nicht immer stabil und experimentelle Fehler werden in der Regel auf Probleme mit einer oder einem anderen Reagens verfolgt. Die immunoquantum Punkte sind besonders problematisch, und mehr als eine Menge benötigen, um getestet werden, um eine zu identifizieren, die akzeptabel ist. Unwirksame Lose zeichnen sich durch hohe Hintergrundsignale gekennzeichnet. Diese sind nicht mit Fasern zugeordnet ist, und wird auf Bereichen des Schiebers zu sehen ist, die keine DNA sind.
Der Einsatz von Lasern lokalen DNA - Schäden einzuführen ist ziemlich populär geworden , da sie von der Bonner Gruppe 4 eingeführt wurde. In den Ländern, und die meisten nachfolgenden Experimenten die Laserleistung so eingestellt sind, um die DDR direkt zu induzieren. Wir haben eine Leistungseinstellung ausreichend niedrig suc verwendeth, die die Aktivierung der DDR sowohl abhängig von Laser- und Psoralen ist. Wie oben diskutiert, argumentiert die Trennung zwischen Psoralen-Addukte, dass wir bei der Reaktion auf die einzelnen Veranstaltungen suchen. Während die Anzahl der ICLs, die durch endogene Vernetzungsmittel gebildet werden, nicht bekannt ist, stellen wir fest, dass die Lokalisierung der Psoralen-Addukte die Zellen nicht tötet, wie sie die Psoralen-Addukten innerhalb von 6-8 h (nicht veröffentlichte Daten) zu entfernen, sind in der Lage, und vorhanden ist und gesund 24 Stunden später. Somit ist dieser Ansatz viel weniger toxisch für Zellen als Protokolle, die Exposition gegenüber Mitteln erfordern, die DNA-Schäden in dem gesamten Zellkern und Mitochondrien einzuführen.
Der Laser / Psoralen Kombination Einführung einer Helix verzerrenden Struktur, die die DDR zu aktivieren. In dieser Hinsicht der von diesem Ansatz erzielten Ergebnisse sind für eine Reihe von Helix zu verzerren Läsionen, die Kaskadierung Natur der DDR gegeben, nach der Aktivierung des ATM / DNAPK / ATR - Kinasen 22.In diesem Zusammenhang beschriebener DNA Faser Ansatz könnte hier auf jede DNA-Struktur erweitert werden, die durch immunologische oder chemische oder biochemische Mittel nachgewiesen werden kann, das durch Fluoreszenz angezeigt werden kann. Diese könnten UV umfassen Photo 23, sperrige Alkylatoren 24, G Quadruplexen 25 und oxidative Läsionen 5.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde teilweise durch die Intramural Research Program des NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) und dem Fanconi Anemia Research Fund unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5,000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
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