Summary
Lasere blir ofte brukt i studier av den cellulære respons på DNA-skade. Imidlertid genererer de lesjoner hvis avstand, frekvens og kollisjoner med replikasjonsgafler er sjelden karakterisert. Her beskriver vi en tilnærming som gjør det mulig å bestemme disse parametrene med laser lokalisert interkjedede kryssbindinger.
Abstract
DNA-skade Response (DDR) har blitt grundig karakterisert ved studier av dobbeltstrengbrudd (DSB) indusert ved laserbestråling mikro i levende celler. DDR til helix forvrengt kovalente DNA modifikasjoner, inkludert DNA interkjedede tverrbindinger (ICLs), ikke er så godt definert. Vi har studert DDR stimulert av ICLs, lokalisert ved laser fotoaktivering av immunotagged psoralens, i kjernen av levende celler. For å løse grunnleggende spørsmål om addukt distribusjon og replikasjonsgaffelen møter, kombinert vi laser lokalisering med to andre teknologier. DNA-fibre blir ofte brukt for å vise utviklingen av replikasjonsgafler ved immunofluorescens av nukleosidanaloger innarbeidet under korte pulser. Immunoquantum prikker har blitt mye brukt for enkelt molekyl bildebehandling. I den nye fremgangsmåten blir DNA-fibre fra celler som bærer laser lokalisert ICLs spredd ut på objektglass. De merkede ICLs vises med immunoquantum prikker og the inter-lesjon avstander bestemmes. Replication fork kollisjoner med ICLs kan visualiseres og ulike møter mønstre identifisert og kvantifisert.
Introduction
DNA er under konstant angrep fra eksogene midler slik som stråling, ultrafiolett lys, miljøgifter, forbrenningsprodukter, etc. I tillegg er det også angrepet av endogene radikal-forbindelser fremstilt ved oksidativ metabolisme. Alle disse har potensial til å kjemisk eller fysisk å bryte integriteten av DNA-1. Forstyrrelser i genomet kan aktivere DNA skade respons (DDR), en rekruttering og posttranslasjonell modifikasjon kaskade med hundrevis, om ikke tusenvis, av proteiner og microRNAs som er involvert i lesjonen reparasjon, regulering av cellesyklusen, apoptose, begynnende alderdom, og inflammatoriske trasé 2.
De fleste av våre informasjon om DDR kommer fra studier med DSB sin. Dette er i stor grad på grunn av tilgjengeligheten av teknologier for innføring av pauser, inkludert sekvensspesifikke pauser, i genomisk DNA i levende celler 3. I tillegg propensity av pauser for å indusere foci av DDR-proteiner, noe som kan vises ved immunfluorescens, har vært svært nyttig for å identifisere de kinetikk og kravene til responderende proteiner. En av de viktigste teknologiene for å studere DDR ble introdusert av Bonner og kolleger, som brukte en laserstråle til å lede en stripe av DSB sin i en "Region of Interest" (ROI) i kjernen av levende celler 4. I praksis, skapte de en lang fokus hvori proteinene ifølge DDR kunne identifiseres ved immunfluorescens. Dette ble vist ved deres demonstrasjon av den sterke stripe av fosforylert histon H2AX (γ-H2AX) i laser eksponerte celler. Siden den gang har laseren fremgangsmåte blitt anvendt i mange studier av DDR-indusert av DSB. Selv kraftig og populært, og kilden til dramatiske immunfluorescens bilder, bør det bemerkes at i de fleste eksperimenter laser intensiteten justeres slik at det blir observer resultater, uten bekymring for lesjon identitet,tetthet eller avstand. Faktisk kan det være vanskelig å gjøre disse estimatene. Dermed er de i stor grad ignorert, til tross for mangfoldet av lesjoner innført i DNA av lasere 5. Dette bidrar til de mange motsetninger i litteraturen 6.
I motsetning til DSB, har de fleste kjemiske modifikasjoner av DNA som ikke stimulere dannelsen av diskrete områder med DDR proteiner. Dette er viktig i lys av vår nåværende forståelse av lesjon frekvenser. Det har blitt anslått at humane celler i kultur medføre så mange som 50 DSB per cellesyklus, dannet hovedsakelig under S-fase 7, 8, 9. Færre er dannet i ikke-prolifererende celler. Dette står i kontrast med det antall nukleobasen tap eller endringshendelser, som er i titusener pr celle / dag 1, 10. Dermed vet vi mest omDDR indusert av hendelser som er forholdsvis sjeldne, og mye mindre om de som fremkalles av heliksen forvrenge lesjoner, som til sammen er langt mer vanlig.
For å løse spørsmål om den cellulære responsen overfor kovalente modifikasjoner av genomisk DNA, ønsket vi å arbeide med en helix forvrengt DNA-addukt som hadde iboende DDR induksjonsaktivitet. Videre, for å lette eksperimentell design og tolkning vi var interessert i en struktur hvis innføring kunne kontrolleres med hensyn til tid og var mottagelig for visualisering. Følgelig har vi utviklet en strategi basert på psoralen. Psoralener er godt karakterisert fotoaktive DNA-interkalatorer som begunstiger 5' TA: AT områder. I motsetning til andre tverrbindingsmidler som for eksempel nitrogensenneper og mitomycin C (MMC) de er ikke DNA-reaktive med mindre utsatt for langbølget UV (UVA-lys). De innskutte molekylene reagerer med tymin baser på motsatte tråder for å fremstille spiral forvrengt interkjedede tverrbindinger (ICLs) 11. Med trimetyl psoralen ble benyttet i forsøkene de fleste produkter er ICLs, relativt få monoadducts er generert (mindre enn 10%) 12, og intrakjede tverrbindinger mellom nærliggende baser på den ene tråden blir ikke dannet. Fordi de er kraftige blokker til replikasjon og transkripsjon, psoralen og andre tverrbindingsmidler, slik som cis-platina og MMC, blir ofte brukt i kjemoterapi. Således psoralen aktivert studier som fulgte etter aktivering av DDR med en spiral forvrenge struktur, og også gitt innsikt i den cellulære responsen overfor en forbindelse med klinisk betydning.
Vi har syntetisert et reagens hvor trimetyl psoralen var knyttet til digoksigenin (Dig), en plantesterol ikke finnes i pattedyrceller og ofte brukt som en immunotag. Kravet for fotoaktivering tillater lokalisering av laserlys (365 nm) av psoralen ICLs i ROI definert i kjerner i levende celler. Disse kan vises ved immunofluorescence mot Dig tag. DNA-reparasjon og DDR proteinene synes i striper av laser lokaliserte ICLs 13, 14.
DDR aktiveres av de høye laserintensitet som anvendes for å fremstille DSB kan skyldes isolert eller gruppert skade 15, 16. Følgelig relevansen av resultatene fra disse forsøkene til naturlig forekommende lesjoner til stede med mye lavere konsentrasjon, er usikkert. For å møte lignende spørsmål om psoralen addukt frekvens og avstand i DNA, vi tok fordel av DNA fiberteknologi 17 og immunoquantum prikker. Kvanteprikker er mye lysere enn fluorescerende fargestoffer og er ikke bleket ved eksponering for lys. Dermed er de ofte brukt for enkelt molekyl avbildning 18, en søknad som fluorescerende fargestoffer er utilstrekkelig lys. Individuelle DNA-fibre kan strekkes på glass lysbilder og kan vises ved immunfluorescens mot nukleosidanaloger innarbeidet under inkubering før celle innhøsting. Vi behandlede celler med Dig-psoralen og eksponert ROI til laseren mikro bestråling. Fibre ble fremstilt fra cellene og enkelte Dig-psoralen-addukter kan bli visualisert med de immunoquantum prikker. Å utsette cellene for nukleosidanaloger for forholdsvis kort tid (20-60 min) tillater visning av replikasjonskanalen i nærheten av laser lokalisert ICLs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av Dig-TMP
- Bland 50 mg (0,18 mmol) 4'-klormetyl-4,5' , 8-trimethylpsoralen og 590 mg (2,7 mmol) av 4,7,10-trioksa-1,13-tridecanedi-amin i en tørr 25 ml rund -bottom kolbe under nitrogen. Tilsett 10 ml toluen og tilbakeløpskjøling i 12 timer. Fjern løsningsmidlet i en rotasjonsfordamper under redusert trykk.
- Rens residuet ved flash-kolonnekromatografi over silicagel. Kolonnen ble eluert med kloroform, metanol og 28% ammoniakkløsning (9: 1: 0,5). Fordamp løsningsmidlet i en rotasjonsfordamper under redusert trykk, og gjenvinne den rene 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometyl-4,5', 8-trimethylpsoralen som en blekgul viskøs væske.
- Bland 5,5 mg (0,012 mmol) 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometyl-4,5', 8-trimethylpsoralen med 5 mg (0,008 mmol) digoksigenin NHS-ester i en tørr rundkolbe under nitrogen. Tilsett 0,5 mL vannfritt dimetylformamid (DMF) etd 3,4 mL av trimetylamin og omrør ved 50 ° C i 18 timer.
- Fjern løsningsmidlet i en rotasjonsfordamper under redusert trykk.
- Oppløs residuet i minimumsmengde diklormetan. Påfør løsningen i 2 pl flekker horisontalt over bunnen av en preparativ tynnskikt-plate med silikagel som stasjonær fase. Kjør preparativ TLC i kloroform: metanol: 28% ammonium hydroksyd (8: 1: 0,1).
- Maskere platen med unntak av de vertikale kanter og identifisere båndet av produktet med kort bølgelengde UV-lampe 254 nm. Skrap produktet fra platen med en spatel og isolere det rene produkt ved bruk av kloroform: metanol: 28% ammonium hydroksyd (8: 1: 0,1) blanding.
- Fjern løsningsmidler i en rotasjonsfordamper under redusert trykk. Oppløs det gjenværende pelletene i 1 ml 50% EtOH: H2O, avgi til 50 ul aliquoter i 1,5 ml rør (~ 20 aliquoter) og tørk i en sentrifugefordamper inntil alt løsningsmidlet dampes (~ 3 timer).
- Oppløs hver alikvot på 200 ul av 50% EtOH: H2O og tørr igjen i en sentrifugefordamper. Oppløs hver prøve på nytt i 200 ul av 50% EtOH: H2O, tørk i en sentrifugalgranulator fordamper og lagre pellets ved -20 ° C for langtidslagring.
- For anvendelse oppløse pelleten i 50 mL av 50% EtOH: H2O Fremstill en 1: 100 fortynning av den oppløste Dig-TMP i H2O og måle OD ved 250 nm. Ekstinksjonskoeffisienten av Dig-TMP er 25.000. Løsningen er stabil i omtrent en måned når den lagres ved -20 ° C. Bekrefte konsentrasjonen ved måling av OD ved 250 nm før hver bruk.
- Beregn stamkonsentrasjon: Abs x 100 x10 6 / 25.000 = konsentrasjon (i uM). Typisk lagerløsningen er ca. 3 mm. Det er viktig å være i dette område for å minimalisere volumet av EtOH ble tilsatt til mediet.
2. Laser Lokalisert Dig-TMP ICLs
- Perform laser lokalisering med et konfokalt mikroskop med en SRS nitrogen laser (337 nm) pumpes gjennom et fargestoff celle sender ut en linje av 365 nm og avfyring 3 ns pulser med 10 Hz, med en kraft på 0,7 nW.
- Lage et vertikalt merke på siden av et 35 mm glassbunn-cellekulturskål med en tusjpenn. Skrap et kors i midten av glasset på kulturoverflaten med en diamant penn slik at den sorte stripe på siden av fatet er på toppen av den ene arm av korset. Tverr er merket på veksten overflaten av glasset, slik at den og vil cellene være i det samme fokalplan.
- Steril platen etter markering med en skylling på 70% EtOH. Tørr før plating celler.
- Plate-celler (standard laboratoriestammer slik som HeLa eller U2OS) i kryss merket kulturskåler en eller to dager før. Celle må være aktiv deling og 50-70% konfluent på dagen for eksperimentet. Inkuber i 24 timer med 1 pM 5-klor-2-deoksyuridin (CldU) for jevnt å merke DNA.
- Legg tilDig-TMP i 50% EtOH: H2O til cellekulturmedium til en sluttkonsentrasjon på 20 uM. Bringe mediet til 37 ° C. Skift medium til de forskjellige cellene og plasseres i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2) i 30 min for å tillate at Dig-TMP å komme i likevekt.
- Mens cellene ruger, etablere X / Y-koordinatene til synsfeltet karakterisert ved at laseren er aktiv. Følge fabrikantens kalibreringsprosedyren karakterisert ved at laseren er rettet av programvaren for å etse en speilglassplate langs en horisontal og diagonal linje. De to linjene definerer grensene for feltet i hvilket lasers kan treffe et mål.
- Sett platen i miljøkammeret, ved 37 ° C med kontrollert CO2 og fuktighet, på mikroskopets objektbord og fokus med 60X objektiv olje på skjæringspunktet mellom korset.
- Rett 365 nm laserstrålen til en ROI, etablert av undersøkeren med formen verktøy i programvare, for å danne en stripe av 3-# 181; mx 0,6 um. Omrisset av ROI er plassert med markøren i kjerner av celler som er lokalisert i umiddelbar nærhet av skjæringspunktet mellom korset. Juster z fokalplan for å målrette laseren midtveis i kjernen. Bruke en laser i området 350-370 nm. 405 nm lasere kan ikke fremcrosslinks 19.
MERK: Vi lokalisere avkastningen i nucleoplasmic områder utenfor nucleoli, som kan skilles fra nukleoplasma i differensialinterferenskontrast (DIC) avbildning. - Verifisere fokus og aktiviteten av laseren ved å øke effekttrinnet til et nivå som er tilstrekkelig til å utslette en celle (cellen vil mørkne og deretter forsvinne). Dette er et viktig diagnostisk for en uhindret lysbanen for laseren gjennom mikroskopet og deretter gjennom dekkglass og inn i cellene.
- Senk effektinnstillingen til akkurat nok til å aktivere psoralen og ICL indusert DDR (dette må bestemmes empirisk for hver laser / microscope kombinasjon). Bruker en laserintensitetsinnstilling (1,7% her) som ikke aktiverer DDR i fravær av psoralen (overvåket ved dannelsen av γ-H2AX).
MERK: Dette er en viktig bestemmelse og innstillingene kan kreve justering dersom laserkilde eller en komponent i lysbanen endres. Følge av opphopning av GFP tagget reparasjons proteiner slik som XPC eller FAN1, som begge er hurtig rekruttert (i sekunder) for å laser psoralen striper, men ikke for å ROI utsettes for lasers alene. Noen proteiner av DDR vises i løpet av sekunder, mens flere minutter kan være nødvendig for andre. Det er nødvendig å utføre tidskurs bestemmelser for hvert protein av interesse. Vi merker oss også at i celler som ikke ble utsatt for laser det ikke er noen striper av responderende proteiner.
- Senk effektinnstillingen til akkurat nok til å aktivere psoralen og ICL indusert DDR (dette må bestemmes empirisk for hver laser / microscope kombinasjon). Bruker en laserintensitetsinnstilling (1,7% her) som ikke aktiverer DDR i fravær av psoralen (overvåket ved dannelsen av γ-H2AX).
- Etter at alle celler i et felt er rettet bevegelse av platen til et nytt felt, å holde seg nær skjæringspunktet mellom korset.
- I eksperimenter designet for å determine fordelingen av inter lesjoner avstander eksponere cellene til laseren i 20-25 felter (4-5 celler / felt) rundt skjæringspunktet. For å analysere replikasjonsmønstre i nærheten av de lokaliserte ICLs inkubere celler med 10 pM 5-Jod-2-deoksyuridin (IDU) etter laser avfyring.
MERK: inkubasjonstiden med IDU er noe vilkårlig. Vi har brukt så kort som 20 minutter, og så lenge som 60 minutter (se nedenfor). Lengre pulser (noen få timer) ofte resultere i flere replikering traktater fortetting, og dermed miste muligheten til bilde fremdriften av enkelt gafler. I noen eksperimenter ces er merket med CldU i 24 timer for jevnt å merke DNA før eksponering til Dig-TMP fulgt av pulsmerking av replikasjonskanalen.
3. innhøsting av celler og strekking av DNA-fibre
- Fjern platen fra scenen, fjern mediet og vask med fosfatbufret saltvann (PBS). Fjern PBS løsning. Plasser en 10 ul dråpe av en kommersiell trypsin/ EDTA-løsning på skjæringspunktet av korset i midten av den glassoverflate.
- Inkuber i 3-4 minutter ved romtemperatur (RT) og deretter trekke trypsinoppløsning med de frigjorte celler inn i pipettespissen. Det er ikke nødvendig å nøytralisere trypsin.
- Plasser dråpe trypsin / EDTA med cellene i den ene enden av et silanbehandlet glassmikroskopslide. Lysere cellene og frigjøre DNA ved tilsetning av 10 ul 0,5% SDS-løsning og inkuberes i 3-4 minutter ved romtemperatur blandes forsiktig med pipettespiss, slik at omkretsen av bassenget for å tørke.
- Vippe sleiden 20 ° og la væsken renne ned til enden. DNA-fibrene er utvidet / strekkes av de hydrodynamiske kreftene i den strømmende væske. La den glir lufttørke (~ 10 min) og feste i 3: 1 metanol / eddiksyre i 10 min. Fjern lysbilder fra fix løsning og lufttørke igjen. På dette punkt kan de lagres på ubestemt tid i 70% EtOH ved -20 ° C. Ved fjerning fra 70% EtOH og lufttørke før den next trinn.
- Vask objektglass i PBS, og deretter denaturere i 2,5 M HCl i 1 time ved RT. Denne behandlingen depurinates DNA gjøre de inngående halogenerte nukleobaser er tilgjengelig for antistoffer.
- Nøytraliser glir i 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Vask to ganger i PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) i 5 minutter hver.
- Blokk glir med 5% bovint serumalbumin (BSA) og 10% geiteserum i PBS. Dekk lysbildene forsiktig med en parafilm for å spre blokkeringsoppløsningen jevnt over glidestykket og inkuberes i 1 time ved romtemperatur.
- Pipetter 100 ul av 1: 200 fortynning i blokkeringsløsning av rotte anti-bromdeoksyuridin (spesifikt detekterer CldU) primært antistoff til hvert objektglass. Dekk lysbildene forsiktig med en parafilm for å spre fortynning jevnt over glidestykket og inkuberes i et fuktig kammer i 1 time ved RT. Fjern parafilm og vaske objektglassene tre ganger i PBST i 5 minutter hver.
- Pipetter 100 ul av fortynnet (1: 100) geit anti-rotte Alexa Fluor 647 i blokkeringsløsning til hvert objektglass. dekkglir forsiktig med en parafilm og inkuberes i 45 min ved RT. Vask objektglassene tre ganger i PBST i 5 minutter hver.
- Pipetter 100 ul av fortynnet (1:40) mus anti-bromdeoksyuridin (detekterer LDU og CldU Denne doble spesifisitet nødvendiggjør blokkering av CldU av rotte anti-BrdU i den forutgående inkubering.) Primært antistoff og kanin anti-DIG-antistoff (1: 200 ) i blokkerende oppløsning til hvert objektglass. Dekk lysbildene forsiktig med en parafilm og inkuberes i et fuktig kammer i 1 time ved RT. Vask objektglassene tre ganger i PBST i 5 minutter hver.
- Pipetter 100 ul av fortynnet (1: 100) geite-anti-muse-Alexa Fluor 488 andc (1: 5000) geite-anti-kanin-probe (f.eks Qdot 655) i blokkerende oppløsning til hvert objektglass. Dekk lysbildene forsiktig med parafilm og inkuberes i 45 min ved RT. Vask objektglassene tre ganger i PBST i 5 minutter hver.
- Drenere overflødig PBST på et papirhåndkle. Tilsett 50 ul av anti-bleking monteringsmedium på hvert objektglass og dekkes med et dekkglass. Bilde eller butikken forikke mer enn 48 timer ved -20 ° C.
4. Fiber Imaging av Fluorescensmikroskopi
- Utføre bildeinnsamling gjennom et 63X objektiv på et invertert mikroskop med en tilknyttet motorisert filterhjul med FITC, Cy5 og Q-Dot 655 deteksjon. Den eksitasjonsfilteret er 425 nm, og emisjonen filter er 655 nm med 20 nm sentrert på emisjonstopp 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laser lokaliserte Dig-TMP (figur 1A) ICLs kan vises ved immunfluorescens mot Dig-tag koblet til psoralen. Selv om laseren kan rettes for å slå på et område av en hvilken som helst kontur, striper er ikke "naturlige" form i celler, og legitime signaler som lett kan skilles fra artifakter på grunn av ikke-spesifikk binding av primære eller sekundære antistoffer. Denne funksjonen er nyttig når du bruker antistoffer på mindre enn perfekt spesifisitet. Et eksempel på den kjente markør av DDR, γ-H2AX, i en stripe av Dig-TMP ICLs er vist i Figur 1B.
Den immunfluorescens av de Dig merket lesjoner i laserstriper ikke tillater noen konklusjoner med hensyn til frekvens og avstanden mellom addukter. For å kunne foreta denne bestemmelsen ble cellene inkubert med CldU i 24 timer før innføring av ICLs. Fargingen mot the CldU tillater visualisering av Dig merket lesjoner på lange fibre og gir klarere fibermønstre enn direkte flekker som DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) eller YOYO {1,1' - (4,4,8 , 8-tetrametyl-4,8-diazaundecamethylene) bis [4 - [(3-metyl-1,3-oksazol-2-yl) metyliden] -l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide}. Etter innføringen av ICLs med laser fotoaktivering, ble fibrene spredd fra målcellene. Analysen av Dig signaler på fibrene, slik som de som er vist i figur 2 viser at de sammen ICL avstander varierte fra mindre enn 10 kb til mer enn 160 kb, som beskrevet i vår nylig publikasjon 21. Det var ingen bevis for gruppert addukter. Dermed stripe av Dig tag, og akkumulering av de DDR proteiner i den stripe, reflekterte nærvær av godt atskilt fra hverandre lesjoner, i det minste målt langs den utstrakte DNA. Betraktet i forhold til celle kromatin dersom ICLs dannet i nukleosomale matriser, med en 6fold kompresjon av forlengede DNA lengde, vil de fortsatt bli separert ved tilsvarende ca. 1,6 kb av DNA.
Eksperimenter Med laser-indusert DNA-skade generelt følge induksjonen av DDR. Disse eksperimentene er sjelden opptatt av spørsmål om DNA-replikasjon. På den annen side, blir DNA-fiber-analyser som typisk anvendes for studier av replikasjon. Eksponering av cellene til korte pulser av halogenerte nukleosidanaloger resultater i deres inkorporering i DNA. Immunofluorescens-analyse av DNA-fibre viser områder med inkorporerte analoger som representerer siste DNA-syntese. Det var av interesse å spørre om DNA-replikasjon skjedde i laser lokalisert ICL striper, og i så fall, hva ville være et mønster av replikering i nærheten av de ICLs? Celler ble inkubert i 24 timer med CldU å lette visningen av lange fibre. Laser lokalisert ICLs ble innført i cellene, etterfulgt av en 1 time puls av IDU. DNA f ibers ble fremstilt fra målcellene og grave tagget ICLs og replikasjonskanalen vist. Resultatene indikerte at laser aktivering av psoralen ikke avslutter replikasjon eller påvirke den totale frekvensen av replikering mønstre. Replication skjedde på den ene siden, og også på begge sider av ICLs, med tosidige mønstre i en 4: 1 flertall som vi har nylig vist 21.
Figur 1: Generering av Laser Lokalisert Dig-TMP ICLs. (A) Oppbygging av Dig-trimetyl-psoralen. (B) Oppsamling av γ-H2AX (grønn) i ROI inneholdende laser lokaliserte ICLs (dig, rød). Kjernen er farget med DAPI (blå). Den lysfelt Bildet viser en celle delvis på mark laget av diamant penn. Merk nukleolene, og plasseringen av ROI utenfor dem.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: DNA-Fibre med laser Lokalisert Dig-TMP-signaler. (A) Celler ble inkubert i 24 timer med CldU å merke DNA. Da laser lokalisert ICLs ble innført og (B), ble cellene høstet og fibrene spres. (C, D) DIG-signalene ble angitt med en prikk immunoquantum (rød) og den CldU ved immunofluorescens (grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laseren lokaliseringsteknologi krever bruk av adherente celler med kjerner som er synlige i lysfelt-mikroskopi. Vi har forsøkt å feste ikke-adherente celler, så som primære lymfocytter, eller løs klebrig dyrkede celler slik som AD293, med glassoverflaten med celle adhesive preparater, så som polylysin eller kollagen, eller mer komplekse blandinger. Selv om disse behandlingene kan binde cellene til overflaten, finner vi at de som regel bli avrundet noe som gjør det svært vanskelig å fokusere på kjernen. Videre er cellene ofte ikke å overleve den første vask etter fjerning av vekstmediet. Men innenfor kravet for heftende celler, vi har med hell brukt et bredt spekter av standard cellelinjer så vel som primære celler for disse studiene. Det er nyttig å teste celler for mycoplasma forurensning. Vi finner at celle responser er endret av disse infeksjonene.
Fokalplanet for laseren er viktig. Målet er åplassere ICLs i kjernen. For høy og fotoaktivering vil være over kjernen; for lav, og det vil være på glasset. Vi synes det er nyttig å skjerpe fokus på DIC bilde i skjæringspunktet mellom cytoplasma og kjernen.
Fiber analyser er ikke vanskelig, men krever en viss øvelse før tolkbare felt er gjenvunnet. Det er viktig å gjennomføre denne teknikken ordentlig. Antallet celler gjenvunnet fra laseren eksperimentene er lav, og hver prøve er brukt i sin helhet på en enkelt lysbilde. Følgelig er det viktig å maksimere utbyttet fra hvert forsøk som prøvene ikke kan deles, med alikvoter lagret for senere analyse. Men hundrevis av hendelser utvinnes fra en enkelt prøve. To trekk ved inngrepet er av sentral betydning. Den ene er den strømningshastighet av cellelysatet nedover lysbildet. Hvis for fort, vil mye av DNA kjøre av raset. Kvaliteten på glassplater er også kritisk. Det hender at vi receive mange som er ineffektive. Følgelig hvert nytt parti må testes før bruk.
Som gjelder for alle laboratorie manipulasjoner påliteligheten av kommersielle reagenser-antistoffer, immunoquantum prikker osv, er alltid en bekymring. Dette er ikke alltid er stabile og eksperimentelle feil blir vanligvis spores tilbake til problemer med ett eller annet reagens. De immunoquantum prikkene er spesielt problematisk, og mer enn ett parti kan ha behov for å bli testet for å identifisere en som er akseptabelt. Ineffektive mange er preget av høye bakgrunnssignaler. Disse er ikke forbundet med fibre, og vil bli sett på områder av objektglasset som ikke har noen DNA.
Bruk av laser for å innføre lokal DNA-skader har blitt ganske populær siden den ble introdusert av Bonner gruppe 4. Hos dem, og de fleste etterfølgende eksperimenter laserstrøminnstillinger er satt slik som å indusere DDR direkte. Vi har brukt en strøminnstilling tilstrekkelig lav such at aktiveringen av DDR er avhengig av både laser og psoralen. Som diskutert ovenfor, avstanden mellom psoralen addukter hevder at vi ser på responsen på enkelthendelser. Mens antall ICLs som er dannet av endogene tverrbindingsmidler ikke er kjent, ser vi at lokaliseringen av psoralen-addukter ikke dreper celler, som de er i stand til å fjerne psoralen-adduktene i 6-8 h (upubliserte data) og er til stede og sunn 24 timer senere. Derfor er denne tilnærmingen er mye mindre toksisk overfor celler enn protokoller som krever eksponering for midler som innfører DNA-skade i hele kjernen og mitokondrier.
Laseren / psoralen kombinasjon innføre en heliks forvrengt struktur som aktiverer DDR. I denne forbindelse de oppnådde resultater fra denne tilnærmingen er anvendelig til en rekke Helix forvrenge lesjoner, gitt den brusende karakter av DDR, etter aktivering av ATM / DNAPK / ATR-kinaser 22.I denne forbindelse DNA fiber metode som er beskrevet her kan bli utvidet til enhver DNA-struktur som kan påvises ved hjelp av immunologiske eller ved kjemiske eller biokjemiske midler som kan vises ved fluorescens. Disse kan omfatte UV-fotoprodukter 23, voluminøse alkylatorer 24, G quadruplexes 25, og oksidative skader 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet delvis av egenutført Research Program fra NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) og Fanconi Anemi forskningsfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5,000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB? Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T.
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
