Kirurgisk Ablation Assay for studere Eye Regeneration i planarier

Summary

Denne protokol viser, hvordan man konsekvent punktafgifter planarian øjne (optiske kopper) uden at forstyrre omgivende væv. Ved anvendelse af en insulin nål og sprøjte, enten den ene eller begge øjne kan ablateres at lette undersøgelser af mekanismer, der regulerer øje regenerering, udviklingen af ​​visuelle regenerering, og det neurale grundlag af lysinduceret adfærd.

Abstract

I undersøgelsen af voksne stamceller og regenerative mekanismer, planarian flatworms er en hæfteklamme in vivo modelsystem. Dette skyldes for en stor del af deres rigelige pluripotente stamceller befolkning og evne til at regenerere alle celle- og vævstyper efter skader, der ville være en katastrofe for de fleste dyr. For nylig har planarierne vundet popularitet som en model for øje regenerering. Deres evne til at regenerere hele øjet (bestående af to vævstyper: pigmentceller og fotoreceptorer) muliggør en dissektion af mekanismer, der regulerer visuelle system regenerering. Øje ablation har flere fordele frem for andre teknikker (såsom halshugning eller hulning) for at undersøge eye-specifikke veje og mekanismer, hvoraf de vigtigste er, at regenerering er stort set begrænset til øjenvæv alene. Formålet med denne video artikel er at vise, hvordan man pålideligt fjerner planarian optiske kop uden at forstyrre hjernen eller omgivende væv.Håndteringen af ​​orme og vedligeholdelse af en etableret koloni er også beskrevet. Denne teknik anvender en 31 G, 5/16 tommers insulin nål til kirurgisk øse ud af optiske kop planarierne immobiliseret på en kold plade. Denne metode omfatter både enkelt og dobbelt øje ablation, med øjne regenererende inden for 1-2 uger, hvilket muliggør en lang række anvendelser. Især kan denne ablation teknik let kombineres med farmakologiske og genetiske (RNA interferens) skærme for en bedre forståelse af regenerative mekanismer og deres udvikling, eye stamceller og deres vedligeholdelse og phototaxic adfærdsmæssige reaktioner og deres neurologiske basis.

Introduction

Planarierne er en kraftfuld model organisme til undersøgelse voksne stamceller cellemedieret regeneration. Disse ikke-parasitære ferskvands flatworms besidder evnen til at regenerere enhver og alle manglende væv, herunder det centrale nervesystem og hjerne ^1. Studeres som langt tilbage som 1700-tallet ^2, teknologiske fremskridt i planarian område i løbet af de sidste 10-15 år (såsom et genom, in situ hybridisering, immunhistokemi, RNA-interferens (RNAi), og transcriptomics) har opdateret denne historiske model organisme . Konkret har planarierne nylig vundet popularitet som en ny model for øje forskning ^3.

Planarierne har prototypiske øjne med kun to vævstyper, fotoreceptor neuroner og pigmentceller; dette har gjort det muligt karakteriseringen af ​​dets eye stem-cellepopulation og viste, at mange af de samme gener regulering hvirveldyr øje deling er konserveret i planarierne ^{4, 5.} De optiske adapter er placeret dorsalt og består af de hvide, upigmenterede dendritter af fotoreceptor neuroner og de semi-lunar sort pigmentceller, og øjnene innerverer hjernen via en optisk chiasm. Ud over at være en model til at belyse regenerative processer ^6, den planarian øje er velegnet til at studere udviklingen af visuelle mekanismer ^7, adfærdsmæssige reaktioner for lys (planarierne vise negativ phototaxis) ^8, og den neurologiske grundlag af adfærd ^9.

Øje regenerering i planarierne har i vid udstrækning undersøgt i to vigtigste sammenhænge: som en del af hoved regeneration efter halshugning ^{4, 10,} og efter udskæring af blot øjenvæv ^{11, 12 13, 14,} selv om nogle undersøgelser også har udført amputationer lige bag øjnene (delvis decapitation) ^15. Men alle disse metoder involverer tab af andre end blot øjet mange væv (såsom hjerne, tarme, og nephridia), potentielt komplicerer fortolkning af resultaterne. Øjet ablation protokol præsenteres her begrænser udskæring til øjenvæv (specifikt ekskl hjernen), hvilket resulterer i data, som er mere specifikke for øjet. Derudover, i modsætning halshuggede orme, der tager 7-14 dage for at begynde fodringen, vil øjet ablateret orme foder inden 24 timer af ablation ^12, tillader RNAi forsøg (hvor RNAi leveres via fødevarer), der skal performed samtidigt.

Selvom øje ablation er teknisk sværere at kunne udføre end halshugning, har de nuværende undersøgelser med øje excision ikke inkluderet detaljerede instruktioner om deres procedurer. Målet med denne video artikel er at gøre det muligt for forskerne at konsekvent fjerne planarian optiske kop uden at forstyrre de underliggende hjernen væv og fjerne så få andre væv som muligt. Denne metode kan anvendes til både enkelt og dobbelt øje ablation og gælder for en lang række undersøgelser. Ligesom de fleste restitution assays øje ablation velegnet til kombination med både farmakologiske og genetiske (RNAi) skærme samt adfærdsmæssige undersøgelser. Her beskriver vi fremgangsmåder til håndtering af orme, at opretholde en planarian koloni, og øjet ablation teknik selv.

Protocol

1. Animalske Kultur og håndtering

BEMÆRK: Denne protokol anvender Schmidtea mediterranea, en diploide planarian arter med en genom ^{16, 17,} som er almindeligt anvendt til regenerering forskning. Men assayet er lige så vellykket med andre arter, såsom Girardia tigrina og Girardia dorotocephala (der er kommercielt tilgængelige).

1. Opretholde orme i "orm vand" lavet fra 0,5 g / L havsalte i ultrarent (eller filtreret deioniseret) vand. Brug sterile polypropylen eller glasbeholdere til at holde ormen vand. Se Supplerende Fil 1 for detaljer om forberedelse orm vand.
   BEMÆRK: Brug aldrig sæbe til at rense beholdere (eller andre forsyninger) som sæbe er toksisk for orme; i stedet tørres af med 70% ethanol og lad det lufttørre. <ol>
2. Brug handsker, når du arbejder med Planaria for at beskytte dem mod forurening.
   BEMÆRK: Orme er meget følsomme over for miljømæssige toksiner og kemikalier, herunder sæbe, blegemiddel, shampoo, balsam, og håndlotion.

Hus kolonier i polypropylen fødevarebeholdere, med låget efterladt delvis åben for luftudskiftning ved ~ 20 ° C (stuetemperatur). Store eksperimentelle orme i enten petriskåle (20 orme pr 100 mm skål) eller ikke-behandlede vævskultur-plader (1 orm per brønd for 12-brøndsplader). For at reducere stress, holde begge kolonier og eksperimenter i mørke.
BEMÆRK: Kolonier bør ikke have mere end 500-1.000 orme per liter orm vand. Til eksperimenter, efterlader låg helt på plads, da luftstrømmen er designet ind i disse retter.

Foder ikke-eksperimentelle orme gang om ugen med pureret økologisk oksekød eller kylling lever ved at slippe puré fra en overførselspipette, anbringelse dråber af fødevarer i hele beholderen. Tillad orme 2 timer for at forbruge fødevarer imørke før rengøring ud beholder (se trin 1.4). Før anvendelse opbevare puré ved -20 ° C i kortfristede (uger) eller -80 ° C til langsigtet (måneder); må ikke nedfryses igen puré til genbrug (som bakterier kan blomstre og skade orme).
BEMÆRK: Lever bør indeholde nogen hormoner eller antibiotika og helst ikke tidligere frosne. Centrifuge puré før frysning (eller før udfodring) for at fjerne luft og forhindre mad fra flydende. Mad skal synke til bunden af ​​beholderen. 1 ml puré er tilstrækkelig til 500-1.000 orme.

Exchange vand en gang om ugen med frisk orm vand for både kolonier og eksperimenter. Koloni beholdere bør også tørres af med en ubleget papirserviet (for at fjerne slim rester, fælde affald) en gang om ugen for at sulte orme eller to gange om ugen til fodring orme (2 timer efter fodring og igen 2 dage senere). For at fastholde biofilmen, ikke tørre mere end 80% af beholderen.

Flytte orme mellem beholdere (eller kirurgi indstilling ep) under anvendelse af en overførsel pipette. Til gratis orme klæbet til beholderoverflader, sprøjte vand over / bag ormen for at frigøre det fra overfladen. Så suge op ormen ind i pipetten, mens du prøver at holde ormen i bunden tommer (tyndere) del af pipetten.

1. Backload pipetter med en lille mængde orm vand før suger dem op.
2. Prøv at flytte vandet rundt ormen, snarere end selve ormen, for at forhindre at rive bløde og rørige orme ved at røre dem med pipetten.
3. Hold eksperimentelle retter dækket medmindre overføre orme eller udskiftning vand.

2. Fremstilling

1. Stop fodring orme mindst en uge forud for eksperimenter.
   1. Vælg orm, der ikke er blevet fodret til ≥1 uge og er mindst 5-7 mm i længden. Overfør ormene til en petriskål 2/3 fuld af orm vand, og bekræft orm længde ved at skyde en lineal under fadet. måle wOrms mens helt ud, og bevæger sig.
      BEMÆRK: Mens mindre (5-7 mm) orme fungere bedre, når der udføres efterfølgende immunofluorescens og in situ hybridiseringsanalyser, større orme (8-10 mm) er nemmere at arbejde med - især når lære at ablatere.
   2. Sørg for, at orme er hele, ubeskadigede, og ikke for nylig regenerere.
      BEMÆRK: Regenerating orme vil have meget lysere (eller ingen) pigment i hovedet og / eller hale region som sammenlignet med normale orme.
   3. Hvis der udføres RNAi eller farmakologiske behandlinger på orme, så gør det på dette punkt. Hvis orme blev tilført som en del af behandlingen (som for RNAi), vente i mindst 7 dage efter den sidste fodring før du fortsætter til trin 2.2.
2. Rengør arbejdsplads og dissektionsmikroskop base med 70% ethanol og lad den tørre helt. Sæt fadet af udvalgte orme til venstre for rækkevidde. Til højre for anvendelsesområdet, placere et par # 5 pincet, en 31 G 5/16 tommer insulin nål med en 1ml sprøjte, og en ren overførselspipetten.
   1. Sikre, at instrumenterne holdes fra at røre bænken (som kunne indføre kontaminanter). Brug en stiv punkt (såsom en spisepindeleje) for at holde tang, nåle- og pipette ren. Alternativt place instrumenter på toppen af ​​en frisk brun (ubleget) papirserviet.
      BEMÆRK: Disse og efterfølgende instruktioner er skrevet, da de vedrører højrehåndede personer. Venstrehåndede personer skal vende højre / venstre retninger.
3. Ved siden af ​​arbejdet rum, placere en kasse med fnugfri væv klude, en kilde til frisk orm vand, og nogle ekstra overførselspipetter (beskyttet mod bænken toppen). Sted orm vand i en plast vaskeflaske for at lette dispensering. lægger også et mærket 12-brønds plade (eller 100 mm petriskål) til højre for anvendelsesområdet til opsamling ablerede dyr.
4. Hvis der anvendes en skræddersyet Peltier plade for at immobilisere orme, placere Peltier plade ned i fordybningen i than base af dissektionsmikroskop og justere outputtet på jævnstrømskilden indtil arbejdsoverfladen af ​​Peltier plade er tilstrækkeligt afkølet (typisk -5 V) .Alternatively, lave en kold plade ved at fylde en 100 mm petriskål ½ fuld med vand og fryse i mindst 24 timer. Kassér låget, og læg i bunden af ​​100 mm skål i bunden af ​​dissektionsmikroskop, og derefter placere låget på en 60 mm petriskål hovedet direkte på overfladen af ​​isen (figur 1A).
   1. Efter at vandet er frosset i 100 mm skål, kan en "vulkan" af is vises i midten af ​​pladen. Hvis dette sker, bruge et barberblad til at skrabe is flad, for at fjerne eventuelle uregelmæssigheder fra overfladen.
      BEMÆRK: Under operationer isen smelter, hvilket gør ablationer meget vanskeligere. Forberede flere is retter i forvejen, og erstatte frosne dem til smeltning dem under assayet, så snart låget af 60 mm skål begynder flydende.
5. Forberedkirurgi overflade. Skær en 5 cm x 10 cm stykke plast paraffin film (4 ^cm2 hvis anvendelse petriskålen kold plade) og placere den på midten af imobiliseringsanordning. Fold en fnugfri væv tørre i en firkant omtrent 2 ^cm2 og placere den på toppen af folien. Skære et stykke hvidt filterpapir 1,5-2 ^cm2 og placere den på toppen af servietten. Se Figur 1B-1E.
   1. Hold foldet serviet på plads med en behandsket finger, og bruge orm vand til let dæmpe tørre at sikre, at den forbliver foldet. Brug den side af en overførsel pipette til at rulle den tørre fladt.
      BEMÆRK: Kolde temperatur hjælper med at holde orme i at bevæge sig. Arbejde "tør" hjælper også i immobilisering. Vævet tørre virker til at væge vand gennem filterpapir, holde ormen fugtig under kirurgi uden at tillade orme at tørre helt ud (som er dødelig).

3. Kirurgisk Ablation

1. Brug en overførsel pipette til at placere påe orm dorsale side op på filtrerpapir. Drej lyskilden på og lede svanehals, så lyset er fokuseret på ormen. Juster dissekere omfang fokus og forstørrelse, så øjnene er tydeligt (hele ormen behøver ikke at være i betragtning); 5X forstørrelse er et godt udgangspunkt. Orientere ormen ved at dreje paraffin film så hovedet peger mod forskeren (mod forsiden af ​​mikroskopet), vinklede 30-40 grader til højre.
   1. Undgå brug af stærkt lys til at forhindre overskydende orm bevægelse. Planarierne vise negative phototaxis og vil forsøge at unddrage sig skarpt lys.
   2. Hvis ormen er anbragt ventrale side opad (med svælg åbning synlig), brug matte side af tangen til forsigtigt repositionere ormen dorsale side op (med øjne synlige). Undgå nærmer dyret med den skarpe spids af tangen for at minimere risikoen for at rive gennem blødt væv, når repositionering dyret.
2. Hold en frisk nål / sprøjte i højre hånd, som om det var en pen (mellem tommel- og pegefinger). Afstive venstre tommelfinger mod Peltier plade (eller en petriskål kold plade), og bruge den venstre tommelfinger som et omdrejningspunkt, hvor den nederste del af sprøjten vil hvile (figur 2A). Kig gennem mikroskopet, og sørg facet af nålen er synlig.
   BEMÆRK: Nåle er meget skarpe. Vær forsigtig, når du håndterer dem. Iført latex eller nitril handsker kan yde en vis beskyttelse.
   1. Brug venstre tommelfinger til at hjælpe med at holde nålen / sprøjten støt under hele proceduren og undgå at ryste hænder.
   2. Danner en vinkel på ca. 40 ° med venstre tommelfinger og venstre pegefinger (med pegefingeren på operationsdagen overflade) for at hjælpe med at holde kirurgi overflade stabil.
3. Medaffasningen af ​​nålen opad (ligesom en ske) skubbes nålen vinkelret på øjet (figur 2B). Brug spidsen af ​​nålen til forsigtigt gennemtrænge det tynde lag af væv, der ligger over den optiske kop (hvid, upigmenteret region) i øjet, øse fra højre til venstre. Meget forsigtigt fjerne pigmenteret væv beliggende inden for optiske kop, pas på ikke at punktere bunden eller ødelægge grænser optiske kop.
   1. Hvis ormen har været på filtrerpapir til> 1-2 min på noget tidspunkt i løbet af proceduren, tilsættes en dråbe af orm vand at rehydrere ormen.
      BEMÆRK: Dehydrering vil øge ormen modtagelighed for ripping skader.
4. Gentag trin 3.3 indtil alle de sorte pigmenterede væv (pigment celler), samt alle de hvide væv af den optiske kop (dendritter af fotoreceptorceller), fjernes. Fjerne udskåret væv sidder fast på enden af ​​nålen ved omhyggeligt aftørring med en serviet tørre. Hvis dobbelt øje ablation er ønsket, ablatere andet øje på dette punkt.
   BEMÆRK: For at undgå skade kan nåle renses ved at gribe nålen med en ren væv serviet holdt med tommel- og pegefinger, og derefter bruge den anden hånd til at trække nålen gennem tørre væk fra tommel- og pegefinger. Alternativt kan nålen tørres på overfladen af ​​et vådt væv tørre og undersøgt for renlighed.
5. Når du er færdig, skal du bruge en overførsel pipette til at flytte ormen til en mærket skål indeholdende frisk orm vand. Hvis analysere gruppe data, placere op til 20 orme i en enkelt 100 mm petriskål. Hvis sporing regenerering i de samme individer over tid, sted 1 orm i hver brønd i en plade med 12 brønde. Når alle orme overføres, skylles orme ved at fjerne alle orm vand fra tallerkener / brønde og erstatte med mere frisk orm vand.
   1. At fjerne orme fra filteret, udsætte den pipette med en lille mængde af orm vand og slip vand på orm. Dette skal løfte than orm fra filtrerpapiret, skal straks suget ind i pipetten til overførsel.
6. Inkuber eksperimenter ved ~ 20 ° C (stuetemperatur) beskyttet mod lys og følge den regenerative proces.
   BEMÆRK: Worms kan lagres i et temperaturkontrolleret inkubator for at opretholde en konstant temperatur, men dette er ikke strengt nødvendigt. Fleste rumtemperaturer kun varierer med +5 ° C, som ikke vil påvirke ormen evne til at regenerere.
7. Om ønsket fix orme til immunhistokemi (se figur 3-4) og / eller in situ hybridiseringsanalyser af genekspression. Der findes forskellige fikseringsmetoder til planarian immunhistokemi ^{18, 19, 20} og in situ-hybridisering ^{21, 22, 23} protokoller.
8. Når der indgås eksperimenter, sacrifice levende orme ved at fjerne ormen vand fra skålen og erstatte med 70% ethanol. Inkuber orme i 3-5 min, kontrol for orme at lysere og slå grålig.
9. Placere ikke-behandlede orme i normale affaldsstrøm engang aflivet. Undgå at indføre levende orme i miljøet, især ikke-hjemmehørende arter.

Representative Results

For første 1-2 timer efter kirurgi, kan dyrene udviser nedsat bevægelighed i forhold til intakte orme (men de vil stadig bevæge). Hvis det ønskes, vil orme spise inden for 24 timer af kirurgi (for eksempel for RNAi fodring). Når følgende øjet regenerering i de samme individer over tid, Sørg for at tage et fotografi af hver orm både før kirurgi (intakt) og ved 1 h efter ablation (HPA). Ved 4 dage efter ablation (dpa) regenererende pigmentceller skal kunne ses, og med 14 dpa hele øjet vil have fuldt regenereret (figur 3A-B). Dette omfatter fotoreceptor neuroner og deres innervation til hjernen (figur 3C), såvel som funktionel restitution af det visuelle system (Figur 4A-C). Vellykkede ablationer vil ikke forstyrre det underliggende væv i hjernen (figur 4D-E), heller ikke indføre andre skader til dyret (figur 5A). mislykkede ablationeromfatte dyr med: en overdrevent store udskæring, der forbinder de to øjne (figur 5B), tårer til den laterale margin af dyret (figur 5C), og / eller sårsteder der stikker gennem de ventrale epidermis (figur 5D). Endvidere mislykkede ablationer indbefatter ufuldstændig fjernelse af hele optiske kop, omfattende både de hvide upigmenterede væv og de sorte pigment celler (Figur 5E-F).

Figur 1: Kirurgi forberedelse. (A) Diagram over kold plade konstruktion bruger bunden af en 100 mm petriskål (fyldt med is) og låget på en 60 mm petriskål (anbringes med oversiden nedad på isens overflade). (B) Diagram af kirurgien overflade, fremstillet af en stak (top til bund) hvidt filterpapir, en fugtig foldet væv tørre, og et stykke paraffin film.(C) Operationen oprettet (for højrehåndet). A: dissektionsmikroskop, B: svanehals belysning, C: kirurgi overflade, D: Peltier plade, E: skål af 5-7 mm orme klar til ablation, F: vaskeflaske af orm vand, G: spisepindeleje falder ren overførselspipette, H: spisepindeleje holding nål / sprøjten, i: spisepindeleje falder pincet, J: container ekstra overførselspipetter. (D) Tilpasset Peltier plade konfiguration. (E) petriskål kold plade konfiguration. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Position af hænder og nål / sprøjten under ablation. (A) Placering af hænder (for højrehåndede). Bemærk, at den venstre tommelfinger bruges til at understøtte sprøjten (afholdti højre hånd) for at minimere bevægelse. (B) Placering af nålen i forhold til ormen øje. Bemærk, at den affasede overflade af nålen vender opad. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: ablated planarian øjne regenerere. Morfologi af Schmidtea mediterranea planarierne fornybare øjne følgende (A) dobbelt øje ablation og (B) enkelt øje ablation. (C) Immunohistokemi viser regenerering af fotoreceptor neuroner (anti-arrestin) efter enkelt øje ablation. Intakte orme er vist før indgrebet, og regenererer er vist ved dag 4 og 14 efter ablation. For enlige øje ablationer, det venstre øje var enblated og det højre øje tjener som en intern (ubeskadigede) kontrol. Røde pilespidser: ablerede øjne. Målestok = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Funktionel genopretning af det visuelle system efter ablation. (A - C) Funktionel assay til at teste planarian fotofobi. (A) Intakte orme undgå at rejse gennem områder af lys, såsom en base til en grøn laser pointer. (B) 24 timer efter ablation, "blinde" dobbelt eye ablerede orme rejse gennem lyse pletter. (C) 7 dage efter ablation, har dobbelt eye ablateret orme regenereret deres visuelle system tilstrækkeligt til at genvinde lys unddragelse. Gul pilespids: afvigende adfærdal respons. (D - E) Eye ablation er begrænset til væv af den optiske kop, og ikke forstyrrer de underliggende hjernevæv. (D) Immunhistokemi viser hjerne arkitektur (anti-synapsin) er uændret fra før ablation til 1 time efter ablation. (E) Hematoxylin og eosin (H & E) -farvning ved 1 h efter ablation i tværgående snit, der viser skaden er stort set begrænset til stedet for det fjernede optiske kop. Højre øje (med sorte pigmentceller) tjener som intern kontrol. Røde pilespidser: ablerede øjne. Skalapanelerne = 1 mm i (AC) 1 mm, 100 um i (DE). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Kendetegnende for vellykkede og mislykkede ablationer. (A) Vellykket enkelt og dobbelt eye ablationer (ved 5 minutter efter ablation) har sår, som er omtrent svarer i størrelse til den oprindelige optiske kop. (B - E) Mislykkede ablationer: (B) for meget væv fjernes eller såret forbinder de to øjne, (C) sårstedet tårer og strækker sig til den margen, (D) såret er for dyb og stikker igennem fra dorsal (D) til ventrale (D') side, og (E - F) ikke alle de optiske kop væv fjernes, visualiseret både morfologisk (E) og med anti-arrestin farvning af fotoreceptor-neuroner (F). Gule pilespidser: afvigende ablationer. Gule cirkler: ablation site. Målestok = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Dette øje ablation teknik forbedrer de nuværende metoder (såsom hulning) ved at udelukke hjernevæv og begrænse udskæring hovedsagelig til øjenvæv. Med praksis, kan denne teknik udføres af de fleste individer, fra teknikere med erfaring i microsurgeries til uerfarne men samvittighedsfulde studerende. Det anbefales, at denne teknik praktiseres mange gange forud for anvendelse ablationer i eksperimenter, herunder (hvis muligt) en bekræftelse af fuldstændig fjernelse af alle øjenvæv ved immunhistokemi eller in situ hybridisering for øje markør (er) ^{4, 5, 13.} Det mest kritiske trin i denne protokol er den scooping ud af væv. Det er vigtigt ikke at fjerne enten for meget eller for lidt væv. Dette kan undgås ved ikke scooping for dybt med nålen, for at undgå at trænge igennem til den ventrale side af ormen. Spidsen af ​​neeDLE bør kun indsættes ca. 0,4 mm dyb, og den skrå del af nålen bør aldrig gå hele vejen gennem øjet. Der skal udvises særlig omhu for ikke at beskadige den skrøbelige væv mellem de to øjne (den mediale kant af den sorte pigmenterede område af hvert øje repræsenterer grænserne for hvert øje). bør også undgås Skader mellem øjet og den distale margen af ​​ormen. Mindre orme er mere tilbøjelige til at rippe eller utilsigtet skade, så det anbefales at anvende større orme (især til praksis). De vigtigste begrænsninger ved denne teknik er, at det er relativt tidskrævende (og ikke egnet til high-throughput skærme), og det kræver en indledende investering ved udøvelse at sikre nøjagtigheden af ​​resultaterne. Men med praksis 10 øjne kan poleres i ~ 15 min.

En større område for fejlfinding er i overensstemmelse planarierne stadig under proceduren. De to vigtigste årsager orme er ikke immobiliseret tilstrækkeligt at udføre ablationerer (a) for meget vand og (b) tab af kold temperatur. (A) Overskydende planarian vand, puljer på kirurgi overflade, mens overførsel orme vil tillade orme at flytte og komplicere operationen. Operationen overflade (fnugfri væv tørre og filtrerpapir) bør kun forblive fugtig. Hvis på noget tidspunkt under proceduren servietten bliver mættet med orm vand, bør enten udskiftes eller en overførsel pipette kan anvendes til forsigtigt at fjerne overskydende væske fra vævet tørre (altid trække servietten og ikke filtrerpapiret). Væv servietter kan også anvendes til at fjerne overskydende vand pooling på operationsdagen overflade. Denne proces kan være nødvendigt at blive gentaget mange gange, afhængigt af antallet af orme, der poleres. (B) Ved anvendelse petriskålen kold plade sat op, husk at udskifte den kolde plade så snart isen begynder at smelte og petriskål låget 60 mm begynder at flyde. Dette vil sikre både en stabil operation overflade og en passende kold overflade. Alternativt hvis anvendelse Peltier pladesat op, være opmærksom på, at efter 45 min til 1 h anvendelse, vil varmen i de ydre ringe overvinde den kolde plade i midten og alle afkøling vil gå tabt. Hvis dette sker, slukke for Peltier plade for 5-10 min at tillade den at komme til stuetemperatur, inden de genoptager ablationer.

Et andet område af fejlfinding er under orm overførsel mellem skålen og kirurgi overflade og tilbage igen. Hvis ablerede orme er svært at fjerne fra filtrerpapiret, placere en dråbe orm vand på orm indtil det flydende pools på toppen af ​​filtrerpapiret. Orme kan derefter suget ind i transfer-pipette som sædvanlig. Hvis problemet fortsætter, så prøv spejlvende ormen på dens ventrale side først (ved hjælp af den matte side af tangen). Hvis en orm sætter sig fast inde i overførsel pipette, dette er normalt et tegn på, at for meget vand er blevet taget op (orme skal blive trukket ind i transfer-pipette ikke længere end omkring en tomme). At fjerne en orm fast i en overførselspipette, udarbejder 1-2 ml orm watis i pipetten, således at ormen er dækket med vand. Fast bladre side af pipetten indtil ormen frigøres fra væggen af ​​pipetten og flyder.

Hvis nålen bliver sløv, udskiftes med en ny nål / sprøjte. Overvej at erstatte nålen efter brug skal poleres ≥30 øjne. Overdreven fjernelse af reseceret væv ved aftørring med en væv tørre kan også kedelig nålen, hvilket gør ablationer vanskeligere. Det er okay, hvis resektion væv holde sig inden for affasede del af nålen under hele proceduren (selv på tværs af flere dyr). Brug altid en ny nål / sprøjte, når der skiftes mellem orme af forskellige betingelser (f.eks vildtype vs RNAi orme), samt når der begynder nye ablation sessioner (dvs. på forskellige dage).

Denne kirurgisk øje ablation teknik er et effektivt middel til at undersøge lys-induceret adfærd (og deres genetiske og neurologiske grundlag) i planarierne, isærnår de kombineres med farmakologiske behandlinger eller RNA-interferens. Øje ablation er også en stor middel til at belyse de mekanismer, der regulerer endogene planarian øje regenerering (og eye stamcelle vedligeholdelse og differentiering) in vivo. Da de fleste hvirveldyr har meget begrænsede evner til at regenerere øjet væv, forståelse hvordan planarierne er i stand til at regenerere deres øjne vil være vigtigt at identificere mulige mekanismer for oversættelse til fremtidige behandlinger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional