Summary
Her beskriver vi en ny tilnærming til å forårsake traumatisk hjerneskade i lukkede hoder i Drosophila melanogaster . Vår metode har fordelen av direkte å levere repeterende påvirkninger med justerbar styrke til hodet alene. Videre utforskning av ryggradssystemet vil bidra til å belyse patogenesen av kronisk traumatisk encefalopati.
Abstract
Kronisk traumatisk encefalopati (CTE) er en etablert neurodegenerativ sykdom som er nært forbundet med eksponering for gjentatt mild traumatisk hjerneskade (mTBI). Mekanismene som er ansvarlige for sine komplekse patologiske forandringer forblir stort sett unnvikende, til tross for en ny konsensus for å definere nevropatologiske kriterier. Her beskriver vi en ny metode for å utvikle en modell av CTE i Drosophila melanogaster ( Drosophila ) i et forsøk på å identifisere nøkkelgenene og banene som fører til den karakteristiske hyperfosforylerte tauakkumuleringen og nevronaldød i hjernen. Justerbar kraftpåvirkning for å forårsake mild lukket skade blir levert direkte til flyhodet, og utsetter hodet for rask akselerasjon og retardasjon. Vår metode eliminerer de potensielle problemene som er forbundet med andre Drosophila mTBI-modeller ( f.eks. Dyredød kan forårsakes av skade påAndre deler av kroppen eller til indre organer). Den mindre arbeids- og kostnadskrevende dyrpleie, kort levetid og omfattende genetiske verktøy gjør fruktfluen ideell til å studere CTE-patogenesen og gjøre det mulig å utføre store, genomgående fremadrettede og farmakologiske skjermbilder. Vi forventer at den pågående karakteriseringen av modellen vil gi viktige mekanistiske innsikter om sykdomsforebygging og terapeutiske tilnærminger.
Introduction
Kronisk traumatisk encefalopati (CTE) har nylig blitt anerkjent som en distinkt nevrodegenerativ lidelse, adskilt fra andre tauopatier som Alzheimers sykdom 1 . I motsetning til Alzheimers sykdom og andre vanlige tauopatier - hvis viktigste risikofaktorer fremmer alderen og en familiehistorie av demens, innebærer CTE, som angitt av navnet, en nær tilknytning til en historie med hjerne traumer, sannsynligvis sett hos kontakt idrettsutøvere, Slik som boksere og fotballspillere, samt i militære veteraner 2 , 3 , 4 , 5 . Det antas å bli initiert av gjentatte hjernerystelser og subkoncussive slag mot hodet. Pasienter kan presentere symptomer og tegn som kognitive underskudd, humør og atferdsendringer og bevegelsesdysfunksjon, som overlapper betydelig med Alzheimers sykdom, frontotemporalDemens, Lewy body demens og Parkinsons sykdom 6 . I motsetning til dette viser etterforsøk av hjernevev et tydelig mønster av hyperfosforylert tauakkumulering som omgir små blodkar ved dybden av kortikale sulci, en patognomonisk funksjon som ikke er observert i de andre degenerative tilstander 7 . Imidlertid er så lite kjent om patogenesen som fører til sykdoms manifestasjon. Dette skyldes i stor grad mangelen på en trofast dyremodell - bare nylig har gnagermodeller blitt generert 5 , 8 . Disse modellorganismer har ulempene med kostnadskrevende omsorg og en relativt lang levetid, som ikke er velegnet for neurodegenerative sykdomsstudier.
Sammenlignet med pattedyr-kolleger, er virvelløse dyr som Drosophila et utmerket alternativ, med kostnadseffektivt vedlikehold,Omfattende verktøy for dissektering av genetiske determinanter, og relativt kort levetid 9 . Bemerkelsesverdig deler fly og menneskelige hjerner evolusjonært konserverte molekylære og cellulære veier, så vel som anatomiske likheter 10 , 11 , 12 . To tidligere ingeniøse Drosophila- modeller for å studere traumatisk hjerneskade har blitt rapportert tidligere 13 , 14 . Den første "High Impact Trauma" (HIT) -enheten designet av Katzenberger og kolleger, inneholdt frittflygende fluer i et plastflaske som var bundet til den frie enden av en metallfjær 13 , 15 . Når plastflasken ble hevet oppreist og løslatt, rammet den en polyuretanpute og ga traumer til fluene da de hoppet til hetteglassveggen og gjenvunnet. I kontrast, designet Barekat og kolleger en annen leveringsmetode ossInn i Omni Bead Ruptor-24 homogeniseringsplattformen 14 . Fluer ble uegnet med CO 2 og plassert i et 2 ml skruekapslør som var sikret til homogenisatoren og underkastet forprogrammerte rystningsbetingelser. En fordel ved å bruke vevshomogenisatorsystemet er at eksperimentet kunne modulere intensiteten av skade, varighet av skade og antall skadeproblemer. Imidlertid har begge regimene den samme ulempen: primære skader på hodet er tilfeldig påført når det gjelder slagplassering og styrke. I tillegg resulterte begge metodene i betydelig dødelighet, forårsaket av uunngåelig sikkerhetsskade på andre deler av kroppen og indre organer. Her beskriver vi en ny metode for å indusere mTBI i fruktfluer. Apparatet vårt består av en gassdrevet ballistisk støtfanger. Sammenlignet med de eksisterende Drosophila- modellene 14 , 15 , har metoden vår enestående fordel ved å levere målingUvirkelig påvirkning, kun rettet mot det frie flygende hodehodet, og dermed muliggjøre nøyaktig kontroll av ulike faktorer, som for eksempel virkningsgrad, tidsintervallet mellom påvirkninger og det totale antall påvirkninger som opprettholdes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering av streikapparatet ( figur 1 )
- Fjern stemplet fra en 1 ml tuberkulinsprøyte. Klipp fat på 1 ml merket.
- Fjern en aerosolbarriere (3 mm høyde x 4 mm diameter) fra en 200 μL pipettspiss og bruk den som en støtfanger. Plasser støtfangeren inne i sprøytekarmen. Trykk forsiktig på fatet for å flytte støtfangeren til spissen, med den flate siden som dekker dyseåpningen.
- Fest tappens ende til plastrør som er koblet til karbondioksid (CO 2 ) strømningsregulator på en Drosophila anestesi stasjon.
- Hold fatet vertikalt og klem det til en standard klemholderholder slik at støtfangeren forblir i bunnen av fatet.
- Modifiser en 200 μL pipettespiss for å lage flyholderen.
- Klipp 4 mm fra spissen for å lage en åpning på 0,8 mm, slik at kun flyhodet blir utsatt.
MERK: ThoRax og alle de andre delene av flygelegemet vil være inne i pipettespissen.
- Klipp 4 mm fra spissen for å lage en åpning på 0,8 mm, slik at kun flyhodet blir utsatt.
- Endre en 1000 μL pipettespiss og en 1 ml sprøytenåledeksel for å få kontakten.
- Klipp av 44 mm fra spissens åpning. Ta en 6 mm lengde på en 1 ml sprøyteålehett og trykk den tett inn i det gjenværende segmentet av 1000 μL pipettespissen.
2. Betjening av streikenheten
- Bedøve en enkelt 2-dagers voksen kvinnelig fly med CO 2 på en flyvepute.
- Overfør forsiktig den til flyholderen med en fin børste. Pek holderen forsiktig slik at flyhodet ses utenfor spissen. Hvis flyproblemet er utsatt utenfor spissen, må du forsiktig ta den tilbake i spissen med en sprunget 1 ml sprøytenål.
MERK: Pass på at du holder flyproblemet inne i holderen. Ellers kan flyet dø av en sugende proboscis skade. - Stram flyet hoLegg til sprøytekanalen med kontakten slik at flyhodet vender nedover.
- Still gasstrykket ved 100 kPa. Juster strømningshastigheten i henhold til eksperimentet.
- Slå strømbryterbryteren raskt av og på slik at støtfangeren treffer flyhodet en gang.
- Løft flyholderen og flytt den over en flypute. Vend på flyholderen og trykk forsiktig på siden for å slippe ut. La flyet stå i et tomt hetteglass for å gjenopprette.
3. Videoassistert bevegelsessporing
- Fyll en petriskål med 6 cm diameter med gjennomsiktig silisiumelastomer for å gjøre sporingsarenaen. Legg igjen en 3 mm mellomrom mellom silisium og oppvasklokk slik at fluene kan gå fritt, men ikke fly.
- Bedøve fire fluer fra hverken skam eller behandlet gruppe hver gang og plasser dem i arenaen. La fluene være ved 22 ° C i 1 time.
- Plasser et ladetilkoblet kamera (CCD) -kamera over arenaer og ta opp i 5 minutter.
- Analyser de registrerte bevegelsesbanene ved hjelp av Ctrax-programvare (fritt tilgjengelig fra Caltech) 16 . Eksporter spordataene i et programmeringsspråk (f.eks. Matlab) -kompatibelt format og analyser dataene basert på avstand som er reist per ramme 17 . Beregn gjennomsnittlig gangavstand for hvert fly og kombinere det med alle andre registrerte fluer / gruppe for å oppnå en gjennomsnittlig kumulativ avstand som tilbys av bestanden av filer i samme gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å etablere en CTE-modell ved hjelp av voksen Drosophila , fastslått vi effektiviteten av enheten vår ved å forårsake en enkelt lukkeskader. For å eliminere variasjonene knyttet til genotype, kjønn eller alder brukte vi 2-dagers Canton-S WT kvinnelige fluer i forsøket. Vi kunne enkelt kontrollere styrken av støtfangeren ved å regulere strømningshastigheten til CO 2 ved et konstant gasstrykk på 100 kPa. Fluer utsatt for en enkelt streik med høyest strømningshastighet (15 l / min) viste minimal ekstern defekt ( figur 2 ). Både de ytre øynene og munnen virket intakt. Likevel fant vi at en strømningshastighet på 15 l / min var akutt dødelig, noe som resulterte i mindre enn 10% overlevelsesrate innen 24 timer ( figur 3A ). I motsetning til dette viste eksponering for en 10 eller 7,5 l / min streik henholdsvis 61,1% og 96,3% overlevelse, mens alle flyr overlevde på 5,0 og 2,5 l / min strømningshastigheterEr 24 timer ( figur 3A ). Derfor standardiserte vi våre fremtidige studier til 5,0 L / min CO 2- strømningshastigheten. Etter en streik på 5,0 l / min, flyr gradvis gjenopprettet mobiliteten innen 4 min ( figur 3B ). I løpet av de neste 2 d, blir deres lokomotivfunksjon målt ved å gå evnen, sakte restaurert til normal ( figur 3C ). Som en foreløpig vurdering, er disse fenotypene minner om de som presenteres av personer som har opplevd hjernerystelse eller milde nivåer av traumer 18 . Pasienter som lider av traumatisk hjerneskade, forekommer ofte med en progressiv forverring av muskelbevegelser og for tidlig død.
For å evaluere de langsiktige effektene av flere hjerneskader, søkte vi en mTBI-protokoll av fem påfølgende streik på 5,0 l / min strømningshastighet, med 24 timers gjenopprettingsperioder mellom hver streik. Å undersøke E virkningen av mTBI på bevegelsesfunksjonen, brukte vi et videostøttet bevegelsessporingssystem for å analysere flymotorfaktoren. Etter å ha eldet fluene 20 d etter behandling, viste den mTBI-behandlede gruppen redusert gangaktivitet og avstandsreise sammenlignet med sham-gruppen ( Figur 4 A & B ; sham-gruppe: 6,49 ± 0,72, n = 28 mot behandlet gruppe: 4,3 ± 0,47, n = 32; p <0,05). For å undersøke om gjentatte hjerneskauser har noen kroniske effekter på overlevelse, bestemte vi levetiden til fluer som utholdt mTBI-protokollen. Vist i figur 4C , sammenlignet med sham-gruppen (n = 129), hadde behandlede fluer (n = 100) en vesentlig redusert median levetid (36,9 ± 2,7 vs. 26,3 ± 0,9 d) og signifikant redusert maksimal levetid (49,3 ± 2,4 Vs 34,7 ± 1,4 d).
1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55602 / 55602fig1.jpg "/>
Figur 1 . Diagram over streikapparatet. Enheten brukte materialer som er tilgjengelige i et Drosophila- laboratorium: 1) 200 μL pipettespiss, 2) 1 ml tuberkulinsprøyte, 3) støpsel, 4) forbindelsesrør heklet til en Drosophila anestesi stasjon og 5) kontakt for å stramme spissen På sprøyten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 . Mild lukket traumatisk skade. En enkelt streik på den høyeste gasstrømmen påførte ikke åpenbar ekstern skade på hode, kropp eller vedlegg. ( A &B ) Strike-inflicted fly. ( C & D ) Sham fly. Skurfluene gjennomgikk nøyaktig de samme prosedyrene som den behandlede gruppen, inkludert overføringer på og utenfor flyholderen, med unntak av at ingen støtfanger ble plassert i sprøytekammeret når CO 2 -strømmen ble påført. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 . Effekten av en enkelt streik. ( A ) Overlevelsesindeksen ved 24 timer (SI 24 ), definert av prosentandelen av fluer som overlevde innen 24 timer etter en streik, er graftet i forhold til gassstrømningshastigheten. Fluer som har blitt slått en gang med 5,0 l / min gassstrøm, gjenvunnet lokomotorisk aktivitet medI 4 min ( B ), og deres mobilitet gjenopprettes sakte til normal over en periode på 2 d ( C) . Feillinje, Standard Feil (SEM). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 . Utvikling av mTBI-modellen i Drosophila . Gjentatte streiker i løpet av fem dager resulterte i betydelig svekket lokomotorisk aktivitet ( A & B ) og redusert levetid ( C ). Representative turstier registrert over 5 min. For 4 sham og behandlede fluer er vist i A. Feilstenger, SEM. * P <0,05, Mann-Whitney U-test med en Bonferroni-korreksjon. Totalt fluer: behandlet gruppe n = 100, sham gruppeN = 129. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyremodeller som trofastmodellerer CTE-funksjoner, inkludert nevrofysiologiske endringer, nevropatologiske karakteristikker og neurobehavioral underskudd, er avgjørende for å avdekke sykdomsmekanismer og for å utvikle diagnostiske og terapeutiske mål. Det er forståelig at ingen dyremodell av en menneskelig sykdom er perfekt for å etterligne alle klinisk relevante endepunkter. Vi mener imidlertid at en robust CTE-modell skal tilfredsstille følgende tre krav: (1) virkningen må brukes direkte på et hode som har en intakt hodebunns- og skalleskjold; (2) hodet skal ikke immobiliseres under støteksponering slik at hurtig akselerasjon-retardasjon og rotasjons- og lineær hodebevegelser tillates; Og (3) den eksperimentelle utformingen skal inkludere både enkle og repeterende regimer, og konsekvensene skal være milde i naturen uten å forårsake synlig skade, som for eksempel vevsødem, kontusjon eller ærlig blødning.
ouR fruktfly modell skiller seg fra andre metoder som forårsaker traumatisk hjerneskade i fluer 13 , 14 , 15 . Både Bead Ruptor-modellen og HIT-enheten forårsaker skade med tilfeldig støtposisjon og styrke. I begge metodene, varierer antall flyr som finnes i enten et standard plastflaske eller en 2 ml skruehylse, kontakt beholderveggen og rebound flere ganger under hver streik eller skade. Siden fluene er fritt bevegelig inne i beholderen, er de primære skader som er påført, betydelig forskjellig for individuelle fluer, ettersom ulike deler av deres kropper og / eller hoder er skadet med forskjellige krefter. Således er det ikke overraskende at fluene led av dysfunksjon i tarmbarriere ved hjelp av disse modellene. Dette var direkte korrelert med dødelighetsgraden i begge regimer 13 , 14 , som sterkt indikerer at nPå-neuronal endringer var ansvarlig for traume-indusert død i begge systemene. I motsetning er vår metode i stand til gjentatte ganger å levere direkte hodepåvirkninger til samme sted. Kroppen er beskyttet mot direkte eksponering, og eliminerer potensielle hemmeligheter at døden kan være forårsaket av skade på andre deler av kroppen eller til indre organer. I tillegg kan strømningshastigheten til CO 2 -gassen som brukes til å drive vekten reguleres for å oppnå kontrollert, justerbar styrke. Viktigst av alt er flyhodet ikke begrenset ved streiken, noe som muliggjør en svært rask akselerasjons-retardasjonsprosess som etterligner den vanligste formen for mTBI som forekommer i den menneskelige befolkning 19 .
Selv om det ville være ideelt å installere en automatisk på / av-bryter for å styre CO 2- strømningsregulatoren, synes den nåværende manuelle bryteren ikke å påvirke gjengestyrkenes reproduserbarhet fordi utformingen av enheten vår alleOws kraften til å bli utøvet raskt når støtfangeren slår på hodet.
Sammendrag, vårt system gir et nytt regime for å bedre etterligne mTBI, introdusere en ny plattform for modell CTE. Som andre Drosophila- modeller som har vist seg å være verdifulle for å dekode de menneskelige nevrogenerative forstyrrelser 9 , 20 , forventes det at den pågående detaljerte karakteriseringen av modellen i form av neuronalt tap, tau-hyperfosforylering, TDP-43 proteinopati og neuroinflammatorisk respons på den påførte mTBI vil Generere viktige mekaniske innsikt i CTE sykdomsprosesser og vil bidra til å svare på noen av de kritiske spørsmålene i feltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble støttet av Johns Hopkins University School of Medicine fakultet oppstart fond til LC
Acknowledgments
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerosol Barrier | USA Scientific | 1120-8810 | Used as an impactor |
| 200 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1111-0706 | Used as a fly head holder |
| 1000 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1122-1830 | Used as a connector |
| 1 mL Tuberculin Syringe | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | Used as a tracking arenas |
| Flow Regulator | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Holder/stand | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Fine Brush | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
References
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
- Martland, H. S. Punch drunk. JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).
- Millspaugh, J. A. Dementia pugilistica. US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).
- Omalu, B. I., et al. Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II. Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).
- Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Sci Transl Med. 4 (134), (2012).
- Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going? Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407 (2013).
- McKee, A. C., et al. The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy. Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
- Littleton, J. T., Ganetzky, B. Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).
- Appel, L. F., et al. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).
- Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster. Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Barekat, A., et al. Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 25252 (2016).
- Katzenberger, R. J., et al. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J Vis Exp. (e52905), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Theadom, A., et al. Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample. J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).
- Drobysheva, D., et al. An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster. J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).
