Summary
Se describe una técnica para el uso de células madre embrionarias murinas para generar dos o tres cuerpos embrioides dimensionales. A continuación, explicamos cómo inducir la diferenciación neural de las células del cuerpo embrioides por ácido retinoico, y cómo analizar su estado de diferenciación de células progenitoras por inmunofluorescencia marcador e inmunotransferencia.
Abstract
Células madre embrionarias de ratón (CES) aislados a partir de la masa interna del blastocisto (típicamente al día E3.5), se pueden utilizar como sistema de modelo in vitro para estudiar el desarrollo embrionario temprano. En ausencia de factor inhibidor de leucemia (LIF), CES diferencian por defecto en las células precursoras neurales. Pueden ser amasaron en una de tres dimensiones (3D) agregada esférica denomina cuerpo embrioides (EB), debido a su similitud con el embrión etapa temprana. EBs se pueden sembrar en cubreobjetos recubiertos de fibronectina, donde se expanden por el crecimiento de dos extensiones (2D) dimensionales, o implantados en matrices de colágeno 3D donde continúan creciendo como esferoides, y se diferencian en las tres capas germinales: endodérmico, mesodérmico y ectodérmico. El cultivo de colágeno 3D imita el entorno in vivo más de cerca que la EBs 2D. El cultivo 2D EB facilita el análisis por inmunofluorescencia e inmunotransferencia para rastrear la diferenciación. Hemos desarrollado una diferenciación neuronal de dos pasosprotocolo ción. En el primer paso, EBs son generados por la técnica de gota colgante, y, simultáneamente, son inducidas a diferenciarse mediante la exposición a ácido retinoico (RA). En el segundo paso, la diferenciación neural avanza en un formato 2D o 3D en ausencia de AR.
Introduction
CES se originan a partir de la masa celular interna del blastocisto. Estas células son pluripotentes, es decir, tienen la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula del organismo de origen. CES diferenciación in vitro es de gran interés como un sistema experimental para la investigación de las vías y mecanismos de desarrollo. Ofrece un modelo de sistema potente y flexible para probar nuevos enfoques terapéuticos para la corrección de la disfunción de las células y los tejidos. EB recapitulan muchos aspectos de la diferenciación celular durante la embriogénesis temprana. En particular, EBs se pueden utilizar cuando la letalidad embrionaria hace que sea difícil determinar la base celular de los defectos embrionarios 1, 2. EBs pueden formarse ya sea por la gota colgante o técnicas de suspensión líquido 3. La ventaja de la primera es la capacidad de generar EBs de tamaño uniforme y la densidad, facilitando así la reproducibilidad experimental.
4.
RA es un pequeño metabolito lipófilo de vitamina A que induce la diferenciación neural 5, 6. Las altas concentraciones de RA promueven la expresión génica neural y reprime la expresión de genes mesodérmico durante la formación de EB 7, 8. RA es producida por la vitamina A oxidación para retinaldehido por alcohol o retinol deshidrogenasa, seguido de oxidación retinaldehido al producto final por retinaldehido deshidrogenasa 9. diferenciación neural requiere transporte de RA desde el citoplasma al núcleo por celular proteína de unión a RA-2 (CRABP2). En el núcleo, RA se une a su complejo receptor cognado que consiste en un heterodímero RAR-RXR 10. Esto da como resultado el reclutamiento de co-transcripcional activadores, y la iniciación de la transcripción 9, 11. Además, RA promueve la degradación de fosforilados (activo) Smad1, antagonizando así BMP y SMAD de señalización 12. Además de estas actividades, RA aumenta la expresión de Pax6, un factor de transcripción que apoya la diferenciación neural 13. Señalización RA es modulada por sirtuin-1 (Sirt1), un dinucleótido de nicotinamida y adenina nuclear (NAD +) - enzima dependiente que deacetylates CRABP2, interfiriendo con su translocación al núcleo, y por lo tanto con RA de unión al heterodímero RAR-RXR 14, 15, 16.
e_content "> Nuestro objetivo en el diseño del protocolo de EB tratado con RA se describe aquí es optimizar la diferenciación neuronal con el fin de facilitar el análisis in vitro de las vías de señalización que regulan la diferenciación ESC en células precursoras neuronales. Una de las ventajas de este protocolo es la facilitación de el análisis de la función celular por inmunofluorescencia. EBs 3D no están bien penetrada por anticuerpos y son difíciles de imagen. EB disociación en una monocapa 2D en puntos de tiempo específicos durante la diferenciación neural facilita immunolabeling y de formación de imágenes de las células por microscopía confocal.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)
- Preparar medio MEF, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, alta glucosa), suplementado con suero de 15% de bovino fetal (FBS).
- Coat placas de cultivo celular de 100 mm con solución de gelatina al 0,5% durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
- Contar MEF utilizando un citómetro. Eliminar la solución de gelatina y se vierte inmediatamente medio MEF pre-calentado a 37 ° C. Rápidamente descongelar viales de mitomicina C MEFs tratadas en un baño de agua a 37 ° durante 2 min, a continuación, las semillas de 2,8 x 10 6 MEFs por placa de 100 mm recubierta con gelatina. Ajustar el número de células en consecuencia si el uso de platos de otros tamaños. Incubar MEFs durante la noche a 37 ° C, 5% de CO2.
- Cambiar el medio en el día siguiente. Cultura durante 2-3 días hasta que la capa MEF es confluente.
2. Ratón ESC Cultura
- Preparar medio ESC, medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) suplementado con 15% de FBS y 103 U / ml de factor inhibidor de leucemia (LIF), 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 55 mM 2-mercaptoetanol, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml), gentamicina (200 mg / ml), y 0,2% antibiótico micoplasma.
- Eliminar el medio MEF de la cápsula preparada en el paso 1 y reemplazar con 37 ° medio ESC C pre-calentado.
- Descongelar un vial de ESC y las células de semillas en la parte superior de la capa de MEF. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2, hasta que los CES alcanzan la confluencia.
- Preparar nuevas placas de cultivo celular que contienen una monocapa confluente de MEFs. Para el paso de la CES, lavar una vez con PBS y separar con 0,25% de tripsina / EDTA durante 2-5 min a 37 ° C, 5% de CO2. Detener la tripsinización añadiendo IMDM fresco con 15% de FBS a las células de desprendimiento, transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml, y se centrifuga a 160 xg durante 5 min a RT.
- Eliminar el sobrenadante, resuspender las ESC con IMDM fresco y el paso quinto de las células a cada nuevo plato recubierto de MEF; incubar hasta que las célulasllegar a confluencia (típicamente 4-5 días).
3. Retirar MEFs y CES cultivo sobre placas recubiertas con gelatina
- Una vez SCE alcanzó la confluencia, separarlas y MEFs con 0,25% de tripsina / EDTA como en el paso 2.4, resuspender las células en IMDM fresco, la transferencia a una placa de petri bacteriológica no adhesiva, y se incuba durante 40 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
- transferir cuidadosamente los CES y MEFs medio que contiene a una nueva placa recubierta con gelatina usando una pipeta de 5 ml, evitando pipeteo repetido. Las células que permanecen en las placas de Petri son los MEF, ya que los CES no se adhieren.
- Passage los CES cada 3-4 días. Menos frecuente pases puede reducir ESC pluripotencia. No exceda el 60% de confluencia, ya que puede favorecer la diferenciación.
- Repita los pasos 3.2-3.3 tres veces o más, según sea necesario, hasta que ya no es detectable MEFs son por un microscopio de cultivo de células, utilizando un objetivo 20X, para asegurarse de que los MEF no están presentes.
- Verificar ESC pluripotencia comprobando ESCcultura para ver si las células forman densas colonias con morfología típica poligonal ESC (Figura 1A). Stemness célula de prueba por reacción inversa cuantitativa en cadena de la polimerasa (QRT-PCR) 17, inmunotransferencia 17, o inmunofluorescencia de la transcripción núcleo pluripotencia factores de 17 (Figura 2).
4. Formación de EB
- Preparar todo trans-RA-solución madre a 10 mM en DMSO, y alícuota en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga de luz-protegido. La solución es estable a -80 ° C durante hasta dos semanas. Protegerlo de la luz.
- Trypsinize CES como en el paso 2.4; replate en IMDM fresco sin LIF, como una suspensión de una sola célula.
- Contar las células usando un hemocitómetro, y preparar una 5 x 10 5 células / ml de suspensión en IMDM con 0,5 RA M.
- Plate 100 20-mu L-gotas por 100 mm de placa de petri con una pipeta de 8 canales y 200 consejos mu l, invertirlos platos, y llenar la tapa invertida con PBS para impedir que las gotas que cuelgan de secado. Proteger los medios de cultivo que contiene la AR-de la luz.
- Cultura EBs en colgante gotas a 37 ° C, 5% de CO2, durante 4 días.
5. 2D EB Cultura
- Coat 12 mm cubreobjetos de vidrio circular con 30 g / ml de fibronectina durante 30 min a RT. Colocar cada cubreobjetos en un pocillo de una placa de 24 pocillos, y se añade 1 ml de IMDM por pocillo.
- Harvest 3 días-crecido colgando EBs gota una por una con 200 consejos l de pipeta y semilla de ellos en los cubreobjetos recubiertos de fibronectina, 20 EBs por pocillo, usando las mismas puntas de pipeta.
NOTA: 3 días de EBS son preferibles a los CE de 4 días, ya que se adhieren mejor a los cubreobjetos. - Continuar cultivo con IMDM-15% de FBS sin LIF. Reemplazar medio cada 3-4 días. Recoger el medio utilizado para el análisis de la secreción de proteínas según sea necesario.
6. Detección de proteínas secretadas
- Transferir 500 l de EB medium a 10 filtros centrífugos kDa-corte, centrifugado a 20.000 xg durante 60 min a 4 ° C.
- Examine el medio que queda dentro de los filtros centrífugos cada 15-20 minutos para evitar el enriquecimiento excesivo. Detener la centrifugación cuando el volumen del medio restante ha caído a 25 l.
- Recoger el medio concentrado restante después de invertir el filtro y girando a 160 xga 4 ° C, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Detectar las proteínas secretadas por inmunotransferencia con anticuerpos específicos 17.
7. Cultura EB 3D
- Recoge los EBs cultivadas durante 4 días en colgando gotas como se describe en el paso 5.2, y colocarlos en tubos de 1,5 mL de centrífuga (30 EBS por tubo).
- Preparar la solución de gel de colágeno siguiendo las instrucciones del kit de cultivo de colágeno 3D (véase Materiales / Tabla Equipment). Diluir volúmenes apropiados de solución de colágeno y 5x DMEM (un componente del kit); añadir el nsolución eutralization (un componente del kit) y mezclar bien inmediatamente, y mantener este en hielo.
- Pipeta de un volumen apropiado de solución de colágeno refrigerada en el tubo de 1,5 ml que contiene el EBs, y transferir suavemente a los pocillos de una placa de 6 pocillos usando una punta de pipeta de 1 ml. Evitar hacer burbujas.
- Inmediatamente transferir la placa a 37 ° C, 5% de CO2, durante 60 minutos para iniciar la polimerización de colágeno.
- Superposición de la placa de EB que contiene con IMDM.
- Cambio de medio cada 3-4 días.
8. EB disociación
- Recoger el día 4 EBs (del paso 4), uno por uno, con 200 consejos l de pipeta y transferirlos a una placa de petri bacteriológica no adhesiva que contiene IMDM con 15% de FBS; cultivo a 37 ° C, 5% de CO2 durante 4 días más. Compruebe el EBS dos veces al día para asegurarse de que no se adhieren a la parte inferior; agitar suavemente el plato para evitar EB fijación a la parte inferior.
- Centrifugar los EBs a 185 xg durante 5 min aRT, en una centrífuga de sobremesa.
- Retire los sobrenadantes. El sedimento no debe exceder de 100! L en cada tubo.
- Añadir a sedimentaron EBs 1 ml Tipo de 0,25% I colagenasa por tubo, suplementado con 20% FBS en PBS.
- Incubar la mezcla EB-colagenasa durante 1 h a 37 ° C, 5% de CO 2, pipeteando suavemente cada 20 min, usando 1 ml puntas de pipeta.
- Lavar las células suavemente 3x con PBS. Si los agregados de células están presentes, utilizar un filtro de células con una malla de 100 micras para eliminarlos.
- Replate las células en un platos recubiertos de gelatina 60 mm de IMDM. Entonces se incuba a 37 ° C, 5% de CO2.
9. La transfección de disociada EBs
- Para qRT-PCR e inmunotransferencia, recubrir una placa de 6 pocillos con 0,5% de gelatina.
- Por inmunofluorescencia, cubreobjetos de vidrio de la capa con 30 g / ml de fibronectina durante 30 min a RT. Colocar cada cubreobjetos en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Añadir IMDM.
- Seed 4,75 x 10 5 o 1 x 10 5
- Cultivar las células a 70% de confluencia antes de la transfección.
- Transfectar las células por un no liposómica lípido reactivo de células madre-óptima 17 (véase Materiales / Tabla Equipo), siguiendo las instrucciones del fabricante.
NOTA: El reactivo se utilizó típicamente alcanzó una eficiencia de transfección del 50% (ver resultados representativos). - Analizar las muestras por qRT-PCR o por inmunotransferencia 17 2 o 3 días después de la transfección, respectivamente.
10. Análisis de EB Diferenciación por inmunofluorescencia
- Wash EBs 2D o disociado EBs 3D con PBS y se fijan con paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 min a TA. Lavar las células fijadas 3x con PBS para eliminar los restos celulares flotante.
NOTA: El paraformaldehido es un irritante de la piel y los ojos; tenga cuidado en su manipulación. Añadir 1% de Triton X-100 en PBS para permeabilizar las células durante 20 minutos a RT, a continuación, lavar 3 veces con PBS. - Retirar PBS y bloquear con BSA al 5% en PBS durante 30 min.
- Prepare dilución de anticuerpo primario en 1% BSA / PBS suplementado con 0,03% de Triton X-100. Reemplazar la solución de bloqueo por la solución de anticuerpo primario. Incubar durante 3 h a TA, o durante la noche a 4 ° C, a continuación, se lavan las células 3 veces con PBS.
- Aplicar anticuerpo secundario en PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar durante 1 hora a RT, a continuación, se lavan las células 3 veces con PBS.
- Monte cubreobjetos en placas de vidrio con un medio anti-fade para microscopía óptica.
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Representative Results
Oct4, Nanog, y Sox2 son los factores de transcripción básicos que confieren ESC auto-renovación y pluripotencia. Se aplicó el protocolo anterior para comparar la diferenciación neural de las ESC de tipo salvaje y de una cepa de ratones modificados genéticamente donde Syx, un gen que codifica para el factor de intercambio específico de RhoA Syx, se interrumpe. Habíamos implicados en la angiogénesis Syx 18. Nos dimos cuenta de las diferencias en los comportamientos de los CE agregan a partir de Syx + / + y Syx - / - CES, y se procedió a comprobar si la diferenciación neural de Syx - / - CES es más rápida que la de sus homólogos SYX + / +.
Para comparar el estado inicial de Syx + / + y Syx - / - CES, cuantificamos en cada genotipo las abundancias de Oct4, Nanog, y Sox2, los factores de núcleo de transcripción tsombrero confiere ESC auto-renovación y pluripotencia. Como se describe en el paso 10 del protocolo, los CES se immunolabeled por Oct4, Sox2, y los anticuerpos Nanog. Las abundancias de los 3 factores de transcripción en Syx + / + y - / - Syx CES fueron similares, como se determina por inmunofluorescencia (Figura 2) e inmunotransferencia 17 (Figura 2).
EBs implantados en una matriz de colágeno 3D (Figura 1B) comiencen a brotar extensiones celulares que son visibles en un microscopio de cultivo celular con un objetivo de 10X, 2 días después de la implantación. En el día 6, entre 5 a 10 brotes de 200 micras o menos puede ser normalmente observados en Syx + / + EBs, mientras que en Syx - / - se observan frecuentemente EBS, 30-50 brotes, la mayoría de los cuales son más largas que 200 micras , (Figura 1C).
Syx - / - que de Syx + / + EBs 2D (Figura 3A). Para comparar la tasa de la diferenciación neural de las células que se extendían desde el Syx + / + y Syx - / - EBs, les immunolabeled después de 6 días de cultivo 2D por la nestina marcador de células madre neural, una proteína reguladora de filamentos intermedios 19. La abundancia de nestina fue sustancialmente mayor en las células que se extienden desde Syx - / - EBs (Figura 3B). Por último, comparamos la abundancia de nestina y tubulina β3 (Tubβ3), una proteína de citoesqueleto axonal 20, en células disociadas a partir de 13 días 2D EBs. Ambas proteínas fueron más abundantes en células disociadas a partir de Syx - / - EBs que en sus contrapartes Syx + / + (Figura 3C). Se obtuvieron resultados similares mediante la cuantificación de immunoblotting de las mismas proteínas 17.
La Figura 4 muestra células transfectadas por proteína fluorescente constitutivamente verde (GFP) -bicíclico RhoA activa (RhoA-Q63L) usando un reactivo de transfección de tallo-célula-óptimo (ver Materiales / Tabla Equipment).
Figura 1: Brote Aparición de Syx + / + y Syx - / - EBS en Cultura 3D. (A) Syx + / + y Syx - / - CES crecieron en colonias agrupadas antes de la inducción de la diferenciación neural. Imágenes de EBs formados en colgando gotas con 0,5 RA M (B y C) y, a continuación insertados en una matriz de colágeno 3D sin RA, como se describe en los pasos 7.1-7.4. Las imágenes fueron capturadas en el día 6 por los objetivos indicados (Escala b ars = 100 m de A y C, 200 m de B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La presencia de factores de transcripción Pluripotencia Core. Imágenes representativas que muestran las abundancias de los marcadores de pluripotencia básicos indicados en Syx + / + y Syx - / - CES (barra de escala = 50 m). Ver Yang et al. 17 para detalles del método immunolabeling (barra de escala = 50 m; DAPI, 2- (4-amidinofenil) -1H-indol-6-carboxamidina). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
gura 3" src = "/ files / ftp_upload / 55621 / 55621fig3.jpg" />
Figura 3: Visualización de Neuronales Diferenciación marcadores en células EB. Imágenes (A) Fase de 2D EB cantos que muestra que las células aumentaron más rápidamente de Syx - / - que de + / + EBs Syx (barra de escala = 200 m). Imágenes (B) de inmunofluorescencia que muestran que la neural nestin marcador de diferenciación fue más abundante en las células en expansión de 6 días 2D Syx - / - EBS que de sus contrapartes Syx + / + (barra de escala = 50 m). Imágenes (C) de inmunofluorescencia que muestran que los marcadores de diferenciación neuronales nestina y Tubβ3 fueron más abundantes en células disociadas a partir de 13 día 3D Syx - / - EBs que de su (barra de escala = 50 m) Syx + / + homólogos. Haga clic aquí para competirwa versión más grande de esta figura.
Figura 4: Visualización de la eficiencia del reactivo de transfección. Tres repeticiones de imágenes de inmunofluorescencia que muestran los CES transfectadas por RhoA constitutivamente activo fusionado a GFP para ilustrar la eficacia de transfección del reactivo usado en la etapa 9.5 del protocolo (Escala bar = 50 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este protocolo se presenta un método relativamente simple y accesible para estudiar la diferenciación neuronal de los CES murinos. En los protocolos anteriores, RA se añadió al medio a día 2 o el día 4 del EB de gota colgante 8 o por cultivo en suspensión 7, respectivamente, o inmediatamente después de la EB colgando agregación gota 21. En el protocolo ideamos, RA se añadió antes. A pesar de la introducción anterior de RA a EBs formado por cultivo en suspensión, este protocolo produce una mayor expresión de marcadores neuronales de diferenciación 8.
En este sentido, favoreció la aplicación de la AR y la inducción de la diferenciación neuronal en el inicio de la cultura de la gota colgante. Esta modificación permite la exposición RA igual a los CES cuando todavía están en una suspensión de células, antes de EB agregación. Cuando se añade RA a EBs agregados, las células en la masa interior EB es probable que detectar una inferior a la AR concentratien que las células en la capa exterior. La aplicación de RA en el inicio de EB agregación es ventajoso también porque suprime endodérmico y el germen mesodérmico desarrollo de la capa en favor de la diferenciación neural de la capa ectodérmica 7, 8. Se confirmó que el tratamiento RA promovió la diferenciación neuronal mediante el examen de la abundancia de cerca de 10 marcadores 17.
Hay tres consideraciones críticas en este protocolo. La primera es la máxima eliminación de las células alimentadoras MEF para lograr una población ESC alta pureza. La segunda es la sensibilidad a la luz de la AR: la solución madre y las gotas colgantes deben ser protegidos de la luz después de la aplicación de RA. RA solución madre es estable sólo durante dos semanas, después de lo cual debe ser preparó una solución fresca. La tercera consideración es la concentración de RA. En nuestros experimentos piloto, se encontró que a una concentración de RA crecimiento celular retardada 10 M y producido EBs de menor tamaño en comparación con las concentraciones más bajas, posiblemente debido a la AR pueden causar apoptosis a altas conncentrations 22, 23, 24. Hemos observado que una concentración RA de 0,5 M produjo un mayor número de EBs bien formados que en cualquiera de los dos mayores de 25 o menores concentraciones, y que el EBs alcanzó un diámetro medio de alrededor de 200 m. EBS más grandes superan el tamaño del campo de un objetivo de 10X y eran, por tanto, más difícil de imagen. Por lo tanto, elegimos 0,5 M como la concentración óptima de la AR.
Análisis por inmunofluorescencia de 3D EBS es problemático porque son demasiado frágiles para la sección de congelados. Por otra parte, se encontró que las secciones congeladas EB no se adhieren bien a portaobjetos de vidrio no recubiertos tratados de manera electrostática. Preparación del cultivo 2D EB requiere la agregación de las gotas que cuelgan adicionales, debido a que algunos EBs no se adhieren bien al sustrato. EB disociación, que es relativamente lento, se puede acelerar mediante pipeteado de la EBs arriba y hacia abajo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante su incubación con colagenasa.
Neuralmente CES diferenciadas se pueden utilizar para reemplazar las células endógenas dañados, por ejemplo, las neuronas dopaminérgicas perdidas en la sustancia nigra en el cerebro de pacientes que sufren de la enfermedad de Parkinson 26. Mientras que las técnicas actuales de diferenciación ESC humana no requieren la formación de EB (ibid.), EBs son todavía una herramienta útil para el análisis detallado de la diferenciación neuronal en el nivel molecular.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia o financieras
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el NIH subvención R01 HL119984 de AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
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