Summary
In questo studio a due parti, è stato sviluppato un attuatore biologico usando cantilevers altamente flessibili di polidimetilsilossano (PDMS) e cellule muscolari viventi (cardiomiociti), e caratterizzato. L'attuatore biologico è stato incorporato con una base di materiali PDMS modificati per costruire un biorobot di nuoto auto-stabilizzante.
Abstract
Le macchine biologiche spesso definite come biorobotti sono dispositivi basati su cellule o tessuti viventi alimentati esclusivamente dall'attività contrattile dei componenti vivi. A causa dei loro vantaggi intrinseci, i biorobotti stanno acquisendo interesse come alternative a robot tradizionali completamente artificiali. Vari studi hanno messo a fuoco sull'utilizzo del potere degli attuatori biologici, ma solo recentemente gli studi hanno caratterizzato quantitativamente la performance dei biorobotti e hanno studiato la loro geometria per migliorare la funzionalità e l'efficienza. Qui dimostriamo lo sviluppo di un biorobot di nuoto auto-stabilizzante che può mantenere il suo passo, la profondità e il rotolo senza intervento esterno. La progettazione e la fabbricazione dello scaffold PDMS per l'attuatore biologico e il bioroboto seguito dalla funzionalizzazione con fibronectina sono descritti in questa prima parte. Nella seconda parte di questo articolo in due parti, abbiamo dettagliato l'incorporazione dei cardiomiociti e caratterizzano l'azione biologicaAtor e funzione biorobota. Entrambe incorporano una base e una coda (cantilever) che producono la propulsione fin-based. La coda è costruita con tecniche di litografia morbida utilizzando PDMS e incisione laser. Dopo aver incorporato la coda con la base del dispositivo, è funzionalizzato con una proteina adesiva cellulare e seminata confluentemente con cardiomiociti. La base dell'attuatore biologico è costituita da un blocco PDMS solido con un perno centrale di vetro (agisce come peso). La base del biorobot è costituita da due materiali PDMS compositi, Ni-PDMS e microballoon-PDMS (MB-PDMS). La polvere di nichel (in Ni-PDMS) permette il controllo magnetico del biorobot durante la semina e la stabilità durante la locomozione. Microballoons (in MB-PDMS) riduce la densità di MB-PDMS e consente al biorobot di galleggiare e nuotare costantemente. L'utilizzo di questi due materiali con diverse densità di massa ha consentito un controllo preciso sulla distribuzione del peso per garantire una forza di ripristino positiva a qualsiasi angolo del bioroboto. Questa tecnicaProduce un biorobot di nuoto auto-stabilizzante magneticamente controllato.
Introduction
Gli attuatori biologici ei biorobotti sono attivamente studiati per fornire un'alternativa alla robotica convenzionale per numerose applicazioni. Biorobotti che camminano 5 , 6 , 7 , 8 , nuotano 1 , 2 , 3 , 4 , pompa 9 , 10 , o presa 11 , 12 , 13 Sono già stati sviluppati. Allo stesso modo, le cellule muscolari possono essere incorporate in una struttura 3D PDMS laminata 14 . Spesso le basi del biorobot sono realizzate usando tecniche di litografia morbida con materiali quali idrogeli e PDMS (polidimetilsilossano). Queste sono scelte interessanti a causa della loro flessibilità, del biocompatibIlity e la rigidezza facilmente sintonizzabile. Le cellule muscolari vive sono di solito incorporate con questi materiali per fornire la generazione di forza attraverso la contrazione. Le cellule del muscolo cardiaco dei mammiferi (cardiomiociti) e le cellule muscolari scheletriche sono state usate principalmente per l'azionamento. Oltre a questi due, i tessuti muscolari degli insetti sono stati utilizzati per operare biorobotti a temperatura ambiente 3 . In questo studio a due parti, i cardiomiociti sono stati scelti a causa della loro contrazione spontanea 6 .
Gran parte delle precedenti ricerche sui biorobotti si è concentrata sullo sviluppo degli attuatori biologici, mentre l'ottimizzazione dell'architettura biorobot e lo sviluppo di funzionalità essenziali per i biorobot sono stati largamente trascurati. Recentemente alcune relazioni hanno dimostrato l'implementazione di diverse modalità di nuoto ispirate alle modalità di propulsione trovate in natura. Questi metodi incorporano film PDMS e cellule muscolari per imitare diversi metodi di propulsione naturale. Ad esempio, è stata riportata la propulsione basata sulla flagella 1 , la propulsione 2 meduse biomimetica, il raggio bio-ibrido 4 e i dispositivi 13 di nuoto PDMS sottile.
In questo documento, presentiamo il processo di fabbricazione di biorobotti di nuoto auto-stabilizzanti che possono mantenere la profondità di immersione così come il pitch and roll. Il biorobot ha una base solida o un corpo, che è azionato da un unico cantilever con cardiomiociti attaccati alla sua superficie. I cardiomiociti provocano l'inclinazione del cantilever in una direzione longitudinale quando si contraggono. Questa forma di nuoto è classificata come nuoto ostraciforme. La capacità di aggiungere funzionalità aggiuntive sulla base è un vantaggio unico del nuoto ostraciiforme. Ad esempio, la base può essere utilizzata per fornire una galleggiabilità eccessiva per portare ulteriori carichi o circuiti di controllo per la contrazione cardiomiocitaria.
StabilitàDel bioroboto è stato spesso trascurato negli studi precedenti di biorobotti. In questo studio abbiamo implementato l'auto-stabilizzazione progettando la base con diversi materiali PDMS compositi di diversa densità di massa. Il bioroboto presenta quindi resistenza a disturbi esterni e mantiene la sua profondità di immersione, pitch e roll, senza aiuto. Il primo strato è PDMS microballoon (MB-PDMS), vale a dire PDMS miscelato con microballoons, che abbassa la densità del biorobot, permettendo così di galleggiare nel mezzo. Il secondo strato è il PDMS cantilever, e il suo spessore è adattato in modo tale che la forza generata dai cardiomiociti può piegare drasticamente il cantilever da 45 ° a 90 °. Lo strato inferiore è nickel-PDMS (Ni-PDMS), vale a dire PDMS miscelato con la polvere di nichel. Questo livello esegue funzioni multiple. È magnetico e quindi permette al biorobot di essere ancorato in fondo al mezzo, durante la semina delle cellule, con un magnete. La miscela di nichel è di densità più elevata di MB-PDMS eMedio e assicurare una posizione verticale del biorobot durante il galleggiamento. Il peso di questo strato genera una coppia di ripristino sul biorobot in qualsiasi passo e rotolo. Inoltre, il rapporto volume tra il Ni-PDMS e il MB-PDMS mantiene la profondità di immersione. I protocolli presentati sarebbero estremamente utili ai ricercatori interessati a caratterizzare la forza battente delle cellule muscolari e dei tessuti, nonché a coloro che desiderano costruire i biorobotti per il nuoto.
La semina degli attuatori biologici funzionalizzati e dei dispositivi biorobotici, la caratterizzazione meccanica e biochimica delle cellule e l'analisi quantitativa della funzione del dispositivo sono descritti in dettaglio nella parte 2 di questo articolo in due parti e negli ultimi lavori 15 .
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Protocol
1. Calcolare la massa di PDMS e Additivi
- Utilizzare la seguente equazione per trovare la massa di PDMS necessaria per altezze specifiche nelle seguenti procedure,
M = ρ * V = ρ * Altezza * Area (1),
Dove 'Altezza' è l'altezza dello strato, 'Area' è l'area di un contenitore che il PDMS sarà curato in 'ρ' è la densità della miscela e 'V' è il volume.
NOTA: Le densità per i calcoli di altezza sono PDMS = 0,965 g / mL, Ni-PDMS = 1,639 g / ml, MB-PDMS = 0,648 g / ml. - Utilizzare l'equazione (1) per stimare la massa di PDMS necessaria per un determinato contenitore per ottenere un'altezza specifica (5 mm) per la base dell'attuatore biologico. La densità risultante di PDMS è di 0,965 g / ml.
NOTA: Il rapporto è di 10: 1 in base all'agente di indurimento in peso.
M base = ρ * V = ρ * V * (
)(2)
Agente di polimerizzazione M = ρ * V = ρ * V * (
) - Utilizzare l'equazione (1) per trovare la massa di Ni-PDMS necessaria, per un determinato contenitore, per ottenere un'altezza specifica (1,5 mm) della base inferiore del bioroboto.
NOTA: i rapporti sono 1: 1.88 (polvere di nichel a PDMS in peso) e 1: 1.71: 0.171 (polvere di nichel a base di PDMS all'agente di polimerizzazione di PDMS in peso). La densità risultante di Ni-PDMS sarà di 1.639 g / mL.
M Nickel = ρ * V = ρ * V * (
) (3)
M base = ρ * V = ρ * V * (
)
Agente di polimerizzazione M = ρ * V = ρ * V * (
) - Analogamente, usare l'equazione (1) a f La massa di MB-PDMS necessaria, per un dato contenitore, per ottenere un'altezza specifica (3,5 mm) della base superiore del bioroboto.
NOTA: I rapporti sono di 1: 5 (microballoons a PDMS in peso) e 1: 4,54: 0,454 (microballoons alla base di PDMS per l'agente di tamponamento PDMS in peso). La densità risultante di MB-PDMS sarà 0,648 g / ml.
M Microballon = ρ * V = ρ * V * (
) (4)
M base = ρ * V = ρ * V * (
)
Agente di polimerizzazione M = ρ * V = ρ * V * (
) - Controllare la stabilità dinamica del biorobot con la dimensione e la geometria desiderati utilizzando gli script di analisi; Vedere le informazioni supplementari, 'Biorobot_dynamic_stability.m' e 'CG_CB_calculation.m'.
)(2) 
) 
) (3) 
) 
) 
) (4) 
) 
) NOTA: Vedere la Figura 1a.
- Spin-cappotto un film sottile di PDMS (vedi Figura 1a-1 e a2). Lo spessore della pellicola PDMS risultante sarà di 25 μm.
- Posizionare un wafer di silicio su un filatore di fotoresist e flip sull'interruttore della pompa per produrre l'aspirazione.
NOTA : Il wafer di silicio ha un diametro da 4 pollici e 500 μm di spessore. - Versare il fotoresistivo positivo ( es. S1808) sul wafer di silicio finché il wafer non è completamente coperto. Programmare il filatore per ruotare a 2000 rpm per 20 s. Quindi, agganciare la spinner premendo sul pedale. Spegnere l'aspirazione dopo la filatura.
- Scaldare un piatto caldo fino a 120 ° C. Usate le pinzette per wafer per prelevare il wafer di silicio dal filatore e posizionare la wafer di silicio direttamente sulla piastra di cottura. Coprire la fetta con un piatto petri poco profondo e cuocere per 10 minuti.
NOTA : è possibile utilizzare un forno per il baKe la fetta utilizzando la stessa temperatura e durata. La figura 1a-1 descrive questo processo. - Posizionare un contenitore di plastica su una scala di pesatura e farlo fuoriuscire. Versare 6 g di base di PDMS nel contenitore e aggiungere 0,6 g di agente polimerizzante PDMS. Mescolare accuratamente il PDMS per 5 minuti.
NOTA: Dopo la miscelazione, la miscela deve essere confluente con le bolle. - Posizionare il contenitore di PDMS misto in una camera a vuoto. Ridurre la pressione della camera di vuoto a 100 mbar e lasciare il contenitore nella camera per 30 minuti. Rompere il vuoto e rimuovere il contenitore. Tenere il contenitore coperto fino all'uso.
- Mettere il wafer di silicio con lo strato di fotoresistenza al forno sul filatore. Versare lentamente l'intera miscela di PDMS degassata sul wafer.
NOTA: Versare lentamente in modo che non si introducano nuove bolle nella miscela. - Impostare il filatore a 1.200 giri / min per 5 minuti. Accendere l'aspirazione della spinner e impegnare la spinner. Spegnere l'aspirazione dopo la filatura.
NOTA: TLe impostazioni di questo risultato hanno uno strato di PDMS di 25 μm. - Scaldare un forno a 40 ° C. Usate le pinzette wafer per raccogliere il wafer di silicio dal filatore, quindi posizionarlo nel forno. Cuocere la cialda durante la notte e raffreddare il wafer a temperatura ambiente.
NOTA: la figura 1a-2 descrive questo processo.
- Posizionare un wafer di silicio su un filatore di fotoresist e flip sull'interruttore della pompa per produrre l'aspirazione.
- Incisione laser del sottile strato PDMS.
- Accendere l'interruttore di alimentazione dell'incisore laser e del suo scarico. Accendere il computer collegato all'incisore laser. Aprire il software di incisione laser.
- Sotto l'opzione "File", aprire il file di progettazione biologico attuatore mostrato nella Figura 2e.
- Premere il pulsante "Impostazioni". Fai clic su "Blu" e cambia l'impostazione di potenza al 3% e la velocità al 4%. Fare clic su "Imposta". Fai clic su "Nero" e cambia "Modalità" per saltare. Quindi fare clic su "Set". Fai lo stesso per "Rosso". Premere il pulsante "Applica" per terminareLe impostazioni. "
- Spingere il pulsante "Activate the Engraver" in alto a destra.
- Premere il pulsante "Trasferisci" per spostare il disegno al centro dello schermo del software.
- Premere il pulsante "Focus View" nel programma e fare clic sul bordo del biorobot sullo schermo. Questo sposta il punto laser di guida dell'incisore laser al punto corrispondente.
- Spostare manualmente la fetta con le pinzette, in modo che il punto sulla fetta corrispondente al punto cliccato nel punto 2.2.4 sia direttamente sotto il punto laser di guida.
- Premere il pulsante "Avvia incisione del lavoro precedente" per avviare il processo di incisione. Rimuovere la fetta dopo che l'incisione è stata completata. Spegnere tutte le apparecchiature.
NOTA: Il pulsante "Inizia l'incisione del lavoro precedente" è il grande triangolo verde. Non guardare direttamente il processo di incisione poiché il laser può danneggiare gli occhi. La figura 1a-3 descrive questo processo. - Preparazione e realizzazione della base dell'attuatore biologico.
- Versare le perle di vetro (3 mm di diametro) in un tubo da 15 ml. Immergere le perle con il 70% di etanolo in acqua di DI per 24 ore. Rimuovere l'etanolo e riempire il tubo con acqua DI per 24 ore. Versare l'acqua di DI e mettere il tubo su una piastra a 50 ° C per facilitare l'essiccazione delle perle di vetro.
- Aggiungere 3 g alla quantità di PDMS trovata nell'equazione (1) per rappresentare il PDMS che si attacca ai lati dei contenitori durante il versamento. Utilizzare l'equazione (2) per trovare le masse PDMS e gli agenti di indurimento.
- Posizionare un contenitore di plastica su una scala di pesatura e farlo fuoriuscire. Versare la quantità di base PDMS trovata nel passaggio 2.3.2 nel contenitore e farla fuoriuscire. Quindi versare la quantità di agente di polimerizzazione PDMS trovata nel passaggio 2.3.2 nel contenitore.
- Mescolare accuratamente il PDMS per 5 minuti.
NOTA: il PDMS viene utilizzato in un rapporto di base di 10: 1 con l'agente di indurimento. La miscela dovrebbe avere molte bolle. - PostoUn contenitore da utilizzare per la cottura su una scala e lo zero. Spegnere con cautela la corretta quantità di PDMS trovata nel passaggio 2.3.2 (e miscelata nel passaggio 2.3.4) nel contenitore. Far cadere i branelli di vetro puliti in tutta la miscela PDMS a intervalli regolari. Lasciare un minimo di 5 mm di spazio intorno a ciascun tallone per la base attuatore biologica.
- Posizionare il contenitore in una camera a vuoto. Ridurre la pressione del vuoto a 100 mbar e spegnere la pompa per vuoto. Dopo 30 minuti, rompere il vuoto e rimuovere il contenitore. Tenere coperto fino all'uso.
NOTA: la pressione nella camera può aumentare lentamente nel tempo, quando la miscela degasa e la camera di vuoto scompare. Se la pressione aumenta in modo sostanzialmente superiore a 100 mbar, accendere la pompa a vuoto per riportare la pressione a 100 mbar. - Scaldare una piastra a 40 ° C. Posizionare con cautela il contenitore di PDMS e le perle di vetro sulla piastra calda. Coprire il contenitore e cuocere per la notte.
- Assemblea di attuatore biologico. NOTA: la seguente procedura può essere eseguita a occhio nudo.
- Tagliare i cubi (5 mm x 5 mm x 5 mm) dal PDMS di massa effettuato nella parte 2.3 usando una lama di rasoio.
NOTA: Un tallone dovrebbe essere al centro di ogni cubo. - Pulire tutti i lati di ogni base attuatore biologico, per rimuovere eventuali contaminanti sulle superfici di base, premendo la base nel nastro e rimuovendo. Ripetere per ogni lato.
- Ripeti i punti da 2.3.2 a 2.3.6 per fare una piccola quantità di PDMS liquido. Immergere la punta di un ago nel PDMS liquido. Posizionare una goccia del PDMS liquido sull'area di incisione in scala della wafer modellata nel punto 2.2. Smear la gocciolina di PDMS in modo che copri completamente l'area di base di 5 mm x 5 mm.
NOTA: L'area di base è la sezione quadrata centrale della figura 2a . - Usare le pinzette per posizionare il cubo pulito dalla fase 2.4.2 sull'area di base che è coperta con PDMS liquido.
- Ripetere il passo 2.4.3 da "Inserire una goccia di PDMS liquido" alla eNd e passo 2.4.4 per ogni dispositivo che verrà eseguito.
- Scaldare una piastra a 40 ° C. Posizionare con cautela il wafer di silicio con gli assiemi sulla piastra calda. Coprire la wafer e cuocere la notte.
NOTA : Tenere le unità fissate fino all'uso. La figura 1a-4 rappresenta il dispositivo finale.
- Tagliare i cubi (5 mm x 5 mm x 5 mm) dal PDMS di massa effettuato nella parte 2.3 usando una lama di rasoio.
3. Fabbricazione di Biorobot (Figura 1b)
- Spin-coating e incisione a laser di un film sottile PDMS
- Ripetere tutti i passaggi in 2.1 e 2.2 utilizzando un nuovo wafer di silicio. Ciò porterà ad una fetta di silicio con un sottile film di PDMS e una sottile pellicola del fotoresist, incisa con un disegno biorobot.
NOTA : Durante la ripetizione del punto 2.2, utilizzare il disegno biorobot per l'incisione laser anziché il disegno attuatore biologico precedentemente utilizzato. Le figure 1b-1 e b-3 descrivono questi processi.
- Ripetere tutti i passaggi in 2.1 e 2.2 utilizzando un nuovo wafer di silicio. Ciò porterà ad una fetta di silicio con un sottile film di PDMS e una sottile pellicola del fotoresist, incisa con un disegno biorobot.
- Preparazione e fabbricazione del compo PDMSsiti.
NOTA : la seguente procedura può essere eseguita a occhio nudo.- Versare i microballi fenolici in un tubo da 50 ml fino a quando non è pieno. Riempire il tubo con l'etanolo al 70% in acqua DI e lasciarlo riposare per 24 ore. Versare l'etanolo, aggiungere l'acqua di DI e lasciarlo riposare per 24 ore. Versare l'acqua di DI e quindi posizionare il tubo su una piastra a 50 ° C per facilitare l'essiccazione dei microballi prima dell'uso.
- Utilizzare l'equazione (1) con la densità MB-PDMS e un'altezza di 3,5 mm per trovare il volume di PDMS richiesto. Aggiungere 3 g all'ammontare totale, per rendere conto del materiale che rimarrà nel contenitore dopo versamento. Utilizzare l'equazione (3) per individuare la base PDMS e gli agenti di agente di polimerizzazione. Misurare la quantità appropriata di base PDMS, agente di tintura e microballi utilizzando la scala.
- Utilizzare l'equazione (1) con densità Ni-PDMS e altezza da 1,5 mm per trovare il volume di PDMS necessario. Aggiungere 3 g all'ammontare totale come nel punto 3.2.2. Utilizzare l'equazione (2) per trovare la base PDMS e la polimerizzazione aImporti gentili. Misurare la quantità appropriata di base PDMS, agente di polimerizzazione e polvere di nichel utilizzando la bilancia.
- Mescolare ogni miscela di MB-PDMS e Ni-PDMS per 5 min. Versare con cautela la corretta quantità di MB-PDMS e Ni-PDMS calcolati in 3.2.2 e 3.2.3 in contenitori separati utilizzando una scala.
NOTA : Le miscele devono essere accuratamente mescolate da una barra di metallo o vetro senza graffiare la superficie inferiore del contenitore di miscelazione. La miscela sarà confluente con le bolle. - Posizionare entrambi i contenitori in una camera a vuoto. Ridurre la sua pressione a 100 mbar per 30 minuti. Ridurre il vuoto e rimuovere i contenitori. Tenere coperto fino all'uso.
- Scaldare una piastra a 40 ° C. Posizionare i contenitori con MB-PDMS e Ni-PDMS sulla piastra calda. Coprire ogni contenitore e cuocere per la notte.
NOTA : Conservare con un coperchio fino all'uso.
- Assemblaggio Biorobot.
- Tagliare le basi biorobotiche di dimensioni rispettive a ciascuna dimensione biorobotica da Ni-PDMS e MB-PDMS utilizzando una lama del rasoio. Vedere la Figura 2b-2d per i disegni di base.
NOTA: Lo spessore di Ni-PDMS è di 1,5 mm e quello di MB-PDMS è di 3,5 mm. - Pulire tutti i lati delle basi biorobot per rimuovere eventuali contaminanti sulle superfici, premendo la base nel nastro e rimuovendo. Ripetere per ogni lato.
- Accendere un caricatore corona. Portare la punta del caricatore corona di 1 cm sopra la base Ni-PDMS, che viene posizionata su una piastra metallica con un tessuto della camera pulita in mezzo. Spostare la punta intorno alla base e continuare per 15 s per trattare la superficie.
NOTA: si deve verificare uno scarico tra il caricatore corona e il wafer. In caso contrario, portare la punta più vicino fino a quando si verifica una scarica. - Ripetere il passaggio 3.3.3 per trattare la superficie della base di un biorobot inciso nel punto 3.1 per la stessa durata. Usate le pinzette per posizionare il lato trattato di Ni-PDMS sul lato trattato del film. Lasciate che il dispositivo rimanga per 5 minuti.
NOTA : Ciò si bloccaGly lega le due parti. Vedere la Figura 1b4 . - Utilizzare pinzette nitide per sbucciare la cantilever biorobot dalla fetta e posizionarla sul fondo della base Ni-PDMS. Usare le pinzette per rimuovere l'intero assemblaggio dalla fetta.
NOTA : Il cantilever verrà fissato alla base Ni-PDMS. La figura 1b-5 e b-6 lo descrivono. - Posizionare una piccola goccia di PDMS non cementato (base 10: 1 all'agente di rettifica) sulla parte superiore della base MB-PDMS. Utilizzate le pinzette per posizionare il lato del Ni-PDMS con il PDMS a film sottile sul MB-PDMS con il PDMS non realizzato. Mettere l'assemblaggio in un piatto di petri di plastica e poi posizionarlo su una piastra a 40 ° C per curare la notte.
NOTA: la Figura 1b-7 rappresenta il dispositivo finale.
- Tagliare le basi biorobotiche di dimensioni rispettive a ciascuna dimensione biorobotica da Ni-PDMS e MB-PDMS utilizzando una lama del rasoio. Vedere la Figura 2b-2d per i disegni di base.
4. Funzionalizzazione dei dispositivi
NOTA : Sotto, descriviamo il processo di preparazione dei dispositivi per la semina delle cellule.
- PrepSono i materiali necessari: la soluzione di fibronectina (50 μg / mL), la soluzione salina di fosfato bufato (PBS), il mezzo modificato di aquile di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale fetale (FBS) e l'antibiotico 1% di penicillina completo (DMEM completato).
- Posizionare 100 μl di soluzione fibronectina nel centro di un pallone di coltura T-25 (superficie inferiore quando il pallone è in posizione verticale). Mantenere i flaconi separati per ogni dispositivo.
- Posizionare il biorobot o l'attuatore biologico rivolto verso il basso sopra la gocciolina di soluzione fibronectina. Assicurarsi che il cantilevamento sia srotolato e immerso nella gocciolina. Incubare a 37 ° C per 30 min.
- Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione fibronectina e lavare due volte con PBS.
- Rimuovere il PBS e riempire il pallone con 10 ml di DMEM. Incubare a 37 ° C per 1 h per facilitare il degasaggio del PDMS. Per sommergere i biorobotti in 10 ml di supporti, utilizzare un magnete per tenere il dispositivo al fondo del pallone. Posizionare il pallone con il samBallare in un bagno di ultrasonizzazione per 5 minuti per rimuovere le bolle.
NOTA : Durante il periodo di incubazione, le bolle d'aria si formano sulla superficie del PDMS, qui denominato degasaggio. Il Ni-PDMS utilizzato nell'assemblaggio biorobot è magnetico. L'attuatore biologico non ha bisogno di un magnete perché rimarrà alla base del pallone a causa del peso del tallone di vetro. Il bioroboto o il gruppo attuatore biologico è ora pronto per la semina, che viene spiegato in dettaglio nella parte 2.
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Representative Results
L'attuatore biologico e il biorobot hanno processi di fabbricazione molto simili, in quanto il biorobot è una naturale estensione dell'attivatore biologico ( Figura 1 ). L'attuatore biologico è stato sviluppato innanzitutto per stabilire le tecniche necessarie per il bioroboto, per analizzare la forza generata dalle cellule e per caratterizzare la maturazione cellulare meccanicamente e biochimicamente, entrambi descritti in dettaglio nella Parte 2 di questo articolo a due parti Così come nel nostro lavoro pubblicato di recente 15 .
La costante di molla dell'attuatore è stata valutata e sintonizzata per una grande variazione nel raggio di curvatura del cantilever durante la piena contrazione del foglio cardiomyocyte. Quindi, abbiamo progettato il biorobot, dando particolare attenzione alla sua stabilità, al controllo durante la semina cellulare e alla facilità di locomozione. Inizialmente, alcuni progetti sono stati scelti, come mostratoNella Figura 2b-2d , con diverse proprietà per valutare quali attributi contribuiscono al massimo alle esigenze di progettazione. I biorobotti sono stati progettati e collaudati con cantilever corti, lunghi e larghi, nonché con diversi cantilevers per testare l'effetto delle modifiche nell'attuatore sulla funzione biorobot. Abbiamo anche considerato dimensioni diverse della base galleggiante. La geometria della base è stata mantenuta come un triangolo in quanto crea l'asimmetria che potrebbe determinare un movimento direzionale.
La stabilità del biorobot era una componente fondamentale del processo di progettazione. Lo strato superiore MB-PDMS è stato utilizzato per fornire galleggiamento al dispositivo, mentre lo strato inferiore Ni-PDMS è stato utilizzato per la stabilità e il controllo magnetico. A causa di una densità più elevata, lo strato di base fatto di nichel fornisce al biorobot la capacità di mantenerlo in posizione verticale e di ritornare alla sua posizione originaria dopo l'esposizione a disturbi esterni; Mostrato in Figura 3
La seguente equazione può descrivere l'altezza dei biorobotti sopra la superficie del mezzo: 
Dove H Ni , H Mb , media ρ , ρ Mb e ρ
Per determinare lo spessore giusto di ogni strato composito, sono stati testati diversi rapporti di miscelazione con Ni-PDMS e MB-PDMS. Le densità massime e minime facilmente mischiate erano di 0,648 g / cm 3 per MB-PDMS e 1,64 g / cm 3 per Ni-PDMS, come mostrato in Figura 3a . Tutte le altezze del biorobot erano state progettate in modo che il momento di ripristino di un biorobot in qualsiasi angolo di inclinazione fosse abbastanza forte da riportarlo in posizione orizzontale. Una forma triangolare è stata utilizzata per ridurre la resistenza idrodinamica. Le dimensioni finali sono mostrate in Figura 3d . Utilizzando uno script di computer, la stabilità è stata analizzata numericamente e dimostrato di avere un forte momento di ripristino utilizzando il metodo a due strati, come mostrato nella Figura 3e . Vedi tabella dei materiali e informazioni supplementariN per il programma di computer utilizzato.
Figura 1: Flusso di processo per la fabbricazione dell'attivatore biologico e Biorobot. Ogni disegno rappresenta le fasi dei materiali e dei metodi nelle sezioni del protocollo 2 e 3 per l'attuatore biologico e la fabbricazione del bioroboto. I cantilever PDMS sono fabbricati con spin-coating e incisione laser. Quindi i cantilever sono collegati ad una base stazionaria con un tallone di vetro per l'attuatore biologico ( a ) o una base galleggiante auto-stabilizzante per il bioroboto ( b ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dimensioni diL'attuatore biologico ei biorobotti fabbricati in questo studio ei file CAD per l'incisione sia dell'attivatore biologico che di vari tipi di biotubi. A) Attuatore biologico. B ) Bioroboto a braccio a doppio braccio. C ) Bioroboto a braccio a braccio ampio. D ) Bioroboto a braccio singolo. E ) disegno CAD di attuatore biologico per incisione laser. F ) disegno CAD di biorobotti per incisione laser. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Densità di miscelazione per Ni-PDMS e MB-PDMS e stabilità dei biorobotti. (A) Rapporti di miscelazione e densità risultanti. ( B ) Le densità e il pesoDelle basi rispetto ai media. ( C ) la rotazione e il ripristino del bioroboto quando è inclinato. Il disallineamento tra il centro di gravità (CG) e il centro di galleggiamento (CB) genera un momento di rotazione. Questo momento ripristinerà il biorobot o causerà l'inclinazione ulteriormente. D ) le dimensioni del bioroboto a braccio singolo in scala millimetrica. ( E ) La forza di ripristino è stata simulata per il bioroboto a braccio singolo mostrato nella parte (c) in condizioni di inclinazione in (b) utilizzando due strati (Ni-PDMS e MB-PDMS) rispetto al singolo strato (MB-PDMS). Il grafico mostra che un bioroboto a singolo strato non si ripristinerà se è inclinato a 45 °, mentre il biorobot a doppio strato avrà sempre una forza di ripristino positiva, mantenendo in posizione verticale il biorobot. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vari nuotatori acquatici trovano diversi meccanismi di locomozione 16 . Il meccanismo di locomozione del bioroboto in questo studio utilizza la locomozione a base di fin, in particolare la locomozione ostraciforme. I nuotatori ostraciformi si propagano spingendo una coda (cantilever) e avendo un corpo rigido (base stratificata) 16 . I pesci come i boxfish e le cowfish utilizzano questo tipo di locomozione. I nuotatori ostraciformi sono tipicamente lenti e hanno dimensioni inefficienti del corpo. Anche se il nuoto ostraciiforme manca di velocità, questa forma di nuoto consente agli ingegneri di implementare varie funzionalità (come la stabilità dinamica) sulla base o sul corpo. Il progetto biorobotico sviluppato in questo studio si basa su una base solida per il galleggiamento e la stabilità, con un cantilever autopulente come meccanismo di propulsione. Uno dei passaggi più importanti nella fabbricazione del biorobot in questo studio è il processo di sottile pellicola PDMS e incisione laser per formare il cantileva. Senza una consolle salda, la giusta miscela di PDMS (per elasticità), spessore corretto (per la costante della molla) e dimensioni (con sufficiente spazio per l'adesione confluente dei cardiomiociti per produrre movimento), il bioroboto non funzionerà. Inoltre, è anche necessario rimuovere tutte le bolle dalla superficie del cantilever tramite ultrasonografia per creare una superficie vitale per l'attaccamento cardiomiocito.
I materiali compositi PDMS sviluppati, MB-PDMS e Ni-PDMS possono essere utilizzati per controllare con precisione la profondità di immersione e produrre con successo la stabilità dinamica dei biorobotti. La densità di massa di questi materiali può essere sintonizzata finemente, come mostrato in Figura 3a . Inoltre, questi materiali non mostrano effetti negativi sulla maturazione e sulla contrazione dei cardiomiociti, come abbiamo mostrato nel nostro lavoro recente 15 . Quindi, i materiali sviluppati possono essere ampiamente utilizzati per implementare una struttura auto-stabilizzante e fluttuanteE per biorobotti e altre applicazioni.
Anche se il protocollo attuale è stato in grado di costruire un biorobot di nuoto auto-stabilizzante, ha poche limitazioni. Innanzitutto, poiché il cantilever è spellato manualmente dalla fetta, il cantilever può essere deformato durante il processo e la ripetibilità della performance del biorobot è influenzata. Ciò può essere affrontato usando uno strato sacrificante di dissoluzione dell'acqua invece dello strato fotoresistente, in modo che il cantilever possa essere facilmente rimosso dalla fetta; I cantilevers più grandi possono essere utilizzati pure per un potere più elevato. In secondo luogo, la procedura si basa principalmente sulle operazioni manuali. La procedura di fabbricazione può essere snellito per una maggiore efficienza. Ad esempio, il processo di assemblaggio che include il seme di cardiomiociti può essere modificato in modo da condurlo su un livello di wafer anziché sul livello di un singolo dispositivo. Infine, la forma della base triangolare del biorobot può essere ottimizzata per aumentare la direzione e la stabilità del nuoto.
<P class = "jove_content"> I biorobotti che sfruttano l'energia generata dalle cellule muscolari viventi sono di notevole interesse come alternativa ai robot tradizionali completamente artificiali. Questo protocollo utilizza la litografia morbida e le tecniche bio-MEMS per produrre un bioroboto auto-stabilizzante e nuoto. Il particolare design può essere ulteriormente raffinato. L'efficienza dell'attuatore potrebbe essere aumentata modellando i segnali di allineamento per i cardiomiociti sulla superficie del bancone. Questo promuoverà l'orientamento cellulare e può aumentare la generazione di forza dei cariomyoctyes 17 . Le dimensioni potrebbero anche essere variate o possono essere attaccate più bracci cantilever, per aumentare ulteriormente la forza netta da contrazioni sincronizzate. Come descritto in precedenza, la base a più strati consente di sartoria dell'altezza del bioroboto sopra la superficie del supporto. Questo determina il carico massimo di trasporto e la stabilità. Inoltre, possiamo sostituire o aggiungere materiali conduttivi al cantilever per fAcilitare la stimolazione elettrica. La stimolazione elettrica può essere usata per controllare il tasso di contrazione delle cellule e la velocità dei biorobotti. Riteniamo che i metodi presentati possano essere usati per sviluppare biorobotti altamente efficienti per applicazioni come la piccola consegna dei pacchetti.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Acknowledgments
MT Holley è sostenuta dal programma dei laureati della Louisiana Board of Regents e C. Danielson è sostenuto dal programma Howard Hughes Medical Institute Professors. Questo studio è supportato da NSF Grant No: 1530884. Gli autori vorrebbero ringraziare il sostegno della sala pulizia presso il Centro per le Microstrutture e le Disposizioni Avanzate (CAMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 sil elast kit 0.5kg | Sylgard 184 |
| Nickel Powder | Sigma-Aldrich | 266981-100G | |
| Phenolic microballoons | US Composites | BJO-0930 | |
| Silicon wafers | 4 inch diameter | ||
| PWM101 light-duty spinner | Spin- coater | ||
| Positive photoresist (S1808) | Dow Corning | DEM-10018197 | |
| Hotplate | |||
| Vacuum chamber | |||
| M206 mechanical convection oven | Convection oven | ||
| Laser engraver | Universal Laser System | VLS2.30 | Utilizes a 10 W, 10.6 µm wavelength, CO2 Laser |
| Universal Laser Systems Application | Universal Laser System | Application for running the VLS 2.30 | |
| Matlab | MathWorks | Numerical analysis program | |
| Scotch Tape | Scotch Brand | ||
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich | Z265926-1EA | Soda-lime glass, diameter 3 mm |
| Scale | Mettler Toledo | EL303 | |
| BD-20AC Laboratory Corona Treater | Electrotechnic Products | 12051A | Corona Discharger |
| Ultrasonic Bath 1.9 L | Fisher Scientific | 15-337-402 | 40 kHz industrial transducer |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | With 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate. |
| Fetalclone III serum | Hyclone Industries, GE | 16777-240 | Fetal bovine serum |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 |
References
- Williams, B., Anand, S., Rajagopalan, J., Saif, M. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat commun. 5, (2014).
- Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
- Huge Herr,, D, A swimming Robot Actuated by Living Muscle Tissue. J Neuroeng. Rehabil. 1, (2004).
- Park, S., al, el Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Chan, V., Park, K., Colleens, M., Kong, H., Saif, T., Bashir, R. Development of miniaturized walking biological machines. Sci. Rep. 2, 857 (2012).
- Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. PNAS. 111, 10125-10130 (2014).
- Xi, J., Scmidt, J., Montemagno, C. Self-assembled microdevices driven by muscle. Nat. Mater. 4, 180-184 (2005).
- Kim, J., et al. Establishment of a fabrication method for a long-term actuated hybrid cell robot. Lab Chip. 7, 1504-1508 (2007).
- Tanaka, Y., Sato, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T., Kitamori, T. A micro-spherical heart pump powered by cultured cardiomyocytes. Lab Chip. 7, 207-212 (2007).
- Park, J., et al. Micro pumping with cardiomyocyte-polymer hybrid. Lab Chip. 7, 1367-1370 (2007).
- Akiyama, Y. Atmospheric-operable bioactuator powered by insect muscle packaged with medium. Lab Chip. 13, 4870-4880 (2013).
- Kabumoto, K., Hoshino, T., Akiyama, Y., Morishima, K. Voluntary movement controlled by the surface EMG signal for tissue-engineered skeletal muscle on a gripping tool. Tissue Eng. Part A. 19, 1695-1703 (2013).
- Feinberg, A., Feigel, A., Shevkoplyas, S., Sheehy, S., Whitesides, G., Parker, K. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
- Vannozi, L., et al. Self-assembly of polydimethylsiloxane structures from 2D to 3D for bio-hybrid actuation. Bioinspiration Biomimetics. 10 (5), (2015).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16, 3473-3484 (2016).
- Sfakiotakis, M., Lane, D., Davies, J. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Oceanic Eng. 24, 237-252 (1999).
- McCain, M., Agarwal, A., Hesmith, H., Nesmith, A., Parker, K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).
