Summary
En este estudio en dos partes, un actuador biológico se desarrolló utilizando polidimetilsiloxano (PDMS) altamente flexible y cantilevers vivos células musculares (cardiomiocitos), y se caracteriza. El actuador biológico se incorporó con una base hecha de materiales PDMS modificados para construir un biorobot de natación autoestabilizante.
Abstract
Las máquinas biológicas, a menudo denominadas biorobots, son dispositivos vivos basados en células o tejidos que se alimentan únicamente por la actividad contráctil de componentes vivos. Debido a sus ventajas inherentes, los biorobots están ganando interés como alternativas a los robots tradicionales totalmente artificiales. Varios estudios se han centrado en aprovechar el poder de los actuadores biológicos, pero sólo recientemente los estudios han caracterizado cuantitativamente el rendimiento de los biorobots y estudiado su geometría para mejorar la funcionalidad y la eficiencia. Aquí, demostramos el desarrollo de un biorobot de natación auto-estabilizante que puede mantener su tono, profundidad y rollo sin intervención externa. El diseño y fabricación del andamio PDMS para el actuador biológico y biorobot seguido de la funcionalización con fibronectina se describe en esta primera parte. En la segunda parte de este artículo en dos partes, detallamos la incorporación de cardiomiocitos y caracterizarAtor y biorobot. Ambos incorporan una base y cola (voladizo) que producen propulsión basada en aletas. La cola se construye con técnicas de litografía blanda utilizando PDMS y grabado láser. Después de incorporar la cola con la base del dispositivo, se funda con una proteína adhesiva celular y se siembra confluentemente con cardiomiocitos. La base del actuador biológico consiste en un bloque PDMS sólido con una perla de vidrio central (actúa como un peso). La base del biorobot consiste en dos materiales compuestos de PDMS, Ni-PDMS y microbalón-PDMS (MB-PDMS). El polvo de níquel (en Ni-PDMS) permite el control magnético del biorobot durante la siembra de las células y la estabilidad durante la locomoción. Los microbolones (en MB-PDMS) disminuyen la densidad de MB-PDMS, y permiten que el biorobot flote y nade constantemente. El uso de estos dos materiales con diferentes densidades de masa permitió un control preciso sobre la distribución del peso para asegurar una fuerza de restauración positiva en cualquier ángulo del biorobot. Esta técnicaProduce un biorobot de natación auto-estabilizante controlado magnéticamente.
Introduction
Actuadores biológicos y biorobots están siendo estudiados activamente para proporcionar una alternativa a la robótica convencional para numerosas aplicaciones. Biorobots que caminan 5 , 6 , 7 , 8 , nadan 1 , 2 , 3 , 4 , bomba 9 , 10 , o agarre 11 , 12 , 13 Ya se han desarrollado. Del mismo modo, las células musculares pueden ser incorporados en una estructura laminada en 3D PDMS [ 14] . A menudo, las estructuras biorobotales se fabrican usando técnicas de litografía blanda con materiales tales como hidrogeles y PDMS (polidimetilsiloxano). Estas son opciones atractivas debido a su flexibilidad, biocompatibY la rigidez fácilmente sintonizable. Las células musculares vivas se incorporan normalmente con estos materiales para proporcionar la generación de fuerza a través de la contracción. Las células del músculo cardíaco de los mamíferos (cardiomiocitos) y las células del músculo esquelético han sido usadas predominantemente para el accionamiento. Además de estos dos tejidos musculares de insectos se han utilizado para operar biorobots a temperatura ambiente 3 . En este estudio en dos partes, los cardiomiocitos fueron elegidos debido a su contracción espontánea [ 6] .
Gran parte de la investigación anterior sobre biorobots se centró en el desarrollo de los actuadores biológicos, mientras que la optimización de la arquitectura biorobot y el desarrollo de funcionalidades esenciales para los biorobots fueron en gran medida descuidados. Recientemente, algunos informes demostraron la implementación de diferentes modos de natación que se inspiraron en los modos de propulsión encontrados en la naturaleza. Estos métodos incorporan películas PDMS y células musculares para imitar diversos métodos de propulsión natural. Por ejemplo, se han descrito propulsión 1 basada en flagelos, propulsión 2 de medusas biomiméticas, rayos biohíbridos 4 y dispositivos de natación PDMS de película delgada 13 .
En este artículo presentamos el proceso de fabricación de biorobots de natación autoestabilizantes que pueden mantener la profundidad de inmersión así como el tono y el balanceo. El biorobot tiene una base sólida o cuerpo, que es propulsado por un solo cantilever con cardiomiocitos unidos a su superficie. Los cardiomiocitos hacen que el voladizo se doble en una dirección longitudinal cuando se contraen. Esta forma de natación se clasifica como natación ostraciiforme. La posibilidad de añadir funciones adicionales a la base es una ventaja única de la natación ostraciiforme. Por ejemplo, la base puede utilizarse para proporcionar una flotabilidad excesiva para transportar cargas adicionales o circuitos de control para la contracción de cardiomiocitos.
EstabilidadDel biorobot a menudo se pasaba por alto en estudios previos de biorobots. En este estudio, hemos implementado la auto-estabilización mediante el diseño de la base con diferentes materiales compuestos PDMS de densidades de masa variable. El biorobot presenta así resistencia a las perturbaciones externas y mantiene su profundidad de inmersión, paso y balanceo, sin ayuda. La primera capa es el microbolón PDMS (MB-PDMS), es decir , PDMS mezclado con microbalones, lo que disminuye la densidad del biorobot, lo que le permite flotar en los medios de comunicación. La segunda capa es el voladizo PDMS, y su espesor se adapta de tal manera que la fuerza generada por los cardiomiocitos puede doblar dramáticamente el voladizo de 45º a 90º. La capa inferior es níquel-PDMS (Ni-PDMS), es decir , PDMS mezclado con polvo de níquel. Esta capa realiza múltiples funciones. Es magnético, y por lo tanto permite que el biorobot se ancle en la parte inferior del medio, durante la siembra de células, con un imán. La mezcla de níquel es de mayor densidad que el MB-PDMS yMedio, y asegurar una posición vertical del biorobot mientras flotante. El peso de esta capa genera un par de recuperación en el biorobot en cualquier paso y rollo. Además, la relación de volumen entre el Ni-PDMS y el MB-PDMS mantiene la profundidad de inmersión. Los protocolos presentados serían de gran utilidad para los investigadores interesados en caracterizar la fuerza de golpeo de células y tejidos musculares, así como aquellos que desean construir biorobots natación.
La siembra del actuador biológico funcionalizado y los dispositivos biorobot, la caracterización mecánica y bioquímica de las células y el análisis cuantitativo de la función del dispositivo se describen en detalle en la Parte 2 de este artículo en dos partes así como en el trabajo reciente 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Calcular masa de PDMS y aditivos
- Utilice la siguiente ecuación para encontrar la masa de PDMS necesaria para alturas específicas en los procedimientos siguientes,
M = ρ * V = ρ * Altura * Área (1),
Donde 'Altura' es la altura de la capa, 'Área' es el área de un contenedor en el que se curará el PDMS, 'ρ' es la densidad de la mezcla y 'V' es el volumen.
NOTA: Las densidades para los cálculos de altura son PDMS = 0,965 g / mL, Ni-PDMS = 1,639 g / mL, MB-PDMS = 0,648 g / mL. - Utilice la ecuación (1) para estimar la masa de PDMS necesaria, para un contenedor dado, para obtener una altura específica (5 mm) para la base del actuador biológico. La densidad resultante de PDMS es 0,965 g / ml.
NOTA: La proporción es de 10: 1 base para el agente de curado en peso.
M base = ρ * V = ρ * V * (
)(2)
M agente de curado = ρ * V = ρ * V * (
) - Utilice la ecuación (1) para encontrar la masa de Ni-PDMS necesaria, para un contenedor dado, para obtener una altura específica (1,5 mm) de la base inferior del biorobot.
NOTA: Las proporciones son 1: 1,88 (polvo de níquel a PDMS en peso) y 1: 1,71: 0,171 (polvo de níquel a base de PDMS a agente de curado PDMS en peso). La densidad resultante de Ni-PDMS será de 1,639 g / ml.
M Níquel = ρ * V = ρ * V * (
) (3)
M base = ρ * V = ρ * V * (
)
M agente de curado = ρ * V = ρ * V * (
) - Similarmente, utilice la ecuación (1) a f Ind la masa de MB-PDMS necesaria, para un contenedor dado, para obtener una altura específica (3,5 mm) de la base superior del biorobot.
NOTA: Las proporciones son 1: 5 (microbalones a PDMS en peso) y 1: 4,54: 0,454 (microbalones a base de PDMS a agente de curado PDMS en peso). La densidad resultante de MB - PDMS será 0,648 g / ml.
M Microbolón = ρ * V = ρ * V * (
) (4)
M base = ρ * V = ρ * V * (
)
M agente de curado = ρ * V = ρ * V * (
) - Compruebe la estabilidad dinámica del biorobot con la dimensión y la geometría deseadas utilizando los guiones de análisis; Vea la información suplementaria, 'Biorobot_dynamic_stability.m' y 'CG_CB_calculation.m'.
)(2) 
) 
) (3) 
) 
) 
) (4) 
) 
) NOTA: Vea la Figura 1a.
- Recubrir por centrifugación una película delgada de PDMS (ver Figura 1a-1 y a2). El espesor de la pelıcula PDMS resultante será de 25 μm.
- Coloque una oblea de silicio en una hiladora fotorresistente y encienda el interruptor de la bomba para producir succión.
NOTA : La oblea de silicio tiene un diámetro de 4 pulgadas y un grosor de 500 μm. - Vierta la fotorresistencia positiva ( p . Ej. S1808) sobre la oblea de silicio hasta que la oblea esté completamente cubierta. Programe el centrifugador para girar a 2.000 rpm durante 20 s. A continuación, enganchar la hiladora presionando el pedal. Apague la succión después de girar.
- Calentar una placa caliente hasta 120 ° C. Utilice pinzas de oblea para recoger la oblea de silicio de la hiladora y colocar la oblea de silicio directamente en la placa de cocción. Cubrir la oblea con una placa de petri poco profunda y hornear durante 10 min.
NOTA : Se puede usar un horno paraKe la oblea usando la misma temperatura y duración. La Figura 1a-1 representa este proceso. - Coloque un recipiente de plástico en una báscula de pesaje y cítelo. Se vierten 6 g de la base de PDMS en el recipiente y se añaden 0,6 g de agente de curado PDMS. Mezclar el PDMS a fondo durante 5 min.
NOTA: Después de mezclar, la mezcla debe ser confluente con burbujas. - Coloque el recipiente de PDMS mezclado en una cámara de vacío. Reduzca la presión de la cámara de vacío a 100 mbar y deje el recipiente en la cámara durante 30 min. Rompa el vacío y retire el recipiente. Mantenga el recipiente cubierto hasta su uso.
- Coloque la oblea de silicio con la capa de fotorresistencia al horno en la hiladora. Vierta lentamente toda la mezcla de PDMS desgasificada en la oblea.
NOTA: Vierta lentamente para que no se introduzcan nuevas burbujas en la mezcla. - Ajustar el centrifugador a 1.200 rpm durante 5 min. Encienda la succión de la hiladora y engancha la hiladora. Apague la succión después de girar.
NOTA: TEstos ajustes dan lugar a una capa de 25 μm de espesor de PDMS. - Calentar un horno a 40 ° C. Utilice pinzas de oblea para recoger la oblea de silicio de la hiladora y luego colóquela en el horno. Hornear la oblea durante la noche y luego enfriar la oblea a temperatura ambiente.
NOTA: La Figura 1a-2 representa este proceso.
- Coloque una oblea de silicio en una hiladora fotorresistente y encienda el interruptor de la bomba para producir succión.
- Grabado láser de la capa de película delgada PDMS.
- Encienda el interruptor de encendido del grabador láser y su extractor. Encienda el ordenador conectado al grabador láser. Abra el software del grabador láser.
- Bajo la opción "Archivo", abra el archivo de diseño del actuador biológico mostrado en la Figura 2e.
- Pulse el botón "Configuración". Haga clic en "Azul" y cambie el ajuste de potencia al 3% y la velocidad al 4%. Haga clic en "Establecer". Haga clic en "Negro" y cambiar el "Modo" para saltar. A continuación, haga clic en "Establecer". Haga lo mismo para "Rojo". Pulse el botón "Aplicar" para finalizarla configuración."
- Pulse el botón "Activar grabador" en la parte superior derecha.
- Presione el botón "Reubicar" para mover el diseño en el centro de la pantalla del software.
- Pulse el botón "Focus View" en el programa y haga clic en el borde del biorobot en la pantalla. Esto moverá el punto láser de guía del grabador láser al punto correspondiente.
- Mueva la oblea manualmente con pinzas, de modo que el punto en la oblea correspondiente al punto apuntado en 2.2.4 esté directamente debajo del punto láser guía.
- Pulse el botón "Iniciar el grabado del trabajo anterior" para iniciar el proceso de grabado. Retire la oblea después de completar el grabado. Apague todos los equipos.
NOTA: El botón "Iniciar el grabado del trabajo anterior" es el gran triángulo verde. No mire directamente el proceso de grabado ya que el láser puede dañar los ojos. La Figura 1a-3 representa este proceso. - Preparación y fabricación de la base del actuador biológico.
- Vierta las perlas de vidrio (3 mm de diámetro) en un tubo de 15 ml. Sumerja las perlas con etanol al 70% en agua desionizada durante 24 h. Retirar el etanol y llenar el tubo con agua DI por 24 h. Vierta el agua DI y coloque el tubo en una placa caliente a 50 ° C para facilitar el secado de las perlas de vidrio.
- Añada 3 g a la cantidad de PDMS que se encuentra en la ecuación (1) para tener en cuenta el PDMS que se adherirá a los lados del recipiente durante el vertido. Utilice la ecuación (2) para encontrar la base de PDMS y las cantidades de agente de curado.
- Coloque un recipiente de plástico en una báscula de pesaje y cítelo. Vierta la cantidad de PDMS base encontrada en el paso 2.3.2 en el contenedor y cero fuera. A continuación, vierta la cantidad de agente de curado PDMS que se encuentra en el paso 2.3.2 en el recipiente.
- Mezclar el PDMS a fondo durante 5 min.
NOTA: El PDMS se utiliza en una proporción de 10: 1 base para el agente de curado. La mezcla debe tener muchas burbujas. - LugarUn recipiente para ser utilizado para hornear en una escala y cero hacia fuera. Cuidadosamente verter la cantidad correcta de PDMS que se encuentra en el paso 2.3.2 (y mezclado en el paso 2.3.4) en el contenedor. Deje limpiar las cuentas de vidrio en toda la mezcla de PDMS a intervalos regulares. Deje un mínimo de 5 mm de espacio alrededor de cada talón para la base del actuador biológico.
- Coloque el recipiente en una cámara de vacío. Reduzca la presión de vacío a 100 mbar y apague la bomba de vacío. Después de 30 min, romper el vacío y retirar el recipiente. Mantenga cubierto hasta su uso.
NOTA: La presión en la cámara puede aumentar lentamente con el tiempo a medida que la mezcla se desgasifica y la cámara de vacío se filtra. Si la presión aumenta sustancialmente sobre 100 mbar, encienda la bomba de vacío para restablecer la presión a 100 mbar. - Calentar una placa de cocción a 40 ° C. Coloque cuidadosamente el recipiente de PDMS y las perlas de vidrio en la placa caliente. Cubrir el recipiente y hornear durante la noche.
- Conjunto del actuador biológico. NOTA: El siguiente procedimiento se puede realizar a simple vista.
- Recorte los cubos (5 mm x 5 mm x 5 mm) del PDMS en masa realizado en la parte 2.3 usando una cuchilla de afeitar.
NOTA: Una cuenta debe estar en el centro de cada cubo. - Limpie todos los lados de cada base del actuador biológico, para eliminar cualquier contaminante en las superficies de la base, presionando la base en la cinta y quítela. Repita para cada lado.
- Rehacer los pasos 2.3.2 a 2.3.6 para hacer una pequeña cantidad de PDMS líquido. Sumerja la punta de una aguja en el PDMS líquido. Coloque una gota del PDMS líquido en el área de base grabada de la oblea con el patrón en el paso 2.2. Frote la gotita de PDMS de modo que cubra completamente la superficie base de 5 mm x 5 mm.
NOTA: El área de base es la sección cuadrada media de la Figura 2a . - Utilice pinzas para colocar el cubo limpio del paso 2.4.2 en el área de base que está cubierto con PDMS líquido.
- Repita el paso 2.4.3 desde "Coloque una gota de PDMS líquido" en la posición eNd y el paso 2.4.4 para cada dispositivo que se realizará.
- Calentar una placa de cocción a 40 ° C. Cuidadosamente coloque la oblea de silicio con los conjuntos en la placa caliente. Cubrir la oblea y hornear durante la noche.
NOTA : Mantenga los ensamblajes unidos hasta su uso. La Figura 1a-4 representa el dispositivo final.
- Recorte los cubos (5 mm x 5 mm x 5 mm) del PDMS en masa realizado en la parte 2.3 usando una cuchilla de afeitar.
3. Fabricación de Biorobots (Figura 1b)
- Spin-coating y grabado con láser una fina película PDMS
- Repita todos los pasos en 2.1 y 2.2 usando una nueva oblea de silicio. Esto dará lugar a una oblea de silicio con una fina película de PDMS y una película delgada de la fotorresistencia, que está grabado con un diseño biorobot.
NOTA : Mientras repita el paso 2.2, utilice el diseño biorobot para el grabado con láser en lugar del diseño del actuador biológico utilizado anteriormente. Las Figuras 1b-1 y b-3 representan estos procesos.
- Repita todos los pasos en 2.1 y 2.2 usando una nueva oblea de silicio. Esto dará lugar a una oblea de silicio con una fina película de PDMS y una película delgada de la fotorresistencia, que está grabado con un diseño biorobot.
- Preparación y fabricación de PDMS compoSitios.
NOTA : El siguiente procedimiento se puede realizar a simple vista.- Verter los microbalones fenólicos en un tubo de 50 ml hasta que esté lleno. Llenar el tubo con etanol al 70% en agua DI y dejar reposar durante 24 h. Se vierte el etanol, se añade agua desionizada y se deja reposar durante 24 h. Vierta el agua DI, y luego coloque el tubo en una placa caliente a 50 ° C para facilitar el secado de los microbalones antes de su uso.
- Utilice la ecuación (1) con la densidad MB-PDMS y 3,5 mm de altura para encontrar el volumen de PDMS requerido. Añadir 3 g a la cantidad total, para tener en cuenta el material que permanecerá en el recipiente después de verter. Utilice la ecuación (3) para encontrar la base de PDMS y las cantidades de agente de curado. Medir la cantidad adecuada de PDMS base, agente de curado y microbalones utilizando la escala.
- Utilice la ecuación (1) con densidad Ni-PDMS y altura de 1,5 mm para encontrar el volumen de PDMS necesario. Añadir 3 g a la cantidad total como en el paso 3.2.2. Utilice la ecuación (2) para encontrar la base PDMS y curar unaGent cantidades. Medir la cantidad apropiada de base de PDMS, agente de curado y polvo de níquel usando la escala.
- Mezclar cada mezcla de MB-PDMS y Ni-PDMS durante 5 min. Verter cuidadosamente la cantidad correcta de MB-PDMS y Ni-PDMS calculados en 3.2.2 y 3.2.3 en recipientes separados usando una escala.
NOTA : Las mezclas deben ser completamente mezcladas por una varilla de metal o vidrio sin rascar la superficie inferior del recipiente de mezcla. La mezcla será confluente con burbujas. - Coloque ambos recipientes en una cámara de vacío. Reduzca su presión a 100 mbar durante 30 min. Romper el vacío y retirar los recipientes. Mantenga cubierto hasta su uso.
- Calentar una placa de cocción a 40 ° C. Coloque los recipientes con MB-PDMS y Ni-PDMS en la placa caliente. Cubrir cada recipiente y hornear durante la noche.
NOTA : Almacene con una tapa hasta su uso.
- Montaje de Biorobot.
- Cortar biorobot bases de dimensiones respectivas a cada tamaño biorobot de Ni-PDMS y MB-PDMS utilizando una cuchilla de afeitar. Vea la Figura 2b-2d para los diseños de base.
NOTA: El espesor de Ni-PDMS es de 1,5 mm y el de MB-PDMS es de 3,5 mm. - Limpie todos los lados de las bases biorobot para eliminar cualquier contaminante en las superficies, presionando la base en la cinta y quitando. Repita para cada lado.
- Encienda un descargador de corona. Lleve la punta del descargador de corona 1 cm por encima de la base Ni-PDMS, que se coloca en una placa de metal con un tejido de sala limpia en el medio. Mueva la punta alrededor de la base y continúe durante 15 s para tratar la superficie.
NOTA: Debe producirse una descarga entre el descargador corona y la oblea. Si no lo hace, acerque la punta hasta que se produzca una descarga. - Repita el paso 3.3.3 para tratar la superficie de la base de un biorobot grabado en el paso 3.1 durante la misma duración. Utilice pinzas para colocar el lado tratado con Ni-PDMS en el lado tratado de la película. Deje reposar el dispositivo durante 5 min.
NOTA : Esto hará queLas dos partes. Véase la figura 1b4 . - Utilice pinzas afiladas para pelar el cantilever biorobot de la oblea y colocarlo en la parte inferior de la base Ni-PDMS. Utilice pinzas para quitar todo el conjunto de la oblea.
NOTA : El voladizo se unirá a la base Ni-PDMS. La figura 1b-5 y la b-6 representan esto. - Coloque una pequeña gota de PDMS sin curar (base de 10: 1 a agente de curado) en la parte superior de la base de MB-PDMS. Utilice pinzas para colocar el lado del Ni-PDMS con el PDMS de película delgada en el MB-PDMS con el PDMS sin curar. Colocar el conjunto en una placa de Petri de plástico, y luego colocar esto en una placa caliente a 40 ° C para curar durante la noche.
NOTA: La figura 1b-7 representa el dispositivo final.
- Cortar biorobot bases de dimensiones respectivas a cada tamaño biorobot de Ni-PDMS y MB-PDMS utilizando una cuchilla de afeitar. Vea la Figura 2b-2d para los diseños de base.
4. Funcionalización de los dispositivos
NOTA : A continuación, describimos el proceso de preparación de los dispositivos para la siembra de células.
- DeberesSon los materiales requeridos: Solución de fibronectina (50 μg / ml), solución salina tamponada con fosfato (PBS), medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y antibiótico al penicilina al 1% (DMEM completo).
- Colocar 100 μl de solución de fibronectina en el centro de un matraz de cultivo T-25 (superficie inferior cuando el matraz está sentado verticalmente). Mantenga frascos separados para cada dispositivo.
- Coloque el biorobot o el actuador biológico hacia abajo sobre la gotita de la solución de fibronectina. Asegúrese de que el voladizo se despliega y sumerja dentro de la gotita. Incubar a 37 ℃ durante 30 min.
- Después de la incubación, eliminar la solución de fibronectina y lavar con PBS dos veces.
- Eliminar el PBS y llenar el matraz con 10 ml de DMEM. Incubar a 37 ° C durante 1 h para facilitar la desgasificación del PDMS. Para sumergir los biorobots en 10 ml de medio, utilice un imán para sostener el dispositivo en la parte inferior del matraz. Coloque el frasco con el samEn un baño de ultrasonidos durante 5 minutos para eliminar las burbujas.
NOTA : Durante el período de incubación, se forman burbujas de aire en la superficie de PDMS, a la que se hace referencia aquí como desgasificación. El Ni-PDMS utilizado en el conjunto biorobot es magnético. El actuador biológico no necesita un imán porque permanecerá en el fondo del matraz debido al peso del cordón de vidrio. El conjunto de actuador biorobot o biológico está ahora listo para la siembra, que se explica en detalle en la parte 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El actuador biológico y el biorobot tienen procesos de fabricación muy similares, ya que el biorobot es una extensión natural del actuador biológico ( Figura 1 ). El actuador biológico se desarrolló primero para establecer las técnicas requeridas para el biorobot, para analizar la fuerza generada por las células y para caracterizar la maduración celular mecánica y bioquímicamente, ambas se describen en detalle en la Parte 2 de este artículo en dos partes como Así como en nuestro trabajo recientemente publicado 15 .
La constante de muelle del actuador se evaluó y sintonizó para un cambio grande en el radio de curvatura del voladizo durante la contracción completa de la hoja de cardiomiocitos. Luego, diseñamos el biorobot, dando especial consideración a su estabilidad, control durante la siembra de células y facilidad de locomoción. Inicialmente, se escogieron algunos diseños, como se muestraEn la Figura 2b-2d , con diferentes propiedades para evaluar qué atributos contribuyen más a los requisitos de diseño. Los biorobots fueron diseñados y probados con cantilevers cortos, largos y anchos, así como con múltiples voladizos para probar el efecto de los cambios en el actuador en la función biorobot. También consideramos diferentes tamaños de la base flotante. La geometría de la base se mantuvo como un triángulo, ya que crea la asimetría que daría lugar a un movimiento direccional.
La estabilidad del biorobot fue un componente crítico en el proceso de diseño. La capa MB-PDMS superior se usó para proporcionar flotabilidad al dispositivo, mientras que la capa inferior de Ni-PDMS se usó para la estabilidad y el control magnético. Debido a una mayor densidad, la capa base de níquel proporciona al biorobot la capacidad de mantenerse erguido y volver a su posición original después de la exposición a perturbaciones externas; Mostrado en la Figura 3
La siguiente ecuación puede describir la altura de los biorobots por encima de la superficie del medio: 
Donde H Ni , H Mb , ρ medio , ρ Mb , y ρ
Para determinar el grosor correcto de cada capa compuesta, se ensayaron diversas relaciones de mezcla con Ni-PDMS y MB-PDMS. Las densidades máximas y mínimas que podrían mezclarse fácilmente eran 0,648 g / cm $ ³ $ para MB-PDMS y 1,64 g / cm $ ³ $ para Ni-PDMS, como se muestra en la Figura 3a . Todas las alturas del biorobot fueron diseñadas para que el momento de restauración de un biorobot en cualquier ángulo de inclinación fueran lo suficientemente fuertes para traerlo de vuelta a la posición horizontal. Se utilizó una forma triangular para reducir el arrastre hidrodinámico. Las dimensiones finales se muestran en la figura 3d . Utilizando un script de computadora, la estabilidad se analizó numéricamente y se demostró que tenía un fuerte momento de restauración utilizando el método de dos capas, como se muestra en la Figura 3e . Ver tabla de materiales e información complementariaN para el programa informático utilizado.
Figura 1: Flujo del proceso para la fabricación del actuador biológico y del biorobot. Cada dibujo representa los pasos en los materiales y métodos en las secciones de protocolo 2 y 3 para la actuación biológica y la fabricación de biorobots. Los voladizos PDMS se fabrican mediante recubrimiento por centrifugado y grabado con láser. A continuación, los voladizos se unen a una base estacionaria con una perla de vidrio para el actuador biológico ( a ) oa una base flotante autoestabilizante para el biorobot ( b ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Dimensiones deEl actuador biológico y Biorobots que se fabrican en este estudio y los archivos CAD para el grabado tanto el actuador biológico y varios tipos de Biorobots. (A) Actuador biológico. ( B ) biorobot en voladizo de brazo doble. C ) Biorobot en voladizo de brazo ancho. ( D ) Biorobot de brazo único. E ) Dibujo CAD de actuador biológico para grabado láser. ( F ) Dibujo CAD de biorobots para grabado láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Densidades de mezcla para Ni-PDMS y MB-PDMS y Estabilidad de los Biorobots. (A) Relaciones de mezcla y densidades resultantes. ( B ) Las densidades y alturaDe las bases en relación con los medios de comunicación. ( C ) La rotación y restauración del biorobot cuando está inclinado. La desalineación entre el centro de gravedad (CG) y el centro de flotación (CB) genera un momento de rotación. Este momento restaurará el biorobot o hará que se incline más. ( D ) Las dimensiones del biorobot de brazo único en escala milimétrica. ( E ) Se simuló la fuerza de restauración para el biorobot de un solo brazo mostrado en la parte (c) en condiciones de inclinación en (b) usando dos capas (Ni-PDMS y MB-PDMS) frente a una sola capa (MB-PDMS). La gráfica muestra que un biorobot de una sola capa no se restablecerá si está inclinado sobre 45 °, mientras que el biorobot de doble capa tendrá siempre fuerza de restauración positiva, manteniendo el biorobot en posición vertical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Varios mecanismos de locomoción se pueden encontrar entre los nadadores acuáticos 16 . El mecanismo de locomoción del biorobot en este estudio utiliza la locomoción basada en las aletas, específicamente la locomoción ostraciiforme. Los nadadores de Ostraciiform se propulsan moviendo una cola (cantilever) y teniendo un cuerpo rígido (capa de la base) 16 . Los peces como el boxfish y cowfish utilizan este tipo de locomoción. Los nadadores ostraciiformes son típicamente lentos y tienen dimensiones corporales ineficientes. Aunque la natación ostraciiforme carece de velocidad, esta forma de nadar permite a los ingenieros implementar diversas funcionalidades (como la estabilidad dinámica) en la base o el cuerpo. El diseño biorobot desarrollado en este estudio se basa en una base sólida para la flotación y la estabilidad, con un voladizo auto-actuante como el mecanismo propulsor. Uno de los pasos más importantes en la fabricación del biorobot en este estudio es la película delgada PDMS y proceso de grabado láser para formar el cantipalanca. Sin un cantilever limpio, la mezcla derecha de PDMS (para la elasticidad), grosor correcto (para la constante del resorte) y dimensiones (que tienen área suficiente para la adherencia confluent de cardiomyocytes para producir el movimiento), el biorobot no funcionará. Además, también es necesario eliminar todas las burbujas de la superficie en voladizo mediante ultrasonidos para crear una superficie viable para la fijación de cardiomiocitos.
Los materiales compuestos PDMS desarrollados, MB-PDMS y Ni-PDMS pueden usarse para controlar con precisión la profundidad de inmersión y producir con éxito la estabilidad dinámica de los biorobots. La densidad de masa de estos materiales puede ajustarse finamente, como se muestra en la Figura 3a . Además, estos materiales no muestran ningún efecto negativo sobre la maduración y contracción de los cardiomiocitos, como hemos demostrado en nuestro trabajo reciente [ 15] . Por lo tanto, los materiales desarrollados pueden ser ampliamente utilizados para implementar una estructura autoestabilizante y flotanteE para biorobots y otras aplicaciones.
Aunque el protocolo actual fue capaz de construir un biorobot de natación auto-estabilizante, tiene algunas limitaciones. En primer lugar, cuando el voladizo se desprende manualmente de la oblea, el voladizo puede deformarse durante el proceso y se afecta la repetibilidad del comportamiento del biorobot. Esto se puede resolver utilizando una capa sacrificial que disuelve el agua en lugar de la capa fotorresistente, de manera que el cantilever pueda ser fácilmente retirado de la oblea; Los cantilevers más grandes se pueden utilizar también para la energía más alta. En segundo lugar, el procedimiento se basa principalmente en operaciones manuales. El procedimiento de fabricación puede simplificarse para una mayor eficiencia. Por ejemplo, el proceso de ensamblaje incluyendo la siembra de cardiomiocitos puede ser modificado para conducirlo en un nivel de oblea en lugar de nivel de dispositivo individual. Por último, la forma de la base triangular del biorobot puede optimizarse para aumentar la direccionalidad y estabilidad de la natación.
<Los biorobots que aprovechan la energía generada por las células musculares vivas son de considerable interés como una alternativa a los robots tradicionales totalmente artificiales. Este protocolo utiliza técnicas de litografía blanda y bio-MEMS para producir un biorobot auto-estabilizante. El diseño particular se puede refinar aún más. La eficiencia del actuador podría aumentarse mediante el diseño de señales de alineación para los cardiomiocitos en la superficie en voladizo. Esto promoverá la orientación celular y puede aumentar la generación de fuerza de los cariomioctyes [ 17] . Las dimensiones también podrían variarse o se podrían unir múltiples brazos en voladizo, para aumentar aún más la fuerza neta de las contracciones sincronizadas. Como se ha descrito anteriormente, la base de múltiples capas permite adaptar la altura del biorobot por encima de la superficie del medio. Esto determina la máxima carga de carga y estabilidad. Además, podemos sustituir o añadir materiales conductores al voladizo con el fin de fAcilitar la estimulación eléctrica. La estimulación eléctrica puede utilizarse para controlar la velocidad de contracción de las células y la velocidad de los biorobots. Creemos que los métodos presentados pueden ser utilizados para desarrollar biorobots altamente eficientes para aplicaciones tales como entrega de paquetes pequeños.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
MT Holley es apoyado por el programa Graduate Fellows de la Junta de Regentes de Louisiana y C. Danielson es apoyado por el Programa de Profesores del Instituto Médico Howard Hughes. Este estudio es apoyado por el NSF Grant No: 1530884. Los autores desean agradecer el apoyo de la sala limpia en el Centro de Microstructuras y Dispositivos Avanzados (CAMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 sil elast kit 0.5kg | Sylgard 184 |
| Nickel Powder | Sigma-Aldrich | 266981-100G | |
| Phenolic microballoons | US Composites | BJO-0930 | |
| Silicon wafers | 4 inch diameter | ||
| PWM101 light-duty spinner | Spin- coater | ||
| Positive photoresist (S1808) | Dow Corning | DEM-10018197 | |
| Hotplate | |||
| Vacuum chamber | |||
| M206 mechanical convection oven | Convection oven | ||
| Laser engraver | Universal Laser System | VLS2.30 | Utilizes a 10 W, 10.6 µm wavelength, CO2 Laser |
| Universal Laser Systems Application | Universal Laser System | Application for running the VLS 2.30 | |
| Matlab | MathWorks | Numerical analysis program | |
| Scotch Tape | Scotch Brand | ||
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich | Z265926-1EA | Soda-lime glass, diameter 3 mm |
| Scale | Mettler Toledo | EL303 | |
| BD-20AC Laboratory Corona Treater | Electrotechnic Products | 12051A | Corona Discharger |
| Ultrasonic Bath 1.9 L | Fisher Scientific | 15-337-402 | 40 kHz industrial transducer |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | With 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate. |
| Fetalclone III serum | Hyclone Industries, GE | 16777-240 | Fetal bovine serum |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 |
References
- Williams, B., Anand, S., Rajagopalan, J., Saif, M. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat commun. 5, (2014).
- Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
- Huge Herr,, D, A swimming Robot Actuated by Living Muscle Tissue. J Neuroeng. Rehabil. 1, (2004).
- Park, S., al, el Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Chan, V., Park, K., Colleens, M., Kong, H., Saif, T., Bashir, R. Development of miniaturized walking biological machines. Sci. Rep. 2, 857 (2012).
- Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. PNAS. 111, 10125-10130 (2014).
- Xi, J., Scmidt, J., Montemagno, C. Self-assembled microdevices driven by muscle. Nat. Mater. 4, 180-184 (2005).
- Kim, J., et al. Establishment of a fabrication method for a long-term actuated hybrid cell robot. Lab Chip. 7, 1504-1508 (2007).
- Tanaka, Y., Sato, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T., Kitamori, T. A micro-spherical heart pump powered by cultured cardiomyocytes. Lab Chip. 7, 207-212 (2007).
- Park, J., et al. Micro pumping with cardiomyocyte-polymer hybrid. Lab Chip. 7, 1367-1370 (2007).
- Akiyama, Y. Atmospheric-operable bioactuator powered by insect muscle packaged with medium. Lab Chip. 13, 4870-4880 (2013).
- Kabumoto, K., Hoshino, T., Akiyama, Y., Morishima, K. Voluntary movement controlled by the surface EMG signal for tissue-engineered skeletal muscle on a gripping tool. Tissue Eng. Part A. 19, 1695-1703 (2013).
- Feinberg, A., Feigel, A., Shevkoplyas, S., Sheehy, S., Whitesides, G., Parker, K. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
- Vannozi, L., et al. Self-assembly of polydimethylsiloxane structures from 2D to 3D for bio-hybrid actuation. Bioinspiration Biomimetics. 10 (5), (2015).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16, 3473-3484 (2016).
- Sfakiotakis, M., Lane, D., Davies, J. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Oceanic Eng. 24, 237-252 (1999).
- McCain, M., Agarwal, A., Hesmith, H., Nesmith, A., Parker, K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).
