Summary
Questo protocollo descrive un metodo per misurare sensibilmente il tasso di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule NSC-34 come motori neuronali quantificando il cambiamento in tempo reale nell'importazione nucleare di una proteina NLS-NES-GFP.
Abstract
Il trasporto nucleocitoplasmatico si riferisce all'importazione e all'esportazione di grandi molecole dal nucleo cellulare. Recentemente, un certo numero di studi hanno mostrato una connessione tra la sclerosi laterale amyotrofica (ALS) e le alterazioni del percorso nucleocitoplasmatico. L'ALS è una malattia neurodegenerativa che colpisce i neuroni motori e che porta alla paralisi e, infine, alla morte, in media di 2-5 anni. La maggior parte dei casi di ALS sono sporadici, privi di qualsiasi legame genetico apparente, ma il 10% viene ereditato in maniera dominante. Recentemente, le espansioni di ripetizione di esanucleotidi (HRE) nel cromosoma 9 aperto frame di lettura 72 (C9orf72) sono stati identificati come una causa genetica di ALS e demenza frontotemporale (FTD). Importante, diversi gruppi hanno recentemente proposto che queste mutanti influenzino il trasporto nucleocitoplasmatico. Questi studi hanno mostrato in gran parte l'esito finale e le manifestazioni causate dagli HRE sul trasporto nucleocitoplasmatico, ma non dimostrano disfunzioni del trasporto nucleare intempo reale. Di conseguenza, solo la carenza nucleocitoplasmatica di trasporto può essere determinata, soprattutto a causa di un'elevata espressione o di inserimento proteico esogeno.
Questo protocollo descrive un nuovo e molto sensibile dosaggio per valutare e quantificare la disfunzione del trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale. Il tasso di importazione di una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) può essere quantificato in tempo reale utilizzando microscopia fluorescente. Questo viene eseguito usando un inibitore dell'esportin, consentendo così alla navetta GFP di entrare solo nel nucleo. Per convalidare il dosaggio, sono state utilizzate le ripetizioni dei dipeptidi tradotte da C9orf72 HRE, poli (GR) e poli (PR), che sono state precedentemente mostrate per interrompere il trasporto nucleocitoplasmico. Utilizzando il saggio descritto, è stata osservata una diminuzione del 50% del tasso di importazione nucleare rispetto al controllo. Utilizzando questo sistema, possono essere esaminati piccoli cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico e la capacità di diversi fattori di salvarlo (anche parzialmente) di un nucleo nucleotiplasmaticoPuò essere determinato il difetto di risposta.
Introduction
Il complesso dei pori nucleari (NPC) controlla l'importazione e l'esportazione di grandi molecole in e fuori dal nucleo delle cellule. Contrariamente alle piccole molecole, che possono entrare nel nucleo senza regola 1 , il trasporto di molecole più grandi è fortemente controllato dal NPC. Queste grandi molecole, come le proteine e l'RNA, associano fattori di trasporto, comprese le importazioni e le esportazioni, da importare ed esportare dal nucleo 2 . Per essere importato, le proteine devono contenere un piccolo motivo peptidico, generalmente chiamato un segnale di localizzazione nucleare (NLS), che è vincolato dalle importanti 2 . Queste sequenze di aminoacidi agiscono come un tag e sono diverse nella composizione 3 , 4 . Le proteine possono essere esportate dal nucleo al citoplasma a causa della loro associazione con l'exportinS, che legano una sequenza di segnali, generalmente chiamata segnale di esportazione nucleare (NES) 2 . Entrambe le importazioni e le esportazioni sono in grado di trasportare il loro carico a causa della regolazione della piccola proteina nucleare RTP correlata GTPase (Ran) 2 . Ran ha dimostrato di esistere in diversi stati conformazionali a seconda che sia vincolato al GTP o al PIL. Quando legato a GTP, Ran può legarsi a importini o esportazioni. Dopo l'adesione a RanGTP, le importazioni rilasciano il loro carico, mentre le esportazioni devono obbligare RanGTP a formare un complesso con il loro carico di esportazione. Lo stato di legame nucleotidico dominante di Ran dipende dalla sua collocazione nel nucleo (RanGTP) o nel citoplasma (RanGDP).
Recentemente, un certo numero di studi hanno mostrato una connessione tra disturbi del percorso nucleocitoplasmatico e sia la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e la demenza frontotemporale (FTD) 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . L'ALS è una malattia neurodegenerativa progressiva e fatale che colpisce sia i neuroni motori superiori che inferiori (MN) 13 e provoca paralisi e, infine, nella morte, in media da 2-5 anni. La maggior parte dei casi di ALS sono classificati come sporadici (SALS), senza alcun legame genetico apparente, ma il 10% è ereditato in maniera dominante (ALS familiare; FALS). Recentemente, le espansioni di ripetizione dell'esanucleotide (HRE) nel cromosoma 9 aperto frame di lettura 72 (C9orf72) sono stati identificati 14,15 come causa genetica di ALS e FTD. Questi mutanti rappresentano il 30-40% dei casi FALS 16 e diversi studi hanno sostenutoChe provocano tossicità colpendo il trasporto nucleocitoplasmico 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Questi studi hanno mostrato in gran parte i risultati finali e le manifestazioni degli HRE sul trasporto nucleocitoplasmatico, ma non dimostrano la rottura nucleocitoplasmatica in tempo reale. Di conseguenza, solo la mancanza di trasporto nucleocitoplasmatico grave è stata valutata 11 , 17 , 18 .
Questo protocollo descrive un nuovo e vePer valutare e quantificare la disfunzione del trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale. Il tasso di importazione di una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) può essere quantificato in tempo reale utilizzando microscopia fluorescente. Ciò avviene usando un inibitore dell'esportin, come descritto in precedenza 18 , consentendo così al shuttle-GFP di entrare solo nel nucleo. Utilizzando la microscopia fluorescente e un software in grado di quantificare i cambiamenti fluorescenti in tempo reale, è possibile quantificare i cambiamenti graduali nell'intensità di fluorescenza del shuttle-GFP, che si trova nel nucleo. Di conseguenza, può essere effettuata una curva di saturazione simile a Michaelis-Menten dell'asse fluorescenza-tempo, che rappresenta la quantità di GFP nucleare in un dato momento. Utilizzando la velocità lineare iniziale delle curve, è possibile generare una pendenza che rappresenta la velocità di ingresso nel nucleo prima della saturazione della fluorescenza.
Per convalidare il saggio, tradurreRipetizioni di dipeptide di C9orf72, poli (GR) e poli (PR), precedentemente riportate per interrompere il trasporto nucleocitoplasmatico, sono state utilizzate 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Utilizzando questo saggio, è stata osservata una diminuzione del 50% del tasso di importazione nucleare rispetto al controllo. Utilizzando questo sistema, possono essere esaminati piccoli cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico. Inoltre, può essere determinata la capacità di diversi fattori per salvare un difetto di trasporto nucleocitoplasmatico.
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Protocol
1. Preparazione della linea cellulare
- Scavare circa 1.000.000 cellule del midollo spinale del neuroblastoma del mouse (cellule NSC-34) che sono state immagazzinate in un contenitore di azoto liquido. Usare un incubatore ad acqua di 37 ° C fino a quando le cellule sono completamente scongelate.
- Aggiungere il terreno fresco e caldo (mezzo DMEM contenente 10% di siero fetale fetale (FBS), 1% di L-glutammina e 1% di antibiotici pen-strep).
- Centrifugare le cellule scongelate (SL16R) a 500 xg per 5 minuti, formando un pellet di cellule. Scartare il mezzo e aggiungere 1 ml di nuovo mezzo per la risospensione cellulare.
- Posizionare le cellule risospese in una pallina da 15 mL e aggiungere un ulteriore 5 mL di terreno. Incubare le cellule durante la notte in un incubatore sterile con 5% di CO 2 a 37 ° C.
- Parallelamente, posizionare 8 coperchi non rivestiti (vetro di copertura: 12 mm, spessore 0,13-0,17 mm) in un piatto da 60 mm di coltura e sterilizzare utilizzando il 70% di etanolo e l'esposizione a 30 minuti di luce UV finché non sia asciutta. Aggiungere il mezzo a ogni piatto e smalti per lavare l'etanolo residuo.
- Aggiungere il tampone di trysina (2,5 g di tripsina e 0,2 g di EDTA in 1 L di Hanks 'Balanced Salt Solution) alle cellule dopo aver raggiunto la confluenza del 90% (circa 6 milioni di cellule per pallone) per consentire alle cellule aderenti di dissociarsi.
NOTA: Le cellule NSC-34 sono sensibili e richiedono solo 15 s di incubazione del tampone di trypsina e 1 min di incubazione aggiuntiva senza trypsina prima della dissociazione usando il mezzo. - Piattare le cellule sui piatti di coltura da 60 mm che già contengono le copertine con 3 ml di mezzo, circa 350.000 per piatto. Lasciarli nell'incubatrice per 24 ore per consentire l'attaccatura cellulare sui coperchi.
2. Trasfezione cellulare
NOTA: Dopo circa 24 ore, le cellule NSC-34 raggiungeranno la confluenza del 40% (circa 800.000 celle) e saranno pronte per la transfezione.
- Preparare il mezzo puro DMEM (300 μL di media DMEM per ogni piatto di coltura da 60 mm) in vasca di microcentrifuga sterilees.
- Aggiungere 2 μg di ciascun plasmo necessario per la trasfezione in ogni tubo di microcentrifuga contenente DMEM.
NOTA: Il plasmide shuttle-GFP è obbligatorio in tutte le cellule. - Aggiungere il reagente di transfection a tutti i tubi di microcentrifuga che contengono i loro plasmidi necessari. Qui, aggiungere 4 μL del reagente di transfection commerciale per ogni 2 μg di DNA.
- Vortice i tubi di microcentrifuga contenenti DMEM, i plasmidi e il reagente di trasfezione e incubandoli a temperatura ambiente per 25 min.
- Aggiungere ogni tubo di microcentrifuga a un piatto di coltura e mescolare delicatamente il piatto per formare una soluzione omogenea. Riporre il piatto nell'incubatore per 48 ore.
NOTA: poiché GFP deve essere espresso in tutte le cellule, l'efficienza di trasfusione shuttle-GFP può essere parzialmente esaminata e pre-testata utilizzando microscopia fluorescente dopo transfection overnight. Un esame completo delle proteine espresse non fluorescenti può essere condotto utilizzando un analogo immunoblotè.
3. Microscopia
- Fissare le copertine contenenti le cellule NSC-34 trasfettate in un supporto per copertina e lavare delicatamente con la soluzione salina fosfatizzata (PBS) per rimuovere le cellule morte staccate.
- Identificare una patch cellulare appropriata utilizzando un filtro fluorescente verde con un microscopio invertito.
NOTA: Una patch cellulare appropriata è definita come un campo di visione del microscopio che mostra un gran numero di celle (20-30 celle in un campo) e in cui i nuclei sono chiaramente definiti nelle cellule. I nuclei cellulari all'interno della patch cellulare vengono identificati per primo con l'occhio e sono contrassegnati manualmente dal software di imaging. - Aggiungere 200 μl di un buffer di Leptomycin B (LMB) inibitore exportin-1 contenente 10 μg / ml di LMB in PBS ai coperchi, gocciolando il tampone sui coperchietti sotto il microscopio.
NOTA: Questo punto nel tempo è impostato come intervallo zero. - Quantifica l'intensità fluorescente dei nuclei segnati in intervalli di 3 s per circa 400-500 s.
4. Analisi
NOTA: poiché diverse cellule esprimono diversi livelli di shuttle-GFP fluorescente, è importante normalizzare l'intensità fluorescente nucleare di ogni cellula alla propria intensità fluorescente iniziale.
- Normalizzare l'intensità fluorescente dei nuclei marcati dividendo l'intervallo fluorescente di 3 ciascun nucleo con la media dei sei intervalli iniziali di quel nucleo.
- Dopo la normalizzazione di ciascun nucleo, produrre una curva di intensità fluorescente che rappresenta la variazione della fluorescenza del nucleo in funzione del tempo per ogni patch cellulare. Per fare questo, calcolare la media di tutte le celle in ciascuna patch cellulare (composta da circa 20-30 celle in ciascuna patch).
NOTA: La curva di intensità fluorescente del nucleo assomiglia a una curva di saturazione di Michaelis-Menten, che è meglio osservata inMe periodi. Ciò è dovuto a una diminuzione degli importi citosolici di shuttle-GFP con il tempo a causa del trasporto nucleare. Questa diminuzione diminuisce statisticamente la probabilità che un shuttle-GFP trasferisca nel nucleo, raggiungendo così la saturazione della fluorescenza nucleare. La pendenza derivata dalla velocità iniziale lineare della curva produce la frequenza di ingresso V max nel nucleo. - Analizzare le pendenze V max di ogni patch cellulare, derivate da tre a cinque esperimenti indipendenti, utilizzando il software di grafica per produrre una pendenza che rappresenta ciascun gruppo sperimentale. Eseguire la quantificazione utilizzando l'analisi statistica ANOVA a senso unico.
5. Validazione della espressione della proteina
- Posizionare piatti di coltura da 60 mm contenenti le cellule residue (non utilizzate nell'esperimento precedente) da ciascun gruppo sperimentale su ghiaccio.
- Smaltire il mezzo e lavare le cellule due volte con PBS per diluire e lavare il mezzo rimanente.
- Trattare le cellule con 200-400ΜL di tampone di lisi contenente PBS, 0,5% Triton e tablet di cocktail inibitore della proteasi (PI). Raschiare utilizzando un raschiatore di celle.
- Raccogliere le cellule in tampone di lisi in un tubo di microcentrifuga e omogeneizzare con un omogeneizzatore a 4000 rpm per 1 min sotto ghiaccio.
- Centrifugare le cellule omogeneizzate a 2.500 xg per 10 min. Raccogliere il surnatante, quantificare la concentrazione proteica utilizzando un dosaggio di Bradford e conservare fino all'uso a -20 ° C.
- Raccogliere tra 30 e 70 μg di proteina totale (a seconda della proteina) e caricarla in un gel SDS-PAGE per testare l'espressione proteica utilizzando un dosaggio immunoblot.
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Representative Results
Utilizzando la procedura qui presentata, le cellule NSC-34, come motorie neuroniche, sono state trasfettate con una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP). Questa proteina, dotata di sequenze di segnali NLS e NES ( Figura 1 ), può spostarsi tra il nucleo e il citoplasma. Generico GFP può entrare o uscire dal nucleo in assenza di un solo segnale di localizzazione solo per diffusione e viene quindi distribuito uniformemente tra il nucleo e il citoplasma ( Figura 2A ). Al contrario, la proteina GFP-shuttle è per lo più trovata nel citoplasma a causa del segnale NES e NLS che influenzano la sua dispersione ( Figura 2B ). Pertanto, solo l'aggiunta dell'inibitore exportin leptomicina B (LMB), che inibisce l'esportazione di proteine, consente l'accumulo del shuttle-GFP nel nucleo e, infine, per la misurazione del tasso di importazione GFP-shuttle ( Figura 2C ). Utilizzando un microscopio fluorescente e così Fmware per quantificare i cambiamenti fluorescenti in tempo reale, possono essere quantificati i cambiamenti graduali dell'intensità di fluorescenza nucleare dello shuttle-GFP. Di conseguenza, può essere prodotta una curva di saturazione simile a Michaelis-Menten dell'asse fluorescenza-tempo ( Figura 3 ), che rappresenta la quantità di GFP nucleare in un dato momento. Utilizzando la velocità lineare iniziale delle curve (come indicato dal cerchio in Figura 3 ), si può generare una pendenza, che rappresenta la velocità di ingresso nel nucleo prima della saturazione della fluorescenza.
Diversi studi indicano che diverse proteine C9orf72 sono tossiche nei modelli Drosophila melanogaster e / o nelle cellule coltivate 6 , 11 . Le ripetizioni di peptide (DPR), poli (PR) e poli (GR) prodotte da HRE nel gene mutato di C9orf72 sono state trovate per indurre lo stress nucleare 8 ,Lass = "xref"> 19 , 20 e sono stati implicati nel trasporto nucleocitoplasmatico compromesso, rendendoli particolarmente dannosi. Per verificare l'utilità del saggio descritto, le cellule NSC-34 simili a motori neuronali sono state trasfettate con questi due plasmidi DPR, poli (PR) e poli (GR). Poiché i poli (PR) e poli (GR) DPRs sono coniugati anche a GFP, è stato importante convalidare che i DPR non sono stati influenzati anche dalla leptomicina-B, il che comporterebbe un risultato falso-positivo. L'espressione Poly (PR) è stata osservata nel nucleo completamente come inclusioni; Quindi, non poteva dare un segnale di importazione nucleare falso positivo ( Figura 4A ). D'altra parte, l'espressione di poli (GR) è stata osservata omogeneamente nel citosolo e anche come inclusioni nel nucleo ( Figura 4B ). Nel trasfezione delle cellule NSC-34 solo con poli (GR) e l'aggiunta di leptomicina-B, non è stato osservato alcun movimento di shuttle del poli (GR) espresso ( Figura 5 ).
Figura 5 ).
Figura 1: Schema del costruttore NLS-NES-GFP (shuttle-GFP). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Leptomicina B inibisce l'esportazione di shuttle-GFP dai nuclei delle cellule NSC-34. Immagini rappresentative delle cellule NSC-34 esp( B ) e 20 minuti dopo l'aggiunta di 10 μg / ml di Leptomycin B (LMB) ( C ). Dopo l'aggiunta di LMB, il shuttle-GFP importa nel nucleo, ma l'esportazione verso il citoplasma è bloccata. Così, shuttle-GFP si accumula nei nuclei. Barra di scala = 15 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: trama Michaelis-Menten che mostra un aumento della fluorescenza nucleare. Rappresentative curve Michaelis-Menten che raffigurano un aumento della fluorescenza nucleare di due gruppi, interessati e non colpiti da cellule nucleocitoplasmatiche, entro 25 min. I primi 5 minuti mostrano una grande differenza nel tasso di crescita, che è dePiegato nel tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: C9orf72 DPRs poli (PR) e poli (GR) espressione in cellule NSC-34. Immagini rappresentative delle cellule NSC-34 trasfettate con i DPR di C9orf72, poli (GR) ( A ) e poli (PR) ( B ). Poli (GR) è espressa nei nuclei delle cellule ma è anche distribuita omogeneamente nel citosol. Il poli (PR) si esprime principalmente nei nuclei. Barra di scala = 30 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo dimostra un nuovo test molto sensibile e quantitativo per valutare i minimi cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico. Utilizzando questo sistema, è possibile osservare e misurare il trasporto nucleocitoplasmatico e la sua disfunzione in tempo reale, non solo i grandi difetti che comportano cambiamenti drammatici nella distribuzione delle proteine. Questo test non solo ha un vantaggio di sensibilità, ma richiede anche una piccola preparazione, è poco costoso ed è un saggio molto facile e poco affidabile.
Per testare l'efficienza di questo sistema, sono state utilizzate le proteine C9orf72, poli (GR) e poli (PR) DPRs, modelli di ALS e FTD che sono stati precedentemente dimostrati di provocare una carenza di trasporto nucleocitoplasmatico, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Utilizzando questo saggio, è stato possibile dimostrare, in tempo reale, una diminuzione di circa il 50% nelIl tasso di importazione nucleare nelle cellule che esprimono i DPR rispetto alle cellule trasfettate con un vettore di controllo. Pertanto questo sistema apre la possibilità di misurare facilmente piccoli cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico, che possono essere causati da questi ed altri mutanti ALS o FTD o altre malattie in cui possono esistere potenziali difetti nel trasporto nucleocitoplasmatico. Sebbene il protocollo qui descritto riguarda le cellule simili ai motori neuronali, potrebbe essere facilmente adattato ad altri tipi di cellule. E soprattutto, utilizzando questo sistema, è ora possibile determinare come diversi fattori molecolari o farmaci possano aiutare a prevenire oa salvatare (anche parzialmente) le carenze nucleocitoplasmatiche di trasporto in ALS, FTD o in altri disturbi.
Una possibile limitazione nell'utilizzo di questo saggio è la limitata capacità di osservare e contrassegnare i nuclei cellulari in cellule che non possiedono un nucleo chiaro o che possiedono un piccolo. Per superare questa situazione, una possibile soluzione può essere quella di utilizzare semplicemente un magnifico magnifico zione. Tuttavia, ciò in ultima analisi diminuirà la quantità di cellule in ogni patch cellulare, aumentando così la quantità di esperimenti necessari per raggiungere un valore significativo.
Un'altra considerazione riguarda il rapporto nucleo-al-citoplasma di shuttle-GFP prima dell'aggiunta di LMB. Questo rapporto può essere molto diverso in diversi tipi di cellule e di conseguenza può essere troppo piccolo (vicino ad un rapporto di 1: 1) per mostrare un nucleo visibile. Una possibile soluzione consiste nell'utilizzare in precedenza un marker nucleare. Questo non influenza l'analisi finale, poiché ogni cellula è normalizzata alla sua fluorescenza nucleare originale. Inoltre, è consigliabile calibrare la concentrazione di LMB utilizzata per l'inibizione dell'esportazione prima che questo assaggio venga eseguito per osservare efficacemente l'aumento ottimale della fluorescenza nucleare.
La carenza di trasporto nucleocitoplasmatico è suggerita per svolgere un ruolo fondamentale nella degenerazione dei neuroni motori in ALS 5 ,= "Xref"> 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . In questo caso, sarebbe probabile che i difetti del trasporto nucleocitoplasmatico simili a quelli osservati nel modello C9orf72 avessero un ruolo in altri modelli ALS. Tuttavia, a causa della grande variabilità tra i diversi modelli, i risultati finali e le manifestazioni molecolari risultanti dalla rottura nucleocitoplasmatica in ogni caso possono essere inosservate o fenotipicamente diverse. Nonostante la vasta ricerca sui diversi modelli FALS, la loro connessione con meccanismi comuni rimane una sfida. Questo esame può ora offrire l'opportunità di superare, almeno parzialmente, questa sfida.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i membri del laboratorio AI per i loro utili commenti e suggerimenti. Vorremmo ringraziare il Prof. Mark Hipp (Istituto Max Planck per la Biochimica) per fornirci il vettore shuttle-GFP. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione israeliana di scienza (ISF # 124/14), della Fondazione Binational Science (BSF # 2013325), della FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794) e dell'Istituto Nazionale di Psicobiologia in Israele NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A | |
| DMEM 4.5 g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 | |
| Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick | Bar Naor LTD | ||
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 | |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | ||
| Imaging Workbench 2 | Axon Instruments | ||
| Leptomycin B | Sigma | L2913 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE | |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
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