Summary
DNA-proteininteraktioner er essentielle for flere biologiske processer. Under evalueringen af cellulære funktioner er analysen af DNA-proteininteraktioner uundværlig for forståelse af genregulering. Kromatinimmunudfældning (ChIP) er et kraftfuldt værktøj til at analysere sådanne interaktioner in vivo.
Abstract
Flere cellulære processer, herunder DNA-replikation og reparation, DNA-rekombination og genekspression, kræver interaktioner mellem proteiner og DNA. Derfor regulerer DNA-proteininteraktioner multiple fysiologiske, patofysiologiske og biologiske funktioner, såsom celledifferentiering, celleproliferation, cellecyklusstyring, kromosomstabilitet, epigenetisk genregulering og celletransformation. I eukaryote celler interagerer DNA'et med histon- og nonhistonproteiner og kondenseres til chromatin. Flere tekniske værktøjer kan bruges til at analysere DNA-proteininteraktioner, såsom Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) og DNase I-fodsporing. Disse teknikker analyserer imidlertid protein-DNA-interaktionen in vitro , ikke inden for den cellulære kontekst. Kromatinimmunpræcipitation (ChIP) er en teknik, der fanger proteiner på deres specifikke DNA-bindingssteder, hvorved der muliggøres identifikation af DNA-proteininteraktionS inden for deres kromatin-kontekst. Det gøres ved fiksering af DNA-proteininteraktionen efterfulgt af immunpræcipitation af proteinet af interesse. Derefter karakteriseres det genomiske sted, som proteinet var bundet til. Her beskriver og diskuterer vi ChIP og demonstrerer dets analytiske værdi til identifikation af transformationsvækstfaktor-p (TGF-β) -induceret binding af transkriptionsfaktoren SMAD2 til SMAD-bindingselementer (SBE) inden for promotorregionen af tyrosin- Proteinkinase Kit (c-KIT) receptorligand stamcellefaktor (SCF).
Introduction
I kernen af eukaryoter interagerer DNA med histonproteiner og nonhistone proteiner og kondenseres til chromatin. I den fysiologiske, patofysiologiske og cellebiologiske kontekst kontrolleres cellefunktioner rumligt og midlertidigt af kromatinkoordineret genekspression. DNA-proteininteraktioner har en væsentlig rolle i reguleringen af cellulære processer, såsom DNA-replikation, rekombination og reparation samt proteinekspression. Derfor er analysen af DNA-protein-interaktioner et uundværligt redskab i evalueringen af genekspression og cellefunktion.
Der findes adskillige teknikker til vurdering af DNA-proteininteraktioner in vitro , såsom Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) og DNase I footprinting 1 , 2 . Imidlertid analyserer disse teknikker ikke protein-DNA-interaktionen inden for kromatin og cellulær kontekst. ChIP iEn teknik, der fanger proteiner bundet til deres specifikke DNA-bindingssteder og derved letter identifikationen af DNA-proteininteraktioner inden for kromatinkonteksten. Teknikken blev oprindeligt udviklet af Gimour og Lis til vurdering af RNA-polymerase II-binding til specifikke gener i Escherichia coli og Drosophila melanogaster 3 , 4 . Det gøres ved fiksering af DNA-protein-komplekserne efterfulgt af udførelse af chromatinekstraktion og afskæring af DNA'et i ~ 200 basispar (bp) fragmenter. Derefter isoleres det DNA-bundet protein af interesse ved immunpræcipitation. Efter reversering af DNA-protein-tværbindingen renses DNA'et og analyseres. Flere fremgangsmåder kan anvendes til analysen af proteinbindingsstederne og afhænger af proteinbindingsstedets nukleinsyresekvens i målgenet 5 . I tilfælde hvor DNA-sekvensen er kendt, er standard PolYmerase Chain Reactions (PCR) kan påføres ved anvendelse af specifikke primerpar, der flankerer det kendte bindingssted. Kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR) kan også anvendes 6 . I tilfælde, hvor sekvensen er ukendt, kan ChIP kombineres med DNA-mikroarrays (ChIP-on-chip), DNA-sekventering (ChIP-seq) eller kloningsteknikker 7 , 8 , 9 .
TGF-β-banen har kraftige tumorundertrykkende funktioner og er en nøglevej i celledifferentiering. Det aktiveres gennem binding af TGF-β1 liganden til dets kognitive receptor-kompleks, hvilket resulterer i serin-phosphorylering af SMAD2 / 3 transkriptionsfaktorer. Efter deres tilknytning til den fælles mediator, SMAD4, translateres SMAD-komplekset til kernen og binder til SBE inden for promoterregionen af målgenene, hvor det regulerer gener, der styrer cellecyklussen, apoptosen og celledifferentienpå. Det transkriptionelle respons på TGF-p-stimulering er celletype- og konteksspecifikke 10 . For nylig beskrev vi en positiv tilbagekoblingssløjfe mellem TGF-β og c-KIT-vejen 11 . I denne model binder TGF-β1-aktiveret SMAD2 til c-KIT ligandpromotoren og inducerer dens ekspression og sekretion. Efterfølgende aktiverer c-KIT-liganden c-KIT-receptoren på en auto- og para-krinisk måde. C-KIT receptoraktivering resulterer i STAT3 Tyr 705- phosphorylering via JAK1 / 2. Efter STAT3-aktivering og nukleær translokation binder STAT3 til TGF-P1 ligandgenet og regulerer dets ekspression.
Her demonstrerer vi den væsentlige rolle, som ChIP-analyse til identifikation af SMAD2-binding til c-KIT-receptorligandpromotoren og til identifikation af signaltransducer (og) aktivatoren (af) transkription 3 (STAT3-binding til TGF-β1- gen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af opløsninger
- Forbered de følgende løsninger frisk for hvert forsøg.
- Til fixeringsopløsningen fremstilles 37% formaldehyd og opbevares ved RT. Fortynd det i 1x phosphatbufferet saltvand (PBS) til en slutkoncentration på 1,42%.
FORSIGTIG: Formaldehyd klassificeres som irriterende, ætsende, mutagent, teratogent og kræftfremkaldende. Må ikke indtages. Undgå indånding af gas / dampe / damp / spray. Ved utilstrækkelig ventilation skal der anvendes egnet åndedrætsværn. Undgå kontakt med hud og øjne. Hold afstand fra uforenelige stoffer, såsom oxidationsmidler, reduktionsmidler, syrer, alkalier og fugt. - For glycine stop-fix-opløsningen fremstilles 0,125 M glycin i 1x PBS-opløsning og opbevares ved RT.
- Til celleskrabningsløsningen fremstilles en 1x PBS-opløsning i dH20 og opbevares på is. Direkte før brug tilsættes proteinasehæmmeren phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) tEn endelig koncentration på 0,5 mM.
FORSIGTIG: PMSF er klassificeret som ætsende og giftig; Brug beskyttelses tøj og brug det i et ventileret område. - Tilsæt direkte 1X proteaseinhibitor Cocktail (PIC; 100X stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO): 104 mM 4- (lige ved anvendelse af cellelysbufferen (20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 85 mM KCl og 0,5% NP40) 2-aminoethyl) benzensulfonylfluoridhydrochlorid (AEBSF), 80 μM aprotinin, 4 mM bestatin, 1,4 mM E-64, 2 mM leupeptin og 1,5 mM pepstatin A) og 0,5 mM PMSF.
- Tilsæt direkte 1X PIC og 0,5 mM PMSF direkte før anvendelse af nuclei lysisbufferen (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 1% SDS).
- Til fixeringsopløsningen fremstilles 37% formaldehyd og opbevares ved RT. Fortynd det i 1x phosphatbufferet saltvand (PBS) til en slutkoncentration på 1,42%.
2. Cell Fixation og Shearing
- Væk cellerne til 70-80% sammenflydelse på 10 cm vævskulturplader. Stimulere cellerne pr. Eksperimentelle mål.
- Fjern vævskulturmediet, tilsæt 5 ml fikseringsopløsning og inkuberCellerne i 10 minutter ved RT på en rystende platform.
- Fjern fixeringsopløsningen og vask cellerne to gange med 10 ml iskold 1x PBS.
- Fjern 1x PBS, tilsæt 5 mL glycine stop-fix-opløsning, og inkuber cellerne i 5 minutter ved RT på en rystende platform.
- Fjern glycine stop-fix-opløsningen og vask cellerne to gange med 10 ml iskold 1x PBS.
- Fjern 1x PBS, tilsæt 2 ml celleopskrabning, og høst cellerne ved hjælp af en celleskraber. Overfør de høstede celler til et konisk rør på is.
- Centrifuger prøverne i 10 minutter ved 600 xg og 4 ° C.
- Fjern supernatanten, resuspender pelleten i 1 ml 1X cellysisbuffer og inkuber på is i 30 minutter. Alternativt snapfrys pelleten i flydende nitrogen og opbevar det ved -80 ° C.
- Når først pelleten er resuspenderet i cellelysepufferen, overføres cellesuspensionen til en iskold dounce-homogenisator og dråber til 10 slag ved anvendelse af en type B-pestlE for celleforstyrrelser.
- Overfør cellesuspensionen til et mikrocentrifugerør og centrifuger prøverne i 10 minutter ved 2.400 xg og 4 ° C.
- Kassér supernatanten, resuspender pelleten i 350 μl kernefordøjelsesbuffer og inkuber prøverne i 5 minutter ved 37 ° C.
- Tilsæt mikrokoccal nuklease (1 U / μl) og bland ved vortexing. Inkuber prøverne ved 37 ° C i 5-20 minutter; Bland prøverne hver 2 min ved inversion.
BEMÆRK: Tids- og enzymkoncentrationen varierer mellem cellelinier og kan kræve optimering i tilfælde af suboptimal enzymatisk afskæring. - Alternativt opnås kromatinskæring ved sonikering ved anvendelse af kommercielt tilgængelige sonikatorer.
BEMÆRK: Sonication betingelser vil kræve optimering. En optimeringseksempelprotokol er angivet nedenfor under anvendelse af et prøvevolumen på 300 μl og en prøveforarbejdningseffekt på 25%.- Efter trin 2.10 kasseres supernatanten og resuspenderer nUklar pellet i 1,0 ml kommerciel skærepuffer.
- Aliquot 300 μL af den resuspenderede nukleare pellet i tre 1,7 ml mikrocentrifugerør. Placer dem på is.
- Skær de 3 alikvoter af fast kromatin ved 25% strøm ved anvendelse af 3 forskellige betingelser for at bestemme de optimale sonikationsbetingelser:
5 pulser på 20 s hver med en 30 s hvile på is mellem hver puls.
10 pulser på 20 s hver med en 30 s hvile på is mellem hver puls.
20 pulser på 20 s hver med en 30 s hvile på is mellem hver puls. - Fortsæt med trin 2.15 som beskrevet nedenfor.
- Efter inkubationen med mikrokokernukleasen tilsættes 7 μl iskold 0,5 M EDTA for at stoppe reaktionen.
- Centrifuger prøverne med det forskydede DNA i 10 minutter ved 16.200 xg og 4 ° C.
- Overfør den forskydede DNA-holdige supernatant til et frisk mikrocentrifugerør. Aliquot 50 μL i et separat mikrocentrifugerør for at bekræfte suCcessful shearing af DNA'et (sektion 3). Brug det resterende volumen med det samme til immunopfældning (sektion 4) eller opbevar den ved -80 ° C.
3. Bekræftelse af shearing-effektiviteten
- Tilsæt 150 μL nukleasefrit dH20 og 10 μl 5 M NaCl til 50 μl alikvoten af det afskårne chromatin fra trin 2.16.
- Inkuber prøverne ved 65 ° C i 4 timer for at vende tværbindene.
- Tilsæt 2 μL RNase A (10 μg / μl) og inkuber prøverne ved 37 ° C i 15 minutter.
- Tilsæt 10 μl proteinase K (0,5 μg / μl) og inkuber prøverne ved 42 ° C i 90 minutter.
- Til oprensning af DNA'et udføres en phenol / chloroformekstraktion 12 .
- Tilsæt nukleasfrit vand til et slutvolumen på 200 μl. Tilsæt 200 μl phenol: chloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) til prøven og hvirvel i 20 s.
- Centrifuge ved rumtemPeratur i 5 minutter ved 16.000 x g. Fjern forsigtigt den øvre vandige fase og overfør den til et frisk rør. Sørg for ikke at overføre phenol under pipetteringen.
- Tilsæt 0,1 volumener 3 M natriumacetat (NH 4 OAc), pH 5,2 og bland ved at flette røret flere gange med en finger. Tilsæt 2,5 volumener iskold 100% ethanol og bland ved vortexing i 5 s. Inkuber prøven O / N ved -20 ° C eller i mindst 1 time ved -80 ° C.
- Centrifugere prøven i 30 minutter ved 4 ° C og 16.000 xg for at pille cDNA'et.
- Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pelleten. Tilsæt 1 ml RT, 70% ethanol og omvendt røret flere gange.
- Centrifugere prøven i 2 minutter ved 4 ° C og 16.000 x g. Fjern forsigtigt supernatanten.
- Tør pelleten i 5-10 minutter ved stuetemperatur. Resuspender pelleten i 30 μl dH20.
- Brug en 5 og 10 μl alikvot af det oprensede DNA til gelelektroforese med en 1% TAEAgarosegel.
BEMÆRK: Succesfuld chromatinafskæring resulterer i et DNA-mønster på 200-1,500 bp. Hvis afskæringen ikke lykkes, bestemmes de optimale forskydningsbetingelser for de specifikke celler ved at modificere inkubationstiden for klipningstrinnet (trin 2.12) til 5, 10 og 15 minutter. - Brug den resterende prøve til at analysere DNA-koncentrationen af prøven. Omvendt beregne DNA-koncentrationen i den afskårne chromatinprøve (trin 2.16); Brug de samme DNA-mængder for hver behandlingsgruppe til immunudfældningen (afsnit 4).
4. Immunpræcipitation
- Kombiner 10-25 μg af det afskårne tværbundne chromatin (trin 2.16) med 25 μl ChIP-grade protein G-magnetiske perler, 10 μl immunpræcipitationsfortyndingsbuffer (stamopløsning: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1,2 mM EDTA og 167 mM NaCl) og 1 μl PIC.
- Efter 4 h inkubation tilsættes 1-10 μg antistof (antistofkoncentrAtionen vil variere baseret på antistoffets affinitet; Det bør oprindeligt anvendes pr. Producentens anbefalinger og eksperimentelt optimeret om nødvendigt) til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og tilsæt dH20 til et slutvolumen på 100 μl.
BEMÆRK: I stedet for den ovenfor beskrevne direkte immunpræcipitationsmetode kan den indirekte immunpræcipitationsmetode anvendes ved først at kombinere kromatinet med antistofferne og derefter tilføje protein G magnetiske perler. - Inkuber prøverne på en ende-til-ende rotator i 4-12 timer ved 4 ° C.
5. Eluering
- Placer rørene på et magnetisk stativ. Når magnetmagnetperlerne på siden af røret er forsigtigt fjernet og kasseret supernatanten.
- Vask perlerne tre gange med 800 μl vaskebuffer 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCI, pH 8 og 150 mM NaCl); Blandes ved at invertere røret flere gange. Placer røret på magnetstativet aNd fjern forsigtigt og kassér vaskebufferen, når de magnetiske perler har aggregat på siden af røret.
- Vask perlerne en gang med 800 μl vaskebuffer 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HCI pH 8 og 500 mM NaCl); Blandes ved at invertere røret flere gange. Placer røret på magnetstativet, og fjern forsigtigt og kassér vaskebufferen, når de magnetiske perler er samlet på røret.
- Resuspender perlerne i 50 μl elueringsbuffer (1% SDS og 100 mM NaHC03) og inkuber prøverne på en ende-til-ende rotator i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Placer rørene på et magnetisk stativ, og når de magnetiske perler samler på siden af røret, overfør supernatanten til et nyt rør.
- Tilsæt 6 μl 5 M NaCl for at vende tværbindingen og 2 μl proteinase K (0,5 μg / μl). Efter blanding af prøverne inkuberes prøverne i 2 timer ved 65 ° C.
- Til oprensning af DNA'et udføres en pheNol / chloroformekstraktion 12 (trin 3.5) og efterfølgende resuspendere pelleten i 30 μl dH20.
BEMÆRK: Prøverne kan analyseres direkte for proteinbindingssteder (afsnit 5) eller kan opbevares ved -20 ° C.
6. Binding-site Analysis
- Udfør en analyse for specifikke bindingssteder inden for en kendt nukleinsyresekvens under anvendelse af PCR eller qRT-PCR. Til primer design, følg konventionelle PCR eller qRT-PCR protokoller. Design primerne til at syntetisere et 150-400 bp amplicon, der broer proteinbindingsstedet af interesse ( figur 1 ).
- Konfigurer PCR'en ved hjælp af fire forskellige DNA-skabeloner for at sikre specificitet: i) DNA fra ChIP immunpræcipiteret med antistoffet af interesse ii) DNA fra ChIP immunpræcipiteret med et uspecifikt IgG-antistof iii) input DNA og iv) H20 som en Negativ kontrol for PCR for at udelukke forurening. I tilfælde af sti stimulering, Vælg en femte skabelon ved hjælp af et andet sæt primere, der er specifikke for et kendt bindingssted for det immunpræcipiterede protein.
BEMÆRK: I tilfælde af c-KIT ligandpromotoranalysen anvendes konventionel PCR til at demonstrere TGF-p-induceret SMAD-binding ved SBE inden for c-KIT ligandpromotorregionen. Som en positiv kontrol udføres PCR på plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) som et kendt mål for TGF-p-induceret SMAD-binding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bindingen af TGF-β1-liganden til dens kognitive receptorkompleks resulterer i serinphosphoryleringen af SMAD2 / 3-transkriptionsfaktorer efterfulgt af deres association med den fælles mediator, SMAD4. SMAD-komplekset translokeres til kernen. TGF-β kan regulere gentranskription enten direkte via SMAD-binding til SBE'er inden for regulatoriske regioner af målgenene eller indirekte gennem den SMAD-regulerede ekspression af transkriptionelle aktivatorer eller repressorer, der efterfølgende regulerer ekspressionen af genet af interesse 10 . For at teste om c-KIT-liganden SCF er transkriptionelt reguleret af den direkte TGF-β1-inducerede binding af SMAD2 til dets promotor, analyserede vi SCF-promotorholdige, 2,4-kb, 5'-flankerende region af SCF-genet for SMAD2 bindende motiv, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . Vi identificerede 7 formodede SBEs upsTræk af SCF startkodon ( figur 1A ). For at bekræfte den TGF-β1-inducerede binding af SMAD2 til SCF-promotoren blev ChIP-assayet, der er beskrevet her, udført. TGF-β1-behandlingen resulterede i SMAD2-binding til SCF-promotoren i humane levercancerlinier, HepG2- og Hep3B-celler ( figur 1B ). I fravær af TGF-β1-stimulering blev der ikke noteret nogen SMAD-binding. Som en positiv kontrol for TGF-β1-induceret SMAD-aktivering blev ChIP for PAI-1 udført. PAI-1-promotoren er et kendt mål for TGF-p / SMAD 13 . For at bekræfte specificiteten af SMAD2-immunpræcipitationen blev der anvendt uspecifikke IgG-antistoffer; Ingen SMAD2-binding til SBE blev noteret efter immunpræcipitation med IgG.
Til en anden demonstration af ChIP-teknologien analyserede vi den 5'-flankerende region af TGF-p-ligand-genet for STAT3-konsensusbindingsmotiverne 5 '-TT (N4) AA-3 'og 5'-TT (N5) AA-3' 15 . Vi identificerede to formodede STAT3 bindingssteder opstrøms for TGFB startkodon ved positionerne -4384 / -4373 (STB-1) og -5365 / -5357 (STB-2) ( Figur 2A ). For at bekræfte TGF-β1-induceret binding af STAT3 til TGF-p-ligandgenet udførte vi ChIP-assays ved anvendelse af TGF-β1-behandlede HepG2- og Hep3B-celler. TGF-β1-behandling resulterede i STAT3-binding til det andet formodede STAT3-bindingssted (STB-2) af TGFB-genet, men ikke til den første (STB-1) ( Figur 2B ). I dette eksempel tjener den positive STAT3-binding til STB-2 som en intern positiv kontrol. I lighed med ovenstående ChIP-eksperiment blev ikke STAT3-binding til STB-2 set efter immunpræcipitation under anvendelse af IgG.
figur 1
Figur 2 : TGF-p-induceret STAT3-binding til TGF-p-genet. ( A ) Skematisk af TGF-β-genet med formodede STAT3-bindingssteder vist som gråbokse med deres relative position til startkodonet. ChIP primer placeringer er vist med deres relative positioner til TGF-β startkodon og PCR produktstørrelserne angivet nedenfor. ( B ) ChIP for TGF-β1-induceret STAT3-binding til TGF-p-genet. Kromatinproteinkomplekser af TGF-β1-behandlede og ubehandlede HepG2- og Hep3B-celler blev immunpræcipiteret med anti-STAT3-antistof. PCR blev udført under anvendelse af TGF-p-specifikke primere. Til venstre vises PCR-resultaterne ved hjælp af input-DNA. I midten er PCR'enResultater efter immunpræcipitation med uspecifik IgG er vist for bekræftelse af STAT3 immunoprecipitationsspecificiteten. Øverste panel viser PCR-resultaterne ved anvendelse af primere, der er specifikke for STAT3-bindingssted 1 (STB-1), og det nederste panel viser resultaterne for STAT3-binding til STAT3-bindingssted 2 (STB-2). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapport demonstrerer vi den TGF-β1-inducerede binding af SMAD2 til en SBE inden for c-KIT ligandpromotoren og TGF-β1-induceret binding af STAT3 til dets genkendelsessekvens inden for TGF-β1-ligandgenet. Vi demonstrerer cytokin-induceret binding af begge transkriptionsfaktorer ved anvendelse af chromatinimmunpræcipitation.
Kromatinimmunudfældning er et kraftfuldt værktøj til at demonstrere direkte binding af et protein af interesse for DNA, for at karakterisere de stimuli, som inducerer proteinbinding til DNA, og til karakterisering af den DNA-sekvens, hvortil proteinet binder. Sidstnævnte oplysninger kan hjælpe med identifikation af gener reguleret af et specifikt protein af interesse og opnås ved anvendelse af ChIP-on-chip, ChIP-seq eller kloningstrategier 7 , 8 , 9 . En af de store fordele ved ChIP versus andre metoder til at demonstrere DNA-proteinbinding, Såsom EMSA eller DNase I-fodsporing, er det, at i bindingen er bindingen indfanget in vivo , mens den med de andre udføres in vitro . Derfor giver ChIP indsigt i DNA-proteinbinding inden for den cellulære kontekst, medens de andre teknikker repræsenterer et isoleret system.
ChIP-analysen er imidlertid kompleks, indebærer flere trin, som kan påvirke resultaterne, og kræver optimering og erfaring. Et af de første trin, der er kritisk for succesfuldt ChIP, er tværbindelsestrinnet (trin 2.2). UV-tværbinding er irreversibel og derfor uegnet til ChIP. Formaldehyd-tværbinding er foretrukket, men formaldehydkoncentration og krydsbindingstid kan begge påvirke effektiviteten af chromatinafskæring og antigenfældning. Generelt foretrækkes lavere formaldehydkoncentrationer (1% vægt / volumen) og kortere tværbindelsestider (5-10 minutter), da de forbedrer skæringseffektiviteten. Imidlertid er formaldehyd ikke effektivVed protein-protein tværbinding og er derfor suboptimal for proteiner, som ikke direkte binder til DNA 16 . I sådanne tilfælde kan ChIP udføres i en to-trins fremgangsmåde, hvor protein-protein-tværbinding sker først ved anvendelse af tværbindingsmidler såsom disuccinimidylglutarat efterfulgt af formaldehydmedieret DNA-protein-tværbinding 17 .
Det næste kritiske trin er chromatinafskæring. I vores undersøgelse anvendte vi enzymatisk forskydning ved hjælp af mikrokokernuklease. Enzymatisk skæring er særlig nyttig for ikke-tværbundet nativt ChIP (N-ChIP), når sonikering vil forstyrre DNA-proteinbindingen. N-ChIP anvendes overvejende til analysen af histoner og histon-modifikatorer 18 . Selvom mikrokokernuklease betragtes som en relativt ikke-specifik endo-exonuklease, har det vist sig at fremkalde sekvensspecifik spaltning 19 . Dette kan resultere i en sekvensafhængig bias i den resulterende fraGments, med overrepræsentation af visse gen loci 20 . Sonikering skaber tilfældigt dimensionerede DNA-fragmenter uden sekvensforspænding og foretrækkes generelt for tværbundet ChIP (X-ChIP). Sonicationbetingelser skal imidlertid bestemmes empirisk for hver celle- eller vævstype og sonikatormodel, og resulterende DNA-fragmenter er generelt større end med enzymatisk skære 16 . Over-sonikering eller emulgering af prøven kan også resultere i tabet af antistofepitoper på grund af protein denaturering og nedbrydning.
Immunudfældningstrinnet er et andet kritisk trin, som i høj grad kan påvirke resultaterne af ChIP. Agarosekuler binder DNA uspecifikt, og variation i antallet af tilsatte perler kan påvirke det specifikke signal-til-baggrund-forhold. Derfor er det vigtigt at holde agarosekuglen "gylle" godt suspenderet, når den tilsættes til DNA-proteinprøverne. Med hensyn til antistoffet anvendt til iMmunopræcipitation, generelt bør der anvendes ChIP-antistoffer, og i det tilfælde, hvor disse ikke er tilgængelige, bør mindst immunpræcipitations-antistoffer foretrækkes. Da specifikke epitoper kan maskeres under tværbinding, er polyklonale antistoffer fordelagtige, da de genkender flere epitoper. Mængden af antistof tilsat bør overstige den faktor, der udfældes, og bør således bestemmes empirisk for hver faktor / antistof. Da kinetikken til at nå ligevægten for antistofbinding er forskellig for hvert antistof, skal de optimale inkubationsbetingelser bestemmes for hvert antistof.
Flere kontrolelementer kan og bør medtages i den eksperimentelle opsætning. I tilfælde, hvor induktionen af en specifik DNA-proteinbindingsreaktion vurderes, er det vigtigt at inkludere en input-DNA-kontrol for at demonstrere lige template DNA-mængder i den endelige analyse ( dvs. PCR eller qRT-PCR). En antistofkontrol er påkrævet tilBekræfte specificiteten af immunpræcipitationen af proteinet af interesse. Normalt er isotype-matchede immunglobuliner velegnede som negative kontroller, men agarosekuler kan også anvendes. Lejlighedsvis anvendes positive kontroller til at bekræfte en funktionel eksperimentel strøm af ChIP, og anti-histon-antistoffer anvendes ofte til dette formål. I stimuleringsforsøg er en foretrukken positiv kontrol immunpræcipitation af proteinet af interesse, med efterfølgende sekvensanalyse for et kendt DNA-område binder proteinerne til ved stimulering. I vores repræsentative resultater blev SBE'en i PAI-1-promotoren anvendt som et kendt mål for TGF-β1-induceret SMAD-binding. I eksperimenter uden stimuleret proteinbinding kan en DNA-sekvens, som er kendt for ikke at være et mål for proteinet af interesse, anvendes til den efterfølgende DNA-analyse. Med hensyn til DNA-analysen er det vigtigt at inkludere en reaktion uden template DNA for at udelukke forurening.
ChIP er en fremragende teknik til direkte at demonstrere bindingen af et protein af interesse for et gen. Det er imidlertid ikke en funktionel undersøgelse. I tilfælde, hvor et protein af interesse menes at have en regulerende rolle, er det vigtigt også at udføre funktionelle assays, såsom reportergenbaserede assays ( fx luciferase). I disse protokoller klones genet af interesse i en regulatorisk stilling af et reportergen. Induktion af genet af interesse resulterer i ekspressionen af reportergenet, hvis det har en regulerende funktion. For yderligere bekræftelse af den regulerende rolle af det specifikke protein af interesse kan enten knock-down eller knock-in-celler genereres, hvori det DNA-bindende protein er genetisk tavs. Som en yderligere kontrol kan proteinbindingsstedet i det regulerende gen muteres for at forhindre bindingen af proteinet af interesse. I en af de to sidstnævnte eksperimentelle konstruktioner vil cellestimulering ikke resultere i ekspressionen af markøren gENE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (startfonde, BB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
| TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/mL |
| Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used/IP: 3 µg |
| Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used/IP: 3 µg |
| ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
| Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
| PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
| PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
| PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
| PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |
References
- Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).
- Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).
- Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26 (1), 37-47 (2002).
- Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D.
- Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).
- Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94 (5), 585-594 (1998).
- Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).
- Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).
- Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5 (12), 15754 (2010).
