Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Published: June 26, 2017 doi: 10.3791/55710
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

Summary

نحن نقدم نظام غرفة هايبوكسيك الرواية للاستخدام مع الكائنات المائية مثل الضفدع والأجنة الزرد. نظامنا هو بسيط، قوي، فعالة من حيث التكلفة ويسمح للاستقراء والحفاظ على نقص الأكسجة في الجسم الحي ، وتصل إلى 48 ساعة. نقدم 2 أساليب قابلة لإعادة الإنتاج لمراقبة فعالية نقص الأكسجين.

Abstract

هنا، نحن نقدم نظاما جديدا لتحريض نقص الأكسجين، الذي وضعنا لدراسة آثار نقص الأكسجين في الكائنات المائية مثل الأجنة الضفدع والزرد. يتكون نظامنا من غرفة تتميز بإعداد بسيط مع ذلك قوي للحث والحفاظ على تركيز الأكسجين ودرجة الحرارة المحددة في أي حل تجريبي من الاختيار. النظام المقدم هو جدا فعالة من حيث التكلفة ولكن وظيفية للغاية، فإنه يسمح الاستقراء والحفاظ على نقص الأكسجة للتجارب المباشرة في الجسم الحي وللفترات الزمنية المختلفة تصل إلى 48 ساعة.

لمراقبة ودراسة آثار نقص الأكسجة، استخدمنا طريقتين - قياس مستويات عامل نقص الأكسجين المحفز 1 ألفا (هيف-1α) في الأجنة كاملة أو الأنسجة المحددة وتحديد تكاثر الخلايا الجذعية الشبكية بنسبة 5-إثينيل-2'- ديوكسيوريدين (إيدو) دمج في الحمض النووي. مستويات هيف-1α يمكن أن تكون بمثابة علامة نقص الأكسجين العام في الجنين كله أو الأنسجةمن الاختيار، هنا شبكية العين الجنينية. دمج إيدو في الخلايا المتكاثر من شبكية العين الجنينية هو ناتج معين من تحريض نقص الأكسجة. وهكذا، فقد أظهرنا أن أسلاف الشبكية الجنينية نقص الأكسجة انخفاض الانتشار في غضون ساعة واحدة من الحضانة تحت 5٪ من الأكسجين من كل من الأجنة الضفدع والزرد.

مرة واحدة يتقن، يمكن أن تستخدم لدينا الإعداد للاستخدام مع الكائنات الحية المائية الصغيرة، لتجارب مباشرة في الجسم الحي ، أي فترة زمنية معينة وتحت العادي، نقص الأكسجة أو تركيز الأكسجين مفرط الأكسجين أو تحت أي خليط الغاز معين آخر.

Introduction

بحوث نقص الأكسجة لديها العديد من التطبيقات. وتشمل هذه التحقيق في التسبب وتطوير العلاجات للحالات الطبية التي تتميز نقص الأكسجة 1 والأمراض ارتفاع حاد حاد 2 . يسبب نقص الأكسجة تغيرات الأيض الرئيسية في جميع الكائنات الحية التي تتطلب الأوكسجين. الإجهاد نقص الأكسجين يؤثر أيضا على نمو الجنين والتنمية والتسبب في العديد من الأمراض البشرية، بما في ذلك تقييد النمو داخل الرحم 3 . لا يمكن أن يؤدي إجهاد نقص الأكسجة فقط إلى انخفاض وزن المواليد، أو وفيات الجنين أو حديثي الولادة، بل يمكن أن يؤدي أيضا إلى مضاعفات كثيرة في حياة البالغين، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية وداء السكري من النوع 2 والبدانة وارتفاع ضغط الدم 4 . وغالبا ما يلاحظ الإجهاد نقص الأكسجة أثناء تطور الورم الصلبة، عندما الأنسجة الورم يتفوق إمدادات الدم لها. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على دراسة آثار نقص الأكسجين في الجسم الحي ومباشرة خلال إمبر التنمية اليونية.

من بين الطرق الأكثر شهرة التي تم استخدامها لدراسة تأثير نقص الأكسجة أثناء التنمية هو استخدام كلوريد الكوبالت في وسط النمو أو حضانة الكائن الحي في غرفة نقص الأكسجين. كلوريد الكوبالت يحفز اصطناعيا استجابة نقص الأكسجة تحت تركيز الأكسجين العادي، نظرا لدورها في استقرار الأكسجين محفز عامل 1 ألفا (هيف-1α) عن طريق منع تدهور بروتيوسومي لها 5 ، 6 ، 7 . ومع ذلك، كونها طريقة مريحة 8 ، واستخدام كلوريد الكوبالت، فضلا عن غيرها من مماثلة كيميائيات نقص الأكسجة الكيميائية يمكن أن يكون لها تأثير ضار غير محدد على الخلايا والأنسجة، على سبيل المثال ، موت الخلايا المبرمج 9 . لذلك، غرف نقص الأكسجين هي طريقة أفضل لتحريض "نقص الأكسجين الطبيعي" في الكائنات الحية من خلال مسار التطور الطبيعي.

نتنت "> لقد ركزنا على تطوير نظام لتحريض نقص الأكسجة في الأجنة الحيوانية المائية، وقد أصبحت كل من الضفادع والزرد الآن الكائنات نموذجية الفقاريات بالمعلومات لدراسات العديد من العمليات البيولوجية، وكذلك نماذج لمختلف الأمراض البشرية.الأجنة الضفدع والزرد وتطور من الخارج، مما يؤدي إلى القضاء على مضاعفات تعويض الأمهات.وعلاوة على ذلك، فإن مسار سريع للتنمية يجعل من الممكن التلاعب العوامل البيئية ومراقبة التغيرات المظهرية في تشكيل الجهاز في الوقت الحقيقي.بالإضافة إلى ذلك، يتم حفظ العديد من مكونات مسارات التنبيه إشارة رئيسية للغاية في وهذه الكائنات النموذجية وقد تميزت بالتفصيل من قبل مجموعة كبيرة من الأدب، والميزة الرئيسية في استخدام الضفادع والأجنة الزرد لدراسة آثار نقص الأكسجين على تطوير الفقاريات هو أن جميع العمليات يمكن رصدها مباشرة، منذ الأكسجين تخترق بسرعة الأجنة. وهكذا، في الضفادع والزرد، كما هو على النقيض من الكائنات نموذج آخر مثلالأجنة الماوس، وتأثير تركيز الأكسجين محددة يمكن دراستها في الأنسجة من الفائدة، دون الأخذ بعين الاعتبار وجود أو عدم وجود الأوعية الدموية وظيفية.

معظم الإمدادات المتاحة تجاريا لحضانة الأكسجين غير مؤات من كونها كبيرة نسبيا ولها ارتفاع تكاليف التشغيل المقابلة. وبصرف النظر عن ارتفاع التكلفة الأولية واستهلاك الغاز، موازنة وصيانة غرف نقص الأكسجة المشتركة تتطلب الحفاظ على جو من نقص الأكسجين المستمر ضد التدرج الغاز التي تحدث بشكل طبيعي في هذه الغرف بسبب حجمها أكبر و / أو تنفس الكائن الحي. وهذا يتطلب توظيف مراوح الغاز ونظام التبريد، مما يزيد من كمية المعدات الإضافية اللازمة، ويعوق البراعة الباحث ويقلل عموما بساطة الإجراء التجريبي. في المقابل، فإن الإعداد الذي نقدمه هنا قوي نسبيا ولكن فعالة جدا من حيث التكلفة، صغيرة، وسهلة لإقامة ويسمح وأست توازن الغاز، جو ناقص الأكسجين مستقرة وتبادل بسيط من المواد والحلول داخل الغرفة. نظامنا يمكن استخدامها للاستخدام مع أي كائن نموذج المائية من الفائدة.

لقد شيدت غرفة نقص الأكسجة التي هي صغيرة مريحة، وبالتالي يمكن وضعها داخل حاضنة المختبر المشتركة، والتي تسمح بسهولة الإجراءات التجريبية في أي درجة حرارة محددة. توفير السيطرة مريحة من درجة الحرارة وكذلك تركيز الأكسجين في المتوسط، وميزة نظامنا ضد حاضنات نقص الأكسجة المتاحة تجاريا تكمن في صغر حجمها وكفاءة التكلفة. وبالتالي، يمكن إنشاء الإعداد لدينا باستخدام إمدادات المختبرات العامة المتاحة لمعظم مختبرات البحوث ولا تتطلب أي مواد باهظة الثمن. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا الإعداد لا تولد الحرارة، على عكس حاضنات نقص الأكسجة المتاحة تجاريا، ويسمح للاستخدام في درجات حرارة أقل من درجة حرارة الغرفة التي توضع في حاضنة. ذي لاست أهمية خاصة للعمل مع الكائنات الحية ذات الدم البارد مثل الضفادع والأسماك حيث تعتمد معدلات النمو والتمثيل الغذائي بقوة على درجة الحرارة.

وبفضل فعاليتها من حيث التكلفة وبسهولة، فإن غرفة حضانة الغاز لدينا تنوعا جدا في تحديد ظروف مختلفة من نقص الأوكسجين أو فرط التأكسج، فضلا عن تمكين الإدارة السريعة والسهلة لوسائل الإعلام والحلول المختلفة لعدد كبير من الظروف التجريبية. وبالإضافة إلى ذلك، توظيف لوحة 24 جيدا بدلا من الأطباق المستخدمة عادة أو الدبابات المختبرية 10 ، 11 ، 12 ، ونظامنا يسمح المراقبة والعلاج التجريبي لعدة شروط متحولة في آن واحد.

للسيطرة على تحريض الصحيح من نقص الأكسجة، لقد رصدنا مستويات البروتين هيف-1α بواسطة الكشف لطخة غربية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدد الخلايا التكاثر قبل وبعد إنكوباتيون في غرفة نقص الأكسجين يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان نقص الأكسجة قد تسبب في الأنسجة. ويستند هذا الأسلوب على نتائجنا المنشورة سابقا 13 ، والتي تبين أن انتشار في الشبكية الجذعية شبكية الخلايا الجذعية يقلل على تحريض نقص الأكسجين. وهكذا، فقد رصدنا مستوى تكاثر الخلايا الجذعية الشبكية عن طريق إضافة 5-إثينيل-2'-ديوكسيوريدين (إيدو) إلى المتوسطة الجنين وقياس دمجها في الحمض النووي للخلايا تكاثر حديثا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة كامبريدج.

1. صيانة الحيوان

  1. الأجنة الضفدع
    ملاحظة: يمكن رفع الأجنة والحفاظ عليها وفقا لمرفق الحيوان والمختبر. هنا، وصف مثال على صيانة الحيوان.
    1. إعداد حل 0.1 بار تعديل بارث (مبس) الحل: 0.88 ملي كلوريد الصوديوم، 10 ميكرومتر بوكل، 24 ميكرومتر ناهكو 3 ، 100 ميكرومتر هيبيس، 8.2 ميكرومتر مغسو 4 ، 3.3 ميكرومتر كا (نو 3 ) 2 ، و 4.1 ميكرومتر كاكل 2 ، ودرجة الحموضة 7.6 .
    2. الحصول على القيطم الأجنة الأجنة عن طريق الإخصاب في المختبر .
      1. تثبيط الإباضة في الكبار الإناث الضفادع مخلب الأفريقية ( القيطم ليفيس) عن طريق الحقن مع الحوامل المصل الغدد التناسلية المصل أسبوع واحد (60 وحدة دولية) و 12 ساعة (500 وحدة دولية) قبل وضع البيض.
      2. جمع البويضات وتسميدها في المختبر مع الخصية الذكور المجانسة.
      3. الرايسي الأجنة في 0.1x مبس في 16 - 18 درجة مئوية. المرحلة الأجنة وفقا لجدول عادي من القيطم ليفيس 14 . رعاية في اختيار الأجنة كلها وعلى قيد الحياة لهذه التجربة.
  2. الأجنة الزرد
    ملاحظة: يمكن رفع الأجنة والحفاظ عليها وفقا لمرفق الحيوان والمختبر. هنا، وصف مثال على صيانة الحيوان.
    1. إعداد المتوسطة الجنين: 5 ملي كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي كاكل 2 ، 0.33 ملي مغسو 4 ، و 0.00001٪ الميثيلين الأزرق.
    2. الحفاظ على سلالة وت أب سلالة دانيو ريريو في 26.5 درجة مئوية.
    3. جمع الأجنة في الصباح من الإخصاب، ورفع حتى 4 د آخر التسميد (دبف) عند 28 درجة مئوية في المتوسطة الجنين أعدت كما هو موضح أعلاه، حدد والمرحلة كما هو موضح سابقا 15 .

2. تحريض نقص الأكسجين في فيفو

  • بناء غرفة حضانة الغاز
    1. استخدام خزان المائية تربية ( الشكل 1A ) التي يتم استخدامها عادة في منشأة الأسماك لبناء غرفة نقص الأكسجة. هذا الخزان يجب أن تناسب لوحة 24 جيدا.
    2. إعداد شبكة أسفل 24 لوحة جيدا كما هو مبين في الشكل 1 . إزالة أسفل البلاستيك من لوحة 24 جيدا ( الشكل 1B )، على سبيل المثال ، وذلك باستخدام آلة طحن لهذا الغرض.
    3. ملء الفراغ بين البلاستيك من الآبار وجدران لوحة مع راتنجات الايبوكسي. نعلق أي مرشح النايلون ( الشكل 1C ) مع قطر شبكة من 0.1-0.2 ملم إلى البلاستيك المغلفة الراتنج والسماح لوحة لتكون جافة تماما.
    4. مرة واحدة الجافة، حفر ثلاثة أو أربعة أنفاق ( الشكل 1D ) من 10 مم طول و 5 مم قطرها في الراتنج، وشبكة لوحة المغلفة الجدران. إرفاق قضبان بلاستيكية أو تفلون( الشكل 1E ) من القطر المناسب وطول 30 ملم إلى الأنفاق ووضع لوحة في خزان الاختيار.
    5. وضع شبكة أسفل 24 لوحة جيدا في خزان المائية المفضل. باستخدام أنابيب سيليكون ( الشكل 1F )، نعلق خزان الغاز ( الشكل 1G ) مع المطلوب O 2 / N 2 خليط أو خليط الغاز آخر من خيار لصمام موزع ( الشكل 1H ) باستخدام منظم الغاز المناسب (I) (بوك 200 شريط). هنا، استخدم خزانات الغاز التي تحتوي على خليط من الأكسجين 5٪ و 95٪ N 2 في التجارب نقص الأكسجة المعروضة هنا.
    6. ضبط معدل تدفق الأوكسجين في وسط الغرفة إلى 0.0017-0.0019 متر مكعب في الثانية الواحدة. في ظل هذا معدل تدفق الغاز، لا ينبغي أن ينظر إلى أي اضطراب في المتوسط ​​في آبار لوحة.
      1. استخدام عالية النقاء منظم الغاز على مرحلتين لهذا الغرض. تعيين منظم للحد من الضغط الداخلي للثه خزان الغاز (1000 - 2500 يسي) إلى ضغط تسليم 10 يسي طوال التجربة. وهكذا، وفقا لمواصفات هذا منظم الغاز، تم تحقيق معدل تدفق 0.00189 متر مكعب في الثانية طوال التجربة.
    7. ربط أنابيب السيليكون وصمام الموزع إلى الناشر القرص السيراميك ( الشكل 1J ) داخل خزان المائية. إغلاق خزان المائية وختم بعناية غطاء، طلاء عليه مع الشحوم سيليكون ( الشكل 1K ) (مقارنة مع الشكل 1 ). إذا كان مطلوبا درجة حرارة غير الغرفة معينة، ضع غرفة نقص الأكسجة في حاضنة مختبر من درجة الحرارة المطلوبة.
    8. اعتمادا على نوع الأجنة المستخدمة في التجربة، وملء خزان غرفة نقص الأكسجة مع المتوسطة الجنين المناسب والبدء في نشر خليط الغاز من خلال الناشر القرص السيراميك. تتوازن لمدة 10-15 دقيقة.
    9. بعد موازنة مع ثه مزيج الأكسجين المطلوب، وقياس تركيز الأكسجين في الماء باستخدام أوكسيميتر أو التحقيق الأكسجين. هنا، استخدام أوكسيميتر مع الألياف البصرية الأكسجين المذاب ومستشعر درجة الحرارة لهذا الغرض.
  • تحريض نقص الأكسجة في الأجنة
    1. اختيار بعناية الأجنة للتجربة، واستخدام الأجنة كلها وعلى قيد الحياة لحضانة نقص الأكسجين. هنا، لنا الأجنة الضفدع من المرحلة 38 أو الأجنة الزرد 4 دبف في التجارب المعروضة هنا.
    2. وضع أطباق الجنين في حاضنة ( الشكل 1K ) التي تحتوي على غرفة حضانة الغاز والسماح لهم موازنة لدرجة حرارة الحاضنة.
    3. نقل بعناية الأجنة في آبار لوحة 24-جيدا متشابكة ( الشكل 1B ) للغرفة حضانة الغاز، وذلك باستخدام ماصة بلاستيكية. دائما استخدام ماصة بلاستيكية لنقل الأجنة في جميع أنحاء البروتوكول.
      ملاحظة: كل بئر من هذه اللوحة يمكن أن تحتوي على ما يصلإلى 5 الأجنة الضفدع من المرحلة 38 أو ما يصل إلى 7 أجنة الزرد من 4 دبف. تسمية الآبار بعناية إذا كان استخدام أنماط وراثية مختلفة.
    4. الحفاظ على غرفة حضانة الغاز تحت ضخ المستمر مع خليط الغاز من الاختيار لمدة 5 ساعات أو لفترة أطول التي تناسب التجربة. استخدام خليط من 5٪ O 2 و 95٪ N 2 هنا.
    5. نقل بعناية الأجنة من غرفة الحضانة الغاز إلى وسط نورموكسيك المقابلة لنوع الجنين والمضي قدما على الفور مع الخطوات 3 أو 4.
    6. إذا كان هناك حاجة إلى مزيد من العلاج نورموكسيك، نقل بعناية الأجنة مرة أخرى إلى الوسط نورموكسيك المقابلة لنوع الجنين.

    • 3. السيطرة الناجحة نقص الأكسجة الحث عن طريق رصد مستويات هيف-1α

    1. استعدادات
      1. إعداد 0.4 ملغ / مل MS222 الحل في 0.1x مبس.
      2. إعداد العازلة التجانس: شراء رابيمونوبوريسيبيتاتيون فحص العازلة (ريبا بالعازلة) لتجانس الأنسجة وتكملة كمية من العازلة اللازمة لتجربتك مع مثبط البروتياز إلى تركيز النهائي 1: 100 الخامس / الخامس.
      3. إعداد حلول لطخة غربية.
        1. إعداد 4x ليملي العازلة تحميل هلام: 425 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 40٪ الخامس / الخامس الجلسرين، 8٪ الخامس / الخامس سدز، 4٪ V / V بيتا ميركابتويثانول، 0.5٪ ث / الخامس بروموفينول الأزرق، 10 مل إجمالي حجم د 2 O.
        2. إعداد 5X العازلة تشغيل: 15 ز قاعدة تريزما، 72 غرام من الجليكاين، 5 غرام سدز، 1 ​​L إجمالي حجم د 2 O.
        3. إعداد نقل العازلة: 2.66 غرام قاعدة تريزما، 14.4 غرام غليكاين، 200 مل 100٪ الميثانول، 1 L إجمالي حجم د 2 O.
        4. إعداد 10X تبست: 5 مل 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 8.0، 30 مل 5M كلوريد الصوديوم، 2.5 مل توين 20، 1 L إجمالي حجم H 2 O.
        5. إعداد حل حجب: 4٪ ث / الخامس مسحوق الحليب الخالي من الدسم في تبست 1X.
    2. مجموعة من الأنسجة
      1. تخدير الأجنة عن طريق الاستحمام في 0.4 ملليجرام / مل MS222 الحل16 ، 17 ونقلها إلى أنبوب التفاعل البلاستيك مليئة العازلة التجانس باستخدام ماصة بلاستيكية. استخدام 20 ميكرولتر العازلة في الجنين. لاحظ أن ما لا يقل عن 5 الأجنة الضفدع من المرحلة 38 أو 7 الأجنة الزرد من 4 دبف مطلوبة لتحديد تغيير كبير في مستويات البروتين HIF1α.
      2. تجانس الأنسجة باستخدام الخالط الأنسجة المناسبة أو سونيكاتور. إزالة الحطام بواسطة الطرد المركزي (15 دقيقة، 13،000 x ج؛ 4 درجات مئوية).
        1. بدلا من ذلك، تشريح شبكية العين من الأجنة الضفدع تخدير 17 والتجانس على النحو الوارد أعلاه. استخدام 20 ميكرولتر من العازلة التجانس في 10 شبكية العين.
      3. خذ طاف باستخدام ماصة، ينكر في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتكملة مع ليملي العازلة تحميل هلام إلى تركيز النهائي من 1X الخامس / الخامس (على سبيل المثال ، إضافة 5 ميكرولتر من العازلة ليملي 4x إلى 15 ميكرولتر جناسة). استخدام هذا طاف ل ويسالخرشنة لطخة أو تجميد العينات في -20 درجة مئوية.
    3. لطخة الغربية
      1. تحميل العينات أعدت كما هو موضح في الخطوة 3.2 على 12٪ مسبقة هلام في نظام الكهربائي باستخدام 1X الخامس / الخامس تشغيل العازلة. استخدام سلم البروتين لتحديد حجم البروتين. نقل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز (0.45 ميكرون غشاء) في نقل العازلة لمدة 1 ساعة معبأة على الجليد في 4 درجات مئوية، وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
      2. منع مواقع ملزمة غير محددة احتضان الغشاء في العازلة حظر لمدة 60 دقيقة. اتبع مع 3 × 10 دقيقة يغسل في 1X تبست.
      3. احتضان الغشاء في حلول أرنب المضادة لل هيف-1α الأجسام المضادة والفأر المضادة لل α- توبولين المخفف 1: 100 الخامس / الخامس و 1: 5000 الخامس / الخامس، على التوالي، في حجب الحل، لمدة 2.5 ساعة في رت. اتبع مع 3 × 10 دقيقة يغسل في 1X تبست.
      4. للكشف، واحتضان في الماعز المضادة للأرنب والماعز المضادة للفأر هرب مترافق الأجسام المضادة المخفف 1: 1000 V / V في حجب الحل لمدة 1 ساعة.اتبع مع 3 × 10 دقيقة يغسل في تبست 1X وتصور تلطيخ هرب باستخدام مجموعة التجارية وآلة المطور من الاختيار.
      5. تحديد كمية البروتين HIF1α باستخدام الكمي الرقمي.

    4. رصد انتشار الخلايا في نقص الأكسجين

    1. استعدادات
      1. إعداد 5 ملي إيدو الحل في وسط الجنين في الاختيار. الحل يمكن استخدامها على الفور أو أليكوتد وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      2. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (بس) أو شراء برنامج تلفزيوني من الموارد التجارية. الأوتوكلاف لمدة 10 دقيقة عند 115 درجة مئوية.
      3. إعداد حلول للكشف عن إدو التأسيس.
        1. إعداد حل التثبيت: 4٪ الخامس / الخامس من 16٪ محلول الأسهم الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني.
        2. إعداد حل السكروز: 30٪ ث / س السكروز في برنامج تلفزيوني.
        3. إعداد بست: 0.1٪ V / V تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني.
        4. إعداد حجب الحل: 10٪ الخامس / الخامس الحرارة المعطل مصل الماعز (Hإيغس) في بست.
        5. إعداد حل دابي: 1: 1000 V / V 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (دابي) في بست.
    2. حضانة الأجنة في نقص الأكسجين لإدماج إيدو
      1. ملء غرفة الحضانة الغاز مع 400-500 مل من 5 ملي إيدو حل تستكمل مع 1٪ V / V دمسو. قبل موازنة الحل مع نفس خليط الغاز المستخدمة في التجربة لمدة 15 دقيقة قبل التجربة. لاحظ أن حجم الحل الحضانة يمكن التقليل من خلال ربط قضبان أقصر ( الشكل 1E ) إلى لوحة شبكة أسفل.
      2. توصيل أنابيب الغاز إلى اسطوانة الغاز التي تحتوي على خليط الغاز من 5٪ O 2 و 95٪ N 2 . احتضان الحل لمدة 15 دقيقة.
      3. نقل الأجنة إلى غرفة الأكسجين، وتوزيعها بالتساوي بين الآبار واحتضان لمدة 2 ساعة. كل بئر يمكن أن يصلح ما يصل إلى 5 الأجنة الضفدع من المرحلة 38 أو ما يصل إلى 7 الأجنة الزرد 4 دبف.
      4. تحليل الجنينs ل إيدو التأسيس.
    3. الوقت بالطبع من حضانة الجنين في نقص الأكسجة وإيدو التأسيس
      1. ملء غرفة الحضانة الغاز مع 500 مل من المتوسطة الجنين في الاختيار. توصيل أنابيب الغاز إلى اسطوانة الغاز التي تحتوي على خليط الغاز من 5٪ O 2 و 95٪ N 2 وتتوازن المتوسطة مع خليط الغاز لمدة 15 دقيقة.
      2. نقل الأجنة إلى غرفة الأكسجين، وتوزيعها بالتساوي بين الآبار واحتضان لفترة زمنية المطلوب تصل إلى 48 ساعة. لآخر 1 ساعة، استبدال المتوسطة الجنين مع 5 ملي إيدو حل تستكمل مع 1٪ V / V دمسو.
      3. نقل الأجنة مرة أخرى إلى طبق نورموكسيك وتحليل ل إيدو التأسيس.
    4. إيدو كشف الكشف والتحليل
      1. تخدير الأجنة عن طريق الاستحمام في 0.4 ملليجرام / مل MS222 الحل.
      2. نقل الأجنة إلى قارورة زجاجية مناسبة وإصلاح عن طريق الحضانة في حل التثبيت لمدة 2 هكتارt رت أو O / N عند 4 درجات مئوية. اتبع مع 3 × 10 دقيقة يغسل في برنامج تلفزيوني. نقل بعناية الأجنة إلى حل السكروز ل كريوبروتكتيون الأنسجة. احتضان لمدة 4 ساعات أو حتى الأجنة تغرق إلى أسفل القارورة الزجاجية.
      3. تضمين الأجنة في تضمين المتوسطة (الأمثل مجمع درجة الحرارة قطع). كتل كريوسكتيون مع الأجنة فورا أو تخزين لمدة تصل إلى 14 د في -80 درجة مئوية.
      4. كريوسكتيون الكتل التي تحتوي على الأجنة باستخدام ناظم البرد. جمع أقسام من 12 ميكرون (الأجنة الزرد) أو 16 ميكرون (الأجنة الضفدع) سمك على الشرائح المجهر والسماح الجافة. عملية كريوسكتيونس فورا أو تخزين في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
      5. كشف إيدو التأسيس بواسطة تلطيخ إمونوفلورسنت باستخدام كيت الكيمياء التجارية. إعداد كمية إيدو رد الفعل مزيج اللازمة لعدد كريوسكتيونس في التجربة، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
        1. ل 500 ميكرولتر من إيدو رد فعل ميكس، استخدم 430 ميكرولتر من 1X رد فعل رد الفعل إيدو، 20 ميكرولتر من كسو 4 ، 1.2 ميكرولتر من اليكسا فلور أزيد، 50 ميكرولتر من 1X إيدو العازلة المضافة.
      6. غسل كريوسكتيونس مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة المتوسطة تضمين و 3 × 5 دقيقة مع بست ل بيرمابيليز الأنسجة. احتضان كريوسكتيونس في حجب الحل لمدة 30 دقيقة.
      7. احتضان كريوسكتيونس مع إيدو رد الفعل ميكس لمدة 1 ساعة تليها 3 × 10 دقيقة يغسل في بست. كوستين كريوسكتيونس مع حل دابي لمدة 15 دقيقة، تليها 3 × 10 دقيقة يغسل في بست. جبل الشرائح مع كريوسكتيونس الملون في تصاعد المتوسطة، وتغطي مع كوفرسليبس وترك لتجف قبل تحليل تحت المجهر الفلورسنت أو تخزين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
      8. تحليل كريوسكتيونس مع تلطيخ مكافحة إيدو تحت مقلوب المجهر المسح متحد البؤر وتحديد عدد من الخلايا إيجابية إيدو باستخدام الكمي الرقمي.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    توظيف نظام غرفة نقص الأكسجة التي نقدمها هنا يسمح لدراسة آثار نقص الأكسجين بشكل فردي وفي الجسم الحي في الحيوانات الحية كلها. نقص الأكسجين يمكن أن يتسبب عن طريق وضع الأجنة الضفدع أو الزرد كامل في غرفة نقص الأكسجين ( الشكل 1 )، ويتم الاضطلاع بها على مجموعات مختلفة من الظروف. يظهر صورة من إعداد غرفة الغاز لدينا الانتهاء في الشكل 2 . لقد رصدنا تركيز الأكسجين في وسط الحضانة باستخدام جهاز استشعار الأكسجين الألياف البصرية (2.1.9) في نقاط زمنية مختلفة خلال التجربة. وتشير هذه البيانات إلى أننا قد تسببت نقص الأكسجة مستقرة (6-6.5٪ الأكسجين المذاب) طوال تجاربنا ( الجدول 1 ).

    أولا، قيمنا في كل مكان وكذلك مستويات شبكية العين من هيف-1α في نورموكسيا ونقص الأكسجة كما يسببها في غرفة الأكسجين لدينا. مؤسسة الحرمين، 1αهو البروتين الذي استقرت تحت تركيزات منخفضة الأكسجين. قمنا بقياس مستويات هيف-1α في الضفدع الضفدع الليزات كلها أبقى تحت تركيز الأكسجين العادي أو تعرضوا لنقص الأكسجة 5٪، وفي المحللات من شبكية العين معزولة. كما هو مبين في الشكل 3 ، واستقرت هيف-1α تحت نقص الأكسجة في كل من الأجنة كاملة وفي شبكية العين. ويتحقق استقرار هيف-1α في آبار مختلفة من شبكة حضانة أسفل لوحة ( الشكل S1 ).

    كما سبق أن أظهرنا، نقص الأكسجين يؤثر على انتشار أسلاف الخلايا الجذعية الشبكية في المنطقة الهدبية الهدبية (كمز) للشبكية 13 . وبالتالي، فإن رصد الانتشار في كمز عن طريق إيدو التأسيس هو علامة جيدة لنجاح تحريض نقص الأكسجة. نحن حضنت الأجنة في غرفة نقص الأكسجين الحفاظ على 5٪ الأكسجين وتقييم انتشار الشبكية كما هو موضح الخطوة 4.2. كما هو متوقعإد، وأظهرت شبكية العين نورموكسيك السيطرة تلطيخ إيدو مكثفة في كمز، حيث تتواجد الأسلاف المتكاثر في كل من الضفدع ( أرقام 4B و 4 D ) والأجنة الزرد ( أرقام 5A و 5 C ). بعد الحرمان من الأكسجين في غرفة نقص الأكسجين، لوحظ انخفاض قوي في انتشار السلف سمز في كل من الضفدع ( أرقام 4C-4D ) والأجنة الزرد (أرقام 5B، 5C). لتحديد مدى تأثير، أجرينا دورة الزمن، احتضان الأجنة في غرفة نقص الأكسجة لفترات أطول تصل إلى 24 ساعة، ورصد الانتشار من قبل إيدو التأسيس كما هو موضح في الخطوة 4.3. يمكن أن نبين أن الانخفاض في انتشار السلف الشبكية كان حادا وأكبر في غضون 2 ساعة، واستمر لعدة ساعات ( الشكل 4D )، في حين أن الأجنة وضعت عادة وفقا لمرحلة تنموية. هذه النتيجة تشير إلى أن نظامنا يمكن أن تحفز بكفاءة نقص الأكسجين في الهدف تيسسو من الفائدة، على أوقات حضانة قصيرة وكذلك الحفاظ على هذه الشروط لفترات أطول في حين دعم تطوير الجنين العادي.

    شكل 1
    الشكل 1: التمثيل التخطيطي لغرفة غرفة الغاز التجريبي. ( أ ) تربية خزان المائية (22 (طول) × 10.5 (العرض) × 10.5 سم (الارتفاع)) ( B ) شبكة أسفل 24 لوحة جيدا (12.8 × 8.6 × 1.7 × 1.5 سم قطرها جيدا) ( C ) النايلون ( E ) تفلون أو قضبان بك من قطر مناسب و 30 مم طول ( F ) سيليكون أنابيب ( G ) خزان الغاز مع (قطر) قطرها 0.1-0.2 مم ( D ) الأنفاق من 10 (طول) × 5 مم الأكسجين المطلوب / كو 2 خليط ( H ) صمام موزع ( I ) صمام الغاز ( J ) سير( K ) غطاء خزان القرص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2: صورة لغرفة غرفة الغاز التجريبي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الجدول 1
    الجدول 1: قياس تركيز الأكسجين في أوقات حضانة مختلفة في غرفة الغاز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا f igure.

    الشكل 3
    الشكل 3: مستويات هيف-1α زيادة على نقص الأكسجين التعريفي في الأجنة القيطم وشبكية العين الخاصة بهم. البقع الغربية من البروتين المحللة من الأجنة كاملة ( A ) أو من شبكية العين الجنينية المعزولة ( B ) أبقى تحت تركيزات الأكسجين العادية أو في نقص الأكسجة. تم البحث عن البقع ل هيف-1α فرعية و α- توبولين. تم أخذ ما لا يقل عن 5 أجنة أو 22 شبكية العين لكل حالة ( ن = 5) ( C، D ) الكمي من لطخة الغربية التي أجريت في ( A، B )، على التوالي. تم تطبيع مستويات البروتين من هيف-1α إلى مستويات البروتين من α- توبولين. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية بين التجارب. * p -value <0.05، *** p -value <0.001؛ n = 5.d / 55710 / 55710fig3large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 4
    الشكل 4: نقص الأكسجين يقلل انتشار الأجنة في الخلايا الجذعية الشبكية مشكاة الأجنة الضفدع. ( A ) تمثيل تخطيطي من مقطع عرضي من خلال 38 مرحلة زينوبوس الشبكية، مما يدل على موقف المنطقة الهدبية الهامشية (كمز) ( B ، C ) إيدو تأسيس قياس بعد 2 ساعة إيدو نبض في شبكية العين دابي الملون من 38 مرحلة الأجنة الضفدع أبقى تحت نورموكسيا ( B ) أو في غرفة نقص الأكسجين ( C ). ماجينتا = دابي وصمة عار؛ رمادي = إيدو وصمة عار. مقياس الحانات = 50 ميكرون ( D ) الكمي للتجربة التي أجريت في B و C. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. *** ن = 7. لكل حالة تم قياس 10-15 شبكية العين ( G ) الكمي للخلايا إيجابية إيدو بعد 1 ساعة إيدو التأسيس في شبكية العين من الحيوانات بعد أوقات مختلفة في نقص الأكسجة (الوقت بالدقائق المشار إليها على المحور س). أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات القياسية من اثنين من التجارب المستقلة ( ن = 2). لكل حالة ونقطة زمنية، تم تحديد ما لا يقل عن 10 شبكية العين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 5
    الشكل 5: نقص الأكسجين يقلل انتشار الأجنة في الشبكية الجذعية خلية شبكية من 4 دبف الأجنة الزرد. إدو تأسيس قياس بعد 2 ساعة إيدو نبض في شبكية العين دابي الملون من 4 دبف الأجنة الزرد وت القديمة أبقى أوندإيه نورموكسيا ( A ) أو في غرفة نقص الأكسجين ( B ). أرجواني: دابي وصمة عار؛ رمادي: إيدو وصمة عار. مقياس الحانات = 50 ميكرون ( C ) الكمي للتجربة التي أجريت في B و C. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. *** p -value <0.001؛ ن = 7. لكل حالة تم قياس شبكية العين 10-15. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل التكميلي 1
    التكميلي الشكل 1: مستويات هيف-1α زيادة على نقص الأكسجين التعريفي باستمرار في آبار مختلفة من لوحة وبين التجارب المختلفة. البقع الغربية من البروتين المحللات من أجنة القيطم كله أبقى تحت تركيزات الأكسجين العادية أوفي اثنين من الآبار مختلفة من غرفة نقص الأكسجين تحت تحريض نقص الأكسجين لمدة 2 ساعة في التجربة 1 ( A ) أو في التجربة 2 ( B ). تم البحث عن البقع ل هيف-1α فرعية و α- توبولين. تم أخذ 5 أجنة الضفدع من المرحلة 38 لكل حالة. التجربة 1 و 2 هي مكررات بيولوجية مستقلة ( C، D ) الكمي للنقاط الغربية التي أجريت في ( A، B )، على التوالي. تم تطبيع مستويات البروتين من هيف-1α إلى مستويات البروتين من α- توبولين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    هنا قدمنا ​​طريقة جديدة سهلة ولكنها قوية للحث على نقص الأكسجة التي يتم تعديلها للاستخدام مع الأجنة الضفدع والزرد ولكن يمكن أيضا أن تكون مناسبة للكائنات المائية الأخرى. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة تكمن في بساطته وكفاءته من حيث التكلفة. ومع ذلك، فإن النتائج التي تحققت مع هذه الطريقة هي قوية جدا. لقد أظهرنا أن نقص الأكسجة يمكن أن يسببها بكفاءة في غرفة سواء في الأجنة كلها وكذلك في نسيج معين - هنا، شبكية العين. لتحديد فعالية تحريض نقص الأكسجة، لقد رصدنا مستويات البروتين هيف-1α في الجنين كله و ليسيتس الشبكية. وفقا لنتائجنا، يمكن أن ينظر إلى نقص الأكسجين الحث على أنها ناجحة، إذا كان يمكن ملاحظة زيادة مستويات هيف-1α على 1 ساعة في غرفة نقص الأكسجين مقارنة مع السيطرة نورموكسيك وتطبيع لمستويات البروتين العالمية، على سبيل المثال ، وذلك باستخدام مستويات α- توبولين كسيطرة. وأكدنا نشاط نقص الأكسجين في الأنسجة عن طريق رصد انتشار الخلايا الجذعيةفي شبكية العين من قبل إيدو التأسيس، ويمكن أن تظهر، وفقا لنتائج نشرت سابقا 13 ، أن نقص الأكسجين الناجم عن استخدام الإعداد المقدمة هنا يؤدي إلى انخفاض انتشار الخلايا الجذعية الشبكية في كل من الأجنة الضفدع والزرد.

    واحدة من الخطوات الحاسمة من هذا البروتوكول هو التأكد من أن غرفة الأكسجين مختومة بشكل صحيح. ويتم إنجاز ذلك باستخدام ختم مناسب على غطاء الخزان، الذي كان الشحوم سيليكون في حالتنا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التنسيب داخل حاضنة تساعد على تجنب تسرب الأكسجين في الغلاف الجوي في الغرفة، من خلال توفير حاجز إضافي. كما أن قياس تركيز الأكسجين مع مسبار مناسب أو قطب كهربائي يضمن أيضا الحفاظ على مستويات الأكسجين الأكسجين مستقرة وبدون تقلبات. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي توخي الحذر لتجنب فتح الغرفة لفترات زمنية طويلة أثناء تبادل الحلول أو العينات بين التجارب.

    نظرا سريعة إكيلمرات إبراتيون من 10 - 15 دقيقة لإنشاء نقص الأكسجين، وهناك حاجة فقط كمية قليلة من خليط الغاز وانخفاض معدل تدفق الغاز للحفاظ على النظام حتى لفترات زمنية أطول مما هو موضح في نتائج ممثل (24 ساعة). يجب أن تكون الحلول المستخدمة في التجربة معادلة مسبقا لتحقيق نقص الأكسجة لمدة 15 دقيقة قبل الحضانة في الغرفة (كما هو موضح في 4.2.1). لقد استخدمنا غرفة نقص الأكسجة خلال فترة 48 ساعة من نقص الأكسجين المستمر دون أي أخطاء كما رأينا من قياسات تركيز الأكسجين لدينا ( الجدول 1 ). وتجدر الإشارة إلى أنه يجب السيطرة على نشر الغاز الصحيح خلال أوقات حضانة أطول. وأخيرا، ينبغي توخي الحذر أثناء وضع الأجنة في الآبار (الخطوة 2.2.1) لتجنب خلط للأجنة من الحيوانات متحولة مختلفة / الظروف التجريبية. هذا هو بسيط جدا لتحقيق نظرا للجدران عالية نسبيا من الآبار واحدة من لوحة.

    على الرغم من كونها بسيطة ولكنها فعالةونظام قوي لتحريض نقص الأكسجة، واستخدام غرفة وصفها هنا لديه عيب واحد للتجارب التي تتطلب استخدام حلول الحضانة باهظة الثمن ووسائل الإعلام. الحد الأدنى لحجم وسائل الإعلام في خزان غرفة لا ينبغي أن تقع أقل من 400 مل. ومع ذلك، يمكن إجراء تعديلات لتناسب أحجام أقل: لقد نجحنا في ضبط طول قضبان ( الشكل 1E ) تعلق على لوحة (2.1.4 و 4.2.1) حتى أننا سوف تتطلب فقط 50 مل من وسائل الإعلام / حل . في حين ليست مثالية لأوقات حضانة أطول، وهذا الإعداد يمكن أن تناسب نفس أنابيب الغاز ويمكن أن تكون مختومة بشكل مناسب لضمان نقص الأكسجين كافية لمدة تصل إلى 8 ساعات.

    وإذا ما أخذنا معا، يمكن استخدام إعداد غرفة الغاز الخاص بنا للاستخدام مع أي كائن نموذجي مائي، ويتم تعيينه عن غيرها من النظم المماثلة المتاحة تجاريا من خلال بساطته وفعاليته من حيث التكلفة وقوته. مرة واحدة يتقن، فإنه يمكن استخدامها مباشرة في التجارب المجراة ، أي فترة زمنية معينة وتحت أي رغبةد الغاز بما في ذلك نقص الأكسجين، فرط التأكسج أو مخاليط الغاز الأخرى.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

    Acknowledgments

    وقد دعم هذا العمل بدعم من جائزة ويلكوم ترست سيا 100329 / Z / 12 / Z إلى واه وزمالة دفغ خ 376 / 1-1 منحت لهونغ كونغ

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sodium chloride Sigma S7653 NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST
    Potassium chloride Sigma P9333 KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,
    Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3/0.1x MBS
    HEPES Sigma H3375 0.1x MBS
    Magnesium sulfate Sigma M7506 MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium
    Calcium nitrate Sigma 202967 Ca(NO3)2/0.1x MBS
    Calcium chloride Sigma C1016 CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium
    Methylene blue Sigma M9140 Embryo medium
    Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) Sigma CG10 Frog fertilization
    Zebrafish breeding tank Carolina 161937 Gas chamber construction
    24-well plate Thermo Scientific 142475 Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
    Epoxy resin RS Components UK Kit 199-1468
    Gas distributor valve WPI Luer Valves Kit 14011 Aquatic tank attachment (Schema 1, H)
    High precision gas valve BOC  200 bar HiQ C106X/2B Gas tank attachment (Schema 1, I)
    5% oxygen and 95% N2 gas tank BOC 226686-L Hypoxic gas mixture
    ceramic disc diffuser CO2 Art  Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 Schema 1, J
    silicone grease Scientific Laboratory Supplies VAC1100 Schema 1, K
    oxymeter Oxford Optronix  Oxylite, CP/022/001 Hypoxic chamber setup
    fibre-optic dissolved oxygen sensor Oxford Optronix HL_BF/OT/E Hypoxic chamber setup
    plastic pasteur pipette Sterilin STS3855604D For embryo transfer
    MS222  Sigma Aldrich E10521-50G Embryo anesthetic
    RIPA buffer  Sigma R0278-50ML Tissue homogenization
    Protease inhibitor Sigma P8340 Tissue homogenization
    Tris Sigma 77-86-1 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST
    Glycerol Sigma G5516 4x Laemmli loading buffer
    Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L3771 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer
    beta-Mercaptoethanol  Sigma M6250 4x Laemmli loading buffer
    Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 4x Laemmli loading buffer
    Trizma base  Sigma 77-86-1 5x Running buffer, Transfer buffer
    Glycine Sigma G8898 5x Running buffer, Transfer buffer
    Methanol Sigma 34860 Transfer buffer
    Tween 20 Sigma P2287-500ML 10x TBST
    skim milk powder Sigma 70166 Blocking Solution
    Eppendorf microcentrifuge tube Sigma T9661
    tissue homogenizer Pellet Pestle Motor Kontes Z359971 Tissue homogenization
    pellet pestles Sigma Z359947-100EA Tissue homogenization
    precast 12% gel Biorad Mini-ProteinTGX, 456-1043 Western Blot
    protein ladder Amersham Full-Range Rainbow ladder, RPN800E Western Blot
    nitrocellulose membrane (0.45 µm) Biorad 162-0115 Western Blot
    anti-HIF-1α antibody Abcam ab2185 Western Blot
    anti-α-tubulin antibody Sigma T6074 Western Blot
    goat anti-rabbit antibody Abcam ab6789 Western Blot
    goat anti-mouse antibody Abcam ab97080 Western Blot
    Pierce ECL 2 reagent  Thermo Scientific 80196 Western Blot
    ECL films Hyperfilm GE Healthcare Amersham 28906837 Western Blot
    5-Ethynyl-2′-deoxyuridine   santa cruz CAS 61135-33-9 EdU, EdU incorporation
    Phosphate-buffered Saline (PBS) Oxoid BR0014G 1x
    Formaldehyde Thermo Scientific 28908 Fixation solution
    Sucrose Fluka S/8600/60 Solution solution
    Triton X-100 Sigma T9284-500ML PBST
    Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) Sigma G6767-100ml Blocking solution (EdU incorporation)
    4',6-diamidino-2-phenylindole  ThermoFisher Scientific D1306 DAPI, EdU incorporation
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Molecular Probes C10338 EdU incorporation
    glass vial VWR 98178853 EdU incorporation analysis
    Tissue-Plus optimal cutting temperature compound  Scigen 4563 Embedding medium, EdU incorporation analysis
    cryostat Jung Fridgocut 2800E Leica  CM3035S EdU incorporation analysis
    microscope slides Super-Frost plus Menzel glass Thermo Scientific J1800AMNZ EdU incorporation analysis
    EdU Click-iT chemistry kit Molecular Probes C10338 EdU incorporation analysis
    FluorSave Calbiochem D00170200 Mounting medium, EdU incorporation analysis
    coverslips VWR ECN631-1575 EdU incorporation analysis
    fluorescent microscope Nikon Eclipse 80i EdU incorporation analysis
    confocal scanning microscope Olympus Fluoview FV1000 EdU incorporation analysis
    Volocity software PerkinElmer Volocity 6.3 EdU incorporation analysis

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
    2. Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude? Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
    3. Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
    4. Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
    5. Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
    6. Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
    7. Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
    8. Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
    9. Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
    10. Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
    11. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
    12. Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
    13. Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
    14. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Nieuwkoop, D. P., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
    15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
    16. Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
    17. McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).

    Tags

    علم الأحياء التنموي، العدد 124، الأجنة الضفدع، الأجنة الزرد، نقص الأكسجة، غرفة نقص الأكسجين، وتطوير الجنين، والخلايا الجذعية في شبكية العين
    تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Khaliullina-Skultety, H., Zi Chao,… More

    Khaliullina-Skultety, H., Zi Chao, N., Harris, W. A. Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (124), e55710, doi:10.3791/55710 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter