Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио

9.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55710

⸱

26 июня 2017 г.

 ,  , 
1Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

В этой статье

Краткое содержание

Мы вводим новую систему гипоксической камеры для использования с водными организмами, такими как эмбрионы лягушки и рыбок данио. Наша система проста, надежна, экономична и позволяет вводить и поддерживать гипоксию in vivo и до 48 часов. Мы представляем 2 воспроизводимых метода для мониторинга эффективности гипоксии.

Аннотация

Здесь мы вводим новую систему индукции гипоксии, которую мы разработали для изучения эффектов гипоксии у водных организмов, таких как эмбрионы лягушки и рыбок данио. Наша система включает в себя камеру с простой установкой, которая тем не менее надежна, чтобы вызывать и поддерживать определенную концентрацию кислорода и температуру в любом выбранном экспериментальном решении. Представленная система является очень рентабельной, но очень функциональной, позволяет проводить индукцию и поддержание гипоксии для прямых экспериментов in vivo и в течение различных периодов времени до 48 часов.

Для мониторинга и изучения эффектов гипоксии мы использовали два метода - измерение уровней индуцируемого гипоксией фактора 1 альфа (HIF-1α) у целых эмбрионов или специфических тканей и определение пролиферации стволовых клеток сетчатки 5-этинил-2'- Дезоксиуридина (EdU) в ДНК. Уровни HIF-1α могут служить общим маркером гипоксии во всем эмбрионе или тканиВыбор, здесь эмбриональная сетчатка. Включение ЭДУ в пролиферирующие клетки эмбриональной сетчатки является специфическим результатом индукции гипоксии. Таким образом, мы показали, что гипоксические эмбриональные предшественники сетчатки снижают пролиферацию в течение 1 часа инкубации под 5% кислорода как эмбрионов лягушки, так и рыбок данио.

После освоения наша установка может использоваться для использования с небольшими организмами водных организмов, для прямых экспериментов in vivo , любого заданного периода времени и при нормальной, гипоксической или гипероксической концентрации кислорода или любой другой данной газовой смеси.

Введение

Исследование Hypoxia имеет множество применений. К ним относятся исследование патогенеза и разработка методов лечения заболеваний, характеризующихся гипоксией 1 и острой больничной болезнью 2 . Гипоксический стресс вызывает значительные метаболические изменения во всех организмах, нуждающихся в кислороде. Гипоксический стресс также влияет на рост и развитие плода и патогенез нескольких заболеваний человека, включая ограничение внутриутробного роста 3 . Гипоксический стресс может не только приводить к снижению веса при рождении, плода и неонатальной смертности, но также может привести к многим осложнениям во взрослой жизни, таким как сердечно-сосудистые заболевания, диабет типа 2, ожирение и гипертония 4 . Гипоксический стресс также часто наблюдается при развитии солидной опухоли, когда опухолевая ткань перерастает в кровь. Поэтому важно иметь возможность изучать влияние гипоксии in vivo и непосредственно во время эмбриона Йонное развитие.

Среди наиболее известных методов, используемых для изучения эффектов гипоксии во время развития, является использование хлорида кобальта в среде роста или инкубация организма в гипоксической камере. Хлорид кобальта искусственно вызывает гипоксический ответ при нормальной концентрации кислорода из-за его роли в стабилизации гипоксически-индуцируемого фактора-1 альфа (HIF-1α), предотвращая его протеосомную деградацию 5 , 6 , 7 . Однако, являясь удобным методом 8 , использование хлорида кобальта, а также других аналогичных миметиков химической гипоксии может оказывать неспецифическое вредное воздействие на клетки и ткани, например , на апоптоз 9 . Поэтому гипоксические камеры являются лучшим методом индукции «естественной гипоксии» в живых организмах в процессе нормального развития.

Ntent "> Мы сосредоточились на разработке системы индукции гипоксии у эмбрионов водных животных. Как лягушки, так и рыбки данио теперь стали информативными модельными организмами-позвоночных для изучения многочисленных биологических процессов, а также моделей для различных заболеваний человека. Зародыши лягушек и рыбок данио Развиваются внешне, устраняя усложнение материнской компенсации. Кроме того, быстрый курс развития позволяет манипулировать факторами окружающей среды и наблюдать фенотипические изменения в формировании органов в реальном времени. Кроме того, многие компоненты основных путей передачи сигналов в значительной степени сохраняются в Эти модельные организмы и были подробно охарактеризованы большим объемом литературы. Главное преимущество использования лягушек и эмбрионов рыбок данио для изучения влияния гипоксии на развитие позвоночных заключается в том, что все процессы можно контролировать напрямую, так как кислород быстро проникает в эмбрионы. Таким образом, у лягушек и данио, как в отличие от других модельных организмов, таких какМышиные эмбрионы, влияние удельной концентрации кислорода можно исследовать в интересующей ткани, не принимая во внимание наличие или отсутствие функциональной сосудистой сети.

Большинство коммерчески доступных установок для гипоксической инкубации имеют недостаток в том, что они сравнительно большие и имеют соответственно высокие эксплуатационные расходы. Помимо высокой начальной стоимости и потребления газа, уравновешивание и поддержание общих гипоксических камер требует поддержания постоянной гипоксической атмосферы против газового градиента, который естественным образом возникает в этих камерах из-за их более крупного размера и / или дыхания организма. Это требует использования газовых вентиляторов и системы охлаждения, что увеличивает количество дополнительного необходимого оборудования, затрудняет ловкость исследователя и в целом снижает простоту экспериментальной процедуры. Напротив, установка, представленная здесь, является сравнительно надежной, но очень рентабельной, небольшой, простой в установке и позволяет fГазового равновесия, стабильной гипоксической атмосферы и простого обмена материалами и растворами внутри камеры. Наша система может использоваться для использования с любым интересующим организмом водной модели.

Мы построили гипоксическую камеру, которая удобно мала и поэтому может быть помещена в общий лабораторный инкубатор, что легко позволяет экспериментальные процедуры при любой определенной температуре. Обеспечивая удобное управление температурой, а также концентрацию кислорода в среде, преимущество нашей системы против коммерчески доступных инкубаторов гипоксии заключается в ее небольших размерах и экономической эффективности. Таким образом, наша установка может быть установлена ​​с использованием общих лабораторных материалов, доступных для большинства исследовательских лабораторий, и не требует каких-либо дорогостоящих материалов. Кроме того, наша установка не генерирует тепло, в отличие от коммерчески доступных инкубаторов гипоксии, и позволяет использовать при температурах ниже комнатной температуры, размещенных в инкубаторе. The laSt особенно важна для работы с хладнокровными организмами, такими как лягушки и рыба, где скорости развития и метаболизма сильно зависят от температуры.

Будучи очень экономичной и легко построенной, наша камера газового инкубатора, тем не менее, очень универсальна при установлении различных гипоксических или гипероксических условий, а также позволяет быстро и легко вводить различные среды и растворы для огромного количества экспериментальных условий. Кроме того, с использованием 24-луночного планшета вместо обычно используемых блюд или лабораторных резервуаров 10 , 11 , 12 наша система позволяет наблюдать и экспериментально обрабатывать несколько условий мутанта сразу.

Чтобы контролировать правильную индукцию гипоксии, мы контролировали уровни белка HIF-1α путем вестерн-блот-детектирования. Кроме того, количество пролиферирующих клеток до и после инкубацииN в гипоксической камере можно использовать для определения того, была ли индуцирована гипоксия в ткани. Этот метод основан на наших ранее опубликованных результатах 13 , свидетельствующих о том, что при индукции гипоксии снижается пролиферация в нише стволовых клеток эмбриональной сетчатки. Таким образом, мы контролировали уровень пролиферации стволовых клеток сетчатки путем добавления 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) к среде эмбриона и измерения его включения в ДНК вновь пролиферирующих клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными в Кембриджском университете.

1. Обслуживание животных

  1. Зародыши лягушки
    ПРИМЕЧАНИЕ. Эмбрионы можно поднимать и поддерживать в соответствии с животным и лабораторным оборудованием. Здесь описан пример обслуживания животных.
    1. Подготовьте 0,1x модифицированный раствор раствора Barth (MBS): 0,88 мМ NaCl, 10 мкМ KCl, 24 мкМ NaHCO 3 , 100 мкМ HEPES, 8,2 мкМ MgSO 4 , 3,3 мкМ Ca (NO 3 ) 2 и 4,1 мкМ CaCl 2 , pH 7,6 ,
    2. Получают эмбрионы Xenopus laevis путем оплодотворения in vitro .
      1. Вызывают овуляцию у взрослых женщин африканских когтистых лягушек ( Xenopus laevis) путем инъекции с беременной грудью гонадотропина в сыворотке на одну неделю (60 МЕ) и 12 ч (500 МЕ) перед укладкой яиц.
      2. Соберите ооциты и оплодотворите их in vitro гомогенизированным самцом яичка.
      3. RaiSe эмбрионов в 0,1x MBS при 16-18 ° C. Сформируйте эмбрионы в соответствии с обычной таблицей Xenopus laevis 14 . Позаботьтесь о выборе целых и живых эмбрионов для эксперимента.
  2. Зародыши данио
    ПРИМЕЧАНИЕ. Эмбрионы можно поднимать и поддерживать в соответствии с животным и лабораторным оборудованием. Здесь описан пример обслуживания животных.
    1. Подготовьте среду эмбриона: 5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2 , 0,33 мМ MgSO 4 и 0,00001% метиленового синего.
    2. Поддержание и разведение штамма WT AB Danio reerio при 26,5 ° C.
    3. Собирайте эмбрионы утром после оплодотворения, повышайте до 4 дней после оплодотворения (dpf) при 28 ° C в среде эмбриона, приготовленной, как описано выше, выберите и выполните стадию, как описано выше 15 .

2. Индукция гипоксии in vivo

  1. Строительство камеры газовой инкубации
    1. Используйте размножающийся водный резервуар ( рис. 1А ), который обычно используется в рыбном объекте для строительства гипоксической камеры. Этот бак должен соответствовать 24-луночным планшетам.
    2. Подготовьте 24-луночный планшет с сеткой, как показано на рисунке 1 . Снимите пластиковое дно 24-луночного планшета ( рис. 1B ), например , используя для этого фрезерный станок.
    3. Заполните пространство между пластиком колодцев и стенками пластины эпоксидной смолой. Прикрепите любой нейлоновый фильтр ( рис. 1C ) с диаметром сетки 0,1-0,2 мм к пластику с полимерным покрытием и дайте плите полностью высохнуть.
    4. После сушки просверлите три или четыре туннеля ( рис. 1D ) длиной 10 мм и диаметром 5 мм в пластинчатых стенах, покрытых смолой и сеткой. Прикрепите пластиковые или тефлоновые стержни( Рис. 1E ) соответствующего диаметра и длиной 30 мм в туннелях и поместите пластину в выбранный резервуар.
    5. Поместите 24-луночную планшницу с сеткой в ​​водный резервуар по выбору. Используя силиконовые трубки ( рис. 1F ), прикрепите газовый резервуар ( рис. 1G ) с помощью желаемой смеси O 2 / N 2 или другой газовой смеси по выбору к распределительному клапану ( рис. 1H ) с использованием соответствующего газового регулятора (I) (BOC 200 бар). Здесь используйте газовые баллоны, содержащие смесь 5% кислорода и 95% N 2 в экспериментах по гипоксии, представленных здесь.
    6. Отрегулируйте расход кислорода в среде камеры до 0,0017-0,0019 кубических метров в секунду. При этом расходе газа в ямах пластины не должно наблюдаться возмущение среды.
      1. Для этой цели используйте двухступенчатый газовый регулятор высокой чистоты. Установите регулятор, чтобы уменьшить внутреннее давление(1000 - 2500 фунтов на квадратный дюйм) до давления подачи 10 фунтов на кв. Дюйм в течение всего эксперимента. Таким образом, в соответствии с характеристиками этого газового регулятора в течение всего эксперимента была достигнута скорость потока 0,00189 кубических метров в секунду.
    7. Соедините силиконовые трубки и распределительный клапан с керамическим дисковым диффузором ( рис. 1J ) внутри водяного бака. Закройте резервуар для воды и аккуратно закройте крышку, нанесите ее силиконовой смазкой ( рисунок 1K ) (сравните с рисунком 1 ). Если требуется определенная не комнатная температура, поместите гипоксическую камеру в лабораторный инкубатор требуемой температуры.
    8. В зависимости от типа эмбрионов, используемых в эксперименте, заполните резервуар гипоксической камеры соответствующей средой эмбриона и начните диффузию газовой смеси через диффузор керамического диска. Уравнить в течение 10-15 мин.
    9. После уравновешивания сЕ желаемую кислородную смесь, измерьте концентрацию кислорода в воде с помощью оксиметра или кислородного зонда. Здесь для этого используйте оксиметр с волоконно-оптическим растворенным кислородом и датчиком температуры.
  2. Индукция гипоксии у эмбрионов
    1. Тщательно выберите эмбрионы для эксперимента, используйте целые и живые эмбрионы для инкубации гипоксии. Здесь у нас эмбрионы лягушки стадии 38 или эмбрионы рыбок данио 4 dpf в представленных здесь экспериментах.
    2. Поместите чашки эмбрионов в инкубатор ( рис. 1K ), содержащий камеру инкубации газа, и позвольте им уравновесить температуру инкубатора.
    3. Осторожно переносите эмбрионы в лунки 24-луночного планшета ( рис. 1B ) камеры инкубации с помощью пластиковой пипетки. Всегда используйте пластиковую пипетку для переноса эмбриона по всему протоколу.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Каждая лунка этой пластины может содержатьДо 5 эмбрионов лягушки стадии 38 или до 7 эмбрионов рыбок данио 4 dpf. Тщательно назовите колодцы, используя разные генотипы.
    4. Поддерживайте камеру инкубации газа при постоянной инфузии с выбранной газовой смесью в течение 5 часов или в течение более длительного времени, которая подходит для эксперимента. Используйте смесь 5% O 2 и 95% N 2 здесь.
    5. Аккуратно переместите эмбрионы из камеры инкубации газа обратно в нормоксическую среду, соответствующую типу эмбрионов, и немедленно приступайте к шагам 3 или 4.
    6. Если требуется дополнительное нормоксическое лечение, осторожно переносите эмбрионы обратно в нормоксическую среду, соответствующую типу эмбрионов.

3. Контроль успешной индукции гипоксии путем мониторинга уровней HIF-1α

  1. Препараты
    1. Подготовьте раствор 0,4 мг / мл MS222 в 0,1x MBS.
    2. Подготовьте буфер для гомогенизации: заготовьте буфер для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA bUffer) для гомогенизации ткани и дополнить количество буфера, необходимое для вашего эксперимента, с помощью ингибитора протеазы до конечной концентрации 1: 100 об. / Об.
    3. Подготовьте решения для вестерн-блоттинга.
      1. Приготовить 4x загрузочный буфер геля Laemmli: 425 мМ Трис, pH 8,0, 40% по объему глицерин, 8% об. / Об. SDS, 4% об. / Об. Бета-меркаптоэтанола, 0,5% мас. / Об. Бромфенол синий, общий объем 10 мл ddH 2 О.
      2. Подготовьте 5x бегущий буфер: 15 г основания Trizma, 72 г глицина, 5 г SDS, общий объем 1 л ddH 2 O.
      3. Готовят буфер переноса: 2,66 г основания Trizma, 14,4 г глицина, 200 мл 100% метанола, 1 л общего объема ddH 2 O.
      4. Подготовить 10x TBST: 5 мл 1 M Tris pH 8,0, 30 мл 5 М NaCl, 2,5 мл Tween 20, 1 L общий объем H 2 O.
      5. Подготовьте блокирующий раствор: 4% мас. / Об. Обезжиренного сухого молока в 1х TBST.
  2. Коллекция тканей
    1. Анестезируйте эмбрионы путем купания в растворе MS222 0,4 мг / мл16 , 17 и переносить их в пластиковую реакционную трубку, заполненную буфером для гомогенизации, с использованием пластиковой пипетки. Используйте 20 мкл буфера на эмбрион. Обратите внимание, что для определения значительного изменения уровней белка HIF1 необходимо, по крайней мере, 5 эмбрионов лягушки 38-го или 7-го эмбриона рыбок данио дабфа.
    2. Гомогенизируйте ткань, используя подходящий тканевый гомогенизатор или ультразвуковой аппарат. Удалите обломки центрифугированием (15 мин, 13000 × 4 ° С).
      1. Альтернативно, рассекайте сетчатки от анестезированных эмбрионов лягушки 17 и гомогенизируйте, как указано выше. Используйте 20 мкл буфера для гомогенизации на 10 сетчаток.
    3. Возьмите супернатант, используя пипетку, денатурируйте при 85 ° C в течение 5 минут и добавьте буфер для загрузки геля Laemmli до конечной концентрации 1x об. / Об. ( Например , добавьте 5 мкл 4x буфера Laemmli до 15 мкл гомогената). Используйте этот супернатант для WesКрапивница или замораживание образцов при -20 ° C.
  3. Вестерн-блот
    1. Загрузите образцы, приготовленные, как описано на этапе 3.2, на 12% -ный гель в электрофорезе, используя 1 х объемный буфер. Используйте белковые лестницы для определения размера белка. Перенесите белки на нитроцеллюлозную мембрану (мембрану 0,45 мкм) в буфер переноса в течение 1 часа, упакованную на льду при 4 ° C, согласно протоколу производителя.
    2. Блокируйте неспецифические сайты связывания, инкубирующие мембрану в Блокирующем буфере в течение 60 мин. Следуйте за 3 x 10-минутными промывками в 1x TBST.
    3. Инкубируйте мембрану в растворах кроличьего анти-HIF-1α антитела и мышиного анти-α-тубулина, разбавленного 1: 100 об. / Об. И 1: 5000 об. / Об., Соответственно, в блокирующем растворе в течение 2,5 часов при комнатной температуре. Следуйте за 3 x 10-минутными промывками в 1x TBST.
    4. Для обнаружения инкубируйте в козьих анти-кроличьих и козьих антимышиных HRP-конъюгированных антителах, разбавленных 1: 1000 об. / Об. В блокирующем растворе в течение 1 часа.Следуйте за 3 x 10-минутными промывками в 1x TBST и визуализируйте окрашивание HRP, используя коммерческий комплект и машину-разработчик по выбору.
    5. Определите количество белка HIF1α, используя цифровую количественную оценку.

4. Мониторинг пролиферации клеток в гипоксии

  1. Препараты
    1. Подготовьте решение 5 мМ EdU в среде эмбриона по выбору. Раствор можно использовать немедленно или аликвоты и хранить при -20 ° C в течение 6 месяцев.
    2. Подготовьте фосфат-буферный солевой раствор (PBS) или купите PBS из коммерческих ресурсов. Автоклав в течение 10 мин при 115 ° С.
    3. Подготовьте решения для обнаружения интеграции EdU.
      1. Подготовьте раствор для фиксации: 4% об. / Об. 16% раствора формальдегида в PBS.
      2. Подготовьте раствор сахарозы: 30% мас. / Об. Сахарозы в PBS.
      3. Подготовьте PBST: 0,1% об. / Об. Triton X-100 в PBS.
      4. Подготовьте раствор для блокировки: 10% об. / Об. Ион-активированная сыворотка козы (HIGS) в PBST.
      5. Подготовить раствор DAPI: 1: 1000 об. / Об. 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в PBST.
  2. Инкубация эмбрионов в гипоксии для включения EdU
    1. Заполните камеру инкубации для газа 400-500 мл 5 мМ раствора EdU с добавлением 1% об. / Об. ДМСО. Предварительно уравновешивают раствор той же газовой смесью, используемой в эксперименте, в течение 15 мин до эксперимента. Обратите внимание, что объем раствора для инкубации можно свести к минимуму путем прикрепления более коротких стержней ( рис. 1Е ) к пластине с сеткой.
    2. Подключите газовую трубу к газовому баллону, содержащему газовую смесь 5% O 2 и 95% N 2 . Инкубируйте раствор в течение 15 мин.
    3. Перенесите эмбрионы в гипоксическую камеру, распределяя их равномерно между лунками и инкубируйте в течение 2 часов. Каждая лунка может вмещать до 5 эмбрионов лягушки стадии 38 или до 7 эмбрионов рыбок данио 4 dpf.
    4. Анализ эмбрионаS для включения EdU.
  3. Временной ход инкубации эмбрионов при гипоксии и включение ЭДУ
    1. Заполните камеру инкубации газом по 500 мл раствора эмбриона. Подключите газовую трубу к газовому баллону, содержащему газовую смесь 5% O 2 и 95% N 2, и уравновешите среду газовой смесью в течение 15 мин.
    2. Перенесите эмбрионы в гипоксическую камеру, распределяя их равномерно между лунками и инкубируйте в течение требуемого периода времени до 48 часов. В течение последних 1 ч замените среду эмбриона раствором 5 мМ EdU, дополненным 1% об. / Об. ДМСО.
    3. Перенесите эмбрионы обратно в нормоксическую тарелку и проанализируйте для включения EdU.
  4. Обнаружение и анализ внедрения EdU
    1. Обезболивают эмбрионы путем купания в растворе MS222 0,4 мг / мл.
    2. Перенесите эмбрионы в соответствующий стеклянный флакон и исправьте путем инкубации в раствор для фиксации на 2 гаT RT или O / N при 4 ° C. Следуйте за 3 x 10-минутными промывками в PBS. Тщательно переносите эмбрионы в раствор сахарозы для тканевой криозащиты. Инкубируйте в течение 4 часов или до тех пор, пока эмбрионы не опустится до нижней части стеклянного флакона.
    3. Вставьте эмбрионы в среду для заливки (оптимальное значение температуры для резки). Криосекционные блоки с эмбрионами немедленно или хранят до 14 дней при -80 ° C.
    4. Криосекция блоков, содержащих эмбрионы, с использованием криостата. Соберите участки 12 мкм (эмбрионы рыбок данио) или 16 мкм (эмбрионы лягушки) на слайдах микроскопа и дайте высохнуть. Технологические криоизоляции немедленно или хранить при -20 ° C в течение 3 месяцев.
    5. Обнаружение включения EdU с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием набора для коммерческой химии. Подготовьте количество реакционной смеси EdU, необходимое для количества криосекций в эксперименте, как описано изготовителем.
      1. Для 500 мкл реакционной смеси EdU используют 430 мкл реакционного буфера 1X EdU, 20 мкл CuSO 4 , 1,2 мкл азида Alexa Fluor, 50 мкл буферной добавки 1X EdU.
    6. Вымойте криосекции один раз PBS, чтобы удалить среду для вложения и 3 x 5 мин с PBST для проницаемости ткани. Инкубируйте криоизоляцию в Блокирующем растворе в течение 30 мин.
    7. Инкубируйте криоизоляцию с реакционной смесью EdU в течение 1 часа и затем промывайте 3 x 10 минут в PBST. Потратьте на криоизоляцию раствором DAPI в течение 15 минут, затем 3 x 10 мин промывают в PBST. Установите слайды с окрашенными криоизомерами в монтажной среде, накройте покровные стекла и оставьте высушить, прежде чем анализировать под флуоресцентным микроскопом или хранить при температуре 4 ° C на срок до 1 года.
    8. Проанализируйте криозоны с окрашиванием анти-ЭДУ под инвертированным конфокальным сканирующим микроскопом и определите количество ЭДУ-положительных клеток, используя цифровую количественную оценку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование гипоксической камерной системы, которую мы здесь приводим, позволяет изучать эффекты гипоксии индивидуально и in vivo у всех живых животных. Гипоксию можно индуцировать путем размещения целых эмбрионов лягушки или рыбок данио в гипоксической камере ( рис. 1 ) и проводить различные сочетания состояний. Изображение нашей завершенной установки газовой камеры показано на рисунке 2 . Мы контролировали концентра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы представили простой, но прочный новый метод для индуцирования гипоксии, который приспособлен для использования с эмбрионами лягушки и данио, но может также быть подходящим для других водных организмов. Основным преимуществом этого метода является его простота и экономичность. Тем не менее, результаты, полученные с помощью этого метода, очень надежны. Мы показали, что гипоксию можно эффективно индуцировать в камере как у всех эмбрионов, так и в специфической ткани - здесь, сетчатки. Для определения эффективности...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана поддержкой от Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z до WAH и стипендией DFG KH 376 / 1-1, присужденной HK

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хлорид натрияSigmaS7653NaCl/0,1x MBS, среда для эмбрионов, 10x
TBST хлорид калияSigmaP9333KCl/0,1x MBS, бикарбонат
натрияSigmaS5761NaHCO3/0,1x MBS
HEPESSigmaH33750,1x
MBS сульфат магнияSigmaM7506MgSO4/0,1x MBS, среда для эмбрионов
Нитрат кальцияSigma202967Ca(NO3)2/0,1x MBS
Хлорид кальцияSigmaC1016CaCl2/0,1x MBS, среда для эмбрионов
Метиленовый синийSigmaM9140Среда для эмбрионов
Гонадотропин сыворотки крови беременной кобылы (PMSG)SigmaCG10Удобрение лягушек
Аквариум для разведения рыбок данио-рериоКаролина161937Конструкция газовой камеры
24-луночная пластинаThermo Scientific142475Nunclon Delta Surface, для конструкции газовой камеры
эпоксидная смолаRS Components UKKit 199-1468
Газораспределительный клапанWPI LuerValves Kit 14011Насадка для водного резервуара (Схема 1, H)
Высокоточный газовый клапанBOC 200 бар HiQ C106X/2BГазовый баллон 200 бар (Схема 1, <сильный>I)
5% кислорода и 95% N2 газовый баллонBOC226686-LГипоксическая газовая смесь
керамический дисковый диффузорCO2 Art Стеклянный нано-аквариумный диффузор CO2, DG005DG005схема 1, J
silicone greaseLaboratory SuppliesVAC1100Schema 1, K
oxymeterOxford Optronix Oxylite, CP/022/001Установка гипоксической камеры
волоконно-оптический датчик растворенного кислородаOxford OptronixHL_BF/OT/EУстановка гипоксической камеры
пластиковая пастеровская пипеткаSterilinSTS3855604DДля переноса эмбрионов
MS222 Sigma AldrichE10521-50GАнестетик для эмбрионов
RIPA buffer SigmaR0278-50MLИнгибитор гомогенизации
тканей Ингибитор протеазыSigmaP8340Гомогенизация
тканей TrisSigma77-86-14x Загрузочный буфер Laemmli, 10x
TBST ГлицеринSigmaG55164x Лаеммли загрузочный буфер
Додецилсульфат натрия (SDS)SigmaL37714x Лаеммли загрузочный буфер, 5x Бегущий буфер
бета-меркаптоэтанол SigmaM62504x Laemmli загрузочный буфер
Bromophenol BlueSigma-AldrichB01264x Laemmli загрузочный буфер
Trizma base Sigma77-86-15x Бегущий буфер, Передаточный буфер
ГлицинSigmaG88985x Бегущий буфер, Передаточный буфер
МетанолSigma34860Передаточный буфер
Tween 20SigmaP2287-500ML10x TBST
сухое обезжиренное молокоSigma70166Блокирующий раствор
Eppendorf микроцентрифужная пробиркаSigmaT9661
гомогенизатор тканейПеллетный пестик Мотор KontesZ359971Гомогенизация тканей
пеллетные пестикиSigmaZ359947-100EAГомогенизация тканей сборный
12% гельBioradMini-ProteinTGX, 456-1043Вестерн Блот
протеиновая лестницаАмершамПолнодиапазонный Радужная лестница, RPN800EВестерн Блот
нитроцеллюлозная мембрана (0,45 &; m)Biorad162-0115Вестерн Блот
анти-HIF-1&альфа антителоAbcamab2185Вестерн Блот
анти-&альфа;-тубулинантитело SigmaT6074Вестерн Блот
козье антитело против кроликаAbcamab6789Вестерн Блот
козье антитело против мышиAbcamab97080Вестерн Блот
Реагент Pierce ECL 2 Thermo Scientific80196Western Blot
ECL пленки HyperfilmGE Healthcare Amersham28906837Western Blot
5-этинил-2 ′-дезоксиуридин  санта-крусCAS  61135-33-9EdU, EdU инкорпорирование
фосфатно-солевого буфера (PBS)ОксоидныйBR0014G1x
ФормальдегидThermo Scientific28908Раствор фиксации
СахарозаFlukaS/8600/60Раствор
Triton X-100SigmaT9284-500MLPBST
Термоинактивированная сыворотка от козы (HiGS)SigmaG6767-100млБлокирующий раствор (инкорпорация EdU)
4',6-диамидино-2-фенилиндол ThermoFisher ScientificD1306DAPI, EdU инкорпорация
Диметилсульфоксид (ДМСО)Молекулярные зондыC10338EdU инкорпорация
стеклянный флаконVWR98178853Анализ инкорпорации
EdU Ткань-Плюс оптимальная температура резки компаунд Scigen4563Среда для встраивания, анализ встраивания EdU
криостат Jung Fridgocut 2800ELeica CM3035SEdU анализ включения
микроскопа предметные стекла Super-Frost плюс стекло Menzel ThermoScientificJ1800AMNZEdU анализ включения EdU
Химический набор EdUМолекулярные зондыC10338Анализ включения EdU
FluorSaveCalbiochemD00170200Монтажная среда, анализ включения EdU
покровные стеклаVWRECN631-1575EdU анализ
включения флуоресцентный микроскопNikonEclipse 80iEdU анализ включения
конфокальный сканирующий микроскопOlympusFluoview FV1000EdU анализ включения
программного обеспечения PerkinElmerVolocity 6.3EdU анализ включения
Scientific

Ссылки

  1. Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203(2007).
  2. Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude? Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
  3. Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
  4. Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
  5. Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
  6. Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
  7. Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
  8. Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
  9. Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
  10. Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
  11. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
  12. Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638(2012).
  13. Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
  14. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Nieuwkoop, D. P., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
  15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  16. Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
  17. McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Индукция гипоксииэмбриональная сетчаткаHIF-1 альфавключение EdUэмбрионы лягушкигазовая инкубационная камераскорость потока кислородавестерн-блот-анализпролиферация клеток-предшественников сетчатки
Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.