Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио

Published: June 26, 2017 doi: 10.3791/55710
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

Summary

Мы вводим новую систему гипоксической камеры для использования с водными организмами, такими как эмбрионы лягушки и рыбок данио. Наша система проста, надежна, экономична и позволяет вводить и поддерживать гипоксию in vivo и до 48 часов. Мы представляем 2 воспроизводимых метода для мониторинга эффективности гипоксии.

Abstract

Здесь мы вводим новую систему индукции гипоксии, которую мы разработали для изучения эффектов гипоксии у водных организмов, таких как эмбрионы лягушки и рыбок данио. Наша система включает в себя камеру с простой установкой, которая тем не менее надежна, чтобы вызывать и поддерживать определенную концентрацию кислорода и температуру в любом выбранном экспериментальном решении. Представленная система является очень рентабельной, но очень функциональной, позволяет проводить индукцию и поддержание гипоксии для прямых экспериментов in vivo и в течение различных периодов времени до 48 часов.

Для мониторинга и изучения эффектов гипоксии мы использовали два метода - измерение уровней индуцируемого гипоксией фактора 1 альфа (HIF-1α) у целых эмбрионов или специфических тканей и определение пролиферации стволовых клеток сетчатки 5-этинил-2'- Дезоксиуридина (EdU) в ДНК. Уровни HIF-1α могут служить общим маркером гипоксии во всем эмбрионе или тканиВыбор, здесь эмбриональная сетчатка. Включение ЭДУ в пролиферирующие клетки эмбриональной сетчатки является специфическим результатом индукции гипоксии. Таким образом, мы показали, что гипоксические эмбриональные предшественники сетчатки снижают пролиферацию в течение 1 часа инкубации под 5% кислорода как эмбрионов лягушки, так и рыбок данио.

После освоения наша установка может использоваться для использования с небольшими организмами водных организмов, для прямых экспериментов in vivo , любого заданного периода времени и при нормальной, гипоксической или гипероксической концентрации кислорода или любой другой данной газовой смеси.

Introduction

Исследование Hypoxia имеет множество применений. К ним относятся исследование патогенеза и разработка методов лечения заболеваний, характеризующихся гипоксией 1 и острой больничной болезнью 2 . Гипоксический стресс вызывает значительные метаболические изменения во всех организмах, нуждающихся в кислороде. Гипоксический стресс также влияет на рост и развитие плода и патогенез нескольких заболеваний человека, включая ограничение внутриутробного роста 3 . Гипоксический стресс может не только приводить к снижению веса при рождении, плода и неонатальной смертности, но также может привести к многим осложнениям во взрослой жизни, таким как сердечно-сосудистые заболевания, диабет типа 2, ожирение и гипертония 4 . Гипоксический стресс также часто наблюдается при развитии солидной опухоли, когда опухолевая ткань перерастает в кровь. Поэтому важно иметь возможность изучать влияние гипоксии in vivo и непосредственно во время эмбриона Йонное развитие.

Среди наиболее известных методов, используемых для изучения эффектов гипоксии во время развития, является использование хлорида кобальта в среде роста или инкубация организма в гипоксической камере. Хлорид кобальта искусственно вызывает гипоксический ответ при нормальной концентрации кислорода из-за его роли в стабилизации гипоксически-индуцируемого фактора-1 альфа (HIF-1α), предотвращая его протеосомную деградацию 5 , 6 , 7 . Однако, являясь удобным методом 8 , использование хлорида кобальта, а также других аналогичных миметиков химической гипоксии может оказывать неспецифическое вредное воздействие на клетки и ткани, например , на апоптоз 9 . Поэтому гипоксические камеры являются лучшим методом индукции «естественной гипоксии» в живых организмах в процессе нормального развития.

Ntent "> Мы сосредоточились на разработке системы индукции гипоксии у эмбрионов водных животных. Как лягушки, так и рыбки данио теперь стали информативными модельными организмами-позвоночных для изучения многочисленных биологических процессов, а также моделей для различных заболеваний человека. Зародыши лягушек и рыбок данио Развиваются внешне, устраняя усложнение материнской компенсации. Кроме того, быстрый курс развития позволяет манипулировать факторами окружающей среды и наблюдать фенотипические изменения в формировании органов в реальном времени. Кроме того, многие компоненты основных путей передачи сигналов в значительной степени сохраняются в Эти модельные организмы и были подробно охарактеризованы большим объемом литературы. Главное преимущество использования лягушек и эмбрионов рыбок данио для изучения влияния гипоксии на развитие позвоночных заключается в том, что все процессы можно контролировать напрямую, так как кислород быстро проникает в эмбрионы. Таким образом, у лягушек и данио, как в отличие от других модельных организмов, таких какМышиные эмбрионы, влияние удельной концентрации кислорода можно исследовать в интересующей ткани, не принимая во внимание наличие или отсутствие функциональной сосудистой сети.

Большинство коммерчески доступных установок для гипоксической инкубации имеют недостаток в том, что они сравнительно большие и имеют соответственно высокие эксплуатационные расходы. Помимо высокой начальной стоимости и потребления газа, уравновешивание и поддержание общих гипоксических камер требует поддержания постоянной гипоксической атмосферы против газового градиента, который естественным образом возникает в этих камерах из-за их более крупного размера и / или дыхания организма. Это требует использования газовых вентиляторов и системы охлаждения, что увеличивает количество дополнительного необходимого оборудования, затрудняет ловкость исследователя и в целом снижает простоту экспериментальной процедуры. Напротив, установка, представленная здесь, является сравнительно надежной, но очень рентабельной, небольшой, простой в установке и позволяет fГазового равновесия, стабильной гипоксической атмосферы и простого обмена материалами и растворами внутри камеры. Наша система может использоваться для использования с любым интересующим организмом водной модели.

Мы построили гипоксическую камеру, которая удобно мала и поэтому может быть помещена в общий лабораторный инкубатор, что легко позволяет экспериментальные процедуры при любой определенной температуре. Обеспечивая удобное управление температурой, а также концентрацию кислорода в среде, преимущество нашей системы против коммерчески доступных инкубаторов гипоксии заключается в ее небольших размерах и экономической эффективности. Таким образом, наша установка может быть установлена ​​с использованием общих лабораторных материалов, доступных для большинства исследовательских лабораторий, и не требует каких-либо дорогостоящих материалов. Кроме того, наша установка не генерирует тепло, в отличие от коммерчески доступных инкубаторов гипоксии, и позволяет использовать при температурах ниже комнатной температуры, размещенных в инкубаторе. The laSt особенно важна для работы с хладнокровными организмами, такими как лягушки и рыба, где скорости развития и метаболизма сильно зависят от температуры.

Будучи очень экономичной и легко построенной, наша камера газового инкубатора, тем не менее, очень универсальна при установлении различных гипоксических или гипероксических условий, а также позволяет быстро и легко вводить различные среды и растворы для огромного количества экспериментальных условий. Кроме того, с использованием 24-луночного планшета вместо обычно используемых блюд или лабораторных резервуаров 10 , 11 , 12 наша система позволяет наблюдать и экспериментально обрабатывать несколько условий мутанта сразу.

Чтобы контролировать правильную индукцию гипоксии, мы контролировали уровни белка HIF-1α путем вестерн-блот-детектирования. Кроме того, количество пролиферирующих клеток до и после инкубацииN в гипоксической камере можно использовать для определения того, была ли индуцирована гипоксия в ткани. Этот метод основан на наших ранее опубликованных результатах 13 , свидетельствующих о том, что при индукции гипоксии снижается пролиферация в нише стволовых клеток эмбриональной сетчатки. Таким образом, мы контролировали уровень пролиферации стволовых клеток сетчатки путем добавления 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) к среде эмбриона и измерения его включения в ДНК вновь пролиферирующих клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными в Кембриджском университете.

1. Обслуживание животных

  1. Зародыши лягушки
    ПРИМЕЧАНИЕ. Эмбрионы можно поднимать и поддерживать в соответствии с животным и лабораторным оборудованием. Здесь описан пример обслуживания животных.
    1. Подготовьте 0,1x модифицированный раствор раствора Barth (MBS): 0,88 мМ NaCl, 10 мкМ KCl, 24 мкМ NaHCO 3 , 100 мкМ HEPES, 8,2 мкМ MgSO 4 , 3,3 мкМ Ca (NO 3 ) 2 и 4,1 мкМ CaCl 2 , pH 7,6 ,
    2. Получают эмбрионы Xenopus laevis путем оплодотворения in vitro .
      1. Вызывают овуляцию у взрослых женщин африканских когтистых лягушек ( Xenopus laevis) путем инъекции с беременной грудью гонадотропина в сыворотке на одну неделю (60 МЕ) и 12 ч (500 МЕ) перед укладкой яиц.
      2. Соберите ооциты и оплодотворите их in vitro гомогенизированным самцом яичка.
      3. RaiSe эмбрионов в 0,1x MBS при 16-18 ° C. Сформируйте эмбрионы в соответствии с обычной таблицей Xenopus laevis 14 . Позаботьтесь о выборе целых и живых эмбрионов для эксперимента.
  2. Зародыши данио
    ПРИМЕЧАНИЕ. Эмбрионы можно поднимать и поддерживать в соответствии с животным и лабораторным оборудованием. Здесь описан пример обслуживания животных.
    1. Подготовьте среду эмбриона: 5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2 , 0,33 мМ MgSO 4 и 0,00001% метиленового синего.
    2. Поддержание и разведение штамма WT AB Danio reerio при 26,5 ° C.
    3. Собирайте эмбрионы утром после оплодотворения, повышайте до 4 дней после оплодотворения (dpf) при 28 ° C в среде эмбриона, приготовленной, как описано выше, выберите и выполните стадию, как описано выше 15 .

2. Индукция гипоксии in vivo

  • Строительство камеры газовой инкубации
    1. Используйте размножающийся водный резервуар ( рис. 1А ), который обычно используется в рыбном объекте для строительства гипоксической камеры. Этот бак должен соответствовать 24-луночным планшетам.
    2. Подготовьте 24-луночный планшет с сеткой, как показано на рисунке 1 . Снимите пластиковое дно 24-луночного планшета ( рис. 1B ), например , используя для этого фрезерный станок.
    3. Заполните пространство между пластиком колодцев и стенками пластины эпоксидной смолой. Прикрепите любой нейлоновый фильтр ( рис. 1C ) с диаметром сетки 0,1-0,2 мм к пластику с полимерным покрытием и дайте плите полностью высохнуть.
    4. После сушки просверлите три или четыре туннеля ( рис. 1D ) длиной 10 мм и диаметром 5 мм в пластинчатых стенах, покрытых смолой и сеткой. Прикрепите пластиковые или тефлоновые стержни( Рис. 1E ) соответствующего диаметра и длиной 30 мм в туннелях и поместите пластину в выбранный резервуар.
    5. Поместите 24-луночную планшницу с сеткой в ​​водный резервуар по выбору. Используя силиконовые трубки ( рис. 1F ), прикрепите газовый резервуар ( рис. 1G ) с помощью желаемой смеси O 2 / N 2 или другой газовой смеси по выбору к распределительному клапану ( рис. 1H ) с использованием соответствующего газового регулятора (I) (BOC 200 бар). Здесь используйте газовые баллоны, содержащие смесь 5% кислорода и 95% N 2 в экспериментах по гипоксии, представленных здесь.
    6. Отрегулируйте расход кислорода в среде камеры до 0,0017-0,0019 кубических метров в секунду. При этом расходе газа в ямах пластины не должно наблюдаться возмущение среды.
      1. Для этой цели используйте двухступенчатый газовый регулятор высокой чистоты. Установите регулятор, чтобы уменьшить внутреннее давление(1000 - 2500 фунтов на квадратный дюйм) до давления подачи 10 фунтов на кв. Дюйм в течение всего эксперимента. Таким образом, в соответствии с характеристиками этого газового регулятора в течение всего эксперимента была достигнута скорость потока 0,00189 кубических метров в секунду.
    7. Соедините силиконовые трубки и распределительный клапан с керамическим дисковым диффузором ( рис. 1J ) внутри водяного бака. Закройте резервуар для воды и аккуратно закройте крышку, нанесите ее силиконовой смазкой ( рисунок 1K ) (сравните с рисунком 1 ). Если требуется определенная не комнатная температура, поместите гипоксическую камеру в лабораторный инкубатор требуемой температуры.
    8. В зависимости от типа эмбрионов, используемых в эксперименте, заполните резервуар гипоксической камеры соответствующей средой эмбриона и начните диффузию газовой смеси через диффузор керамического диска. Уравнить в течение 10-15 мин.
    9. После уравновешивания сЕ желаемую кислородную смесь, измерьте концентрацию кислорода в воде с помощью оксиметра или кислородного зонда. Здесь для этого используйте оксиметр с волоконно-оптическим растворенным кислородом и датчиком температуры.
  • Индукция гипоксии у эмбрионов
    1. Тщательно выберите эмбрионы для эксперимента, используйте целые и живые эмбрионы для инкубации гипоксии. Здесь у нас эмбрионы лягушки стадии 38 или эмбрионы рыбок данио 4 dpf в представленных здесь экспериментах.
    2. Поместите чашки эмбрионов в инкубатор ( рис. 1K ), содержащий камеру инкубации газа, и позвольте им уравновесить температуру инкубатора.
    3. Осторожно переносите эмбрионы в лунки 24-луночного планшета ( рис. 1B ) камеры инкубации с помощью пластиковой пипетки. Всегда используйте пластиковую пипетку для переноса эмбриона по всему протоколу.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Каждая лунка этой пластины может содержатьДо 5 эмбрионов лягушки стадии 38 или до 7 эмбрионов рыбок данио 4 dpf. Тщательно назовите колодцы, используя разные генотипы.
    4. Поддерживайте камеру инкубации газа при постоянной инфузии с выбранной газовой смесью в течение 5 часов или в течение более длительного времени, которая подходит для эксперимента. Используйте смесь 5% O 2 и 95% N 2 здесь.
    5. Аккуратно переместите эмбрионы из камеры инкубации газа обратно в нормоксическую среду, соответствующую типу эмбрионов, и немедленно приступайте к шагам 3 или 4.
    6. Если требуется дополнительное нормоксическое лечение, осторожно переносите эмбрионы обратно в нормоксическую среду, соответствующую типу эмбрионов.

    • 3. Контроль успешной индукции гипоксии путем мониторинга уровней HIF-1α

    1. Препараты
      1. Подготовьте раствор 0,4 мг / мл MS222 в 0,1x MBS.
      2. Подготовьте буфер для гомогенизации: заготовьте буфер для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA bUffer) для гомогенизации ткани и дополнить количество буфера, необходимое для вашего эксперимента, с помощью ингибитора протеазы до конечной концентрации 1: 100 об. / Об.
      3. Подготовьте решения для вестерн-блоттинга.
        1. Приготовить 4x загрузочный буфер геля Laemmli: 425 мМ Трис, pH 8,0, 40% по объему глицерин, 8% об. / Об. SDS, 4% об. / Об. Бета-меркаптоэтанола, 0,5% мас. / Об. Бромфенол синий, общий объем 10 мл ddH 2 О.
        2. Подготовьте 5x бегущий буфер: 15 г основания Trizma, 72 г глицина, 5 г SDS, общий объем 1 л ddH 2 O.
        3. Готовят буфер переноса: 2,66 г основания Trizma, 14,4 г глицина, 200 мл 100% метанола, 1 л общего объема ddH 2 O.
        4. Подготовить 10x TBST: 5 мл 1 M Tris pH 8,0, 30 мл 5 М NaCl, 2,5 мл Tween 20, 1 L общий объем H 2 O.
        5. Подготовьте блокирующий раствор: 4% мас. / Об. Обезжиренного сухого молока в 1х TBST.
    2. Коллекция тканей
      1. Анестезируйте эмбрионы путем купания в растворе MS222 0,4 мг / мл16 , 17 и переносить их в пластиковую реакционную трубку, заполненную буфером для гомогенизации, с использованием пластиковой пипетки. Используйте 20 мкл буфера на эмбрион. Обратите внимание, что для определения значительного изменения уровней белка HIF1 необходимо, по крайней мере, 5 эмбрионов лягушки 38-го или 7-го эмбриона рыбок данио дабфа.
      2. Гомогенизируйте ткань, используя подходящий тканевый гомогенизатор или ультразвуковой аппарат. Удалите обломки центрифугированием (15 мин, 13000 × 4 ° С).
        1. Альтернативно, рассекайте сетчатки от анестезированных эмбрионов лягушки 17 и гомогенизируйте, как указано выше. Используйте 20 мкл буфера для гомогенизации на 10 сетчаток.
      3. Возьмите супернатант, используя пипетку, денатурируйте при 85 ° C в течение 5 минут и добавьте буфер для загрузки геля Laemmli до конечной концентрации 1x об. / Об. ( Например , добавьте 5 мкл 4x буфера Laemmli до 15 мкл гомогената). Используйте этот супернатант для WesКрапивница или замораживание образцов при -20 ° C.
    3. Вестерн-блот
      1. Загрузите образцы, приготовленные, как описано на этапе 3.2, на 12% -ный гель в электрофорезе, используя 1 х объемный буфер. Используйте белковые лестницы для определения размера белка. Перенесите белки на нитроцеллюлозную мембрану (мембрану 0,45 мкм) в буфер переноса в течение 1 часа, упакованную на льду при 4 ° C, согласно протоколу производителя.
      2. Блокируйте неспецифические сайты связывания, инкубирующие мембрану в Блокирующем буфере в течение 60 мин. Следуйте за 3 x 10-минутными промывками в 1x TBST.
      3. Инкубируйте мембрану в растворах кроличьего анти-HIF-1α антитела и мышиного анти-α-тубулина, разбавленного 1: 100 об. / Об. И 1: 5000 об. / Об., Соответственно, в блокирующем растворе в течение 2,5 часов при комнатной температуре. Следуйте за 3 x 10-минутными промывками в 1x TBST.
      4. Для обнаружения инкубируйте в козьих анти-кроличьих и козьих антимышиных HRP-конъюгированных антителах, разбавленных 1: 1000 об. / Об. В блокирующем растворе в течение 1 часа.Следуйте за 3 x 10-минутными промывками в 1x TBST и визуализируйте окрашивание HRP, используя коммерческий комплект и машину-разработчик по выбору.
      5. Определите количество белка HIF1α, используя цифровую количественную оценку.

    4. Мониторинг пролиферации клеток в гипоксии

    1. Препараты
      1. Подготовьте решение 5 мМ EdU в среде эмбриона по выбору. Раствор можно использовать немедленно или аликвоты и хранить при -20 ° C в течение 6 месяцев.
      2. Подготовьте фосфат-буферный солевой раствор (PBS) или купите PBS из коммерческих ресурсов. Автоклав в течение 10 мин при 115 ° С.
      3. Подготовьте решения для обнаружения интеграции EdU.
        1. Подготовьте раствор для фиксации: 4% об. / Об. 16% раствора формальдегида в PBS.
        2. Подготовьте раствор сахарозы: 30% мас. / Об. Сахарозы в PBS.
        3. Подготовьте PBST: 0,1% об. / Об. Triton X-100 в PBS.
        4. Подготовьте раствор для блокировки: 10% об. / Об. Ион-активированная сыворотка козы (HIGS) в PBST.
        5. Подготовить раствор DAPI: 1: 1000 об. / Об. 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в PBST.
    2. Инкубация эмбрионов в гипоксии для включения EdU
      1. Заполните камеру инкубации для газа 400-500 мл 5 мМ раствора EdU с добавлением 1% об. / Об. ДМСО. Предварительно уравновешивают раствор той же газовой смесью, используемой в эксперименте, в течение 15 мин до эксперимента. Обратите внимание, что объем раствора для инкубации можно свести к минимуму путем прикрепления более коротких стержней ( рис. 1Е ) к пластине с сеткой.
      2. Подключите газовую трубу к газовому баллону, содержащему газовую смесь 5% O 2 и 95% N 2 . Инкубируйте раствор в течение 15 мин.
      3. Перенесите эмбрионы в гипоксическую камеру, распределяя их равномерно между лунками и инкубируйте в течение 2 часов. Каждая лунка может вмещать до 5 эмбрионов лягушки стадии 38 или до 7 эмбрионов рыбок данио 4 dpf.
      4. Анализ эмбрионаS для включения EdU.
    3. Временной ход инкубации эмбрионов при гипоксии и включение ЭДУ
      1. Заполните камеру инкубации газом по 500 мл раствора эмбриона. Подключите газовую трубу к газовому баллону, содержащему газовую смесь 5% O 2 и 95% N 2, и уравновешите среду газовой смесью в течение 15 мин.
      2. Перенесите эмбрионы в гипоксическую камеру, распределяя их равномерно между лунками и инкубируйте в течение требуемого периода времени до 48 часов. В течение последних 1 ч замените среду эмбриона раствором 5 мМ EdU, дополненным 1% об. / Об. ДМСО.
      3. Перенесите эмбрионы обратно в нормоксическую тарелку и проанализируйте для включения EdU.
    4. Обнаружение и анализ внедрения EdU
      1. Обезболивают эмбрионы путем купания в растворе MS222 0,4 мг / мл.
      2. Перенесите эмбрионы в соответствующий стеклянный флакон и исправьте путем инкубации в раствор для фиксации на 2 гаT RT или O / N при 4 ° C. Следуйте за 3 x 10-минутными промывками в PBS. Тщательно переносите эмбрионы в раствор сахарозы для тканевой криозащиты. Инкубируйте в течение 4 часов или до тех пор, пока эмбрионы не опустится до нижней части стеклянного флакона.
      3. Вставьте эмбрионы в среду для заливки (оптимальное значение температуры для резки). Криосекционные блоки с эмбрионами немедленно или хранят до 14 дней при -80 ° C.
      4. Криосекция блоков, содержащих эмбрионы, с использованием криостата. Соберите участки 12 мкм (эмбрионы рыбок данио) или 16 мкм (эмбрионы лягушки) на слайдах микроскопа и дайте высохнуть. Технологические криоизоляции немедленно или хранить при -20 ° C в течение 3 месяцев.
      5. Обнаружение включения EdU с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием набора для коммерческой химии. Подготовьте количество реакционной смеси EdU, необходимое для количества криосекций в эксперименте, как описано изготовителем.
        1. Для 500 мкл реакционной смеси EdU используют 430 мкл реакционного буфера 1X EdU, 20 мкл CuSO 4 , 1,2 мкл азида Alexa Fluor, 50 мкл буферной добавки 1X EdU.
      6. Вымойте криосекции один раз PBS, чтобы удалить среду для вложения и 3 x 5 мин с PBST для проницаемости ткани. Инкубируйте криоизоляцию в Блокирующем растворе в течение 30 мин.
      7. Инкубируйте криоизоляцию с реакционной смесью EdU в течение 1 часа и затем промывайте 3 x 10 минут в PBST. Потратьте на криоизоляцию раствором DAPI в течение 15 минут, затем 3 x 10 мин промывают в PBST. Установите слайды с окрашенными криоизомерами в монтажной среде, накройте покровные стекла и оставьте высушить, прежде чем анализировать под флуоресцентным микроскопом или хранить при температуре 4 ° C на срок до 1 года.
      8. Проанализируйте криозоны с окрашиванием анти-ЭДУ под инвертированным конфокальным сканирующим микроскопом и определите количество ЭДУ-положительных клеток, используя цифровую количественную оценку.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Использование гипоксической камерной системы, которую мы здесь приводим, позволяет изучать эффекты гипоксии индивидуально и in vivo у всех живых животных. Гипоксию можно индуцировать путем размещения целых эмбрионов лягушки или рыбок данио в гипоксической камере ( рис. 1 ) и проводить различные сочетания состояний. Изображение нашей завершенной установки газовой камеры показано на рисунке 2 . Мы контролировали концентрацию кислорода в инкубационной среде с использованием волоконно-оптического кислородного датчика (2.1.9) в разные моменты времени во время эксперимента. Эти данные свидетельствуют о том, что во всех наших экспериментах мы индуцировали стабильную гипоксию (6-6,5% растворенного кислорода) ( табл. 1 ).

    Во-первых, мы оценивали вездесущие, а также уровни сетчатки HIF-1α в нормоксии и гипоксии, индуцированные в нашей гипоксической камере. HIF-1αЯвляется белком, который стабилизируется при низких концентрациях кислорода. Мы измеряли уровни HIF-1α в лизатах эмбрионов всей лягушки, которые поддерживались при нормальной концентрации кислорода или подвергались 5% -ной гипоксии, а также в лизатах их изолированных ретинов. Как показано на рисунке 3 , HIF-1α стабилизируется под гипоксией как у всех эмбрионов, так и у сетчатки. Стабилизация HIF-1α достигается в разных лунках инкубационной пластины сетчатого дна ( рис. S1 ).

    Как мы показали ранее, гипоксия влияет на пролиферацию предшественников стволовых клеток сетчатки в цилиарной маргинальной зоне (CMZ) сетчатки 13 . Таким образом, наблюдение за пролиферацией в CMZ посредством включения EdU является хорошим маркером для успешной индукции гипоксии. Мы инкубировали эмбрионы в гипоксической камере, поддерживаемой на 5% кислорода, и оценивали пролиферацию сетчатки, как описано в Стадии 4.2. Как и ожидалосьEd, нормоксические контрольные сетчатки показали интенсивное окрашивание EDU в CMZ, где пролиферирующие предшественники находятся в обеих лягушках ( фигуры 4B и 4D ) и эмбрионах рыбок данио ( рисунки 5A и 5C ). После лишения кислорода в гипоксической камере наблюдалось сильное снижение пролиферации CMZ-предшественников у обеих лягушек ( фигуры 4C-4D ) и эмбрионов рыбок данио (рис. 5B, 5C). Чтобы определить степень эффекта, мы выполнили курс времени, инкубируя эмбрионы в гипоксической камере в течение более длительных периодов времени до 24 ч, контролируя пролиферацию путем включения EdU, как описано в шаге 4.3. Мы могли бы показать, что уменьшение пролиферации прародителя сетчатки было острым и наибольшим в течение 2 часов и сохранялось в течение многих часов ( рис. 4D ), тогда как эмбрионы развивались нормально в соответствии с их стадией развития. Этот результат позволяет предположить, что наша система может эффективно индуцировать гипоксию в целевой тиПредставляющих интерес, в короткие сроки инкубации, а также поддерживать эти условия в течение более длительных периодов времени, поддерживая нормальное развитие эмбрионов.

    Рисунок 1
    Рисунок 1: Схематическое изображение установки экспериментальной газовой камеры. ( A ) размножающийся водный резервуар (22 (длина) x 10,5 (ширина) x 10,5 см (высота)) ( B ) 24-луночный планшет (12,8 x 8,6 x 1,7 x 1,5 см) ( C ) нейлон Фильтр с диаметром ячейки 0,1-0,2 мм ( D ) туннелей 10 (длина) х 5 мм (диаметр) ( E ) Тефлоновые или ПВХ-стержни соответствующего диаметра и 30 мм ( F ) силиконовые трубки ( G ) Требуемый газовый клапан ( I ) распределителя ( I ) смеси кислорода / CO 2 ( H )Amic disc диффузор ( K ) крышка бака. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    фигура 2
    Рисунок 2: Изображение установки экспериментальной газовой камеры. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Таблица 1
    Таблица 1: Измерение концентрации кислорода при различных временах инкубации в газовой камере. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого f igure.

    Рисунок 3
    Рисунок 3: Уровни HIF-1α увеличиваются при индукции гипоксии в эмбрионах Xenopus и их сетчатке. Вестерн-блоты белковых лизатов из целых эмбрионов ( А ) или из изолированных эмбриональных сетчаток ( В ) поддерживались в нормальных кислородных концентрациях или в гипоксии. Клетки были исследованы для субъединицы HIF-1α и α-тубулина. Для каждого состояния принимали по меньшей мере 5 эмбрионов или 22 сетчатки ( n = 5) ( C, D ). Количественное определение Вестерн-блоттинга, выполняемого в ( A, B ), соответственно. Уровни белка HIF-1α были нормированы на уровни белка α-тубулина. Шкалы ошибок представляют собой стандартные отклонения между экспериментами. * P -значение <0,05, *** p -значение <0,001; N = 5.D / 55710 / 55710fig3large.jpg «target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Рисунок 4
    Рисунок 4: Гипоксия снижает пролиферацию прародителей в сетчатой ​​стволовой клетке сетчатки эмбрионов лягушек. ( A ) Схематическое изображение поперечного сечения через 38-ступенчатую сетчатую сетчатку Xenopus , указывающую положение вставки желтой краевой зоны (CMZ) ( B , C ) EdU, измеренное после 2-часового импульса EdU в сетчатых сетчатых сетках DAPI с 38 стадии Эмбрионов лягушек, находящихся под нормоксией ( B ) или в гипоксической камере ( C ). Magenta = окраска DAPI; Gray = EdU. Шкала шкалы = 50 мкм ( D ) Количественная оценка эксперимента, проведенного в B и C. Полосы ошибок представляют собой стандартные отклонения. *** N = 7. Для каждого состояния оценивали количественно 10-15 сетчаток ( G ). Количественное определение EdU-положительных клеток после 1 часа включения EDU в сетчатки животных после различных периодов гипоксии (время в минутах, обозначенное по оси x). Шкалы ошибок представляют собой стандартные отклонения двух независимых экспериментов ( n = 2). Для каждого условия и точки времени было определено количественно как минимум 10 ретина. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Рисунок 5
    Рисунок 5: Гипоксия снижает пролиферацию прародителей в сетчатой ​​стволовой клетке сетчатки 4 dpf эмбрионов данио. Включение EDU, измеренное после 2-часового импульса EdU в сетчатых сетчатых сетках DAPI из 4 dpf старых эмбрионов WTe-рыбок даниоНормоксии ( А ) или в гипоксической камере ( В ). Маджента: окраска DAPI; Серый: окраска ЭДУ. Шкала шкалы = 50 мкм ( C ) Количественная оценка эксперимента, проведенного в B и C. Полосы ошибок представляют собой стандартные отклонения. *** p -значение <0,001; N = 7. Для каждого условия оценивали 10-15 сетчатки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Дополнительный рисунок 1
    Дополнительный рисунок 1: Уровни HIF-1α увеличиваются при индукции гипоксии последовательно в разных лунках пластинки и между различными экспериментами. Вестерн-блоты белковых лизатов из всех эмбрионов Xenopus сохраняются при нормальных концентрациях кислорода илиВ двух разных лунках гипоксической камеры при индукции гипоксии в течение 2 часов в эксперименте 1 ( A ) или в эксперименте 2 ( B ). Клетки были исследованы для субъединицы HIF-1α и α-тубулина. Для каждого состояния брали 5 эмбрионов лягушки стадии 38. Эксперимент 1 и 2 представляют собой независимые биологические репликации ( C, D ). Количественная оценка вестерн-блотов, выполняемых в ( A, B ), соответственно. Уровни белка HIF-1α были нормированы на уровни белка α-тубулина. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Здесь мы представили простой, но прочный новый метод для индуцирования гипоксии, который приспособлен для использования с эмбрионами лягушки и данио, но может также быть подходящим для других водных организмов. Основным преимуществом этого метода является его простота и экономичность. Тем не менее, результаты, полученные с помощью этого метода, очень надежны. Мы показали, что гипоксию можно эффективно индуцировать в камере как у всех эмбрионов, так и в специфической ткани - здесь, сетчатки. Для определения эффективности индукции гипоксии мы контролировали уровни белка HIF-1α в целом эмбрионе и лизатах сетчатки. Согласно нашим результатам, индукцию гипоксии можно считать успешной, если увеличение уровня HIF-1α можно наблюдать через 1 час в гипоксической камере по сравнению с нормоксическим контролем и нормализуется до глобальных уровней белка, например , используя уровни α-тубулина Как контроль. Мы подтвердили активность гипоксии в тканях путем мониторинга пролиферации стволовых клетокА также в соответствии с нашими ранее опубликованными результатами 13 , что гипоксия, индуцированная с использованием представленной здесь установки, приводит к уменьшению пролиферации стволовых клеток сетчатки у эмбрионов лягушки и рыбок данио.

    Одним из важных этапов этого протокола является обеспечение надлежащей герметизации гипоксической камеры. Это достигается за счет использования соответствующего уплотнения на крышке бака, в нашем случае это силиконовая смазка. Кроме того, размещение внутри инкубатора поможет избежать утечки атмосферного кислорода в камеру, обеспечивая дополнительный барьер. Измерение концентрации кислорода с помощью соответствующего зонда или электрода также гарантирует, что уровни гипоксического кислорода поддерживаются стабильными и без колебаний. Кроме того, следует проявлять осторожность, чтобы избежать открытия камеры в течение длительных периодов времени при обмене растворами или образцами между экспериментами.

    Учитывая быстрое равновесиеВремя вибрации 10-15 мин для установления гипоксии, лишь небольшое количество газовой смеси и низкий расход газа необходимы для поддержания системы даже в течение более длительных периодов времени, чем описано в репрезентативных результатах (24 часа). Растворы, используемые в эксперименте, должны быть предварительно уравновешены для достижения гипоксии в течение 15 мин до инкубации в камере (как описано в 4.2.1). Мы использовали гипоксическую камеру в течение 48 часов постоянной гипоксии без каких-либо ошибок, как видно из наших измерений концентрации кислорода ( таблица 1 ). Следует отметить, что правильную диффузию газа необходимо контролировать в течение более длительного времени инкубации. Наконец, следует соблюдать осторожность при помещении эмбрионов в лунки (шаг 2.2.1.), Чтобы избежать смешивания эмбрионов от разных мутантных животных / условий эксперимента. Это довольно просто достичь, учитывая относительно высокие стенки одиночных колодцев пластины.

    Несмотря на то, что это простой, но эффективныйИ надежная система индукции гипоксии, использование описанной здесь камеры имеет один недостаток для экспериментов, которые требуют использования дорогостоящих инкубационных растворов и сред. Минимальный объем среды в баке камеры не должен опускаться ниже 400 мл. Тем не менее, корректировки могут быть выполнены с учетом меньших объемов: нам удалось отрегулировать длину стержней ( рис. 1Е ), прикрепленных к пластине (2.1.4 и 4.2.1), чтобы потребовалось всего 50 мл среды / раствора , Хотя это не идеально подходит для более длительных периодов инкубации, эта установка может соответствовать одной и той же газовой трубе и может быть надлежащим образом герметизирована для обеспечения достаточной гипоксии в течение 8 часов.

    Взятые вместе, наша установка газовой камеры может использоваться для использования с любым организмом в водной модели и отличается от других подобных коммерчески доступных систем своей простотой, экономичностью и надежностью. После освоения его можно использовать для прямых экспериментов in vivo , любого заданного периода времени и при любом желанииD, включая гипоксию, гипероксию или другие газовые смеси.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

    Acknowledgments

    Эта работа была поддержана поддержкой от Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z до WAH и стипендией DFG KH 376 / 1-1, присужденной HK

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sodium chloride Sigma S7653 NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST
    Potassium chloride Sigma P9333 KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,
    Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3/0.1x MBS
    HEPES Sigma H3375 0.1x MBS
    Magnesium sulfate Sigma M7506 MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium
    Calcium nitrate Sigma 202967 Ca(NO3)2/0.1x MBS
    Calcium chloride Sigma C1016 CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium
    Methylene blue Sigma M9140 Embryo medium
    Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) Sigma CG10 Frog fertilization
    Zebrafish breeding tank Carolina 161937 Gas chamber construction
    24-well plate Thermo Scientific 142475 Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
    Epoxy resin RS Components UK Kit 199-1468
    Gas distributor valve WPI Luer Valves Kit 14011 Aquatic tank attachment (Schema 1, H)
    High precision gas valve BOC  200 bar HiQ C106X/2B Gas tank attachment (Schema 1, I)
    5% oxygen and 95% N2 gas tank BOC 226686-L Hypoxic gas mixture
    ceramic disc diffuser CO2 Art  Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 Schema 1, J
    silicone grease Scientific Laboratory Supplies VAC1100 Schema 1, K
    oxymeter Oxford Optronix  Oxylite, CP/022/001 Hypoxic chamber setup
    fibre-optic dissolved oxygen sensor Oxford Optronix HL_BF/OT/E Hypoxic chamber setup
    plastic pasteur pipette Sterilin STS3855604D For embryo transfer
    MS222  Sigma Aldrich E10521-50G Embryo anesthetic
    RIPA buffer  Sigma R0278-50ML Tissue homogenization
    Protease inhibitor Sigma P8340 Tissue homogenization
    Tris Sigma 77-86-1 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST
    Glycerol Sigma G5516 4x Laemmli loading buffer
    Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L3771 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer
    beta-Mercaptoethanol  Sigma M6250 4x Laemmli loading buffer
    Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 4x Laemmli loading buffer
    Trizma base  Sigma 77-86-1 5x Running buffer, Transfer buffer
    Glycine Sigma G8898 5x Running buffer, Transfer buffer
    Methanol Sigma 34860 Transfer buffer
    Tween 20 Sigma P2287-500ML 10x TBST
    skim milk powder Sigma 70166 Blocking Solution
    Eppendorf microcentrifuge tube Sigma T9661
    tissue homogenizer Pellet Pestle Motor Kontes Z359971 Tissue homogenization
    pellet pestles Sigma Z359947-100EA Tissue homogenization
    precast 12% gel Biorad Mini-ProteinTGX, 456-1043 Western Blot
    protein ladder Amersham Full-Range Rainbow ladder, RPN800E Western Blot
    nitrocellulose membrane (0.45 µm) Biorad 162-0115 Western Blot
    anti-HIF-1α antibody Abcam ab2185 Western Blot
    anti-α-tubulin antibody Sigma T6074 Western Blot
    goat anti-rabbit antibody Abcam ab6789 Western Blot
    goat anti-mouse antibody Abcam ab97080 Western Blot
    Pierce ECL 2 reagent  Thermo Scientific 80196 Western Blot
    ECL films Hyperfilm GE Healthcare Amersham 28906837 Western Blot
    5-Ethynyl-2′-deoxyuridine   santa cruz CAS 61135-33-9 EdU, EdU incorporation
    Phosphate-buffered Saline (PBS) Oxoid BR0014G 1x
    Formaldehyde Thermo Scientific 28908 Fixation solution
    Sucrose Fluka S/8600/60 Solution solution
    Triton X-100 Sigma T9284-500ML PBST
    Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) Sigma G6767-100ml Blocking solution (EdU incorporation)
    4',6-diamidino-2-phenylindole  ThermoFisher Scientific D1306 DAPI, EdU incorporation
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Molecular Probes C10338 EdU incorporation
    glass vial VWR 98178853 EdU incorporation analysis
    Tissue-Plus optimal cutting temperature compound  Scigen 4563 Embedding medium, EdU incorporation analysis
    cryostat Jung Fridgocut 2800E Leica  CM3035S EdU incorporation analysis
    microscope slides Super-Frost plus Menzel glass Thermo Scientific J1800AMNZ EdU incorporation analysis
    EdU Click-iT chemistry kit Molecular Probes C10338 EdU incorporation analysis
    FluorSave Calbiochem D00170200 Mounting medium, EdU incorporation analysis
    coverslips VWR ECN631-1575 EdU incorporation analysis
    fluorescent microscope Nikon Eclipse 80i EdU incorporation analysis
    confocal scanning microscope Olympus Fluoview FV1000 EdU incorporation analysis
    Volocity software PerkinElmer Volocity 6.3 EdU incorporation analysis

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
    2. Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude? Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
    3. Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
    4. Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
    5. Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
    6. Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
    7. Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
    8. Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
    9. Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
    10. Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
    11. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
    12. Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
    13. Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
    14. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Nieuwkoop, D. P., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
    15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
    16. Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
    17. McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).

    Tags

    Биология развития выпуск 124 эмбрионы лягушки эмбрионы рыбок данио гипоксия гипоксическая камера развитие эмбриона стволовые клетки сетчатки
    Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Khaliullina-Skultety, H., Zi Chao,… More

    Khaliullina-Skultety, H., Zi Chao, N., Harris, W. A. Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (124), e55710, doi:10.3791/55710 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter